Академія медичних наук УкраЇни

Інститут мІкробІологІЇ та ІмунологІЇ

ім. І.І. Мечникова

БІЛЯЄВСЬКА СВІТЛАНА ЮЛІЇВНА

УДК 615.32/31.076.9+616.9:579.841

Мікробіологічне обгрунтування використання плацентарних препаратів та декаметоксину при синьогнійній інфекції

03.00.07 – мікробіологія

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

Харків - 2001

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана в лабораторії клінічної мікробіології Інституту мікробіології та імунології ім. І.І. Мечникова АМН України.

Науковий керівник: кандидат медичних наук, професор Павленко Неоніла Володимирівна, професор кафедри мікробіології, вірусології та імунології Харківського державного медичного університету МОЗ України

Офіційні опоненти: доктор медичних наук, старший науковий співробітник Бабич Євген Михайлович, Інститут мікробіології та імунології ім. І.І.Мечникова АМН України, завідувач лабораторії краплинних інфекцій;

доктор біологічних наук, професор Співак Микола Якович, Інститут мікробіології і вірусології ім. Д.К. Заболотного НАН України, завідувач відділом проблем інтерферону та імуномодуляторів.

Провідна установа: Інститут епідеміології та інфекційних хвороб

ім. Л. В. Громашевського, АМН України

Захист відбудеться 28.05.2001p. о 13 годині на засіданні спеціалізованої Вченої Ради Д.64.618.01 при Інституті мікробіології та імунології ім. І.І. Мечникова АМН України за адресою: 61057, м. Харків, вул. Пушкінська, 14 ).

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Інституту мікробіології та імунології ім. І.І. Мечникова АМН України, 61057, м. Харків, вул. Пушкінська, 14).

Автореферат розісланий 28.04.2001p.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради, к. мед. н., с.н.с. І.Ю. Кучма

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Під впливом антибіотиків та хіміопрепаратів на фоні зниженої імунологічної реактивності організму і зростання кількості алергічних реакцій неухильно змінюється етіологічна структура гнійно-запальних захворювань (ГЗЗ) (Сидоренко С.В., 1999; Barret J.K., Hoch J.A., 1998). Госпітальні інфекції все частіше обумовлюються грамнегативною мікрофлорою, яка на сьогодні є головною причиною гнійно-запальних ускладнень (Зубов Л.А., Богданов Ю. М., 1998; Gold H.S., Moerling R.S., 1996). Серйозною проблемою клініцистів є госпітальна інфекція, обумовлена антибіотикорезистентною мікрофлорою, синьогнійною паличкою насамперед (Bergogne-Berezin E, 1999; Finlay B.B., Falkow S., 1997; Emmerson A.M. Enstont J.E., Griffin M., 1996).

Виявляється все більше штамів Р. aeruginosa, резистентних до антибіотиків останніх поколінь (Гречко В.А., 2000; Козлов Р.С., 2000; Kenneth Todar, 1997). Багаторічний досвід, накопичений по вивченню синьогнійної інфекції, свідчить про те, що, як правило, ця інфекція має місце у хворих зі зниженою резистентністю (при опіках, онкологічних захворюваннях, у випадках використання імунодепресантів та ін.), а також при медикаментозній алергії, що обумовлює високу смертність хворих від розвитку синьогнійного сепсису Дикий І.Л. та інш., 1996; Robert E.W. Hancock, 1999). В патогенезі різних форм синьогнійної інфекції безумовна роль належить також порушенням імунного статусу хворих (М.Г. Крутиков та інші, 1998), тому багато дослідників та клініцистів шукають шляхи корекції імунітету у хворих з синьогнійною інфекцією. Безумовно, пошук ефективних та доступних вітчизняних імуностимулюючих засобів є однією з актуальних проблем біології та медицини.

Сучасна клінічна імунологія має достатньо широкі можливості проведення імуностимулюючої терапії, але більшість відомих в наш час імунокоригуючих засобів важко стандартизувати. Це пов'язано з тим, що первинною сировиною багатьох з них є продукти метаболізму, компоненти мікробних клітин та екстракти з імунокомпетентних органів тварин (селезінка, тимус) . Крім того, отримані з цієї сировини препарати в терапевтичних дозах часто спричиняють побічні ефекти.

В останній час все частіше тканини плаценти використовують як протизапальні засоби та імуностимулятори (Сухих Г.Т., 1998; Рябчикова О.П. та інш., 1998; Гольцев А.М. та інш., 1999). На наш погляд комплексне лікування синьогнійної інфекції повинно включати як антибактеріальні препарати, так і засоби впливу на імунну систему. Вказане підтверджує актуальність досліджень експериментального обгрунтування використання раніше відомих вітчизняних препаратів за новим призначенням: антисептика декаметоксину та препаратів з тканини плаценти людини - амніоцену та біоглобіну.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами.

Дисертаційна робота пов'язана з плановою науковою тематикою Інституту мікробіології та імунології ім. І.І. Мечникова АМН України: “Комплексна розробка мікробіологічних та імунологічних критеріїв ефективності лікування хворих з різними гнійно-запальними ураженнями” (шифр ЦФ.4.23.98 № держреєстрації 01984002477 ), “Вивчити вплив препаратів плаценти на показники протиінфекційного імунітету при гнійно-запальних захворюваннях (клініко-експериментальне дослідження)”, (шифр ІН.22.97 № держреєстрації ОІ940І4332 ), “Розробка нових лікарських форм декаметоксину” (шифр ІН.ІЗ.00.0012.91 № держреєстрації 01.9.10.041919). Автор була виконавцем перерахованих комплексних тем.

Мета і задачі дослідження. Мета роботи – мікробіологічне обгрунтування можливості застосування амніоцену, біоглобіну та декаметоксину в якості імуностимуляторів при експериментальній синьогнійній інфекції.

Для досягнення мети в дисертаційній роботі сформульовано і розв'язано такі задачі:

1. Визначити біологічні особливості штамів Р. aeruginosa, циркулюючих в клініках різного профілю м. Харкова.

2. Вивчити механізми дії декаметоксину на окисно-відновні процеси в клітинах синьогнійної палички.

3. Означити імунотропні властивості декаметоксину, амніоцену та біоглобіну в дослідах на тваринах.

4. Оцінити біологічну суть захисної дії імуноцитів інтактних та активованих препаратами з тканини плаценти людини при експериментальній синьогнійній інфекції.

Об'єкт дослідження – синьогнійна інфекція.

Предмет дослідження – препарати з плаценти людини та декаметоксин.

Наукова новизна одержаних результатів.

Показано, що серед циркулюючих штамів P. aeruginosa, виділених від хворих на ГЗЗ і з об'єктів лікарняного середовища стаціонарів різного профілю м.Харкова, найчастіше зустрічаються серотипи 02, 04, 06.

Встановлені імунотропні властивості декаметоксину, амніоцену і біоглобіну.

Експериментально показано, що декаметоксин (в дозах від 10 до 20 мг/кг), амніоцен і біоглобін селективно впливають на клітинну ланку імунної системи (активізують клітини МФС і Т-лімфоцити), а також мають виражений стимулюючий вплив на антитілогенез, що зумовлює доцільність їх використання як імуномодулюючих засобів.

Вперше експериментально обгрунтовано використання декаметоксину, амніоцену та біоглобіну в захисті від синьогнійної інфекції.

Вперше експериментально обгрунтована трансплантація інтактних і активованих препаратами з тканини плаценти людини імуноцитів, які мають протективну дію при синьогнійній інфекції.

Встановлено, що найбільшу ефективність в захисті від синьогнійній інфекції мають тімоцити. Активовані препаратами з плаценти імуноцити проявляють захисний ефект в більшій мірі, ніж імуноцити активовані відомим імуномодулюючим засобом Т-активіном.

Практичне значення одержаних результатів. Вилучені та охарактеризовані штами Pseudomonas aeruginosa, циркулюючі в клініках різного профілю м. Харкова; досліджена чутливість найпоширеніших серотипів P.aeruginosa до антибіотиків останніх поколінь.

Експериментально обгрунтовані імунотропні якості препаратів із тканини плаценти людини – амніоцену і біоглобіну, які вже знайшли використання в клінічній практиці: Інформаційний лист “Способ лечения деструктивного нефротуберкулеза с применением иммуностимулятора амниоцена”, Київ, 1993; патенти № 31867А від 2000 р. “Спосіб лікування хворих на гострі виразки шлунку, ускладнені кровотечею”, та № 30696А “Спосіб комплексного лікування пародонтиту” від 2000 р.

Матеріали дисертації використовуються в навчальних програмах кафедри клінічної імунології та мікробіології Харківської медичної академії післядипломної освіти МОЗ України, кафедри мікробіології, вірусології та імунології Харківського державного медичного університету МОЗ України, кафедри фармакології Буковинської державної медичної академії МОЗ України.

Особистий внесок здобувача. Особистий внесок автора в отримання наукових результатів полягає у виборі напрямку, постановці мети та формулюванні задач, в аналізі наукової літератури та патентному пошуку. Вибрані методичні підходи, опрацьовані моделі, згідно з якими особисто виконані дослідження імунотропних властивостей декаметоксину і препаратів з тканини плаценти людини - амніоцену і біоглобіну. Самостійно вилучені та охарактеризовані штами Р. aeruginosa, циркулюючих в стаціонарах різного профілю м. Харкова. Усі положення, висновки, статистична обробка одержаних в ході досліджень результатів належать авторові.

Апробація результатів дисертації. Основні положення дисертації викладені та обговорені на науково-практичних конференціях “Актуальні питання мікробіології, епідеміології та імунології інфекційних хвороб” (Харків, 1993); “Оптимальные средства и методы иммунокоррегирующей, противовоспалительной и противомикробной терапии” (Харків, 1993); міжнародних наукових конференціях, “Идеи И. И. Мечникова в развитии современного естествознания” (Харків, 1995); “Актуальні питання боротьби з інфекційними захворюваннями” (Харків, 1997); “Стратегія і тактика боротьби з інфекційними захворюваннями” (Харків, 1998).

Публікації. За темою дисертації опубліковано 14 наукових робіт, з них 6 - у наукових журналах, що рекомендовані ВАКом України (3 самостійних), 2 патента на винахід, один інформаційний лист.

Структура дисертації. Дисертація складається з вступу, огляду літератури, чотирьох розділів власних досліджень, розділу “Аналіз і узагальнення результатів досліджень”, висновків, списку використаної літератури. Останній містить 246 літературних джерел. Обсяг дисертації становить сторінок друкованого тексту. Робота ілюстрована 27 таблицями та 10 малюнками.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Матеріали і методи дослідження. Мікробіологічні та біохімічні методи. Матеріал для обстеження: гнійне виділення ран, кров, жовч, фекалії, ексудат, змиви з інвентарю, інструментів, перев'язочного матеріалу та з рук медичного персоналу різних клінік м. Харкова. Усього обстежено 1148 хворих з гнійно-запальною інфекцією, досліджено 622 змиву з об'єктів лікарняного середовища. Забір матеріалу, його транспортування, вилучення та ідентифікація мікроорганізмів проводилися загальноприйнятими методами та згідно методичних рекомендацій: “Микробиологическая диагностика заболеваний, вызванных псевдомонадами и другими неферментирущими бактериями”, Київ, 1988 р.

Чутливість мікроорганізмів до антибіотиків визначили методом дисків відповідно до методичних рекомендацій (Даценко Б.М. с соавт., 1989). У якості тест-культури використаний еталонний штам Pseudomonas aeruginosa АТСС 27853.

Моделювання генералізованої синьогнійної інфекції проведено шляхом внутрішньочеревинного введення LD100 штаму Pseudomonas aeruginosa (75х 106 КУО/мл).

Дослідження впливу декаметоксину на окисно-відновні процеси в клітинах бактерій клінічних штамів P. aeruginosa вивчено з використанням відомих біохімічних методів: визначення синтезу макромолекул, нуклеїнового обміну, проникності мембран, ферментативної активності (“Унифицированные методы лабораторных исследований”, Москва, 1974), а також методів, описаних Долбовською А.С. , 1975; Яковенко О.Н. та Троїцьким Н.М., 1985; Бутовою Л.Г., Блінковою Л.П. ,1991; Соніним Є.О., Виноградовою Р.П. , 1975.

Імунологічні методи. Оцінка імуномодулюючої активності препаратів проводилась з використанням методів: визначення антитіл у сироватці крові та антитілоутворюючих клітин у селезінці; реакції гіперчутливості сповільненого типу; вивчення впливу препаратів на макрофагальну систему, проліферацію і кооперацію Т- і В-лімфоцитів; оцінки мітостатичної і лімфотоксичної дії; оцінки анафілактогенної активності; реакції загальної і шкіряної анафілаксії; методу адоптивного переносу імунокомпетентних клітин відповідно до методичних рекомендацій: “Методические рекомендации по экспериментальному (фармакологическому) изучению иммунномодулирующего действия фармакологических средств” (Москва, 1984); “Влияние на иммунные реакции и возможности клинического применения для иммунокоррекции ГАМК-ергических препаратов” (Киев, 1990); “Методические рекомендации по предоставлению документации на лекарственные средства в Фармакологический комитет МЗ Украины” (Киев, 1993); “Методические рекомендации по экспериментальному (доклиническому) изучению фармакологических веществ, предлагаемых в качестве нестероидных противовоспалительных средств” (Киев, 1994).

Характеристика препаратів, взятих для дослідження імуномодулюючої активності:

амніоцен (Amniocenum) - амніотична оболонка з плаценти людини ( ТФС 42-1676-86). Були використані дози: 1,25 мг/кг, 2,5 мг/кг, 5 мг/кг;

біоглобін (Bioglobinum) - комплекс біохімічних сполук в окисленній формі, отриманих з плацентарних тканин людини (ТФС 42 2386-94). Були використані дози: 1.4 мг/кг, 7 мг/кг, 14 мг/кг;

декаметоксин (Decamethoxinum) - похідна четвертинного амонію, катіонна поверхнево-активна сполука (ТФС 42-1814-88). Були використані дози: 10 мг/кг, 15 мг/кг, 25 мг/кг;

Т-активін (препарат-порівняння) використовувався в дозі 0,1 мг/кг.

Статистичні методи. Отримані результати досліджень оброблялись з використанням пакету прикладних статистичних програм “Multifac 2,2”. за допомогою персонального комп'ютера типу ІВМ-486 із застосуванням методів варіаційної статистики (Мінцер О.П. і співавт., 1991).

Результати дослідження та їх обговорення. 1. Біологічні особливості штамів P. aeruginosa, циркулюючих в клініках різного профілю м. Харкова.

При бактеріологічному обстеженні хворих на ГЗЗ P. aeruginosa в монокультурі та в асоціаціях, вилучена в 3,5 % - 46,6 % випадків. В хірургічній клініці P. aeruginosa в асоціації із стрептококами, бактероїдами та клостридіями складала 46,6 % випадків, в гінекологічній клініці цей збудник в асоціації із стрептококами зустрічався в 4,5 % випадків, в дерматологічній - в асоціації із стафілококами – в 13,5 % , в урологічній - у монокультурі і в асоціації з кишковою паличкою – в 23,7%, в стоматологічній - в асоціації із стафілококами, стрептококами, пептострептококами та бактероїдами – в 3,5 % випадків.

При обстеженні предметів лікарняного середовища синьогнійна паличка в хірургічній клініці вилучена з частотою до 50,0 %, в дерматологічній - до 60,0 %, в урологічній - до 22,2%. Безсумнівно, контаміновані предмети сприяють поширенню синьогнійної інфекції, в лікувальних стаціонарах названого профілю. Встановлено, що серед циркулюючих штамів синьогнійної палички найчастіше зустрічаються 02, 04 та 06 серотипи. Виділені штами Р. aeruginosa серотипів 02, 04 та 06 характеризувались вираженою гемолітичною та желатиназною активністю. Біохімічні властивості вилучених штамів P. aeruginosa вказаних серотипів відзначаються вираженою стійкістю.

При визначенні чутливості до дії сучасних антибіотиків клінічних штамів Р. aeruginosa, виділених від хворих на ГЗЗ в стаціонарах різного профілю, встановлено, що штами серотипів 02, 04 та 06 були стійкими майже до всіх вивчених антибіотиків, слабочутливими штами псевдомонад серотипу 02 виявились лише до тієнаму і таривіду, а серотипів 04 і 06 - до тієнаму, таривіду, ципробаю, гентаміцину та амікацину (табл. 1).

При вивченні антибактеріальної активності сполук четвертинного амонію та інших груп антисептиків і дезинфектантів щодо циркулюючих штамів Р. aeruginosa виявлено, що поширені в клініках антисептики та дезинфектанти не ефективні по відношенню до синьогнійної палички, за виключенням декаметоксину (МЗК - 30 мкг/мл). Штами Р. aeruginosa, виділені з об'єктів лікарняного середовища, також виявили стійкість до антисептиків та дезинфектантів в слідуючих концентраціях: фенол – більше 2%; йодпирон – 2%, Н2О2 – 3%; рокал – 1%;

Таблиця 1

Спектр антибактеріальної активності сучасних антибіотиків

щодо клінічних штамів Р. аeruginosa

Антибіотики Комерційна назва використаних Серотип

Антибіотиків 02 04 06

Бета-лактамні Карбопенеми Пеніцилін Оксацилін Ампіцилін Кефлін R/Кефзол R Клафоран R Тієнам R      С      С      С

Макроліди Еритроміцин Сумамед Рулід R         

Фторхінолони Таривід Ципробай С  С С С С

Аміноглікозиди Гентаміцин Тобраміцин Амікацин    С  С С  С

Тетрацикліни Вібраміцин   

Рифампіцин Рифампіцин(Рифадин)   

Лінкосаміди Лінкоміцин   

Різні групи Фузидін   

Глікопептіди Ристоміцин   

Поліміксини Поліміксин   

Примітка. -резистентні; С-слабочутливі (10,3 – 17,2 мм – діаметр зони затриманого росту)

хлорамін – 3%; борна кислота – більше 10 %. Найбільш ефективним виявився 0,1 % розчин декаметоксину, до якого були чутливими майже всі свіжовилучені штами Р. aeruginosa. Враховуючи високу токсичність більшості дезинфектантів, що обмежує їх використання, та ефективну антипсевдомонозну дію декаметоксину доцільно використовувати його з метою профілактики синьогнійної інфекції та обробки лікарняного інвентаря.

2. Вивчення механізмів дії декаметоксину на окисно-відновні процеси в клітинах синьогнійних паличок.

Проведено всебічне дослідження синтезу макромолекул, ферментативної активності, проникності мембран та клітинної стінки штамів P. aeruginosa, в результаті яких встановлено, що декаметоксин у випробуваних дозах впливає на синтез ДНК, при цьому специфічно не пригнічуючи синтез РНК. В бактеріостатичних та бактерицидних дозах препарат порушував проникність мембран для низькомолекулярних сполук, викликав лізис протопластів, деструкцію клітинної стінки Р. aeruginosa, вилучаючи з її складу ліпополісахаридну фракцію.

Встановлено виражений вплив декаметоксину на клітинні процеси ланцюгу дихання: окисне фосфорилювання, активність дегідрогеназ циклу трикарбонових кислот з одночасним зниженням рівня аденозинтрифосфату в клітині.

3. Імунотропні властивості декаметоксину і препаратів з плаценти людини - амніоцену і біоглобіну.

Для цього в першу чергу досліджені алергізуючі властивості препаратів у реакціях загальної і шкірної анафілаксії. Встановлено, що декаметоксин, амніоцен і біоглобін у всіх досліджених дозах не виявляють алергізуючих властивостей.

Для оцінки впливу досліджуваних препаратів на гуморальну ланку імунітету визначали титри антитіл і число антитілоутворюючих клітин (АУК) у селезінці. Результати досліджень показали, що у низькореагуючої лінії мишей С57В1 біоглобін в дозі 14.0 мг/кг вірогідно збільшував число АУК (контроль - 61,0 ± 7,2, дослід - 108,0 ± 11,1), амніоцен збільшував число АУК у всіх досліджених дозах, що свідчить про можливість впливати на синтез антитіл в даних умовах досліду. При безпосередньому виявленні рівня антитіл у сироватці тварин ця тенденція зберігалась. Декаметоксин в дозі 10,0 мг/кг при спільному введенні з антигеном збільшував число АУК в селезінці у 2,8 разів, в дозі 15,0 мг/кг - у 2,0 рази, а в дозі 25 мг/кг зменшував синтез антитіл у 1,5 - 2 рази, при цьому кількість АУК не змінювалось (р<0,05), що свідчить про дозозалежний єфект.

Вплив досліджуваних препаратів на клітинну імунну відповідь.При дослідженні впливу амніоцену, біоглобіну та декаметоксину на ефекторну можливість лімфоцитів у реакції трансплантаційного імунітету було встановлено, що препарати в досліджуваному діапазоні доз не впливали на активність трансплантованих лімфоцитів, що свідчить про відсутність впливу на реакцію “трансплантат проти хазяїна”. Індекс інактивації КУО у біоглобіну складав від (52,5 ± 2,2) % до (33,7 ± 2,1) %, у амніоцену - від ( 53,5+5,1) % до (40,1+3,7) %, у декаметоксину - від (54,8+5,1) % до (53,2+5,0) %, в контролі (56,5 ± 3,2) %, контроль препарату порівняння Т-активіну - (40.6+3,9) %.

При вивченні впливу препаратів на кооперацію Т- і В-лімфоцитів встановлено, що амніоцен в дозі 5,0 мг/кг та біоглобін в дозі 14,0 мг/кг суттєво посилювали ефекти взаємодії Т- і В-лімфоцитів, про що свідчить збільшення числа АУК у селезінці тварин (240,0 ± 20,2 і 278,3 ± 18.3, відповідно). Дані щодо АУК в цих дослідах фактично відповідали числу АУК у селезінці тварин, де застосовувався Т-активін (244. 6 ± 30.1 при контролі 162,2 ± 29,6). Декаметоксин в дозах 10,0 і 15,0 мг/кг посилював ефект взаємодії Т- і В-лімфоцитів, але при використанні дози 25 мг/кг імунна відповідь не змінювалась.

При індукції гіперчутливості сповільненого типу (ГСТ) у сенсибілізованих еритроцитами барана (ЕБ) тварин після введення декаметоксину в дозі 25 мг/кг інтенсивність реакції знижувалась до (15,23 ± 1,67) % при контролі (24,7 ± 2,68) %. А введення декаметоксину в дозах 10,0 і 15 мг/кг підвищувала індекс реакції (ІР) до (30,2 ± 3,6) % і (35,1 ± 3,8) %, що свідчить про вплив декаметоксіну на регуляторні процеси клітини, відповідальні за розвиток реакції ГСТ. Після введення амніоцену і біоглобіну ІР підвищувався у 1,5 - 2 рази. Цей висновок підтверджується результатами, одержаними в наступному досліді у сублетально (5 Гр.) опромінених мишей, коли порушується імунологічна компетентність організму. Введення декаметоксину в дозах 10 та 15 мг/кг після опромінювання тварин підвищувало інтенсивність реакції у 2,5 - 3 рази. При введенні препарату в дозі 25 мг/кг - ІР не підвищувався, що вказує на відсутність клітин, які приймають участь у ГСТ. Введення тваринам амніоцену в дозі 5 мг/кг та біоглобіну в дозі 14 мг/кг стимулювало формування ГСТ в 2,5 - 3 рази.

Було вивчено два найбільш важливих критерію оцінки специфічної активності досліджених препаратів: пригнічення проліферації стволових клітин (мітостатичний ефект) і відміну інактивації ендогенних стволових клітин (лімфотоксична дія). Декаметоксин (у дозах 5 - 15,0 мг/кг), амніоцен і біоглобін у всіх використаних дозах не виявили мітостатичного ефекту, про що свідчать середні числа КУО у дослідних групах тварин, які не відрізняються вірогідно від середніх чисел КУО у контрольних групах. Обробка тварин препаратами не впливала на гомотрансплантаційну активність пересаджених лімфоцитів, оскільки відсоток виживших КУО суттєво не відрізнявся від контрольного. Таким чином, декаметоксин у дозах 5,0 - 15,0 мг/кг, амніоцен і біоглобін у всіх досліджених дозах не виявили інгібуючого впливу на швидко проліферуючі клітини, що вказує на відсутність мітостатичної дії і не пригнічували функціональну активність лімфоцитів, що вказує на відсутність лімфотоксичної дії. Декаметоксин у дозах 25 - 50 мг/кг проявляв лімфотоксичний та мітостатичний ефекти, але ці дози являють собою значно вищі за терапевтичні.

У реакції бласттрансформації лімфоцитів обробка лімфоцитів декаметоксином, амніоценом і біоглобіном у всіх використаних дозах не спричиняла суттєвого підвищення кількості бластів у порівнянні спонтанною бласттрансформацією. Кількість бластів була суттєво нижчою відсотка бласттрансформації в культурах, оброблених ФГА, що підтверджує відсутність мітогенної активності препаратів (р < 0.01).

При вивченні впливу препаратів на фагоцитарну активність макрофагів перітонеального ексудату (ПЕ) у мишей лінії СВА встановлено, що досліджувані препарати суттєво змінювали поглинаючу здатність макрофагів та індекс фагоцитозу: амніоцен активував фагоцитоз у 1,6 разів, біоглобін - у 1,8 разів, декаметоксин - в дозі 15,0 мг/кг - у 1,7 разів. Разом з тим, вони мали виражений вплив на одну з основних функцій фагоцитів - їх перетравлюючу здатність, вірогідно (р < 0.05) підвищуючи індекс завершеності фагоцитозу у порівнянні з контролем, що свідчить про здатність препаратів посилювати ефективність мікробоцидних систем макрофагів. Треба відзначити, що декаметоксин в дозі 25 мг/кг такої дії не виявив.

У НСТ-тесті, який дозволяє отримати уявлення про порушення в системі окислювального метаболізму фагоцитів, всі досліджені препарати (за винятком декаметоксину в дозі 25 мг/кг у мишей) вірогідно (р < 0.05) підвищували кількість НСТ-позитивних нейтрофілів.

Таким чином, на різних експериментальних моделях встановлені імунотропні властивості декаметоксину, амніоцену і біоглобіну, при цьому імуномодулюючі властивості препаратів знаходяться в значній залежності від дози. Імунотропна активнітсь амніоцену і біоглобіну посилювалась по мірі збільшення дози, декаметоксин проявляв імунотропні властивості тільки в дозі 10 - 15 мг/кг.

Для раціонального застосування вказаних імуностимулюючих засобів при синьогнійній інфекції потрібно мати дані щодо чутливості імуноцитів макроорганізму до досліджених препаратів.

4. Біологічна суть захисної дії імуноцитів, активованих препаратами з тканини плаценти людини при експериментальній синьогнійній інфекції.

Вивчали протективну роль інтактних та активованих препаратами клітин селезінки, тимуса, лімфатичних вузлів, перітонеального ексудату (ПЕ), лімфоцитів крові в захисті від синьогнійної інфекції. Імуноцити трансплантували за 4 -5 годин до зараження P. aeruginosa (штам АТСС 27853) мишам, які були імунодепресовані за допомогою циклофосфаміду. Інтактні клітини селезінки підвищували виживання експериментальних тварин у 10 разів. Клітини селезінки, які були активовані відомим Т-клітинним стимулятором Т-активіном (препарат порівняння) і досліджуваними препаратами з плаценти, підвищували виживання мишей у 20 - 25 разів. Інтактні клітини тимусу підвищували виживання тварин у 15 разів. Обробка тимоцитів in vitro амніоценом і біоглобіном збільшувала виживання мишей майже у 40 разів (р < 0.01). Інтактні клітини лімфатичних вузлів підвищували виживання мишей також у 15 разів, при цьому клітини лімфатичних вузлів, оброблені амніоценом і біоглобіном, сприяли підвищенню виживання мишей у 20 і 25 разів відповідно. Інтактні лімфоцити периферичної крові підвищували виживання тварин у 10 разів, але активація лімфоцитів in vitro взятими в дослід препаратами не посилювала їх протективні властивості (р < 0.05).

При дослідженні захисної ролі клітин макрофагально-фагоцитарної системи (МФС) при синьогнійній інфекції було встановлено, що кількість тварин-реципієнтів інтактних клітин ПЕ, які вижили, збільшилась тільки у 3 рази. При цьому функціональна активність інтактних клітин виявилась значно підвищеною в результаті стимуляції in vitro Т-активіном. Амніоцен і біоглобін у порівнянні з Т-активіном стимулювали клітини ПЕ більш, ніж у 2 рази (р < 0.05).

Таким чином, встановлені різні протективні властивості інтактних та активованих препаратами імуноцитів в захисті від синьогнійної інфекції. Слід відмітити переважно захисну дію Т-клітин при інфікуванні тварин синьогнійною паличкою. Препарати з плаценти активізували дію усих імуноцитів, але найбільшу ефективність у захисті від синьогнійної інфекції мали тимоцити. Тимоцити, оброблені біоглобіном та амніоценом, сприяли підвищенню виживання мишей на 10 - 15 % більш, ніж тимоцити, оброблені Т-активіном.

З метою оцінки можливого впливу декаметоксину, біоглобіну та амніоцену на наслідки генералізованої синьогнійної інфекції, мишам вводили препарати за 1 - 2 доби до інфікування P. aeruginosa.

Захисний ефект декаметоксину проявлявся в діапазоні доз 10-20 мг/кг, дози вище й нижче вказаних були не ефективні (рис. І). Біоглобін та амніоцен при профілактичному введенні виявляли виражену захисну дію відносно генералізованої синьогнійної інфекції у зростаючих дозах: чим вище доза, тим більш виражений ефект, що й було доведено нами у попередніх дослідженнях in vitro (рис.2, 3).

Таким чином, декаметоксин, амніоцен та біоглобін є імунологічно безпечними і при цьому виявляють селективну дію на гуморальну та клітинну ланки імунної системи. Відсутність алергізуючих властивостей у поєднанні з нешкідливістю у декаметоксину, амніоцену та біоглобіну, підтверждують раціональність їх використання по новому призначенню в якості імуностимулюючих препаратів, що експериментально доведено на прикладі синьогнійної інфекції.

ВИСНОВКИ

З позиції мікробіології та імунології обгрунтована можливість застосування амніоцену, біоглобіну та декаметоксину в якості імуностимуляторів для профілактики і лікування експериментальної синьогнійної інфекції. Доведено, що імуностимулюючі ефекти декаметоксину в значній мірі залежать від дози.

1. Серед циркулюючих штамів P. aerugіnosa, вилучених від хворих на ГЗЗ і з об'єктів лікарняного середовища стаціонарів різного профілю м. Харкова, найчастіше зустрічаються серотипи 02, 04, 06.

2. Вилучені та охарактеризовані штами синьогнійної палички, виділені від хворих з ГЗЗ та з об'єктів лікарняного оточення у стаціонарах різного профілю, виявились стійкими до сучасних антибіотиків і лише до тієнаму, гентаміцину, амікацину, ципробаю і таривіду вони проявляють слабку чутливість. Штами Р. aeruginosa, що належать до найпоширенішого серотипу 02, виявились слабочутливими тільки до тієнаму і таривіду.

3. Антисептики і дезінфектанти, які широко використовуються в медицині, малоефективні щодо P. aeruginosa. Декаметоксин в концентрації 0,1 % проявляє високу активність щодо циркулюючих в умовах клінік псевдомонад.

4. Механізм дії декаметоксину в бактеріостатичних та бактерицидних дозах на клітини Р. aeruginosa проявляється, в першу чергу, в деструкції клітинної стінки за рахунок вилучення з її складу ліпополісахаридної фракції, а також пов'язаний з зміною проникності мембрани для низькомолекулярних сполук. Відмічено певний вплив його на клітинні процеси у ланцюгу дихання: окисного фосфорилювання, зниження активності дегідрогеназ циклу трикарбонових кислот з одночасним зниженням рівня аденозинтрифосфату в клітині.

5. Декаметоксин в дозах від 10 до 20 мг/кг, амніоцен і біоглобін в терапевтичних дозах є імунологічно безпечними, мають селективну здатність впливати на клітинну ланку імунної системи, а також чинять виразну стимулюючу дію на антитілогенез, що підтверджує їх імунотропні властивості.

6. В захисті від синьогнійної інфекції інтактні та активовані препаратами з плаценти імуноцити, трансплантовані мишам-реципієнтам, мають різні протективні властивості. Найбільшу ефективність виявляють трансплантовані тимоцити, що вказує на переважну захисну дію Т-клітин при синьонійній інфекції. Імуноцити, активовані біоглобіном та амніоценом, проявляють більш виражений захисний ефект, ніж імуноцити, активовані Т-активіном.

7. При профілактичному введенні декаметоксину в дозах від 10 до 20 мг/кг, біоглобіну та амніоцену у терапевтичних дозах відмічений певний ефект на перебіг синьогнійної інфекції в дослідах на тваринах, що і зумовлює доцільність їх використання в якості імуномодулюючих засобів.

СПИСОК ОПУБЛІКОВАНИХ ПРАЦЬ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

1. Беляевская С.Ю. Влияние декаметоксина и препаратов из плаценты на анафилактогенную активность и развитие гиперчувствительности немедленного типа // Вестник проблем биологии и медицины. – Полтава – Харьков. – 1997. - №29.- С.116-118.

2. Біляєвська С.Ю. Протективна дія препаратів із тканини плаценти людини при експериментальній синьогнійній інфекції //' Вісник фармації.- 1997.-№2.- С.117-116.

3. Беляевская С.Ю. Эффективность действия декаметоксина и препаратов из ткани плаценты человека на гуморальный иммунный ответ // Вестник проблем биологии и медицины.- Полтава-Харьков.- 1997.- № 20.- С. 59-62.

4. Изменение иммунологических показателей у больных с острыми кровоточащими язвами желудка / Зайцев В.Т., Бойко В.В., Беляевская С.Ю., Тарабан И.А., Макаров В.В. // Вісник проблем біології і медицини.-Полтава-Харків. - 1999. - №3. - С. 14-17.

5. Корекція імунного статусу у хворих на гострі виразки шлунку, ускладнені кровотечею, з використанням біоглобіна / Зайцев В.Т., Бойко В.В., Біляєвська С.Ю., Макаров В.В. // Врачебная практика. - 1999. - №6. - С. 32-35.

6. Антибиотикочувствительность штаммов возбудителей, выделенных в клиниках г.Харькова в 1990-1997гг от больных с гнойно-воспалительными процессами / Калиниченко Н.Ф., Дьяченко В.Ф., Старобинец З.Г., Марющенко А.М., Беляєвская С.Ю. // Експериментальна і клінічна медицина – 1999. - №2. - С. 61-62.

7. Беляевская С.Ю., Герман С.И. Состояние Т- и В-систем иммунитета у больных пародонтитом // Медицина сегодня и завтра. – 1997. – Вып. 2. – С. 147.

8. Спосіб лікування хворих на гострі виразки шлунку,ускладнені кровотечею / Зайцев В., Бойко В.В, Макаров В.В., Біляєвська С.Ю. // Деклараційний патент № 31867А від 15.12.00 по заявці № 98115953 .

9. Спосіб комплексного лікування пародонту / Потапова С.І., Потапов В.Ю., Герман С.І, Бєляєвська С.Ю., Соколова І.І.. // Деклараційний патент на винахід № 30696А від 15.12.2000.

10. Імунотропні лікарські засоби у комплексній терапії хронічної інфекційної патології нирок / Чернявський В.І., Лисенко А.І., Козін Ю.І., Біляєвська С.Ю. // Мікробіологія, епідеміологія та клініка інфекційних хвороб. - Харків, 1994. - С. 50-54.

11. Оценка иммунотропной активности препаратов из ткани плаценты человека / Чернявский В.И., Шитов Г.Г., Лысенко А.И., Беляевская С.Ю. // Оптимальные средства и методы иммунокоррегирующей, противовоспалительной и противомикробной терапии: Тез. докл. научно-практич. конф. - Харьков, 1993.- С. 276.

12. Применение иммунотропннх лекарственных средств при хронической инфекции патологии почек / Лысенко А. И., Чернявский В.И., Козин Ю.Г., Федец М.И., Беляевская С.Ю. // Тез. докл. научно-практич. конф. “Актуальнне вопросы микробиологии, эпидемиологии и иммунологии инфекционных болезней”. - Харьков, 1993. - С. 226.

13. Системний подход к оценке иммунного статуса больных и эффективности иммунокоррегирующей терапии / Лисняк Ю,В., Чернявский В.И., Лысенко А.И., Беляевская С.Ю., Козин Ю.И. //Идеи И.И. Мечникова в развитии современного естествознания: Тез. докл. научно-практич. конф.- Харьков, 1995.- С. 181-182.

14. Інформаційний лист № 190-94 “Способ лечения деструктивного нефротуберкулеза с применением иммуностимулятора амниоцен” / Лысенко А.И., Чернявский В.И., Козин Ю.И., Беляевская С.Ю. // Київ, 1993.

Біляєвська С.Ю. Мікробіологічне обгрунтування використання плацентарних препаратів та декаметоксину при синьогнійній інфекції. - Рукопис.

Дисертація на здобуття вченого ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 03.00.07 - мікробіологія. - Інститут мікробіології та імунології ім. І.І. Мечникова АМН України, Харків. - 2001.

Дисертацію присвячено експериментальним дослідженням, в яких обгрунтовано застосування декаметоксину та препаратів з плаценти людини – амніоцену і біоглобіну за новим призначенням в якості імуностимуляторів. Протимікробний препарат декаметоксин у дозах від 10 до 20 мг/кг, протизапальні препарати амніоцен і біоглобін є імунологічно безпечними, мають селективну здатність впливати на клітинну ланку імунної системи, а також чинять виразну стимулюючу дію на антитілогенез, що і зумовлює доцільність їх використання в якості імуномодулюючих засобів. Показана протективна роль інтактних та активованих амніоценом та біоглобіном імуноцитів при синьогнійній інфекції. Обгрунтовано ефективність використання декаметоксину, амніоцену та біоглобіну при експериментальній синьогнійній інфекції.

Ключові слова: синьогнійна інфекція, декаметоксин, амніоцен, біоглобін, імунотропні властивості.

Беляевская С.Ю. Микробиологическое обоснование применения плацентарных препаратов и декаметоксина при экспериментальной синегнойной инфекции.- Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.07- микробиология. - Институт микробиологии и иммунологии им. И.И. Мечникова АМН Украины, Харьков, 2001.

Диссертация посвящена экспериментальным исследованиям, в которых обосновано применение декаметоксина и препаратов из ткани плаценты человека - амниоцена и биоглобина в качестве иммуностимуляторов для профилактики и лечения синегнойной инфекции. Штаммы синегнойной палочки, выделенные от больных с гнойно-воспалительными заболеваниями и с объектов внешней среды в клиниках разного профиля, относятся к серотипам 02,04,06 и оказались устойчивыми ко всем исследованным антибиотикам и слабочувствительными к тиенаму, гентамицину, амикацину, ципробаю и таривиду.

Механизм действия декаметоксина в бактериостатических и бактерицидных дозах на клетки P. aeruginosa обусловлен, в первую очередь, деструкцией клеточной стенки за счёт выделения из её состава липополисахаридной фракции, изменение проницаемости мембран для низкомолекулярных соединений, лизиса протопласты.

Установлено, что противомикробный препарат декаметоксин в дозах от 10 до 20 мг/кг, противовоспалительные препараты амниоцен и биоглобин являются иммунологически безвредными, стимулируют клеточное звено иммуной системы, а также стимулируют антителогенез.

Иммуноциты, активированные in vitro препаратами из плаценты человека с последующим переносом их иммунодепрессивным реципиентам, существенно повышают выживание мышей при синегнойном сепсисе.

Установлено, что декаметоксин, амниоцен и биоглобин индуцируют неспецифическую резистентность организма при профилактическом введении животным, о чём свидетельствует их выраженный эффект в случае генерализованного синегнойного сепсиса.

Ключевые слова: синегнойная инфекция, декаметоксин, амниоцен, биоглобин, иммунотропные свойства.

Bilyaevska S.Y. Microbiological aspeсt of the problem of the effectivity of decametoxine and preparations from human's placenta tissue in experimental Pseudomonas aeruginosas Infection.- The Manuscript.

Dissertation for receiving of the candidate degree of biology on speciality 03.00.07 - microbiology.- Mechnikov Institute of Microbiology and Immunology, Kharkov, 2001.

The Dissertation dedicate in the experimental investigations in which establish before unknown's immunomodulative property of decametoxine and preparations from the human's placenta tissue - amniocen and bioglobin. Antimicrobial preparation decametoxine in the doses from 10 to 20 mg/kg, antiinflammantory preparation amniocen and biopreparation bioglobin are immunologically positive, these preparation influence on cellular immunity, stimulate production of antibodies, that prove application of its as immunostimulators. It was research the protective role of immunocytes which are intactive and activate by amniocen and bioglobines about Pseudomonas aeruginosas infection. For the first time it was found effectivity of decametoxine, amniocene and bioglobine by experimental Pseudomonas aeruginosas infection.

Key words: Pseudomonas aeruginosas infection, decametoxine, amniocene, bioglobine, immunomodulative property