УКРАЇНСЬКА АКАДЕМІЯ АГРАРНИХ НАУК

ІНСТИТУТ ТВАРИННИЦТВА

Щербак олена валентинівна

УДК 636.22/.28:636.4:57.08

Порівняльний аналіз ооцитів, яйцеклітин та ембріонів великої рогатої худоби і свині, що були отримані в умовах in vivo та in vitro

03.00.20 біотехнологія

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата сільськогосподарських наук

ХАРКІВ 2001

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана у відділі біотехнології відтворення і генної інженерії Інституту тваринництва УААН та лабораторії генної інженерії Харківського біотехнологічного центру УААН і Міністерства освіти і науки.

Науковий керівник

доктор сільськогосподарських наук,

старший науковий співробітник

Безуглий Микола Дмитрович,

науковий директор Інституту

тваринництва УААН

Офіційні опоненти :

доктор біологічних наук, професор Шахбазов Валерій Гайович, Харківський національний університет, завідувач кафедри генетики і цитології

кандидат сільськогосподарських наук Скляров Павло Миколайович, Харківський зооветеринарний інститут Міністерства аграрної політики України, асистент кафедри розведення та відтворення сільськогосподарських тварин

Провідна установа:

Державний науково-дослідний контрольний інститут ветеринарних препаратів та кормових добавок Міністерства аграрної політики України,

м. Львів

Захист дисертації відбудеться ‘’24 ‘’квітня 2001 р. о 13 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 65.356.02 при Інституті тваринництва УААН за адресою: 62404, Харківська обл., Харківський р-н., п/в Кулиничі

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Інституту тваринництва УААН за адресою 62404, Харківська обл., Харківський р-н., п/в Кулиничі

Автореферат розісланий ‘’22’’березня 2001 р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради,

кандидат сільськогосподарських наук Чалий О.І.

Загальна характеристика роботи

Актуальність теми. Останні роки характеризуються пильною увагою до проблем біології розвитку, які хвилюють як біологів, що намагаються розкрити механізми диференціації та розвитку організму, так і біотехнологів, практичні потреби яких вимагають як можливо більш глибоких знань ембріонального періоду розвитку сільськогосподарських тварин. Необхідність повної інформації про передімплантаційний період розвитку обумовлена тією обставиною, що навіть в умовах in vivo має місце загибель значної кількості зигот та зародків (Anderson L.L, 1974; Эрнст Л.К., Сергеев Н.И., 1989, Эрнст Л.К., Жигачев А.И., 1990, Стефанович А.В., Бариляк И.Р., 1994). На думку дослідників, близько 5-10% усіх тільних корів мають зиготу з хромосомними аномаліями (Weisner E., Willer H., 1981). А у не зовсім адекватних умовах in vitro загибель зародків, можливо, зростає.

У біотехнології все більш широке застосування знаходить метод запліднення яйцеклітин та культивування ембріонів поза організмом. Оскільки умови in vitro не адекватні фізіологічним процесам, які супроводжують дозрівання ооцитів, запліднення яйцеклітин та дроблення ембріонів в організмі тварин, можливо очікувати, що це накладає свій відбиток на стан яйцеклітин та ембріонів, хоча удосконалення методів та умов культивування проходить постійно (Prichard J.F., Pool S.H., 1991; Choi Y. et al., 1991; Морено М.В., 1992; Van Inzen W.G. et al., 1993; Chung B.H.et al., 1994; Лебедева И.В. и др., 1995; Лобачьова І.В.. 1996; Жернокльов Г.В., 1998). Однак досліджень, спрямованих на вивчення стану хромосомного апарату цих яйцеклітин та ембріонів, дуже мало (Iwasaki S., Nakahara T., 1990; Yadaw B.R. et al., 1991; Iwasaki S. et al., 1992). Не проводилось також комплексного порівняльного аналізу гамет та ембріонів, які отримані в умовах in vitro, між декількома видами тварин.

Зв`язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Наукові дослідження проводилися в рамках тематичного плану Інституту тваринництва УААН та Харківського біотехнологічного центру. Здобувач був виконавцем по темам “Розробити біотехнологічні методи створення сільськогосподарських тварин з заданими господарсько-корисними ознаками (№ держреєстрації 0196U011388) та “Розробити метод кріоконсервації ембріонів свиней” (№ держреєстрації 0196U011390).

Мета та завдання досліджень. Метою роботи було порівняння морфології та стану хромосомного апарату жіно чіх гамет (ооцитів, яйцеклітин) та ембріонів великої рогатої худоби і свині, які були отримані в умовах організму та поза ним. Для досягнення поставленої мети вирішувались такі завдання:

1. Вивчити кінетику мейоза в ооцитах корів та свиней при культивуванні in vitro за методикою, яку використовували у відділі біотехнології відтворення та генної інженерії ІТ УААН.

2. Вивчити вплив індивідуальних якостей ооцитів на ефективність їх дозрівання поза організмом.

3. Провести цитогенетичний аналіз ооцитів та яйцеклітин великої рогатої худоби і свині, що дозріли в умовах in vivo та in vitro.

4. Вивчити можливі аномалії яйцеклітин та зигот корів і свиней у процесі запліднення in vitro.

5. Порівняти ранні ембріони великої рогатої худоби та свиней, які були отримані поза організмом.

6.

Об’єкт дослідження: ооцити, яйцеклітини і ембріони великої рогатої худоби та свині, що були отримані в умовах in vivo та in vitro.

Предмет дослідження: порівняння стану морфології та хромосомного апарату жіночіх гамет та ембріонів великої рогатої худоби і свині в процесах гаметогенезу та раннього ембріогенезу в умовах in vivo та in vitro.

При виконанні роботи використовували біотехнологічні методи (виділення ооцитів із яєчників тварин, культивування ооцитів та ембріонів поза організмом), морфологічні (оцінка ооцитів, яйцеклітин та ембріонів за морфофізіологічними показниками) та цитогенетичні (для виявлення аномалій хромосомного апарату) методи досліджень. Обробку числового матеріалу проводили методами статистичного аналізу.

Науковою новизною отриманих результатів є комплексний підхід при порівнянні ооцитів, яйцеклітин та ембріонів великої рогатої худоби і свині, отриманих в умовах in vivo та in vitro.

Вивчені особливості тривалості першого мейотичного ділення в ооцитах великої рогатої худоби та свині, які культивували поза організмом.

В роботі вперше було проведено цитогенетичний порівняльний аналіз ембріонів корів з ембріонами свині, які були отримані в умовах in vitro.

Висунута гіпотеза про різні механізми дегенерації ембріонів, які були отримані в умовах організму та поза ним.

Практичне значення отриманих результатів. Отримані дисертантом дані про кінетику мейозу були використані в дослідах по ембріональному клонуванню великої рогатої худоби у відділі біотехнології відтворення та генної інженерії ІТ УААН.

В Інституті свинарства УААН в дослідах по культивуванню ооцитів та заплідненню яйцеклітин свині були використані середовища для культивування ооцитів, оптимізовані здобувачем, а також дані, отримані дисертантом про хронологію подій першого мейотичного ділення в ооцитах свині. Дані, що отримав дисертант, також були використані у курсах лекцій з біотехнології, генетики та біології розвитку сільськогосподарських тварин у Харківському зооветеринарному інституті. Отримані дані про хронологію подій першого мейотичного ділення в ооцитах корів та свиней можуть бути використані при постановці дослідів по заплідненню яйцеклітин поза організмом та кріоконсервації ооцитів різних стадій зрілості.

Теоретична цінність роботи полягає у встановленні деяких причин та можливого механізму ранньої ембріональної смертності сільськогосподарських тварин.

Особистий внесок здобувача полягає в проведенні експериментальних досліджень з теми дисертації, опрацюванні першоджерел літератури, аналізі та інтерпретації одержаних результатів, статистичній обробці результатів досліджень. Методологічні підходи та схема досліджень були розроблені разом з науковим керівником. Із загальних наукових експериментів та публікацій дисертант використав тільки свою частину результатів.

Апробація результатів дисертації. Основні положення дисертації були представлені та обговорені на конференціях молодих вчених та спеціалістів (Харків, 1996; 1998); на Міжнародній науково-виробничій конференції “Теорія та практика племінного діла в тваринництві” (Харків, 1996); на Міжнародній науково-виробничій конференції “Використання трансплантації ембріонів в селекції і відтворення сільськогосподарських тварин” (Асканія -Нова, 1997); на Міжнародній науково-виробничій конференції “Сучасні проблеми ветеринарної медицини, зооінженерії, технологій продуктів тваринництва з нагоди 100-річчя від часу надання Львівській академії ветеринарної медицини ім`я С.З.Гжицкого“ (Львів, 1997); на ІІ та ІІІ Міжнародній конференції “Використання сучасних молекулярно-генетичних і біотехнологічних розробок у генетико-селекційних дослідженнях” (Одеса, 1998, 1999) та на міжнародній конференції, присвяченій 50-річчю перших успішних пересадок ембріонів свині і 100-річчю з дня народження автора цієї розробки – О.В. Квасницького (Київ, 2000).

Публікації. Основний зміст дисертаційної роботи викладено у 6 друкованих працях. У тому числі в 4 статтях у фахових виданнях, затверджених ВАК України та 2 тезах доповідей науково-практичних конференцій.

Структура та обсяг дисертації. Дисертацію викладено на 130 сторінках машинописного тексту, вміщує 15 таблиць та 23 рисунки. Список літератури складається з 187 джерел, у тому числі 128 на іноземних мовах.

Матеріал та методика досліджень

Дослідження проводились в Інституті тваринництва УААН та Харківському біотехнологічному центрі. Робота виконана з 1994 по 1999 рік.

Яйцеклітини, що дозрівали в умовах in vivo, отримували із яєчників тварин методом аспірації передовуляторних фолікулів. Ембріони ранніх стадій отримували промиванням яйцеводів та рогів матки, після забою тварин. Отримання ембріонів тварин більш пізніх стадій проводили на 7-8 день статевого циклу нехірургічним способом.

Яєчники тварин брали на Харківському м’ясокомбінаті та на бойні д/г “Українка”. В дослідах по вивченню впливу індивідуальних якостей ооцитів на ефективність їх дозрівання поза організмом об’єм яєчників вимірювали за допомогою мірного циліндру. Ооцит-кумулюсні комплекси (ОКК) отримували методом насічок яєчників корів та свиней. В дослід відбирались ОКК з щільним компактним кумулюсом та гомогенною ооплазмою. Для дозрівання ОКК корів використовували середовище ТСМ-199 з 10% фетальної телячої сироватки та гормональними добавками. В середовище для дозрівання ооцитів свиней, крім перелічених компонентів, додавали 5-10% свинячої фолікулярної рідини. Яйцеклітини корів запліднювали заморожено-відталою спермою, попередньо капацитованою гепарином та культивували в середовищі ТСМ-199 з 20% фетальної телячої сироватки, а яйцеклітини свиней запліднювали свіжоотриманою спермою, також попередньо капацитованою, та культивували у модифікованому середовищі Віттена.

Цитогенетичний аналіз проводили після фарбування 1% ацетогематоксиліном під світловим мікроскопом Axiovert -35.

Результати досліджень

Кінетика мейозу в ооцитах корів та свиней при культивуванні поза організмом

Відомо, що тривалість мейозу, який складає основну частину процесу дозрівання ооцитів, та його стадій у ссавців видоспецифічна. Крім того, за даними різних авторів, в умовах in vitro, вона дуже коливається як для корів, так і для свиней (Suss U. et al., 1988; Betancourt M. et al., 1993; Yoshida M. et al., 1993). Тому нами була вивчена часова послідовність стадій мейозу в ооцитах корів та свиней при культивуванні поза організмом в оптимізованих нами умовах (табл.1-2).

Таблиця 1

Кінетика мейозу в ооцитах корів, які культивували поза організмом |

Час культивування, год.

Стадія

мейозу | 16

n=32 | 18

n=34 | 20

n=33 | 22

n=27 | 24

n=63 | 26

n=43

Діакінез | 96,9 | 32,4 | 21,2 | 0 | 0 | 0

МI | 47 | 57,6 | 18 ,5 | 14,2 | 7

AI-TI | 17,6 | 21,2 | 59,6 | 8 | 0

MII | 0 | 0 | 0 | 18,5а | 73 | 81,4а

Дегенера-

ція | 3,1 | 3 | 0 | 3,4 | 4,8 | 11,6

*- Усі значення вказані в відсотках від кількості досліджених ооцитів у цей проміжок часу.

а - Р< 0,001

Таблиця 2

Кінетика мейозу в ооцитах свині, які культивували поза організмом |

Час культивування, год.

Стадія

мейозу | 18

n=40 | 30

n= 50 | 38

n=44 | 40

n=55 | 42

n=50 | 44

n=43

Діакінез | 100 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0

МI | 0 | 90 | 4,6 | 3 | 0 | 0

AI-TI | 0 | 10 | 15,9 | 8 | 0 | 0

MII | 0 | 0 | 79,5 | 85,2а | 94,5а | 93

Дегенера-

ція | 0 | 0 | 0 | 3,8 | 5,5 | 7

*- Усі значення вказані в відсотках від кількості досліджених ооцитів у цей проміжок часу.

а -Р< 0,05

Таким чином, нами було встановлено, що перше мейотичне ділення в ооцитах свиней займає майже у два рази більше часу ніж цей процес в ооцитах корів. В ооцитах корів він складає 24-26 годин, а в ооцитах свиней 42-44 години. Тому запліднення яйцеклітин поза організмом цих видів тварин необхідно проводити у ці проміжки часу.

Вплив індивідуальних якостей ооцитів на ефективність їх дозрівання поза організмом

Першим етапом біотехнології культивування ембріонів поза організмом є дозрівання ооцитів з метою отримання повноцінних яйцеклітин. На цьому етапі ооцити отримують, як правило, із групи яєчників. Тому при низькому рівні дроблення зигот не можливо точно визначити причини, які його визвали тому, що це може бути обумовлено або впливом індивідуальних якостей ооцитів або ж умовами дозрівання. Нами були проведені експерименти по культивуванню ооцитів із окремих яєчників для з`ясування можливого впливу їх індивідуальних властивостей на дозрівання поза організмом. Для наведення та більшої наочності отриманих результатів ми об`єднали яєчники у три групи за їх об`ємом. У кожній групі ми виділили дві підгрупи: яєчників з жовтим тілом та без нього. В табл. 3-4 наведена середня ефективність дозрівання ооцитів свиней та корів поза організмом із окремих яєчників.

Так, середня кількість ооцитів з щільним компактним кумулюсом, отриманих із яєчників свиней об`ємом 12-16 мл з жовтим тілом, було достовірно нижче (Р<0,01), ніж кількість таких ооцитів, які були отримані із яєчників об`ємом 8-12 мл. Також достовірно нижче (Р< 0,001) була доля повноцінних яйцеклітин, отриманих при дозріванні ооцитів із яєчників об`ємом 8-12 мл без жовтого тіла, у порівнянні з долею яйцеклітин, отриманих із яєчників свині об`ємом 12-16 мл з жовтим тілом.

Таблиця 3

Середня ефективність дозрівання ооцитів свині поза організмом із

окремих яєчників

Об`єм яєчника, | Тип

яєчника | Кіл-ть яєчників | Середня

кількість, шт | Доля повноцінних

мл | шт | ооцитів | яйцеклі-

тин на МІІ | яйцеклітин на МІI, %

12-16 | з ж.т. | 6 | 5,8 0,7а | 4,5 0,9 | 77,1

без ж.т. | 3 | 19 4,6 | 10,7 5,3 | 56,1

8-12 | з ж.т. | 3 | 8,3 3,3 | 3,3 0,9 | 40

без ж.т. | 6 | 13,8 2,4а | 4,5 1,9 | 32,5

5-8 | без ж.т. | 6 | 13,5 3,5 | 9,2 2,4 | 67,9

- Р < 0,001; а - Р < 0,001

А середня кількість ооцит-кумулюсних комплексів з щільним компактним кумулюсом, отриманих із яєчників корів об`ємом 8-12 мл була достовірно нижча ніж середня кількість таких ооцит-кумулюсних комплексів із яєчників об`ємом 15-19 мл без жовтого тіла.

Таблиця 4

Середня ефективність дозрівання ооцитів корів поза організмом із

окремих яєчників

Об`єм яєчника, | Тип

яєчника | Кіл-ть яєчників | Середня

кіл-ть, шт | Доля повноцінних

мл | шт | ооцитів | яйцекле-

тин на МІІ | яйцеклітин на МІІ, %

15-19 | з ж.т. | 3 | 13,3 0,9 | 10 1,2 | 75

без ж.т. | 4 | 15 1,3а | 13,8 2 | 91,7

8-15 | з ж.т. | 3 | 6 1,4 | 5 1,5 | 83,4

без ж.т. | 8 | 6,8 1,3а | 2,4 0,6 | 35,2

3,5-8 | без ж.т. | 4 | 8,3 1,2 | 5,8 0,9 | 69,6

- Р < 0,001; а - Р < 0,001

Також достовірно нижче була доля яйцеклітин, які дозріли із ооцитів, отриманих із яєчників об`ємом 8-15 мл, у порівнянні з долею яйцеклітин, які дозріли із ооцитів, отриманих із яєчників об`ємом 15-19 мл.

Таким чином, можливо зробити висновок, що ооцити корів, отриманні із яєчників корів об`ємом 15-19 мл без жовтого тіла, та ооцити свиней, отримані із яєчників об`ємом 12-16 мл, але які мають жовте тіло, володіють більш високою ефективністю дозрівання.

Порівняльний аналіз ооцитів корів та свиней, які були отримані в різних умовах культивування

Багато спадкових захворювань обумовлено хромосомними та геномними мутаціями, які виникають в статевих клітинах у процесі гаметогенезу навіть в природних умовах організму. У неадекватних умовах культивування частота з`явлення цих аномалій, можливо, зростає. Тому нами було проведено аналіз ооцитів, які дозрівали в яєчниках (in vivo) та тих, які дозрівали поза організмом.

Ооцити свиней та корів, що дозріли в природних фізіологічних умовах, ми отримували методом аспірації із передовуляторних фолікулів яєчників. Нами було отримано 52 яйцеклітини корів і 60 яйцеклітин свиней (табл.5). Серед них з метафазними пластинками (МІІ) без аномалій було 46,2% та 81,7% яйцеклітин корів та свиней, відповідно.

Таблиця 5

Порівняльний аналіз яйцеклітин корів та свиней, отриманих в умовах

in vivo та in vitro

Умови

отримання | Вид

тварин | Загальна кількість | Відібрано

для куль | Метафаза ІІ мейоза

жіночих гамет | тивувания, шт

(%) | без аномалій, шт (%)а | з аномалією, шт (%)а

in vivo | Велика рогата худоба | 52 | - | 24 (46,2) | 28 (53,8)

Свиня |

60 | - | 49 (81,7) | 11 (18,3)

in vitro | Велика рогата худоба | 255 | 120 (47,1) | 87 (34,2) | 33 (12,9)

Свиня |

265 | 130 (19,1) | 91 (34,4) | 39 (14,7)

а - доля від загальної кількості жіночих гамет

Із яєчників забитих тварин було отримано 255 ооцитів корів та 265 ооцитів свині на різних стадіях розвитку. Потім нами було відібрано 120 ооцитів корів та 130 ооцитів свиней, придатних до наступного культивування. Після їх дозрівання у культурі до метафази ІІ було проведено цитогенетичний аналіз. Було встановлено, що тільки 34,2% яйцеклітин корів та 34,4% яйцеклітин свиней від початково видалених з яєчників ооцитів мали нормальний набір хромосом на МІІ мейозу.

При морфологічному аналізі (табл.6) видалених з передовуляторних фолікулів яєчників ооцитів було виявлено, що їх можна розділити на два типи: ооцити з ослизненим кумулюсом (ооцити з повністю експандованим кумулюсом, який представлений желеподібною речовиною, з темними включеннями) та ооцити з розпушеним кумулюсом. Ооцити другого типу за своєю морфологією були подібні до ооцитів, які досягли другої метафази мейозу при культивуванні поза організмом.

Таблиця 6

Аналіз ооцитів, отриманих із передовуляторних фолікулів яєчників

корів та свиней

Вид

тварин | Тип

ооцитів | Кіл-ть

ооцитів, (%) | ТІ- МІІ, (%) | Клампінг,

(%) | Фрагмен-

тація,

(%)

Велика

рогата | з ослизненим кумулюсом | 30

(57,7) | 2

(6,6) | 8

(26,7) | 20

(66,7)

худоба | з розпушеним кумулюсом | 22

(42,3) | 22

(100) | 0 |

0

Свиня | з ослизненим кумулюсом | 12

(20) | 1

(8,3) | 5

(41,7) | 6

(50)

з розпушеним кумулюсом | 48

(80) | 48

(100) | 0 | 0

- Р< 0,05

При порівнянні ооцитів, нами було виявлено, що кількість ооцитів з ослизненим кумулюсом, отриманих із яєчників корів, була вірогідно вища, ніж кількість таких же ооцитів, отриманих із яєчників свиней. Усі аспіровані нами ооцити з розпушеним кумулюсом знаходились на стадії телофази І - метафази ІІ мейозу і ніяких аномалій у них не знайдено. При проведені цитологічного аналізу ооцитів з ослизненим кумулюсом було встановлено, що їх хромосоми в більшості випадків були повністю або частково дегенеровані, хоча зустрічалися ооцити з нормальною ТІ- МІІ.

Аналізуючи ооцити корів та свиней, які дозріли в культурі in vitro (табл.7), нами були виявлені такі аномалії, як: диплоїдна метофаза ІІ, анеуплоїдія, клампінг та фрагментація хромосом. В яйцеклітинах корів, що культивували поза організмом, було знайдено 27,5% , а в яйцеклітинах свиней 30% аномалій хромосомного апарату.

Таблиця 7

Результати цитогенетичного аналізу яйцеклітин, що дозріли

поза організмом

Вид

тварин | Анеуплої-

дія,(%) | Поліплоі-дія,(%) | Фрагмента-ція хромосом,(%) | Клампінг хромосом, (%) | Всього аномалій, (%)

Велика рогата худоба | 6/120

(5) | 9/120

(7,5) | 10/120

(8,3) | 8/120

(6,7) | 33/120

(27,5)

Свиня | 6/130

(4,6) | 7/130

(5,4) | 15/130

(11,5) | 11/130

(8,5) | 39/130

(30)

- У вигляді дробу показано відношення кількості ооцитів з зазначеною аномалією до загальної кількості проаналізованих ооцитів.

Таким чином, нами було встановлено, що кількість ооцитів з ослизненим кумулюсом, отриманих із яєчників корів, була вірогідно вища, ніж кількість таких же ооцитів, отриманих із яєчників свиней. Виявлено, що доля усіх аномалій в яйцеклітинах корів та свиней, культивованих поза організмом, знаходиться на однаково високому рівні і складає 27,5% та 30%, відповідно.

Запліднення яйцеклітин сільськогосподарських тварин поза організмом

Пізнання механізмів запліднення та розробка ефективних методів управління цим процесом є важливим для регулювання розмноження ссавців. Процес запліднення може супроводжуватись деякими порушеннями, наприклад, поліспермією або партеногенезом, а частота порушень складає 31% та залежить від типу овуляції, місця запліднення, виду тварин та віку донора (Понд У.Дж., Хаупт К.А., 1983; Дыбан А.П., 1988; Эрнст Л.К., Сергеев Н.И., 1989; Левин К.Л., 1990). У наших дослідженнях по заплідненню яйцеклітин корів та свиней поза організмом також було виявлено поліспермне запліднення (табл.8).

Таблиця 8

Поліспермне запліднення яйцеклітин корів та свиней поза організмом

Вид | Кількість яйцеклітин та ембріонів, шт

тварин | проаналізовано | із них поліспермних, (%)

Велика рогата худоба | 88 | 15

(17,0)

Свиня | 101 | 33

(32,7)

- Р < 0,01

При цьому рівень поліспермного запліднення у великої рогатої худоби був вірогідно нижче (Р< 0,01) у порівнянні з свинею.

Спонтанний партеногенез у наших дослідах не був виявлений (табл.9). Хоча не можна заперечувати, що отримані ембріони можуть розвиватися за типами гіногенезу або ж андрогенезу.

Таблиця 9

Результати запліднення поза організмом та спонтанного

партеногенезу у яйцеклітинах сільськогосподарських тварин

Вид

тварин | Ооцитів

у досліді | Яйцеклітин, шт |

Рівень дроблення яйцеклітин, що

осіменяли | не осіменяли | осіменяли, (%) | не осіменяли

Велика рогата худоба |

100 |

50 |

50 |

20 (40)а |

0а

Свиня |

70 |

35 |

35 |

17(48,5)в |

0в

а- Р < 0,001 ; в - Р < 0,001

Аналіз ранніх ембріонів великої рогатої худоби та свині, що були отримані поза організмом

Запліднення яйцеклітин та культивування ембріонів поза організмом пов’язано з деякими труднощами, наприклад, “блоком розвитку”. У ембріонів великої рогатої худоби він спостерігається на стадії 8-16 клітин, а у ембріонів свині на стадії 4-8 клітин.

Оцінюють та відбирають ембріони за їхньою відповідністю стадії розвитку фактичному віку ембріонів, за відношенням до тест-фарбників, інтенсивностю обміну речовин, за здібністю досягати відповідної стадії розвитку в культурі in vitro, але як правило їх оцінюють та відбирають за морфологічними ознаками.

При морфологічному аналізі отриманих ембріонів корів, культивованих 56 годин, були виявлені ембріони від 2-х клітинної стадії розвитку до стадії ранньої морули (рис.1)

А при морфологічному аналізі, отриманих нами ембріонів свиней (рис.2), що культивували 48 годин, нами були знайдені ембріони від 2-х клітинної стадії розвитку до 8-16 клітинної стадії.

Рис. 1 Морфологічний аналіз ембріонів великої рогатої худоби після 56 годин культивування поза організмом

Рис. 2 Морфологічний аналіз ембріонів свині після 48 годин культивування поза організмом

При цитогенетичному аналізі отриманих у культурі ембріонів як свиней, так і корів було виявлено, що вони не подолали “блоку розвитку”. Так, ембріони корів, морфологічно оцінені нами як 16-ти клітинні ембріони - морули, виявились фрагментованими 8-10-ти клітинними ембріонами, або навіть дегенерованими яйцеклітинами. Така сама картина спостерігалась і при аналізі ембріонів свиней. Ембріони, морфологічно оцінені як 8-16-ти клітинні, виявилися 4-6-ти клітинними ембріонами або ж фрагментованими яйцеклітинами. Це ще раз вказує на неадекватність оцінки ембріонів за морфологічними ознаками та на необхідність застосування цитогенетичного аналізу як додаткового методу визначення повноцінності зародків.

Під час вивчення метафазних пластинок бластомерів у ембріонах як свиней, так і корів були виявлені аномалії типу: поліплоїдія, гаплоїдія та порушення цитотомії.

Так, під час цитогенетичного аналізу в 2-3-х клітинних ембріонах великої рогатої худоби було виявлено 18,5% аномалій, в 4-5-ти клітинних - 20%, а в 6-8-ми клітинних - 25% (табл.10).

Таким чином, спостерігається тенденція збільшення частки геномних аномалій з ускладненням стадії розвитку ранніх ембріонів корів.

Таблица 10

Цитогенетичний аналіз ембріонів корів, що культивували

поза організмом

Стадія |

(доля від | Кількість

загальної | ембріонів, кількості | шт.

, %)

розвитку | проаналі- | що мають | аномалії

ембріону | зовано | поліплоїдія | гаплоїдія |

порушения

цитотомії | всього

2-3-х

клітин. | 27 |

3

(11,1) | 1

(3,7) | 1

(3,7) | 5

(18,5)

4-5-ти клітин. | 15 | 1

(6,7) | 2

(13,3) | 3

(20)

6-8-ми

клітин. | 8 | 1

(12,5) | 1

(12,5) | 2

(25)

Всього | 50 | 5

(10,0) | 4

(8,0) | 1

(2,0) | 10

(20)

У наших дослідженнях при цитогенетичному аналізі ембріонів свиней (табл. 11) було знайдено 20,1% аномалій в 2-3-х клітинних ембріонах, 3,1% - в 4-5-ти клітинних та 28,6% - в 6-8-ми клітинних ембріонах.

Таке зниження долі геномних аномалій у 4-5-ти клітинних ембріонах випадає із загальної картини збільшення аномалій з просуванням стадії розвитку, як це спостерігалось у ембріонів великої рогатої худоби. Однак, це може бути пов’язано з різним механізмом та часом усунення дегенерованих або аномальних ембріонів. Можливо, у великої рогатої худоби усунення аномальних ембріонів проходить на більш пізніх стадіях, а у свиней - на 2-х клітинній стадії.

Таким чином, причиною невдач запліднення та культивування поза організмом ооцитів та ембріонів може бути як неповноцінне цитоплазматичне та ядерне дозрівання ооцитів, так і хромосомні аномалії в ооцитах та ембріонах. Час, а, можливо, і механізм загибелі ембріонів з аномаліями є видоспецифічним.

Таблиця 11

Цитогенетичний аналіз ембріонів свині, що культивували

поза організмом

Стадія |

(доля від | Кількість

загальної | ембріонів, кількість, | шт

%)

розвитку | проаналі- | що мають | аномалії

ембріона | зовано | поліплоїдія | гаплоїдія |

порушення

цитотомії | всього

2-3-х клітин. | 15 |

1

(6,7) | 1

(6,7) | 1

(6,7) | 3

(20,1)

4-5-ти клітин. | 32 | 1

(3,1) |

1

(3,1)

6-8-ми

клітин. | 7 | 1

(14,3) | 1

(14,3) | 2

(28,6)

Всього | 54 | 3

(5,6) | 2

(3,7) | 1

(1,8) | 6

(11,1)

Аналіз ембріонів великої рогатої худоби, що були отримані в умовах in vivo та in vitro

За літературними джерелами в ембріонах, які були отримані з організму самиць, приктично всі бластомери мають ядра. У дослідженнях по аналізу дегенерованих ембріонів (табл.12), що отримані нехірургічним шляхом із рогів матки на 7-9 добу, нами було виявлено, що доля бластомерів без ядер у них складає 2,5% (7/281).

Таблиця 12

Порівняльній аналіз ембріонів великої рогатої худоби, що отримані в умовах in vivo та in vitro

Умови культивування | Кіл-ть ембріонів, | Кіл-ть бластомерів, шт

(доля від проаналізованних, %)

шт | проаналізо-вано | з них

з ядрами | без ядер

in vivo |

17 | 281 | 274 (97,5) | 7 (2,5)

in vitro |

78 | 596 | 292 (49) | 304 (51)

- Р < 0,001

А в ембріонах, що отримані при культивуванні поза організмом, тільки 49% (292/596) бластомерів мали ядра.

Таким чином, можна припустити, що дегенерація ембріонів великої рогатої худоби, які отримані у природних фізіологічних умовах та в культурі in vitro, проходить різними шляхами. Для ембріонів, що отримані заплідненням поза організмом, - це фрагментація цитоплазми або “хибне” (“несправжнє”) ділення, а для ембріонів, що отримані в природних фізіологічних умовах організму, - це вплив генетичних мутацій, порушень процесу митозу і т.д.

висновки

1.

2.

3.

4.

5.

6.

7.

8.

9.

пропозиції виробництву

1.

2.

3.

список опублікованих праць

1.

Дисертантом була виконана частина серій експерименту по встановленню хронології подій першого поділу мейозу в ооцитах корів та свиней, результати яких потім були узагальнені з результатами серій експерименту, що були виконані співавтором.

2. Щербак Е.В. Порівняльний аналіз ембріонів великої рогатої худоби, одержаних в умовах in vivo та in vitro// Научно-технический бюллетень ИЖ УААН. -1998.- №73. - С.81-84.

3. Щербак Е.В., Безуглый Н.Д. Частота геномных аномалий в эмбрионах крупного рогатого скота и свиней при культивировании in vitro //Науково-технічний бюлетень ІТ УААН. - 1998. - №75. - С.205-209.

Дисертант виконав експериментальну частину, провів аналіз та узагальнення отриманих результатів.

4.

5.

6.

Щербак О.В. Порівняльний аналіз ооцитів, яйцеклітин та ембріонів великої рогатої худоби і свині, що отримані в умовах in vivo та in vitro. - Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата сільськогосподарських наук за спеціальністю 03.00.20- біотехнологія. -Інститут тваринництва УААН, Харків, 2001.

У роботі проведено детальний аналіз жіночих гамет та ембріонів великої рогатої худоби і свині, які були отримані в умовах організму та поза ним. Встановлено, що дозрівання у культурі in vitro ооцитів свині до метафази ІІ триває майже в двічі довше, ніж ооцитів великої рогатої худоби. Виявлено, що при культивуванні поза організмом, кількість аномалій хромосомного апарату яйцеклітин цих видів тварин знаходиться на однаково високому рівні. Досліджені морфологічні та цитогенетичні особливості процесів запліднення яйцеклітин та раннього ембріонального розвитку великої рогатої худоби і свині поза організмом. Встановлено, що поліспермне запліднення вірогідно частіше спостерігається у свині. Виявлено, що геномні аномалії в ембріонах корів накопичуються (на рівні тенденції) з просуванням стадії розвитку ембріона, а в ембріонах свиней така тенденція не спостерігається. Проведено порівняльний аналіз ембріонів великої рогатої худоби, які були отримані в умовах in vitro та in vivo. Висунута гипотеза про різні механізми дегенерування таких ембріонів.

Ключові слова: ооцити, яйцеклітини, ембріони, свиня, велика рогата худоба, цитогенетика, хромосомний апарат, культивування поза організмом, запліднення in vitro.

Щербак Е.В. Сравнительный анализ ооцитов, яйцеклеток и эмбрионов крупного рогатого скота и свиньи, полученных в условиях in vivo и in vitro. - Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата сельскохозяйственных наук по специальности 03.00.20- биотехнология. - Институт животноводства УААН, Харьков, 2001.

В работе проведен детальный анализ женских гамет и эмбрионов крупного рогатого скота и свиньи, полученных в условиях организма и вне его. В работе изучена кинетика мейоза в ооцитах крупного рогатого скота и свиньи, которые созревают в условиях in vitro. Установлено, что созревание ооцитов свиньи в оптимизированных нами условиях длится почти в два раза дольше, чем в ооцитах крупного рогатого скота (42-44 ч и 24-26 ч, соответственно).

Были проведены эксперименты по культивированию ооцитов из отдельных яичников для выяснения возможного влияния их индивидуальных качеств на созревание вне организма. Мы объединили яичники в три группы по их объему. В каждой группе выделили две подгруппы: яичники с желтым телом и без него. Установлено, что ооциты коров, полученные из яичников объемом 15-19 мл без желтого тела и ооциты свиней, полученные из яичников объемом 12-16 мл, но имеющих желтое тело, обладают более высокой эффективностью к созреванию по сравнению с ооцитами, полученными из других типов яичников.

При морфологическом анализе выделенных ооцитов было выявлено, что их можно разделить на два типа: ооциты с ослизненным кумулюсом (ооциты с полностью экспандированным кумулюсом, представляющим собой вязкое студнеобразное вещество с темными скоплениями) и ооциты с разрыхленным кумулюсом. Ооциты второго типа по своей морфологии были похожи на ооциты, которые получают при культивировании вне организма в течение 24-26 часов для ооцитов коров и 42-44 часов для ооцитов свиней, т.е. на те, которые достигли второй метафазы мейоза. Сравнивая ооциты, полученные из яичников разных видов животных, нами было обнаружено, что количество ооцитов с ослизненным кумулюсом, полученных из яичников коров, было достоверно (Р< 0,05) выше, чем количество таких же ооцитов, полученных из яичников свиньи. Ооциты с разрыхленным кумулюсом находились на стадии телофазы І - метафазы ІІ мейоза и никаких аномалий в них не обнаружено, а хромосомы ооцитов с ослизненным кумулюсом в большинстве случаев были полностью или частично дегенерированы.

Цитогенетический анализ яйцеклеток как коров, так и свиней, созревшие в культуре in vitro, позволил обнаружить такие аномалии, как: диплоидная метафаза ІІ, анеуплоидия, клампинг и фрагментация хромосом. Доля всех обнаруженных аномалий хромосомного аппарата в яйцеклетках этих видов животных находится на одинаково высоком уровне и составляет у коров - 27,5%, а у свиней - 30%. Наиболее часто как в яйцеклетках коров, так и свиней встречалась фрагментация хромосом. В яйцеклетках как коров, так и свиней, на некоторых препаратах была выявлена трехгрупповая метафаза.

Диссертантом исследованы морфологические и цитогенетические особенности процессов оплодотворения яйцеклеток и раннего эмбрионального развития крупного рогатого скота и свиньи in vitro. Выявлено полиспермное оплодотворение вне организма как у свиньи, так и крупного рогатого скота. При чем уровень полиспермного оплодотворения у коров был достоверно ниже по сравнению со свиньями, а спонтанный партеногенез в наших условиях не наблюдался. При цитогенетическом анализе бластомеров эмбрионах, как свиней, так и коров были обнаружены аномалии типа: полиплоидия, гаплоидия и нарушение цитотомии. Было установлено, что ранние эмбрионы коров имеют в среднем 20% аномалий хромосомного аппарата, а эмбрионы свиней - 11,1% аномалий.

В 2-х клеточных эмбрионах крупного рогатого скота было обнаружено 18,5% аномалий, в 4-х клеточных - 20%, а в 6-8-ми клеточных -25%. При цитогенетическом анализе эмбрионов свиней было обнаружено 20,1% аномалий в 2-х клеточных эмбрионах, 3,1% - в 4-х клеточных и 28,6% - в 6-8-ми клеточных эмбрионах. Таким образом, выявлено, что геномные аномалии в эмбрионах коров накапливаются (на уровне тенденции) с продвижением стадии развития эмбриона, а в эмбрионах свиней такая тенденция не наблюдается. Следовательно, причиной неудач оплодотворения и культивирования вне организма может быть как неполноценное цитоплазматическое и ядерное созревание ооцитов, так и хромосомные аномалии в ооцитах и эмбрионах. Время, а, возможно, и механизм гибели эмбрионов с аномалиями являются видоспецифичными.

При анализе дегенерированных эмбрионов, полученных нехирургическим путем из рогов матки на 7-9 сутки, было выявлено, что доля бластомеров без ядер составляла 2%. А в эмбрионах, полученных при культивировании вне организма, только 49% бластомеров имели ядра. Поэтому можно предположить, что дегенерация эмбрионов крупного рогатого скота, полученных в естественных физиологических условиях и в культуре in vitro, идет разными путями.

Ключевые слова: ооциты, яйцеклетки, эмбрионы, свинья, крупный рогатый скот, цитогенетика, хромосомный аппарат, культивирование вне организма, оплодотворение in vitro.

Scherbaсk E.V. The comparative analysis of pig and cattle oocytes, ova and embryos received in vivo and in vitro conditions. Manuscript.

The dissertation for degree of candidate of agricultural science by speciality 03.00.20 - biotechnology.- Institute of animal sсince, Kharkov, 2001.

The detailed analysis female gametes and embryos of cattle and pigs received in conditions of organism and outside of it is carried out in this work.

It is established, that the pig oocyte maturing