АКАДЕМІЯ МЕДИЧНИХ НАУК УКРАЇНИ

ІНСТИТУТ МЕДИЦИНИ ПРАЦІ

На правах рукопису

БУНЯТЯН ЮРіК АНДРАНІКОВИЧ

УДК 543.061/063+615.9:547.7/.8+ 631.461.3+577.4+613.2+614.7

НАУКОВІ ОСНОВИ ГІГІЄНІЧНОГО МОНІТОРИНГУ ГЕТЕРОЦИКЛІЧНИХ ІНГІБІТОРІВ НІТРИФІКАЦІЇ

14.02.01 - гігієна

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня

доктора біологічних наук

Київ - 2001

Дисертацією є рукопис

Робота виконана в Науково-дослідному інституті гігієни навколишнього середовища і профілактичної токсикології (НДІГІТОКС) МОЗ Республіки Вірменія.

Офіційні опоненти:

доктор біологічних наук, ст.н.с. Александрова Л.Г., провідний науковий співробітник лабораторії аналітичної хімії та моніторингу токсичних речовин, Інститут медицини праці АМН України;

доктор медичних наук, професор Волощенко О.І., завідувач лабораторії гігієни нових хімічних матеріалів, препаратів та біомоніторингу, Інститут гігієни і медичної екології ім. Марзеєва О.М. АМН України;

доктор медичних наук, ст.н.с. Овсяннікова Л.М., провідний науковий співробітник лабораторії молекулярної біології, Інститут клінічної радіології НЦРМ АМН України.

Провідна установа: Інститут екогігієни і токсикології ім. Л.І.Медведя МОЗ України, м.Київ

Захист дисертації відбудеться 04.12.2001 р. о 14 год.на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.554.01 при Інституті медицини праці АМН України за адресою: 01033, Київ-33, вул. Саксаганського, 75.

З дисертацією можна ознайомитися в науковій бібліотеці Інституту медицини праці АМН України (01033, Київ-33, вул. Саксаганського, 75).

Автореферат розісланий 03.11.2001 року.

Вчений секретар спеціалізованої

вченої ради, канд. мед. наук А.І. Ковальова

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність проблеми. Застосування значних обсягів мінеральних добрив, зокрема азотних, окрім очевидної сільськогосподарської необхідності є і джерелом негативного впливу на навколишнє середовище і здоров'я людини. Крім несприятливих гігієнічних і природоохоронних аспектів, застосування усе більших кількостей азотних добрив невиправдане й з економічних позицій, через значні втрати і, як наслідок, невисокої їх ефективності.

Розвиток науково-технічного прогресу спричинив пошук шляхів і розробку прийомів зменшення втрат азоту добрив унаслідок процесу денітрифікації, а також частково за рахунок вимивання нітратів, підвищення ефективності застосовуваних азотних добрив, зниження рівнів нітратів у продукції сільського господарства. Пошуки увінчалися успіхом за рахунок реалізації ідеї використання з азотними добривами нового класу агрохімікатів – інгібіторів нітрифікації (ІН).

В країнах СНД протягом ряду років велись дослідження у галузі синтезу та розробки технології отримання карбаміду, модифікованого ІН. Провідним інститутом у цій галузі була Дзержинська філія ГІАП, перетворена на ДЕрЖНДІКАРБАМІДПРОЕКТ з науково-виробничим підприємством "Інаком". Роботи проводились у співдружності з ДЕрЖНДІМЕТАнолПРОЕКТ (м. Сіверодонецьк), ВО "АЗОТ" (м. Невинномиськ).

Сільськогосподарські випробування карбаміду з ІН проводились в співдружності з НДІУІФ НВО "МІНДОБРИВА", ЦИНАО та НДІГІТОКС (м. Єреван) протягом ряду років у багатьох великих господарствах різних регіонів та показали високу ефективність особливо на рисі (Українська НДС рису, Херсонська область, НДІ рису, Краснодарський край); на овочевих культурах (МолдНДІО, м. Тирасполь; ДАОС, Московська область; НДІОХ, м. Митищі, Московська область; Біл. НДІКіП, Мінська область); на баштанних культурах (НДІОБ, Астраханська область); на бавовнику (Турк. НДІП, Ашхабадський район); на злакових (Гродненський СГІ).

Однак саме застосування ІН висуває низку гігієнічних проблем з оцінки ступеня ризику, пов'язаних не тільки з токсичністю, транслокаційною, мігруючою здатністю, стабільністю в навколишнім середовищі, а й спряжених зі спрямованістю дії на природні рівноважні системи. У комплексі заходів щодо мінімізації ступеня ризику в зв'язку з використанням ІН найважливішим є розробка основ гігієнічного моніторингу цих сполук, що включає наукове обґрунтування токсиколого-гігієнічних критеріїв безпечного застосування ІН і розробку методів гарантованого контролю цих критеріїв.

Мета і задачі досліджень. Мета цих досліджень полягала в розробці наукових основ гігієнічного моніторингу деяких широко застосовуваних ІН гетероциклічного ряду з позицій їх безпечного застосування для здоров'я людини і навколишнього середовища. Досягнення поставленої мети передбачало вирішення ряду наукових і прикладних завдань по виявленню параметрів безпечного застосування ІН та їх контролю у межах, що спрямовані на регулювання якості навколишнього середовища а саме:

·

· вивчити токсичний вплив ІН похідних піразолового, триазолового, піридинового рядів і їхніх метаболітів, визначивши основні параметри токсикометрії при пероральному і перкутантном шляхах надходження в організм;

· дослідити закономірності надходження, розподілу ІН в організмі теплокровних і виведення з нього, шляхом вивчення токсикокінетики при пероральному шляху надходження;

· виявити закономірні зв'язки параметрів токсикокінетики з проявом токсичної дії;

· вивчити стабільність ІН гетероциклічного ряду в різних типах ґрунтів та гідроліз при різних умовах;

· дослідити фіто-акумуляційні і фітотоксичні властивості ІН гетероциклічного ряду щодо поставленої мети;

· вивчити міграційні властивості гетероциклічних ІН у системах "ґрунт-рослина", "ґрунт-вода", "ґрунт-повітря";

· дослідити залишки ІН у воді, ґрунті, повітрі та рослинах;

· дослідити вплив ІН на біологічну активність ґрунтів, у тому числі і з позицій процесів самоочищення;

· визначити квантово-хімічні параметри молекул досліджуваних ІН та дослідити можливості їхнього використання для виявлення залежності між структурою гетероциклічних ІН і проявом токсичної дії.

Наукова новизна результатів досліджень. Наукова новизна проведеної роботи полягає в наступному:

·

· виявлено особливості хроматографічного поводження ІН - КМП, ГММП, АТГ, НП і їхніх метаболітів МП, 6-ХПК в умовах газорідинної і тонкошарової хроматографії, визначені оптимальні умови процесів екстракції ІН з об'єктів навколишнього середовища і біоматеріалу, очищення і концентрування екстрактів, розроблені чутливі методи їхньої індикації і кількісного визначення в об'єктах навколишнього середовища, тваринному організмі, крові, сечі, калі;

· вперше визначені основні токсикометричні параметри азотовмісних гетероциклічних ІН КМП, ГММП, АТГ і метаболіту МП при пероральному шляху надходження, виявлено їхню політропну дію на організм піддослідних тварин з деякою перевагою нейротоксичної і гепатотропної дії та науково обґрунтовані нешкідливі дози ІН для людини при одноразовому і багаторазовому впливах;

· стосовно до тваринного організму обґрунтоване використання як модель, що відбиває кінетичні процеси надходження, і виведення ІН гетероциклічного ряду;

· встановлено закономірності надходження, накопичення і виведення з організму ІН, обумовлені характером гетероциклічного кільця в структурі останніх і виражені кінетичними кривими абсорбції з ШКТ і елімінації з тваринного організму; розраховано ряд токсикокінетичних параметрів при пероральному надходженні ІН, що дозволяють оцінювати біоконцентрації і токсичну дію;

· виявлені й описані закономірності розкладу ІН піразолового і триазолового рядів у ґрунті в залежності від структури і типів ґрунтів; обґрунтовано використання встановлених закономірностей як моделі процесів деструкції ІН у грунті, що зіграло пріоритетну роль у дослідженні подальших процесів міграції ІН;

· охарактеризовано закономірності міграції ІН у навколишньому середовищі (повітря, вода, рослина), що використані при обґрунтуванні відповідних гігієнічних регламентів;

· науково обґрунтовано максимально допустимі рівні (МДР) ІН піразолового і триазолового рядів у харчових продуктах ;

· вивчено взаємовплив ІН і водного середовища в залежності від рН і температури, що дозволило науково обґрунтувати гранично допустимі концентрації (ГДК) ІН у воді водойм;

· виявлено однотипність метаболізму ІН у ґрунті, воді, тваринному організмі і можливість утворення як у тваринному організмі, так і в об'єктах навколишнього середовища їхніх токсичніших метаболітів;

· встановлено деякі квантово-хімічні параметри молекул ІН піразолового, триазолового і піридинового рядів, отримано їхні молекулярні діаграми, обґрунтовано можливість застосування методу квантово-хімічних розрахунків і його перспективність у прогнозуванні ступеня токсичності гетероциклічних ІН та їхніх деяких фізико-хімічних властивостей;

· обґрунтовано деякі доповнення до методичних підходів гігієнічної регламентації ІН у ґрунті, з огляду на вибірковість дії на процеси нітрифікації.

Теоретична і наукова цінність роботи:

·

· теоретично описані та підтверджені експериментально моделі прогнозу токсичної дії на організм теплокровних за токсикокінетичними параметрами та квантово-хімічними характеристиками структури молекул гетероциклічних ІН – похідних піразолу, триазолу, піридину та їх метаболітів;

· встановлено перспективність використання методів квантово-хімічних розрахунків у токсиколого-гігієнічних дослідженнях під час аналізу зв'язку "структура-токсичність" гетероциклічних азотовмісних сполук, що особливо актуально при направленому пошуку структур з заданими властивостями;

· виявлені особливості хроматографічної поведінки вивчених молекул ІН, їхні фізико-хімічні властивості покладені в основу вибору оптимальних умов екстракції проб та схеми аналітичного визначення ІН – похідних піридину, піразолу, триазолу в об'єктах довкілля та біологічному матеріалі;

· обґрунтовано використання для гігієнічної характеристики поведінки ІН в навколишньому середовищі моделі деструкції ІН у ґрунті, що включало залежність від структури сполуки та типів ґрунтів, міграції їх у суміжні середовища, с урахуванням вибірковості дії ІН на активність ферментів азотного обміну у ґрунті, а також показники відновлення активності ферментів нітрифікації.

Практичне значення роботи. Результати проведених досліджень дозволили:

·

· видати токсикологічні паспорти ІН КМП, ГММП, АТГ для включення їх у ТУ з виробництва зазначених ІН;

· обґрунтувати гігієнічні нормативи ІН КМП (МП), ГММП, АТГ у повітрі робочої зони, у воді водойм, у продукції рослинного походження;

· запропонувати методики визначення ІН у біосубстратах теплокровних і деякі токсикокінетичні параметри для використання в клінічній практиці при діагностиці отруєнь, а також при прогнозуванні клініки отруєнь;

· видати висновки про можливість практичного застосування КМП, ГММП, АТГ разом з азотними добривами;

· рекомендувати кількісні характеристики токсиколого-гігієнічних показників ІН як систему критеріїв гігієнічного моніторингу ІН, що забезпечують їхнє безпечне застосування в сільському господарстві і контролюється розробленими методами.

Апробація результатів роботи. Основні положення і результати досліджень повідомлені й обговорені: на Вченій Раді НДІ гігієни навколишнього середовища і профілактичної токсикології (НДІГІТОКС) МОЗ РВ (2001 р., пр. №1); 1 з'їзді республіканського товариства токсикологів (Єреван, 1986 р.); Всесоюзній нараді "Перспективи використання ІН для підвищення ефективності азотних добрив" (ВО СОЮЗОСНОВХИМ, НИУИФ, Москва, 1986 р.); Всесоюзному науковому симпозіумі "Деградація пестицидів при комплексному захисту сільськогосподарських культур від шкідливих організмів" (ВАСХНИЛ, ВИЗР, Ленінград, 1990 р.); Всесоюзній конференції "Актуальні питання токсикології і гігієни застосування пестицидів і полімерних матеріалів у народному господарстві" (ВНДІГІНТОКС, Київ, 1990 р.); Всесоюзній конференції "Застосування ІН для підвищення ефективності азотних добрив "(НИУИФ, Москва, Самарканд, 1990 р.); республіканській конференції "Сучасні проблеми гігієни навколишнього середовища й охорони здоров'я населення "(МОЗ РВ, НДІГІТОКС, Єреван, 1994 р.); республіканській конференції в галузі технології заготівель "Сучасний стан і перспективи розвитку науково-дослідних робіт" (МСХ і Заготівель РА, Вірменська Сільськогосподарська Академія, Вірменська Політехнічна Академія, НП і Проектне Держпідприємство "ПАРЕНИЙ", Єреван, 1996 р.); II республіканської наукової конференції "Забруднення харчових продуктів біотичними й абіотичними контамінантами" (ЕГУ, Національна Академія Наук РВ, НП і Проектне Об'єднання "ПАРЕНИЙ", Єреван, 1996 р.); науково-практичної міжнародної конференції "Актуальні проблеми екогігієни і токсикології" (МОЗ України, Інститут екогігієни і токсикології ім. Л.І. Медведя, Київ, 1998 р.); матеріали дисертації представлені у вигляді обґрунтувань гігієнічних нормативів, повідомлені, обговорені і прийняті на засіданнях Комітету з гігієнічної регламентації застосування пестицидів при Головному санепідуправлінні МОЗ СРСР (Єреван, 1987 р., Київ, 1992 р.); методи визначення препаратів в об'єктах навколишнього середовища і біоматеріалі, оформлені у вигляді методичних вказівок, за завданням Групи експертів "Державної комісії з боротьби зі шкідниками, хворобами рослин і бур'янами" при МСХ СРСР апробовані практичними службами і фахівцями інститутів гігієнічного профілю, а потім разом з рецензіями обговорені і ухвалені на поточних засіданнях; результати досліджень, наведені в річних заключних звітах, рецензовані НДІ сфери інтересів Проблемної комісії АМН СРСР "Наукові основи гігієни і токсикології пестицидів, полімерів і пластичних мас".

Особистий внесок автора у виконання дисертаційної роботи. Тема дисертаційної роботи запропонована автором, план та анотація якої затверджені на Вченій Раді ВНДІГІНТОКС (м. Київ, пр. № від 28.03.86). переважна частина роботи виконана особисто автором на базі керованої ним лабораторії аналітичної хімії та метаболізму хімічних речовин (НДІГІТОКС МОЗ РВ), безпосередньо брав участь у проведенні токсикологічних та гігієнічних експериментальних досліджень за темою дисертації. Автором створені різні установки, моделі та пристрої, що забезпечили проведення досліджень на високому науково-методичному рівні.

Особисто систематизував, проаналізував, теоретично узагальнив наукові результати всіх розділів дисертації, сформулював основні висновки.

Брав участь у підготовці методичних вказівок та рекомендацій з безпечного використання ІН та їхнього впровадження в практику.

Публікація результатів досліджень. За результатами досліджень опубліковані 43 наукові праці, у тому числі 2 авторські посвідчення.

Основні положення, що виносяться на захист.

1. Комплексна система пріоритетних критеріїв гігієнічного моніторингу нової групи агрохімікатів – гетероциклічних ІН (похідних піразолу, триазолу, піридину), яка включає кількісні токсиколого-гігієнічні характеристики ІН (гігієнічні нормативи, параметри токсикометрії та токсикокінетики) і показники, що характеризують поведінку ІН в об'єктах довкілля (ґрунт, вода, рослини, повітря) забезпечує їх безпечне застосування.

2. Розроблені методи ідентифікації та кількісного визначення азотовмісних ІН гетероциклічного ряду та їхніх деяких метаболітів у повітрі, воді, ґрунті, рослинному матеріалі та біологічних середовищах (кров, сеча, тканини внутрішніх органів) придатні для гігієнічного та біологічного моніторингу ІН.

3. Одночастинна математична модель, що відбиває кінетичні процеси надходження та виведення ІН гетероциклічного ряду з організму придатна для розрахунків токсикокінетичних параметрів, тісно пов'язаних з показниками токсичності та картиною її прояву.

4. Модель деструкції ІН у ґрунті, кількісні характеристики процесів відновлення активності ферментів нітрифікації, з урахуванням вибірковості дії ІН на азотний обмін ґрунту можуть слугувати основними гігієнічними критеріями дії ІН, включаючи їхню міграцію в довкілля.

5. Значимість та перспективність методу квантово-хімічних розрахунків у токсиколого-гігієнічних дослідженнях під час аналізу зв'язку "структура-токсичність", у прогнозі ступеня токсичності гетероциклічних азотовмісних ІН та їхніх деяких фізико-хімічних властивостей.

Структура й обсяг роботи. Дисертаційна робота викладена на 290 сторінках тексту. Складається з вступу, шести глав, заключної частини, висновків, практичних рекомендацій, включає 21 таблицю, 46 рисунків, список використаної літератури, що містить 291 найменування, у тому числі 64 закордонних. Є додаток, що містить 113 таблиць.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Проведений критичний аналіз наявних ліитературних даних з проблеми дозволив обгрунтувати основні напрямки досліджень.

Об'єкти і методи досліджень. Об'єктами досліджень були похідні піразолу – 1-карбамоїл-3(5)-метилпіразол (КМП), N-гідроксиметил-3(5)-метилпіразол (ГММП), їхній метаболіт – 3(5)-метилпіразол (МП); триазолу – 4-аміно-1,2,4-триазол (АТГ); піридину – 2-хлор-6-(трихлорметил) піридин (синонім – нітрапірин) (НП) і його метаболіт – 6-хлорпиколиновая кислота (6-ХПК), рекомендовані як ІН.

Наведено фізико-хімічні властивості досліджуваних ІН і можливих продуктів їхнього перетворення. Обговорено та обгрунтовано необхідні методи і принципи дослідження, сформульовано необхідні умови експериментів, вимоги до реактивів і матеріалів, приладів й апаратури.

Для аналітичного контролю за вмістом досліджуваних речовин розроблялися методики хроматографічного аналізу (тонкошарова хроматографія – ТШХ, газорідинна хроматографія - ГРХ) азотовмісних гетероциклічних ІН у повітрі, воді, ґрунті, рослинному матеріалі і біосубстратах експериментальних тварин (печінка, нирки, легені, серце, селезінка, мозок, кров, сеча, кал) з використанням вітчизняних й закордонних матеріалів, реактивів, устаткування, приладів (газовий хроматограф "Цвет-106", спектрофотометри СФ-26, Спекорд М40, UR-20 та інші).

Для визначення ступеню небезпеки нових ІН проведено токсикологічні експерименти: визначено параметри токсикометрії і виявлено характер токсикодинаміки; досліджено вплив КМП, МП, ГММП, АТГ на організм теплокровних при одноразовому, багаторазовому впливі та у хронічному 9-ти місячному експерименті. Експерименти проведені на білих безпородних щурах, мишах і кроликах. У статистично порівнюваних групах узяті 6-10 тварин. Токсичність ІН визначалася для білих щурів і мишей при введенні в шлунок і нанесенні на шкіру. Показниками токсичності слугували виживаність тварин, їхня поведінка, загальний стан, маса тіла, час появи клінічних симптомів інтоксикації і настання летального результату. Основним критерієм оцінки токсичної дії при одноразовому введенні препаратів у шлунок є середньосмертельна доза (ЛД50), що розрахована по методу пробіт-аналізу (Прозоровский В.Б., 1962).

Кумулятивні властивості ІН вивчені при щоденному введенні сполук у шлунок тварин у дозах 1/10, 1/20 і 1/50 від ЛД50. Досліджувався також вплив ІН (у дозах 1/100, 1/1000, 1/10000 від ЛД50) на організм теплокровних у хронічних 9-ти місячних експериментах.

При підборі показників для оцінки функціонального стану піддослідних тварин, на яких чинили вплив ІН, і з'ясування деяких сторін механізму їхньої токсичної дії виходять з наявних у літературі даних про характер впливу на теплокровних тварин деяких фрагментарних структурних аналогів ІН, а також даних, отриманих при гострій токсичності сполук. У ході виконання досліджень використано комплекс різних токсикодинамічних методів дослідження з залученням широко застосовуваних біохімічних, морфологічних та інших тестів і показників. При цьому враховувалися динаміка маси тіла тварин, коефіцієнти маси внутрішніх органів і головного мозку, стан морфологічного складу периферичної крові. Синтетична здатність печінки контролювалася вивченням змісту загального білка і білкових фракцій (Дыбин А. Л., 1974). Функціональний стан печінки контролювався також за активністю трансаміназ за методом Райтмана і Френкеля, вмісту сечовини в сироватці крові – за Крокером та ін.; знешкоджуюча функція печінки оцінювалася за тривалістю гексеналового сну (Кост Е.У., 1975). Функціональний стан нирок оцінювали за добовим діурезом, відносній густині сечі (рефрактометричний метод), вмісту сечовини в сечі за Крокером та ін. Функціональний стан ЦНС оцінювався за здатністю щурів підсумовувати підпорогові електричні імпульси (Сперанский B.C., 1965) і за умовними оборонними рефлексами (Хелми P.M., 1965).

Проведені патоморфологічні дослідження внутрішніх органів і головного мозку експериментальних тварин, на яких чинився одноразовий і багаторазовий вплив ІН.

Для з'ясування процесів переміщення і метаболізму ІН в організмі і зіставлення концентрацій з відповідними токсичними ефектами вивчали токсикокінетику ІН у дослідах in vivo. Досліджували біосередовища – тканини внутрішніх органів тварин – печінки, нирок, легень, серця, селезінки, мозку, а також кров, сечу, кал. Біологічні середовища аналізували на вміст ІН і їхніх метаболітів методами ТШХ, ГРХ, розробленими нами. Результати досліджень оброблялись методами математичної статистики. Вірогідність результатів визначалася при P<0,05 за допомогою критеріїв Ст'юдента і Фішера. У досвідах in vivo використовувалися дози 1/2, 1/5, 1/10 від ЛД50 при пероральному введенні. Біосередовища аналізувалися після введення ІН до негативного результату. У кожній з експозицій для кожної дози і кожного ІН досліджувався усереднений біоматеріал групи тварин з 6 особин. Для опису динаміки концентрацій ІН в організмі обрана одночастинна математична модель (кров) токсикокінетики при позасудинному шляху введення (Голубев А. А., Люблина Е.И., Толоконцев Н.А., Филов В.А., 1973; Холодов Л.Е., Яковлев В.П., 1985).

З огляду на специфіку застосування ІН при експериментальних модельних і натурних дослідженнях, пов'язаних з вивченням поведінки ІН в об'єктах навколишнього середовища, "базовим" середовищем обрано ґрунт, як основний об'єкт забруднення. Всі ж інші середовища розглянуті в зв'язку з можливою міграцією ІН із ґрунту. Через це дослідження виконані згідно з вимогами і методичними прийомами, укладеними у відповідних посібниках і рекомендаціях з вивчення екзогенних хімічних речовин у ґрунті (Гончарук Е.И., Сидоренко Г. И., 1982; Галстян А.Ш., 1978).

Лабораторні дослідження проведені на природних типах ґрунтів: чорноземах Вірменії, сіроземах Узбекистану, дерново-підзолистих ґрунтах Московської області. На цих типах ґрунтів у модельних умовах вивчена стабільність ІН, фіто-акумуляційні і фітотоксичні властивості, водно-міграційні, повітряно-міграційні, загальносанітарні показники.

Вивчення впливу ІН на органолептичні властивості і санітарний режим модельних водойм проведено за загальноприйнятими методами (Минх А.А., 1973). Стійкість ІН у воді модельних водойм, а також гідроліз при різних умовах (t°C,вивчені загальноприйнятими кінетичними методами досліджень.

Проведені натурні гігієнічні дослідження з визначення залишкових кількостей ІН у ґрунті, воді водойм, дренажних водах, воді рисових чеків, рослинності, харчових продуктах рослинного походження, а також дослідження харчової цінності останніх. Паралельно проводилося визначення нітратів у тих же зразках методом "сухого відновника" і для порівняння іон-селективним методом.

Добір зразків у різних кліматогеографічних зонах здійснювався за загальноприйнятою методикою (Унифицированные правила отбора проб сельскохозяйственной продукции, продуктов питания и объектов окружающей среды для определения микроколичеств пестицидов. МЗ СССР, ГСЭУ, Москва, 1980).

Усі дослідження з визначення залишкових кількостей або концентрацій ІН проведені розробленими нами методами, що одержали офіційне визнання.

У зв'язку зі специфікою дії ІН велика увага приділена дослідженню загальносанітарного показника шкідливості, що характеризує вплив хімічної речовини на здатність ґрунту до самоочищення, і його біологічну активність, особливо на активність ферментів азотного обміну, зокрема, оксидаз і редуктаз азотного обміну, що беруть участь у здійсненні процесу нітрифікації.

Проведено деякі розрахунки електронних параметрів молекул досліджуваних ІН із застосуванням обчислювальної техніки і стандартних квантово-хімічних програм методом MNDO (Dewar M.J.S., Thiel W., 1977).

Отримані результати досліджень використані при нормуванні ІН в об'єктах навколишнього середовища відповідно до принципу комплексного нормування (Методические указания по гигиенической оценке новых пестицидов. МЗ СССР, ВНДІГІНТОКС, Киев, 1988).

Експериментальні дані статистично оброблені за загальноприйнятими методами (Беленький М.Л., 1963; Соловьева Т. В., Хрусталева А. А., 1974; Булатов М.И., Калинкин И.П., 1976; Доерфель К., 1994).

Програма досліджень і аналіз отриманої інформації базується на таких теоретичних принципах і закономірностях: теорії міжмолекулярної взаємодії; принципах пороговості всіх типів дії хімічних сполук на цілісний організм з урахуванням необхідності комплексного підходу до встановлення порогів шкідливої дії; загальних закономірностях, що обумовлюють надходження, розподіл, перетворення і виділення отрут з організму теплокровних; кінетики поведінки органічних речовин у відкритій системі; закономірностях кругообігу речовин у природі і процесів саморегуляції біологічних систем організмового, популяційного і біоценологічного рівнів; принципах комплексного нормування; принципах квантово-хімічних підходів до проблеми будова-активність; закономірностях зв'язку будови хімічних речовин та їхньої токсичної дії; принципах пріоритетності медичних і природоохоронних показників перед технічною досяжністю сьогоднішнього дня й іншими техніко-економічними критеріями.

РОЗРОБКА МЕТОДІВ ВИЗНАЧЕННЯ МІКРОКІЛЬКОСТЕЙ ІНГІБІТОРІВ НІТРИФІКАЦІЇ І ЇХНІХ ДЕЯКИХ ПРОДУКТІВ ПЕРЕТВОРЕННЯ В ОБ'ЄКТАХ НАВКОЛИШНЬОГО СЕРЕДОВИЩА І БІОМАТЕРІАЛІ

Для визначення ІН розроблялися методи газорідинної хроматографії (ГРХ) та тонкошарової хроматографії (ТШХ), тому що саме ці методи забезпечують високі межі виявлення і вибірковість аналізу досліджуваних сполук.

Під час розробки хроматографічного методу аналізу досліджуваних ІН у тонкому шарі значна увага була звернена на вивчення хроматографічної поведінки останніх залежно від будови, природи рухомого розчинника й адсорбенту, детектування цих сполук на пластинці. Вивчення цих питань дозволило встановити оптимальні умови хроматографічного поділу, ідентифікації ІН і продуктів їхнього перетворення.

Результати власних досліджень показали, що з числа універсальних найпридатнішими для КМП, МП, ГММП, АТГ є проявники на основі діазотованої сульфанілової кислоти (реактив Паулі) і йод-крохмальний реактив після галогенування. Необхідною умовою виявлення цих сполук зазначеними проявниками є попереднє УФ-опромінення пластинок з пробами. Для виявлення нітрапірину (НП) найбільш чуттєвим виявився ацетоновий розчин аміакату срібла, а для його метаболіту (6-ХПК) водяний розчин аміакату срібла, у зв'язку з чим спільне визначення НП і 6-ХПК на одній пластинці виявилося неможливим.

На підставі об'єктивних критеріїв поділу, застосовуваних у хроматографії, для ефективного поділу в тонкому шарі сорбенту рекомендовані такі системи рухливих розчинників: при визначенні КМП і МП – гексан-ацетон (1:1) чи хлороформ-ацетон (2:1); ГММП – гексан-ацетон (5:3) чи хлороформ-ацетон (2:1); АТГ – 80% водний етанол, тобто в порядку зменшення рухливості вони розташовуються в ряді КМП>МП = ГММП>АТГ і спільне визначення цих сполук неможливе (виняток КМП і МП).

Як рухлива фаза при визначенні НП рекомендована система гексан-ацетон (10:1), а 6-ХПК – бензол-оцтова кислота (1:1).

З метою вибору оптимальних умов ГРХ поділу і визначення ІН використані різні детектори (ДЕЗ, ТІД, ДІП) і нерухомі фази різної полярності: ХЕ-60, верзамід 900, OV-17, FFAP, апієзон L, SE-30, нанесені на хроматон-N-AW-HMDS, хромосорб G, інертон-супер. Застосовуваними детекторами і наповнювачами АТГ і 6-ХПК, навіть при високих температурах, детектуються з дуже низькою чутливістю. Очевидно, недостатня леткість цих сполук не дає можливості визначити їх методом ГРХ. Застосування ж реакційної хроматографії ускладнювало методики й через значні втрати не давало можливості вийти на чутливість, здатну забезпечувати контроль гігієнічних нормативів.

Із застосованих детекторів при визначенні МП, КМП, ГММП найбільш чутливим зарекомендував себе ТІД. Однак при хроматографуванні КМП і ГММП отримані результати не мали закономірної відтворюваності. Як правило, результатом було визначення МП, тобто відбувалося розкладання КМП і ГММП на МП. У зв'язку з цим визначення КМП і ГММП у такому вигляді методом ГРХ стає неможливим, однак з'являється можливість визначення цих сполук у вигляді МП, розклавши їх цілком. Розкладання можна проводити до введення в прилад чи у самій колонці. Для останнього поряд з високою температурою термостату колонок, необхідний ще і луг у складі наповнювача колонок. Поряд з перевагами подібного підходу є і недоліки – виключається диференціація МП і КМП, МП і ГММП за їхньої спільної присутності, що з гігієнічних позицій має визначені складності через різну токсичність сполук (ЛД50 МП< ЛД50 КМП< ЛД50 ГММП). Разом з тим, оцінка благополуччя середовища об'єкта за токсичнішим продуктом перетворення є підходом, широко здійснюваним у гігієні. Отже, в перспективі цей методичний прийом може бути використаний не тільки при визначенні МП, але і відповідній оцінці середовища за МП, що утворюється при розкладанні КМП чи ГММП. З цією метою рекомендовані колонки з 5% верзаміду 900 на хроматоні-N-AW-DMCS з 20% гідроксиду калію; 5% апієзона L на інертоні AW-DMCS з 20% їдкого калі; 2% FFAP на хромосорбі G. Необхідно додати, що на останній колонці досягається той же ефект повного перетворення як КМП, так і ГММП у МП, незважаючи на те, що гідроксид калію не застосовується.

При визначенні НП найбільш чуттєвим виявився детектор постійної швидкості рекомбінації (ДПР – варіант ДЕЗ), а задовільний поділ на колонці з неполярною нерухомою фазою SE-30.

Для оцінки ефективності поділу на всіх зазначених колонках використані об'єктивні критерії поділу застосовувані в хроматографії: число теоретичних тарілок, висоту еквівалентну теоретичній тарілці, утримуваний обсяг, відносний утримуваний обсяг, коефіцієнт поділу.

Найбільш оптимальними екстрагентами ІН з об'єктів дослідження виявилися для витягу піразолів – хлороформ, триазолу – вода, ацетон, етанол, піридинових похідних – хлороформ, етилацетат. Для очищення екстрактів використовувалися: очищення кислотою; колонкове очищення з АВ-17-8, основним оксидом алюмінію, почерговими шарами сорбентів; розподіл між двома незмішуваними рідинами; кислотно-лужне очищення.

Концентрування екстрактів велося при встановлених експериментально температурах: КМП, МП, НП – не вище 40°С, ГММП – не вище 30°С, 6-ХПК – не вище 60°С, АТГ – не вище 80°С. Знайдені умови екстракції, очищення екстрактів, хроматографічного поділу покладені в основу методик визначення МП, КМП, ГММП, АТГ, НП, 6-ХПК у повітрі, воді, ґрунті, рослинному матеріалі, продукції сільського господарства і біосубстратах експериментальних тварин.

Під час розробки методик для кожного ІН для всіх типів проб, що аналізувалися (повітря, вода, ґрунт, біологічні субстрати, харчові продукти) експериментально встановлені та розраховані метрологічні характеристики визначена межа кількісного визначення, середнє значення визначення, стандартне відхилення, довірчий інтервал середнього значення визначення (n=20-25, P=0,95), відносне стандартне відхилення. У модельних дослідах проведено більше 1500 вимірів заданих масових концентрацій (мг/дм3, мг/м3) або масових часток (мг/кг) сполук, що визначались. Межі кількісного визначення не перевищували половини гігієнічного нормативу, середнє значення визначення в залежності від матриці, що аналізується, коливалось в межах 80-95%, довірчий інтервал середнього значення визначення в межах 2-8%, що відповідає вимогам санітарного контролю, що проводиться в рамках гігієнічного моніторингу.

ТОКСИЧНИЙ ВПЛИВ ІНГІБІТОРІВ НІТРИФІКАЦІЇ КМП, ГММП,

АТГ, НП І ЇХ МЕТАБОЛІТІВ МП, 6-ХПК НА ОРГАНІЗМ ТЕПЛОКРОВНИХ

Вивчення токсичних властивостей ІН при одноразовому пероральному введенні проводилося на щурах і мишах. Оскільки ІН у сільському господарстві рекомендовані до застосування як окремо, так і в суміші з карбамідом, були визначені також деякі параметри токсичності цих сумішей.

У таблиці 1 наведені деякі параметри токсичності ІН при пероральному надходженні, там же наведені для порівняння літературні дані аналогічних досліджень НП і 6-ХПК (Сов. - амер. симпозиум, Ташкент, 1980; Барсельянц Г.Б., 1981; Асланян Г.Ц., 1982).

Досліджувані сполуки є малотоксичними для щурів і мишей, за винятком метаболіту МП і ГММП, які є середньо токсичними для мишей. Експериментальні миші до МП і ГММП виявляють виражену видову чутливість, коефіцієнт якої складає 4,2 і 5,3 відповідно. Усі вивчені сполуки і їхні суміші з карбамідом відносяться до III класу небезпеки.

ІН не виявляють місцево-подразнюючої та резорбтивно-токсичної дії при одноразовому і багаторазовому нанесенні на шкіру експериментальних тварин.

Внесення ІН, а також сумішей з карбамідом у кон'юнктивальний мішок ока кроликів, показало, що через 3 години після контакту зі слизовими очей вони викликали незначне подразнення, сльозотечу, розширення зіниці. Ознаки подразнення зникали через 2-3 доби після внесення. Виняток становлять МП і ГММП, що викликають різке подразнення слизової очей з подальшим утворенням більма.

Клінічна картина інтоксикації піддослідних тварин у гострому експерименті виявляється вже через годину після введення сполук у шлунок, а загибель настає в основному в перші 3 доби, тоді як у випадку НП подібні явища настають трохи пізніше, що корелює зі швидкостями процесів абсорбції й елімінації.

Для встановлення дії ІН і термінів прояву його на деякі фізіологічні функції при одноразовому введенні препарату в шлунок, випробувано дози, що дорівнювали 1/5, 1/10, 1/20, 1/50 і 1/100 від ЛД50, при яких визначалися і граничні дози. Виявлено зміни в досліджуваних показниках при дії граничних і діючих доз, що реєструються як визначені функціональні зміни вже через 1-2 години після введення препаратів, дозволили при вивченні кінетики надходження в кров і виведення препаратів визначити значимі терміни добору біоматеріалу. Крім гострих дослідів, проведено токсикологічні дослідження при повторних (4 місяці) і хронічних (9 місяців) впливах досліджуваних сполук на організм піддослідних тварин.

Як 4-місячні підгострі (у дозах 1/10, 1/20, 1/50 від ЛД50), так і 9-місячні хронічні експерименти (у дозах 1/100, 1/1000, 1/10000 від ЛД50) показали, що протягом зазначених термінів загибель піддослідних тварин не спостерігалась, тобто за усталеною гігієнічною класифікацією (Медведь Л. И., 1974) у досліджуваних сполук кумулятивні властивості виражені слабко (коефіцієнт кумуляції більше 5). Разом з тим, при зазначених умовах введення сполук в організм відзначені зміни деяких фізіологічних і біохімічних показників стану організму (сумаційно-пороговий показник, морфологічна картина периферичної крові, антитоксична і синтетична здатність печінки, деякі показники, що характеризують функціональний стан нирок тощо), що

Таблиця 1

Деякі параметри токсичності ІН при їх одноразовому

пероральному надходженні в організм теплокровних

ІН Максимально переносима доза, мг/кг Абсолютно смертельна доза, мг/кг ЛД50, мг/кг Терміни загибелі, діб КВЧ Поріг гострої дії (щурі) мг/кг (доза від ЛД50) Зона гострої дії

щурі миші щурі миші щурі миші щурі миші щурі миші

МП КМП ГММП АТГ НП 6 – ХПК 800 600 1000 8000 2000 500 50 600 50 10000 400 300 200 2000 2000 20000 4500 3000 500 1800 600 14000 1600 1800 1000±115 1280±129 1650±137 13600±1159 3675±243 1487±143 2830±150* 240±12 1040±110 310±33 11680±444 1114±91 777±112 1-3 1-3 1-3 2-3 3-7 1-3 1-3 1-3 1-4 2-3 2-6 1-4 - - - - - - 4,2 1,2 5,3 1,2 3,3 1,91 10(1/100) 64(1/20) 33(1/50) 1360(1/10) 50 (1/100) 30 (1/100) 100 (широка) 20 (середня) 50 (широка) 10 (вузька) 74 (широка) 94 (широка)

*- дані ДАУ КЕМІКЛ (США)

свідчить про функціональну кумуляцію ІН.

Аналіз результатів біохімічних, фізіологічних, морфологічних та інших досліджень показав, що досліджувані сполуки чинять загальнотоксичну дію на організм піддослідних тварин, що виражається впливом на ЦНС (пригнічення нервово-м'язової збудливості); на печінку (зміна білковотворної, антитоксичної функцій); на активність деяких ферментів переамінування; на деякі показники морфологічної сполуки периферичної крові тощо. Подібний вплив досліджуваних ІН на функціональний стан піддослідних тварин, а також результати аналізу з їхнього визначення у внутрішніх органах, системах і головному мозку свідчать про політропність досліджуваних сполук, з деяким переважаючим нейротоксичним і гепатотоксичним ефектом впливу, а за характером своєї дії – тих, що мають слабко виражену функціональну кумуляцію.

Для опису динаміки концентрацій ІН в організмі обрана одночастинна модель токсикокінетики, де як єдина частина взята її центральна частина – плазма крові. Одначе модель ускладнена тим, що обрано позасудинний шлях введення ксенобіотика, тобто враховується процес усмоктування (абсорбції, k – константа абсорбції). Ця модель найпростіша й поруч з іншими спрощеннями передбачає ще одне – організм єдине ціле і зменшення концентрації препаратів у крові описується за допомогою однієї константи швидкості – константи елімінації (к).

Розв'язання рівнянь процесів абсорбції, елімінації, а також рівняння сумарного процесу, що описує поведінку речовини в однофазній біологічній системі за умови експоненційного надходження до системи відомої дози речовини і одночасного видалення цієї дози зводиться до визначення двох констант – k і K, що і визначено для кожної речовини експериментально. Дослідження проведені з використанням трьох доз для кожного ІН (1/2, 1/5, 1/10 від ЛД50). На підставі проведених досліджень побудовані графіки залежності "концентрація-час" визначений час напівнасичення (напівабсорбції) і напіввиведення (напівелімінації), а потім і відповідні константи k і K, що дозволили вивести криві процесів абсорбції й елімінації. Сумарний процес відображений, як приклад, графіками на рис.1 (доза 1/2 від ЛД50).

Константи абсорбції й елімінації дозволили обчислити час досягнення найбільшого вмісту речовини в крові (для одночастинної моделі – у всьому організмі), а також розрахункову величину найбільшого зростання вмісту речовини в крові (у випадку одночастинної моделі – в організмі). Порівняння деяких розрахункових і реальних токсикокінетичних параметрів дозволило виявити ті реальні дози препарату, що абсорбувалися в кров, і дати уявлення про біодоступність препаратів (табл. 2). Як показали результати досліджень з токсикокінетики досліджуваних ІН усмоктуваність і виведення препаратів зростає в такому ряді: НП< ГММП< КМП< АТГ, біодоступність же зростає в ряді НП<АТГ< ГММП< КМП. Встановлено зв'язок між дозою препаратів і часом токсичної дії, що дозволило розрахувати час біологічної дії; у розрахунках використали як межі зниження – порогові дози гострої дії препаратів (табл. 3).

Клінічна картина гострої інтоксикації ІН в основному однотипна і прямо корелює з виявленими токсикокінетичними параметрами.

З огляду на кінетику процесів абсорбції й елімінації ІН гетероциклічного ряду, можна вважати, що накопичення самих ІН в організмі теплокровних малоймовірне, тобто можна стверджувати про

відсутність матеріальної кумуляції, однак виявлено деяке підсумовування зроблених ними змін, що свідчить про слабковиражену функціональну кумуляцію.

ПОВЕДІНКА ІНГІБІТОРІВ НІТРИФІКАЦІЇ

КМП, ГММП, АТГ, НП У ҐРУНТІ І ДЕЯКИХ ОСНОВНИХ ОБ'ЄКТАХ НАВКОЛИШНЬОГО СЕРЕДОВИЩА

Винятково важливим є вивчення поведінки ІН у ґрунті і вплив на різні види живих організмів, їхня трансформація під дією ґрунтових і інших факторів, а також міграційні можливості в контамінуючі з ґрунтом середовища.

Для характеристики деструкції ІН використані такі показники: константа швидкості розкладання, період напівзникнення, період майже повного зникнення. При цьому в динаміці виявляються і метаболіти (табл. 4-6).

На підставі отриманих даних щодо стійкості в ґрунті залежно від величин Т50 і Т99 КМП, ГММП, НП віднесені до малостійких сполук, а АТГ до стійких сполук.

Для вивчення фіто-акумуляційних властивостей ІН застосовувалися біологічний тест на проростання насінь і досліди з проростками. Показниками впливу досліджуваних ІН були сходження насіння (%), довжина коренів проростків, довжина проростків. Пріоритет був відданий насамперед негативному впливу на корені проростків, тобто гальмування їхнього розвитку. У такий спосіб були випробувані ячмінь, пшениця, кукурудза, рис, горох, огірок, редис, буряк, васильок, цибуля. Результати досвідів показали відсутність фітоцидної та фітотоксичної дії ІН. Усі випробувані дози ІН, що перевищували рекомендовані в 2, 4, 10 разів, не чинили негативного впливу на схожість насінь і на загальний розвиток рослин. Важливим доповненням є вивчення транслокації ІН у рослину з ґрунту. При цьому гігієнічну значимість набувають визначення залишкових кількостей (ЗК) ІН, якість вирощеної продукції, що включає і визначення вмісту нітратів. На предмет визначення ЗК ІН і їхніх метаболітів, а також нітратів, аналізу підлягали понад 2000 зразків, у тому числі рису (зерно, рослина, корені), картоплі, огірків, томатів, капусти, буряка, моркви, дині, кавуна, шпинату, цибулі та інші сільськогосподарської продукції,Таблиця 2

Деякі кінетичні константи та розрахункові характеристики процесів

абсорбції та елімінації КМП, ГММП, АТГ, НП в організмі теплокровних

Сполука Період напівабсорбції (напівнасичен-ня), години Період напівелімінації (напіввиведен-ня), години Константа швидкості абсорбції, k, год-1 Константа швидкості елімінації, К, год-1 Час досягнення максимальної концентрації препарату в крові, tmax, год. Біодоступ-ність препарату, f Розрахунковий час виведення препаратів у гострому експе-рименті, год.

КМП 0,8 9,20 0,87 0,08 3,02 0,01021 12,53

ГММП 1,7 12,70 0,41 0,05 5,84 0,00697 20,05

АТГ 0,4 3,22 1,73 0,22 1,36 0,00580 4,55

НП 7,8 22,00 0,09 0,03 18,33 0,00197 33,34

Таблиця 3

Час біологічної дії деяких доз КМП, ГММП, АТГ, НП

Доза КМП