ІНСТИТУТ ГЕРОНТОЛОГІЇ АМН УКРАЇНИ

ШИКУЛА РОКСОЛАНА ГРИГОРІВНА

УДК: 612.172.015.348.014.2

GTP-ЗВ’ЯЗУЮЧІ БІЛКИ ТА ФОСФАТИДИЛІНОЗИТИДНИЙ ЦИКЛ

ПРИ М-ХОЛІНЕРГІЧНІЙ РЕГУЛЯЦІЇ СКОРОТЛИВОСТІ СЕРЦЯ

03.00.04-біохімія

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата медичних наук

Київ-2001

Дисертацією є рукопис

Робота виконана у Львівському державному медичному університеті імені Данила Галицького МОЗ України

Науковий керівник: доктор біологічних наук, професор

Воробець Зіновій Дмитрович,

Львівський державний медичний

університет імені Данила Галицького,

завідувач кафедри медичної біології та

генетики

Офіційні опоненти: доктор медичних наук, професор

Кульчицький Олег Костянтинович,

Інститут геронтології АМН України,

завідувач лабораторії регуляції

метаболізму

доктор біологічних наук,

член-кор. НАН України, член-кор.

АМН України,

Гула Надія Максимівна,

Інститут біохімії ім.О.В.Палладіна

НАН України,

завідувач відділу біохімії ліпідів

Провідна установа: Київський національний університет імені Тараса Шевченка, кафедра біохімії

Захист відбудеться 26 червня 2001 року о 13.00 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.551.01 в Інституті геронтології АМН України за адресою: 04114, Київ, вул.Вишгородська, 67

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Інституту геронтології АМН України за адресою: Київ, вул.Вишгородська, 67

Автореферат розісланий 23 травня 2001 р.

Вчений секретар спеціалізованої

вченої ради Потапенко Р.І.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність проблеми. Дослідження молекулярних механізмів регуляції скоротливості серця є однією з актуальних проблем сучас-ної біохімії та теоретичної медицини. Скоротливість серцевого м’яза модулюється багатьма фізіологічними та фармакологічними сполуками через рецепторні механізми шляхом індукції систем вторин-них месенджерів і подальшої регуляції іонної провідності [Курский и др., 1988; Hosey, 1995, 1999; Sharma et al., 1996]. Гормони, нейромедіатори та інші агоністи здатні швидко і зворотно активу-вати такі внутрішньоклітинні процеси, як скоротливість, секреція, енергетичний обмін, зміна мембранного потенціалу. За останні роки намітився значний прогрес в розумінні того, яким чином ці речовини впливають на активність клітин [Авдонин, Ткачук, 1994; Colecraft et al., 1998; Hosey et al., 1995]. Більшість із них не проникає в клітини, а зв’язується з рецепторами на поверхні плазматичної мембрани. Далі передача гормонального сигналу мож-лива кількома альтернативними шляхами, що визначається типом рецеп-тора, з яким зв’язався агоніст. Практично для кожного з відомих гормонів виявлено кілька типів рецепторів, серед яких є завжди хоча б один, зв’язування ліганда з яким призводить до надхoдження Са2+ в цитоплазму чи мобілізації Са2+ із внутріш- ньоклітинних депо [Capogrossi et al., 1990]. Збільшення концентрації Са2+ у цитоплазмі, який безпосередньо впливає на активність скоротливих білків кардіоміоцитів, є наслідком каскаду біохімічних реакцій. На першому етапі передачі сигналу від рецептора беруть участь GТР-зв’язуючі білки (G-білки), які здійснюють функціональний зв'язок між рецепторами та ефекторними системами і, тим самим, забезпечують трансмембрaнну сигналізацію [Birnbaumer et al., 1990; Neer, 1995].Далі включаються аденілатциклазна чи фосфатидилінозитидна системи, відбувається синтез вторинних месенджерів, які регулюють активність Са2+-транспортуючих систем сарколеми та саркоплазматичного ретикулуму і, таким чином, впливають на концент-рацію іонізованого кальцію в цитоплазмі та клітинну відповідь [Ткачук,1998; Divecha, Irvine, 1995].

Велика кількість гормонів та інших агоністів, рецепторів, G-білків тощо свідчить про різноманітність і складність систем регуляції активності клітини.

Особливий інтерес у цьому плані останнім часом становить М-холінергічна регуляція скоротливості серця, яка перебуває під контролем блукаючого нерва.

Дослідження структури і функції мускаринових рецепторів і G-білків стрімко розширюються і поглиблюються, що можна пояснити очікуваним терапевтич- ним потенціалом у захворюваннях, які пов’язані з порушенням серцевої діяльності.

Методика перфузії ізольованого серця дає широкі можливості для ви- вчення функціональної активності міокарда, стану рецепторів та інше [Мойбенко та ін., 1995; Гула та ін., 2000; De Jonge et al., 1995; Huddart, Mill, 1996]. Проте участь гетеротримерних GТР-зв'язуючих білків у передачі гормонального сигналу та їх властивості, а також обмін фосфатидилінозитидів,

залишаються значною мірою не з'ясованими. Тому актуальними є дослідження властивостей GТР-зв’язуючих білків у сарколемі міокарда та обміну фосфатидилінозитидів, як одних з основних етапів вивчення гормональної регуляції ефекторних систем, що забезпечують процеси скорочення та розслаблення міокарда.

Для з’ясування безпосередньої участі G-білків і фосфатидилінозитидів та зміни їх властивостей у процесах трансдукції зовнішніх сигналів доцільно проводити дослідження на більш простих системах, ніж ціла клітина. Припускається, що такою системою можуть бути препарати сарколеми міокарда.

Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертаційна робота виконана відповідно до плану науково-дослідних робіт Львівського державного медичного університету ім. Данила Галицького в рамках теми “Роль кальцій-транспортуючих систем у регуляції скоротливості серця при індукції фосфатидилінозитидного циклу” (№ реєстрації: 2. 28. 4. 9.).

Мета і задачі дослідження. Мета роботи – з‘ясування функціонального стану GТР-зв’язуючих білків та фосфатидилінозитидної системи при М-холінергічній рецепторній регуляції скоротливості ізольованих перфузованих сердець кролів. Для досягнення цієї мети були поставлені такі задачі:

1.Дослідити скоротливість міокарда при дії М-холінергічного рецепторного агоніста карбахоліну.

2.Вивчити GТР-зв'язуючі властивості та GТРазну активність G-білків при активації М-холінергічних рецепторів.

3.Вивчити обмін фосфатидилінозитидів та утворення вторинних месенджерів при перфузії серця карбахоліном.

4.Ідентифікувати білки сарколеми міокарда, що фосфорилюються, при індукції фосфатидилінозитидного циклу карбахоліном.

Об’єкт дослідження – механізм передачі гормонального сигналу від мускаринових холінергічних рецепторів на ефекторні системи.

Предмет дослідження – скоротливість серця, GTP-зв’язуючі білки сарколеми міокарда, обмін фосфатидилінозитидів, протеїнкіназа С, фосфорилювання сарколеми.

Методи дослідження: метод перфузії ізольованого серця за Ланген- дорфом, контроль скоротливості, виділення препаратів сарколеми міокарда, визначення GTP-зв’язуючих властивостей G-білків, визначення активності GTPази, ADP-рибозилювання білків сарколеми, вивчення метаболізму поліфосфатидилінозитидів сарколеми, виділення інозитфосфатів, визначення активності протеїнкінази С, ідентифікація субстратів фосфорилювання сарколеми міокарда.

Наукова новизна одержаних результатів. Уперше показана наявність у виділених препаратах сарколеми міокарда функціонально активної системи передачі гормонального сигналу через М-холінергічні рецептори на ефекторні системи: “рецептор – GTP-зв’язуючий білок – GTPазна активність – обмін фосфатидилінозитидів – синтез вторинних месенджерів – інозит-1,4,5-трифос- фату та діацилгліцерину – фосфорилювання білків”.

Уперше здійснено комплексне дослідження скоротливості міокарда та окремих ланок механізму передачі гормонального сигналу через М-холіно- рецептори і виявлений тісний взаємозв’язок між скоротливістю міокарда та властивостями GTP-зв’язуючих білків, GTPазною активністю, обміном фосфатидилінозитидів при дії М-холінергічного агоніста карбахоліну.

Дістало подальший розвиток з’ясування GTP-зв’язуючих властивостей G-білків, в результаті чого виявлені ділянки зв’язування з високою і низькою спорідненістю до GTP; продемонстровано, що карбахолін змінює їх спорід- неність до даного нуклеотиду.

Уперше комплексно показано, що при дії М-холінергічного агоніста карбахоліну на серце активується обмін фосфатидилінозитидів та утворення інозит-1,4,5-трифосфату.

Ідентифіковані субстрати Са2+-фосфоліпідзалежного фосфорилювання сарколеми міокарда при дії карбахоліну.

Практичне значення одержаних результатів. Отримані дані розширю- ють уявлення про розуміння загальних принципів функціонування клітин серця та про можливості використання везикульованих препаратів сарколеми міокар- да для вивчення механізму дії гормонів і фізіологічно активних речовин, які мають рецептори на плазматичній мембрані. Вони можуть стати основою для розробки методів корекції патології скоротливості міокарда, причина якої полягає в порушенні окремих ланок передачі гормонального сигналу через М-холінорецептори. У зв’язку з цим з’являється можливість керованого добору фармакологічних препаратів, які модулюють GTPазну активність та обмін фосфатидилінозитидів.

Матеріали дослідження можуть використовуватись у курсі лекцій з біохімії та нормальної фізіології.

Особистий внесок здобувача. Дисертантом особисто проаналізовано наукову літературу за темою дослідження, сформульовані та обгрунтовані основні положення дисертаційної роботи і налагоджено методи досліджень. Експериментальні дослідження, результати яких викладені в дисертації, проведені автором особисто, окрім електронно-мікроскопічних досліджень. Постановка завдань, аналіз та обговорення отриманих результатів проводились спільно з науковим керівником і співавторами статей.

Апробація результатів дисертації. Основні положення дисертаційної роботи доповідались та обговорювались на 2-й Міжнародній Парнасівській біохімічній конференції (Гданськ, 1998), 46-й щорічній конференції “Медицина і наука в спорті і тренуванні” (Вашингтон, 1999), 1-му Кавказькому симпозіумі з медико-біологічних наук (Тбілісі, 1999), Міжнародній конференції Інституту землеробства і біології тварин УААН, присвяченій 100-річчю з дня народження З.Гжицького (Львів, 1999), Всеукраїнському з’їзді патофізіологів (Одеса, 2000), Першій Львівсько-Люблінській конференції з експериментальної та клінічної біохімії (Львів, 2000), 3-й Міжнародній Парнасівській конференції “Механізми трансдукції і передачі клітинних сигналів” (Львів, 2000), на конференціях молодих учених Львівського медичного університету ім. Данила Галицького (Львів, 1997-2000).

Публікації. Основні результати дисертаційної роботи висвітлені у 6 статтях, 5 з яких опубліковані у наукових фахових виданнях, а також у 4 тезах доповідей.

Структура та обсяг дисертації. Дисертація складається зі вступу, огляду літератури, методів досліджень, розділів, що відображають результати власних досліджень, висновків та списку використаної наукової літератури, який містить 198 джерел. Роботу викладено на 125 сторінках машинопису, ілюстро- вано 20 рисунками та 8 таблицями.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Матеріали і методи досліджень. У дослідах використовували ізольовані й перфузовані серця кролів (52 шт.). Тварин анестезували тіопенталнатрієм (40 мг на 1 кг маси внутрішньовенно). Попередньо, за 30 хв. до наркозу, тваринам вводили гепарин - 500 ОД на 1 кг маси. Видалені серця поміщали в льодяний розчин Кребса-Хензелейта. Для перфузії серце підвішували на металеву канюлю, діаметр якої відповідав діаметрові аорти. Серця перфузували ретроградно відповідно до класичного методу Лангендорфа розчином Кребса-Хензелейта, насиченим 95% О2 i 5% СО2 при 37 0С. Пpo зміни скоротливості серця судили за тиском у латексному балончику, введеному в лівий шлуночок. Реєстрацію здійснювали за допомогою приладу Mirgograf 34 (Elema, Швеція). У відповідних серіях експериментів перфузію проводили за присутності карбахоліну, неорганічного міченого фосфату – [32P]Na2HPO4(50-70 мКі на 1 ммоль). Після закінчення перфузії серця швидко охолоджували в льодяному розчині Кребса-Хензелейта. Препарати сарколеми виділяли з лівого шлуночка серця кроля за методом Джонса і співавт. [Jones, 1979] з деякими модифікаціями [Воробец и др., 1988]. Всі етапи виділення здійснювали при температурі 2-4 0С.

Дослідження зв’язування GTP з сарколемою міокарда в дослідах in vitro проводилися за методом [Brandt, 1986] , використовуючи [3Н]GTP. GTPазну активність визначали за гідролізом [г-32Р]GTP [Liebman, 1990].

ADP-рибозилювання білків сарколеми проводили згідно з [Koц, 1990], використовуючи [32Р]NAD і кашлюковий токсин. Метаболізм поліфосфа- тидилінозитидів сарколеми визначали за включенням 32Р із [?-32Р] АТР в поліфосфатидилінозитиди. Фосфоліпіди із сарколеми екстрагували сумішшю хлороформ : метанол : 12н HCl (200 : 200 : 1) і розділяли в тонкому шарі силікагелю [Шрагин и др., 1988]. Плями інозитидових фосфоліпідів іденти- фікували авторадіографічно.

Інозитфосфати із тканин серця, після перфузії сердець у присутності міченого фосфату, екстрагували за допомогою HClO4 [Lapetina et al., 1985]. Для розділення інозитфосфатів використовували колонку Dawex, форміатну форму.

Активність протеїнкінази С і фосфорилювання білків сарколеми визначали за включенням 32Р із [г-32Р]АТР у білки мембран [Воробец и др., 1988; Курский и др., 1989]. Ідентифікацію білків сарколеми, що фосфорилюються в результаті протеїнкіназної реакції здійснювали згідно з описаними методиками [Курский и др., 1988]. Статистично-математичне опрацювання результатів досліджень проводили згідно з [Диамантопуло, 1990; Епанечников, 1988; Рокицкий, 1967].

РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ ТА ЇХ ОБГОВОРЕННЯ

Скоротливість ізольованого перфузованого серця при дії ?-адренергічних і М-холінергічного агоніста. Перш ніж розпочати вивчення властивостей G-білків і обміну фосфатидилінозитидів при дії М-холінергічного агоніста карбахоліну, необхідно було здійснити контроль скоротливості ізольованого перфузованого серця (рис. 1).

При перфузії ізольованого серця карбахоліном у концентрації 10-7 моль/л знижуються частота та амплітуда скорочення, що виявляється у зниженні систолічного тиску в лівому шлуночку серця. Для контролю функціональної активності серця перфузію здійснювали також у присутності ?-адренергічного агоніста ізопреналіну (10-7 моль/л) і активатора каталітичної субодиниці аденілатциклази - форсколіну (10-5 моль/л). На відміну від інгібуючого ефекту карбахоліну на скоротливість серця, ізопреналін і форсколін активують скоротливість.

Відомо, що впливи ізопреналіну і форсколіну пов’язані з активністю аденілатциклазної системи, що виявляється у підвищенні рівня сАМР і активації сАМР-залежної протеїнкінази [Rinaldi, 1982], а вплив карбахоліну – з обміном фосфатидилінозитидів, що виявляється в утворенні інозит-1,4,5-трифосфату та 1,2-діацилгліцерину, який активує протеїнкіназу С [Neer, 1995]. Таким чином, активація ?-адренергічних і М-холінергічних рецепторів в умовах перфузії ізольованого серця спричинює підвищення рівня вторинних месенджерів, які активують відповідні протеїнкінази і фосфорилювання певних білків. Через 3 хв після введення карбахоліну (10-9–10–6 моль/л) у перфузуючий розчин вимірювали систолічний тиск і частоту скорочень серця. Показано, що при підвищенні концентрації карбахоліну від 10-9 до 10-7 моль/л систолічний тиск знижується на 22%, а частота скорочень - на 17 %.

При концентрації карбахоліну 10-6 моль/л систолічний тиск був менший на 74%, а частота скорочень - на 67% стосовно контролю. Вищі концентрації карбахоліну повністю пригнічують систолічний тиск уже через 1 хв перфузії .

Характеристика отриманих препаратів сарколеми міокарда. Для вивчення GTP-зв’язуючих білків, які локалізовані в сарколемі, необхідно було отримати якнайбільш чисті препарати сарколеми міокарда та охарактеризувати їх. Існує досить багато методів отримання сарколемальної фракції міокарда [Воробец и др., 1989; Bartschat et al., 1980; Jones et al., 1979]. Різноманітність таких методів значною мірою свідчить про проблеми отримання препаратів сарколеми, які володіли б властивостями, подібними до тих, що є в інтактній тканині. Різні методи дають неоднаковий ступінь очистки сарколеми, що суттєво погіршує інтерпретацію та порівняння експериментальних даних, отриманих різними групами вчених.

У зв’язку з цим у початковій серії експериментів ми охарактеризували виділені препарати сарколеми з точки зору їх чистоти, тобто ступеня забруднення іншими субклітинними органелами.

Ферментативні активності. З’ясовано, що активність Na+, K+-АТРази (локалізованої винятково в сарколемі) везикульованих препаратів сарколеми міокарда збільшується стосовно нефракціонованого гомогенату більш, ніж у 20 разів, від 3,7 до 78,2 мкмоль Рі на 1 мг білка за годину.

Максимальні значення Nа+, К+-АТРазної активності, які ми спостерігали, аналогічні таким для високоочищених препаратів сарколеми міокарда собак [Jones et al., 1979] і бика [Flockerzi et al., 1983]. Активності таких маркерів сарколеми, як аденілатциклаза та 5’-нуклеотидаза, в наших препаратах були також максимальні та досягали 148±16,2 пмоль сАМР на І мг білка за І хв і 14,9±2,0 мкмоль Рі на І мг білка за І год відповідно, що свідчить про високий ступінь очистки препаратів сарколеми.

Отримавши високоочищені препарати сарколеми міокарда, які володіли високими активностями маркерних ферментів, можна було припустити, що в них збереглись функціонально активні G-білки і перейти до розв’язання основних задач – вивчення властивостей G-білків та обміну фосфатидил- інозитидів.

Характеристика GTP-зв’язуючих ділянок G-білків сарколеми міокарда при дії М-холінергічного агоніста карбахоліну. Подальші наші дослідження полягали у вивченні кінетичних характеристик процесу зв’язування GTP, який запускає активацію G-білків.

Криві зв’язування GTP у магнієвому та безмагнієвому середовищах свідчать про те, що існують дві ділянки зв’язування GTP: високо- та низькоафінні. Кількість місць зв’язування в середовищі без Mg2+ в низькоафінній ділянці приблизно в 10 разів перевищує кількість місць зв’язування у високоафінній ділянці. Bmax ділянок сарколеми міокарда високого споріднення до GTP дорівнює 8±0,8 пмоль/л на 1 мг білка, а Kd дорівнює 7,0*10-8 моль/л (табл. 1).

Таблиця 1

Властивості GТР-зв'язуючих білків сарколеми міокарда (М±m, n=4) |

Вmах , пмоль/мг білка | Кd , моль/л

Високо-

споріднені ділянки | Низько-

споріднені ділянки | Високо-

споріднені ділянки | Низько-

споріднені ділянки

Контроль | 8,0±0,8 | 84,0±5,0 | 7,0*10- 8 | 5,8*10 - 6

Карбахолін | 16,0±1,0 | 88,0±6,0 | 4,3*10 - 8 | 5,8*10 - 6

Карбахолін + атропін | 9,0±0,8 | 85,0±6,0 | 6,8*10 - 8 | 5,9*10 – 6

М-холінергічний агоніст карбахолін активує зв’язування GTP високоспорідненими ділянками, при цьому Kd знижується до 4,3*10-8 моль/л.

При підвищенні концентрації GTP в інкубаційній суміші виявляються ділянки зв’язування GTP з низьким спорідненням до GTP (Вmax = 84±5 пмоль на 1 мг білка, а Kd = 5,8*10-6 моль/л). Карбахолін (10-4 моль/л) не впливає на Kd ділянок з низьким спорідненням. Антагоніст М-холінорецепторів атропін (10-6 моль/л) запобігає активаційному ефекту карбахоліну і на високоспоріднене, і на низькоспоріднене зв’язування GTP.

Зв’язування GTP, очевидно, відбувається з GTP-зв’язуючими білками, які є посередниками між рецепторами та ефекторними біохімічними системами. Про це свідчать результати дослідження GTPазної активності препаратів сарколеми міокарда. За GTPазною активністю судять про наявність функціонально актив- них GTP-зв’язуючих білків.

GTPазна активність G-білків сарколеми міокарда при дії карбахоліну. Продемонстровано, що карбахолін (10-6-10-3 моль/л) активує GTPазну актив- ність, а атропін (10-6 моль/л) знімає активуючий вплив карбахоліну (рис.2). Найбільшою мірою GTPазна активність стимулюється карбахоліном у концентрації 10-4 моль/л. Нижчі концентрації карбахоліну (10-6-10-5 моль/л) меншою мірою активують GTPазну активність.

Проведено детальне вивчення впливу оптимальних концентрацій карбахоліну (10-4 моль/л) на GTPазну активність.

При оптимальних концентраціях GTP GTPазна активність зростає втричі, від 12,8,0 до 38,0,0 пмоль GTP на 1 мг білка за 1 хв. Атропін (10-6 моль/л) знижує ефект карбахоліну до 16,2,5 пмоль GTP на 1 мг білка за 1 хв.

Значення Кm для GTP становить1,5*10-7 моль/л, що відповідає Кm відомих спряжених білків. Враховуючи інформацію про існування різноманітних форм G-білків, можна вважати, що базальна GTPазна активність досліджуваних плазматичних мембран (12,8±2,0 пмоль Рі/мг білка за 1 хв) відповідає швидкості гідролізу GTP G-білками, які експресуються в даній клітинній системі. Вклад кожного з G-білків у базальне значення GTPазної активності з низьким Km буде залежати як від кількісного співвідношення між G-білками, присутніми в плазматичній мембрані, так і від відносної гідролітичної активності. Дані, отримані в експериментах по ADP-рибозилюванню високоафінних GTPаз бактеріальними токсинами, підтверджують це припущення.

Відомо, що карбахолін інгібує аденілатциклазну активність через Gб?–білок, а фосфоліпазу С активує через Gaq-білок [Neer, 1995]. Фосфоліпаза С також може активуватись ?г-?убодиницями Gi–білка . Таким чином, карбахолін через М-холінорецептори та систему G-білків може впливати на фосфо- рилювання сарколеми як за участю протеїнкінази А, так і за участю протеїнкінази С.

Раніше було показано, що активація протеїнкінази С везикульованих препаратів сарколеми міокарда спричинює стимуляцію АТР-залежного транспорту Са2+ [Курский и др., 1989]. Активація Са2+-помпи сприяє зниженню концентрації Са2+ в цитоплазмі, що може бути однією з причин гальмівного впливу карбахоліну на скоротливість серця, оскільки активація холінорецепторів індукує через Gaq-білок утворення 1,2-діацилгліцерину – активатора протеїнкінази С.

Вплив Mg2+, NaF, кашлюкового токсину на зв’язування GTP та GTPазну активність. Іони магнію (10 ммоль/л) суттєво знижують стосовно контролю зв’язування [3Н]GTP у сайті високої спорідненості і в сайті низької спорідненості до 1,6±0,2 і 4,9±0,4 пмоль/мг білка відповідно. При цьому Кd [3Н]GTP знижується в обох сайтах від 7,0*10-8 і 5,8*10-6 відповідно до 4,8*10-9 і 6,4*10-8 моль/л, що свідчить про підвищення спорідненості G-білків до GTP (табл. 2).

Таблиця 2

Вплив Mg2+ на Вmax та Кd для GTP G-білків сарколеми міокарда (М±m, n=4) |

Вmax , пмоль/мг білка | Kd , ммоль/л

Високо-споріднені ділянки | Низько-споріднені ділянки | Високо-споріднені ділянки | Низько-споріднені ділянки

Контроль | 8,0±0,8 | 84,0±5,0 | 7,0*10-8 | 5,8*10-6

Mg2+ | 1,6±0,2 | 4,9±0,4 | 4,8*10-9 | 6,4*10-8

Тобто в присутності Mg2+ спорідненість високо- і низькоафінної ділянки до GTP зростає. Можливо, це пов’язано з тим, що за відсутності екзогенного Mg2+ сам GTP не викликає дисоціації субодиниць G-білків, і це визначає знижену спорідненість гетеротримерного комплексу до GTP. Таким чином, різниця в Kd для зв’язування GTP у високо- і низькоафінній ділянці сарколеми міокарда відображає їх структурну різницю в процесі функціонування, залежну від Mg2+.

NaF, як активатор GTP-зв’язуючих білків, чинить гальмівний вплив на активовану карбахоліном GTPазну активність сарколеми міокарда (табл.3), оскільки він конкурентно блокує зв’язування GTP з G-білками [Stadel, Crooke, 1989]. Як кофактор у цих реакціях в інкубаційне середовище додавали AlCl3 [Авдонин, Ткачук, 1994; Stadel, Crooke, 1989]. У результаті взаємодії NaF і AlCl3 утворюється комплекс AlF4-, який використовується як інструмент для вивчення ролі G-білків у процесах трансмембранної передачі сигналів. Відомо, що AlF4- ефективно і зворотно активує гетеротримерні G-білки типів Gs, Gi, Gq, Gt [Neer, 1995].

Вважається, що комплекс AlF4- має структуру, подібну з фосфатною групою, і може взаємодіяти з GTP, зв’язуючись з ?-субодиницею G-білків.

Таблиця 3

Вплив NaF та ADP-рибозилювання на GTPазну активність G-білків сарколеми (М±m, n=4) |

GTPаза, пмоль 32Р/мг білка за 1хв | Кm, ммоль/л

Контроль | 12,8±2,0 | 1,5*10-7

NaF | 20,0±1,8 | ---

ADP-рибозилювання | 2,0±0,4 | 2,2*10-6

За присутності 10 ммоль/л NaF і 20 мкмоль/л AlCl3 активність ферменту знижувалась від 38,0 ± 4,0 в присутності карбахоліну до 20,0 ± 1,8 пмоль на 1 мг білка за 1 хв.

Зв’язування GTP і його гідроліз відбуваються на Gб–субодиниці, яка володіє ендогенною GTPазною активністю [Bourne et al., 1991]. Ця субодиниця піддається ADP-рибозилюванню. ADP-рибозилювання – інструмент для вивчення функціональної специфіки окремих G-білків. Відомо, що деякі бактеріальні токсини (кашлюковий, холерний, ботулінічний) можуть специфічно каталізувати перенесення ADP–рибози з NAD+ на залишки відповідних амінокислот у молекулах G-білків [Авдонин, Ткачук, 1994]. Відомо, що Gs-білок рибозилюється холерним токсином, а Gі-білок – кашлюковим токсином [ Clapham, Neer, 1993].

Цей методичний підхід ми використали для ідентифікації GTP-зв’язуючих білків у плазматичних мембранах серця.

Доведено, що ADP-рибозилювання сарколеми міокарда кашлюковим токсином призводить до гальмування GTPазної активності з 12,8±2,0 до 2,0±0,4 пмоль 32Р/мг білка за 1хв. При концентрації [?32P]GTP 100 мкмоль/л константа швидкості GTPазної реакції в контролі дорівнює 0,011 хв-1, а ADP-рибозилювання знижує її до 0,0017 хв-1. За відсутності Mg2+ константа швидкості GTPазної реакції зростає приблизно вдвічі як у контролі, так і в ADP-рибозильованих мембранах. Ці результати певною мірою узгоджуються з даними літератури, отриманими на гладких м’язах . Кm для GTP у GTPазній реакції в нативних мембранах становить 1,5*10-7моль/л, а в ADP-рибозильованих – 2,2*10-6 ммоль/л . Це свідчить про зниження спорідненості модифікованого рибозилюванням G-білка до GTP, GTPазна активність його при цьому теж знижується. Отримані дані свідчать про те, що ADP-рибозилювання по-різному впливає на на зв’язуючу і гідролізуючу ділянки Gб-cубодиниці [Neer, 1995].

Таким чином, на ізольованих препаратах сарколеми міокарда вивчено зв’язування GTP, GTPазну активність мембран, їх чутливість до ADP-рибозилювання, NaF, Mg2+, а також М-холінергічну рецепторну регуляцію зв’язування GTP і GTPазної активності. Результати свідчать про наявність в ізольованих препаратах сарколеми міокарда функціонально активних G-білків, які стабілізуються в присутності Mg2+, чутливі до NaF, можуть ADP-рибозилюватись кашлюковим токсином, що припускає наявність у гетеротримерному комплексі Gб?-субодиниці, функція якої полягає в інгібуванні активності аденілатциклази. Ці препарати можна використовувати як адекватну модель для вивчення властивостей GTP-зв’язуючих білків у системі “рецептор – G-білок – ефекторний фермент – транспорт Са2+” при передачі гормональ- ного сигналу .

Утворення інозит-1,4,5-трифосфату. Коли серця перфузують 32Рі, фосфат використовують у кардіоміоцитах для синтезу [?-32Р]АТР, а вже ?-фосфат із АТР включають у фосфатидилінозитиди. Після дії карбахоліну на М-рецептори сарколеми активується фосфоліпаза С, яка гідролізує фосфатидилінозит-4,5-дифосфат до інозит-1,4,5-трифосфату та 1,2-діацил- гліцерину [Hokin, 1985]. За присутності АТР відновлюється рівень фосфатидилінозит-4,5-дифосфату за рахунок фосфорилювання фосфати-дилінозит-4-фосфату відповідною кіназою. Рівень фосфатидилінозит-4-фосфату поповнюється в результаті фосфорилювання фосфатидилінозиту за допомогою фосфатидилінозиткінази.

Отримані нами профілі елюції екстрактів [32Р]-інозитфосфатів із сарколеми контрольних та перфузованих карбахоліном сердець показали, що введення карбахоліну збільшує рівень [32Р]інозит-1,4,5-трифосфату в кілька разів (рис.3).

Підвищення рівня інозит-1,4-дифосфату при дії карбахоліну пояснюється тим, що І-1,4,5-Р3 гідролізується до І-1,4-Р2 фосфатазою, яка відщеплює фосфат у п’ятому положенні І-1,4,5-Р3. Висока активність фосфатаз не дає змоги отримати точні кількісні результати стосовно вмісту інозит-1,4,5-трифосфату. За нашими результатами рівень включеного міченого фосфату на І-1,4,5-Р3 у контролі складає 3,6±0,2 нмоль на 1 г тканини, а при дії карбахоліну зростає до 8,7±0,3 нмоль на 1 г тканини. Ймовірно, в цьому випадку інозитфосфат представлений інозит-1,4,5-трифосфатом, оскільки в серці не знайдені ферментні системи, які забезпечували б утворення інозит-1,3,4-трифосфату [Ford et al., 1992]. Інозит-1,4,5-трифосфат швидко перетворюється на інозит-1,4-дифосфат за допомогою відповідної фосфатази, тому багато авторів для характеристики впливу рецепторних агоністів чи антагоністів на обмін фосфатидилінозитидів визначають сумарний рівень усіх інозитфосфатів або тільки рівень інозит-1,4-дифосфату. Ми виявили підвищення рівня [32P]інозит-1,4,5-трифосфату в ізольованому серці кроля через 1 хв від початку перфузії серця карбахоліном. Паралельно також підвищувався рівень [32P]інозит-1,4-дифосфату, що свідчить про можливе дефосфорилювання І-1,4,5-Р3 до І-1,4-Р2. Загалом ці результати вказують на активацію фосфоліпази С карбахоліном.

Рис.3. Профілі елюції 32Р-інозитфосфатів з екстрактів серця кроля, яке перфузували з 32Рі:

1 – контроль; 2 - карбахолін, 10-7 моль/л.

Дослідження включення 32Р у фосфатидилінозитиди сарколеми міокарда при перфузії ізольованих сердець 32Рі показало, що рівень 32Р у фосфа-тидилінозит-4-фосфаті та фосфатидилінозит-4,5-дифосфаті в дослідах з карбахоліном (10-7 моль/л) вищий відносно контролю в 2,6 та 2,3 разу відповідно (рис.4).

Це пояснюється тим, що гідроліз РІ-4,5-Р2, який стимулюється карбахоліном, про що свідчить підвищення рівня І-1,4,5-Р3, супроводжується включенням 32Рі з АТР у фосфатидилінозитид та фосфатидилінозит-4-фосфат за участю відповідних кіназ. У результаті гідролізу фосфатидилінозит-4,5-дифосфату, крім І-1,4,5-Р3, утворюється інший продукт – діацилгліцерин, який є активатором протеїнкінази С.

Активність мембранозв’язаної протеїнкінази С при дії карбахоліну. Дослідження протеїнкінази С і фосфорилювання сарколеми міокарда дуже важливе, оскільки кожен фосфорильований білок виконує відповідну функцію в клітині, а тому необхідно знати, які білки фосфорилюються в тих чи інших умовах. Зараз добре відомо, що фосфорилювання сарколеми міокарда протеїнкіназою С (Са2+-фосфоліпідзалежною протеїнкіназою) відіграє важливу роль у регуляції активності Са2+-транспортуючих систем і відповідно в скоротливості міокарда [Воробец и др., 1988; Курский и др., 1989; Hosey et al., 1995]. Ця протеїнкіназа виявлена як у сарколемі, так і в розчинній фракції клітин. Властивості розчинного ферменту вивчені досить добре, а мембранозв’язаного - меншою мірою. Нами з’ясовано, що за відсутності екзогенного ферменту, в присутності Са2+, препарати сарколеми міокарда досить інтенсивно фосфорилюються (53 пмоль 32Р на І мг білка за І хв) ендогенними протеїнкіназами, ймовірно, Са2+-фосфоліпід- і Са2+-кальмо-дулінзалежними. За відсутності екзогенного ферменту, в присутності Са2+ і активного форболового ефіру (10-8 г/мл), який активує протеїнкіназу С, інтенсивність фосфорилювання сарколеми зростає до 502 пмоль 32Р/мг білка за 1 хв. 4 ?-форбол-12,13-дидеканоат, який не є активатором РК-С, не впливає на фосфорилювання. Додавання в інкубаційне середовище інгібітора РК-С поліміксину В разом з активним форболовим ефіром запобігає фосфорилюванню білків сарколеми.

За допомогою електрофорезу фосфорильованих препаратів сарколеми міокарда в DS-Na-полі- акриламідному гелі виявлена наявність щонайменше 40 зафарбованих кумассі зон, електрофоретична актив- ність яких відповідає білкам з Мm , яка варіює від 10 до 300 кДа. При подальшій радіоавтографії цього гелю виявилося, що основна кількість 32Р-фосфату включається в 7 білкових субстратів.

При порівнянні фосфорилювання білків сарколеми в різних умовах – у контролі і під час перфузії серця з карбахоліном -простежується значна активація вклю-чення 32Рі у білки в разі стимуляції М-холінорецепторів карбахоліном. Зокрема, активується фосфорилювання білків з Мm 94, 87, 78, 58, 54, 46, 42, 24, 15, 11кДа (рис.5).

Роль білків сарколеми міокарда, що фосфорилюються, не цілком з'ясована. Припускається, що білки з Мm 42, 24, 11 кДа пов’язані з роботою різних Са2+-транспортуючих систем [Kikkawa, Nishizuka, 1986].

На основі отриманих даних запропонована гіпотетична схема механізму впливу карбахоліну на регуляцію скоротливості серця на перших етапах реалізації гормонального сигналу (рис.6).

Згідно цієї схеми, взаємодія агоніста з М-холінорецепторами, призводить до активації GTP-зв’язуючих білків двох типів: Gi i Gq. Активація Gi-білка інгібує активність аденілатциклази, що супроводжується зменшенням кількості сАМР і зменшенням активності сАМР-залежних протеїнкіназ. Це, в свою чергу, призводить до зниження рівня фосфорилювання таких білків як фосфоламбан, кальційдуктин та інших і пригнічення активності Са2+-транспортуючих

Рис. 6. Механізм дії М-холінергічних агоністів на клітину шляхом активації G-білків

систем сарколеми і саркоплазматичного ретикулуму. В результаті функціо- нування цієї системи скоротливість міокарда повинна знижуватись. З іншого боку, активація Gq-білка стимулює фосфоліпазу С, що призводить до інтенсифікації обміну фосфатидилінозитидів і, в результаті, до збільшення в клітинах кількості інозит-1,4,5-трифосфату та діацилгліцерину. Перший викликає звільнення Са2+ із саркоплазматичного ретикулуму в цитозоль, а другий активує протеїнкіназу С і фосфорилювання відповідних білків, які теж модулюють активність Са2+-транспортуючих систем сарколеми та саркоплазматичного ретикулуму. Клітинна відповідь, у даному випадку скоротливість міокарда, буде визначатись результатом взаємодії двох систем: аденілатциклазної та фосфатидилінозитидної.

Як свідчать наші результати, мускаринова холінергічна регуляція скоротливості серця опосередковується через Gі- і Gq-білки, при цьому задію- ється фосфатидилінозитидна і, ймовірно, аденілатциклазна системи.

ВИСНОВКИ

У дисертації відповідно до поставленої мети та задач дослідження вперше отримано підтвердження наявності в препаратах сарколеми міокарда функціонально активної системи передачі гормонального сигналу в клітину через М-холінорецептори, GTP-зв’язуючі білки, обмін фосфатидилінозитидів, протеїнкіназу С, а також вивчені властивості G-білків і стан фосфатидил- інозитидної системи. Такий ланцюг передачі гормонального сигналу забезпечує М-холінергічну регуляцію скоротливості міокарда, що підтверджується наступним.

1.

2.

3.

4.

5.

6.

7. В ізольованих препаратах сарколеми міокарда наявний фізіологічно активний ланцюг передачі гормонального сигналу від рецептора на ефекторну систему, який включає “рецептор – G-білок – обмін фосфати- дилінозитидів – вторинні месенджери – інозит-1,4,5-трифосфат і діацилгліцерин – протеїнкіназа С - фосфорилювання білків”. Препарати сарколеми можуть бути моделлю для вивчення молекулярних механізмів передачі гормонального сигналу.

СПИСОК ПРАЦЬ, ОПУБЛІКОВАНИХ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

1.

2.

3.

4.

5.

6.

7.

8.

9.

10.

АНОТАЦІЇ

Шикула Р.Г. GTP-зв’язуючі білки та фосфатидилінозитидний цикл при М-холінергічній регуляції скоротливості серця. – Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата медичних наук за спеціальністю 03.00.04 - біохімія. – Інститут геронтології АМН України. - Київ. – 2001.

Дисертацію присвячено дослідженню властивостей гетеротримерних GTP-зв’язуючих білків та обміну фосфатидилінозитидів при активації М-холінергічних рецепторів серця. Встановлено, що мускариновий холінергічний агоніст карбахолін в умовах перфузії ізольованого серця кроля блокує скоротливу функцію міокарда. Ідентифіковано ділянки G-білків з високою і низькою спорідненістю до зв’язування GTP, визначено їх константи дисоціації для GTP. Продемонстровано активацію карбахоліном зв’язування GTP, стимуляцію ним GTPазної активності сарколеми. Перфузія ізольованого серця карбахоліном індукує фосфатидилінозитидний цикл, що призводить до збільшення утворення вторинного месенджера інозит–1,4,5–трифосфату. Доведено, що в препаратах сарколеми міокарда наявні функціонально активні Gi- та Gq-білки, про що свідчить ADP-рибозилювання в присутності кашлюкового токсину та активація обміну фосфатидилінозитидів при стимуляції М-холінергічних рецепторів.

Ключові слова: міокард, сарколема, G-білки, карбахолін, М-холінорецептори, перфузія, фосфатидилінозитиди.

Шикула Р.Г. GTP–связывающие белки и фосфатидилинозитидный цикл при М–холинергической регуляции сократимости сердца. – Рукопись.

Диссертация на соискание учёной степени кандидата медицинских наук по специальности 03.00.04 – биохимия. – Институт геронтологии АМН Украины. – Киев. – 2001.

Диссертация посвящена изучению свойств гетеротримерных GTP-связывающих белков и обмена фосфатидилинозитидов при активации М-холинергических рецепторов сердца. Эти системы непосредственно участвуют в передаче гормонального сигнала от рецептора на эффектор, который определяет клеточный ответ.

Целью работы было исследование функционального состояния GTP-связывающих белков и фосфатидилинозитидной системы при М-холинергической рецепторной регуляции сократимости изолированных перфузированных сердец кроликов.

Эксперименты проводились на изолированных и перфузированных сердцах кроликов. Сердца перфузировали ретроградно соответственно классическому методу Лангендорфа раствором Кребса–Хензелейта. О изменениях сокращаемости сердца судили по давлению в латексном баллончике, введенном в левый желудочек. В соответственных сериях экспериментов перфузию проводили в присутствии карбахолина, атропина, неорганического меченого фосфата. Препараты сарколеммы выделяли с левого желудочка сердца кролика по методу Джонса с некоторыми модификациями. Определение GTP-связывающих свойств G-белков проводили с помощью исследования связывания [3H]GTP из сарколеммой миокарда. GTPазную активность определяли по гидролизу [-32 P] GTP на основе метода Лиебмана. Для исследования действия карбахолина и атропина на GTP-связывающие белки сарколемму обрабатывали аламетицином. ADP-рибозилирование белков сарколеммы проводили, используя [32P]NAD и коклюшный токсин. Белки разделяли электрофоретически в градиенте 8-15% полиакриламидного геля в присутствии DS-Na. После высушивания гели поддавали авторадиографии 16-48 часов. Метаболизм полифосфатидилинозитидов сарколеммы миокарда изучали по кинетике включения 32Р в фосфатидилинозитиды. Для выделения инозитфосфатов в перфузирующий раствор вводили меченный фосфат [32P]Na2HPO4 .Разделение инозитфосфатов осуществлялось на колонке Dawex. Активность протеинкиназы С и фосфорилирования белков сарколеммы определяли по включению 32Р из [- 32 P] АТР в белки мембран.

Впервые в комплексе изучено отдельные участки передачи гормонального сигнала при активации мускариновых холинергических рецепторов сарколеммы миокарда. В частности, исследовано влияние карбахолина на сократимость сердца, на свойства G-белков и их GTPазную активность.

Показано, что мускариновый холинергический агонист карбахолин в условиях перфузии изолированного сердца кролика блокирует сократительную функцию миокарда. Эффект карбахолина на частоту сокращений и давление в левом желудочке был дозозависимым. Идентифицировано участки G-белков с высоким и низким сродством к связыванию GTP, определено их константы диссоциации для GTP. Карбахолин активирует связывание GTP, тогда как антагонист мускариновых рецепторов атропин предупреждает активирующий эффект карбахолина на связывание GTP.

Продемонстрировано стимуляцию карбахолином GTPазной активности сарколеммы, а также ингибирующее влияние атропина на активацию GTPазы карбахолином. Активность GTPазы сарколеммы миокарда чувствительна к влияниям NaF, Mg2+, ADP-рибозилирования.

Установлено, что перфузия изолированного сердца карбахолином индуци- рует фосфатидилинозитидный цикл. Включение 32Рі в фосфатидилинозит-4-фосфат и фосфатидилинозит-4,5-дифосфат возрастает по отношению к контро- лю. Это ведёт к увеличению продукции вторичного мессенджера инозит-1,4,5-трифосфата. Основная функция этого вторичного посредника состоит в выходе Са2+ из саркоплазматического ретикулума.

Доказано, что в препаратах сарколеммы миокарда присутствуют функцио- нально активные Gi - и Gq-белки, о чём свидетельствует ADP-рибозилиро- вание в присутствии коклюшного токсина и активация обмена фосфатидил- инозитидов при стимуляции М-холинергических рецепторов.

Показано, что карбахолин индуцирует активность эндогенной протеинкиназы С сарколеммы миокарда, которая активируется диацил- глицерином, образованным в результате гидролиза фосфатидилинозит-4,5-дифосфата.

Идентифицированы белковые субстраты фосфорилирования сарколеммы миокарда. Установлено, что карбахолин стимулирует фосфорилирование белков сарколеммы с молекулярными массами 94, 87, 78, 58, 54, 46, 42, 24, 15 и 11 кДа.

В изолированных препаратах сарколеммы миокарда присутствует физиологически активная цепь передачи гормонального