КИЇВСЬКИЙ НАЦІОНАЛЬНИЙ УНІВЕРСИТЕТ

ІМЕНІ ТАРАСА ШЕВЧЕНКА

Чорна Валентина Іванівна

УДК: 577.152.34; 577.349

ЦИСТЕЇНОВІ КАТЕПСИНИ В УМОВАХ ПРОМЕНЕВОГО УРАЖЕННЯ

ТА ЗЛОЯКІСНОГО РОСТУ

03.00.01 – радіобіологія

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня

доктора біологічних наук

Київ – 2001

Дисертацією є рукопис

Робота виконана в Дніпропетровському національному

університеті Міністерства освіти і науки України

Науковий консультант - академік НАН України,

Професор Кучеренко Микола Євдокимович,

Київський національний університет імені Тараса Шевченка,

завідувач кафедри біохімії

Офіційні опоненти:- доктор біологічних наук

Дружина Микола Олександрович,

Інститут експериментальної патології, онкології та

радіобіології ім. Р.Є. Кавецького НАН України, відділ біофізики

канцерогенезу, провідний науковий співробітник

доктор біологічних наук

Кутлахмедов Юрій Олексійович,

Інститут клітинної біології та генетичної інженерії НАН України,

відділ біофізики та радіобіології,

завідувач лабораторії радіоекології

доктор медичних наук

Чаяло Петро Петрович,

Науковий центр радіаційної медицини АМН України,

завідувач лабораторії радіаційної біохімії

Провідна установа Інститут онкології АМН України

Захист відбудеться “ 22 ” жовтня 2001 р. о 14 годині на засіданні

спеціалізованої вченої ради Д 26.001.24 у Київському національному

університеті імені Тараса Шевченка за адресою:

вул. Академіка Глушкова, 2, біологічний факультет. ауд. 215

Поштова адреса: 01033, Київ, вул. Володимирська, 64

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Київського

національного університету імені Тараса Шевченка за адресою:

вул. Володимирська. 58

Автореферат розісланий “ 20 .” вересня 2001 р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради Брайон О.В.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми досліджень. Дослідження механізмів залежності біохімічних змін від дози опромінення є актуальною проблемою радіаційної біохімії як в загальнотеоретичному аспекті, так і в плані їх практичного застосування за специфічних обставин, зокрема тих, що виникли внаслідок аварії на Чорнобильській АЕС (Кучеренко М. та ін., 1977; Hasegawa M. еt al., 1997; Smit J. et al., 1994). За умов сучасності актуальності набула проблема спільності і відмінності в механізмах дії гострого і хронічного опромінення, особливо це стосується дії низьких рівнів іонізуючого випромінювання, коли головну роль у виникненні радіаційних змін відіграють ураження мембранних структур (Кузин А., 1970, 1977, 1989; Барабой В., 1996; Эйдус Л., 1994; Гераськин С., 1995). З позиції класичної радіобіології неможливо пояснити появу несподівано значних ефектів, які спричиняються за дії малих доз радіації (Бурлакова Е., 1994; Спитковский Д., 1992; Серкиз Я. и др., 1992).

Прогнозування можливих біологічних ефектів, зумовлених дією малих доз радіації на ссавців, викликає необхідність пошуку тестів, які б дозволили адекватно оцінити ступінь цього впливу. Одним із таких перспективних напрямків вважають дослідження активності клітинних лізосомальних протеіназ та їх інгібіторів, оскільки протеоліз є важливою ланкою в регуляції багатьох біохімічних процесів (Азарян А., 1989; Schwartz M., 1995; Bednarski E. et al., 1997). Аварія на Чорнобильській АЕС виявила, що найменш дослідженими при дії малих доз радіації є біохімічні процеси в ЦНС.

Найбільш гострими питаннями, які хвилюють вчених, лікарів є генетичні ефекти радіаційного забруднення після аварії на ЧАЕС і їх наслідки для здоров’я наступних поколінь (Пилинская М., 1999). Аналіз літератури свідчить про недостатність клінічних і експериментальних даних стосовно особливостей стохастичних і нестохастичних ефектів у нащадків опромінених батьків (Абдель-Гани А. и др., 1999; Лазюк Т. и др., 1999). При дії іонізуючих випромінювань в малих дозах виникають небажані віддалені наслідки: злоякісні новоутворення, спадкові ефекти (Нягу А., 1991; Вейнберг Г. и др., 1999; Косенко М. и др., 1999). Значна кількість морфо-функціональних досліджень свідчить про високу чутливість до дії малих доз радіації організму під час ембріонального та постнатального розвитку (Kimler B. et al., 1994; Холодова Н. и др., 1996). Одним із наслідків радіаційного впливу на організм є розвиток гіпоксичного стану (Keyeux A. et al., 1997). Поряд з модифікацією гемодинамічних показників, радіація сприяє також розвитку гемічного гіпоксичного стану. Особливо небезпечне гіпоксичне ушкодження для мозку, що розвивається (Cwag B. et al., 1995). Гемічний тип гіпоксії є найменш вивченим типом з усіх гіпоксичних станів (Ярмоненко С., 1997; Park E. et al., 1998). Недостатньо вивчені і механізми впливу гіпоксії, індукованої радіацією на формування, диференціювання і дозрівання різних мозкових структур ЦНС, а дані про стан лізосомально-вакуолярного апарату клітин мозку за умов гіпоксії дуже обмежені (Hill I. et al., 1997; Tsuchiya K. et al., 1999).

Актуальність вивчення лізосомальних цистеїнових катепсинів нервової системи визначається, з одного боку, тими функціями, які вони виконують в клітині, а з другого – тією роллю, яку ці ферменти відіграють в системі відповіді організму на дію шкідливих факторів оточуючого середовища. Дослідження пептидгідролаз головного мозку започатковано ще роботами академіка Палладіна О.В., Полякової Н.М., Бєліка Я.В., Галояна А.А., і з того часу значна кількість досліджень присвячена з’ясуванню ролі пептидгідролаз при патологіях мозку (Jung H. et al., 1999; Youg B. et al., 2000), але ряд питань залишаються нерозкритими і в наш час, до них відноситься роль катепсинів в нейрохімічних механізмах онтогенетичного розвитку при радіаційному і гіпоксичному ушкодженнях мозку, пухлинному рості та інвазивних процесах (Rooprai H. et al., 1997; Cataldo A. et al., 1997).

Пошуки засобів ефективного поліпшення променевої терапії пухлин мають на меті подолання радіорезистентності, обумовленої існуванням фракції гіпоксичних клітин. Вивчаються можливості посилення променевого ураження пухлинних клітин шляхом штучного підвищення їх радіочутливості за допомогою радіосенсибілізаторів хімічної і фізичної природи. В променевій терапії злоякісних новоутворень проблема радіорезистентності пухлинних клітин має критичне значення, оскільки обмежує ефект лікування і є причиною поновлення росту пухлин, виникнення рецидивів і метастазів. Аналіз даних літератури свідчить, що біохімічні механізми гіпоксирадіотерапії вивчені недостатньо (Ярмоненко С., 1980; Хворостенко М. и др., 1986). Таким чином, викладені дані зумовлюють актуальність та доцільність проведення досліджень в цих напрямках. Зважаючи на значне число осіб, що постраждали внаслідок аварії на Чорнобильській АЕС, розкриття молекулярних механізмів порушень функції ЦНС має велике медико-соціальне значення.

Звязок з науковою тематикою організації. Робота відповідає тематиці науково-дослідних робіт: - інституту біології Дніпропетровського національного університету та виконана у рамках держбюджетних тем Міністерства освіти України: № 02-20-97 “Фундаментальні дослідження впливу синергічної дії екопатогенних чинників та наукове обгрунтування нових комплексних методів діагностики, корекції та профілактики порушень стану здоров’я населення”; № 40-94 “ Дослідження нервовоспецифічних білків у нормі та за наявності факторів ризику з ціллю розробки методів діагностики патологічних станів дітей”; - кафедри біофізики і біохімії у рамках держбюджетних тем Міністерства освіти № 208-76, №50-81, № 44-86.

Мета і задачі дослідження. Метою даної роботи стало експериментальне дослідження молекулярно-клітинних механізмів змін структурно-функціонального стану лізосомальних цистеїнових катепсинів В, L, Н мозкових структур ЦНС за умов дії різних доз іонізуючої радіації, гіпоксії та пухлинного росту. Для досягнення поставленої мети необхідно було вирішити наступні задачі.

1. На основі кількісного аналізу динаміки різних форм активності лізосомальних цистеїнових катепсинів В, L, Н та зміни їх компартменталізації у функціонально і морфологічно різних структурах ЦНС визначити спільні і відмінні особливості дії надлетальних (50, 100, 200 Гр) і малих доз іонізуючої радіації (5; 10; 20; 25 сГр) в динаміці радіаційного ураження.

2. З’ясувати роль цистеїнових катепсинів В, L, Н в радіаційно-індукованих змінах катаболізму у функціонально і морфологічно різних структурах ЦНС за умов одноразового та фракціонованого рентгенівського опромінення за дози 25 сГр.

3. Визначити співвідношення між радіаційно-індукованими зрушеннями активності і компартменталізації цистеїнових катепсинів головного мозку нащадків першої генерації опромінених щурів в період постнатального розвитку.

4. Оцінити активність цистеїнових катепсинів та ступінь вивільнення їх із лізосомально-вакуолярного апарату клітин головного мозку дорослих щурів за умов експериментальної гемічної гіпоксії (нітритної метгемоглобінемії).

5. Дослідити механізм дії пренатальної гемічної гіпоксії на розподіл різних форм активності цистеїнових катепсинів у структурах головного мозку нащадків в динаміці постнатального розвитку.

6. Визначити причинно-наслідковий зв’язок тканинного і плазматичного протеолізу за рівнями активності лізосомальних цистеїнових катепсинів В, L, Н у сироватці крові ліквідаторів аварії на ЧАЕС, опромінених і гіпоксичних щурів з метою обґрунтування можливості застосування цього показника як діагностико-прогностичного тесту патологічного стану.

7. Вивчити роль високоочищених препаратів цистеїнових катепсинів головного мозку в деградації нейроспецифічних білків.

8. Провести визначення рівнів активності катепсинів В, L, Н у пухлинах головного мозку з різною гістоструктурою, гістогенезом та ступенем злоякісності. Виділити, очистити та виявити зміни фізико-хімічних властивостей катепсинів В, L, Н при злоякісній трансформації.

9. Встановити вплив пухлинного процесу та променевого тотального і локального опромінення на активність цистеїнових катепсинів пухлини і тканин щурів-пухлиноносіїв із застосуванням газогіпоксичної суміші (ГГС-10), а також роль відновленого глутатіону в процесі пухлинного росту.

10. З'ясувати загальні механізми пошкоджень лізосомально-вакуолярного апарату клітин головного мозку індукованих радіацією, пухлинною інвазією та гіпоксією за змінами різних форм активності і компартменталізації та деяких фізико-хімічних властивостей цистеїнових катепсинів.

Наукова новизна одержаних результатів. В результаті проведених досліджень вперше з’ясована роль зміни активності, компартменталізації та фізико-хімічних властивостей лізосомальних цистеїнових катепсинів В, L, Н ЦНС у біохімічних механізмах дії іонізуючої радіації, гіпоксії, злоякісного росту. В динаміці перебігу ЦНС-синдрому визначено дозозалежне підвищення активності лізосомальних катепсинів головного мозку і зміни їх компартменталізації.

У діапазоні малих доз радіації вперше встановлена залежність зміни активності катепсинів від дози з можливим тригерним переходом клітини на новий рівень протеолізу за порогової дози 25 сГр. Порівняльний аналіз закономірних змін активності цистеїнових катепсинів В, L, Н головного мозку у формуванні адаптивної відповіді на тотальне одноразове і фракціоноване опромінення (25 сГр) свідчить про менш ефективну лабілізацію мембран лізосом за співвідношеннями вільної і неседиментованої форм активності катепсинів клітин кори великих півкуль, гіпокампу, мозочку, середнього мозку, Варолієвого мосту і смугастого тіла, а також відповідним вивільненням цистеїнових катепсинів у кров після фракціонованого опромінення.

Виявлено значне підвищення активності цистеїнових катепсинів в ранні періоди постнатального розвитку і з’ясована адаптивна спрямованість встановлених змін. Вперше показано, що опромінення батьків (фракціоноване – 25 сГр) спричиняє різний ступінь активації цистеїнових катепсинів у функціонально і морфологічно різних структурах головного мозку нащадків першого покоління в залежності від того, хто з батьків був опромінений, і від терміну онтогенетичного розвитку. Запропонована концепція про можливу функціональну роль цистеїнових катепсинів в онтогенезі в нормі і при патологічних станах.

З’ясована роль гемічної гіпоксії у розвитку радіобіологічних ефектів малих доз радіації. Вперше встановлено, що метгемоглобінемія середньої тяжкості спричиняє зміни активності цистеїнових катепсинів головного мозку статевозрілих щурів і нащадків, подібні до ефектів опромінення. Більш істотні зміни активності катепсинів В, L, Н у сироватці крові нащадків, що зазнали пренатальної дії гемічної гіпоксії, в порівнянні з дорослими щурами, свідчать про більшу уразливість до гіпоксичного впливу організму, що розвивається.

Встановлено, що розвиток пухлини (саркома 45) індукує зміни активності цистеїнових катепсинів як в самих пухлинах, так і в органах тварин-пухлиноносіїв. Визначені різноспрямовані зміни променевих реакцій пухлини і нормальних тканин за рівнями активності катепсинів В, L, Н. Встановлено, що застосування газогіпоксичної суміші – ГГС-10 в процесі опромінення обумовлює радіозахисний ефект нормальних тканин при відсутності захисту пухлини.

Досліджено вміст глутатіону (GSH, GSSG) у доброякісних і злоякісних пухлинах головного мозку. Показано, що у пухлинах концентрація глутатіону знижується залежно від гістоструктури пухлини. Порівняльний аналіз фізико-хімічних властивостей (Mr, Vmax, Km, pHопт.) високоочищених катепсинів В, L, Н із тканин мозку і пухлин головного мозку, виявив різницю кінетичних параметрів, рівнів активності катепсинів у пухлинах і нормальних тканинах.

Вперше визначена роль цистеїнових катепсинів В, L, Н головного мозку у деградації нейроспецифічних білків.

На основі отриманих даних та даних літератури розроблена узагальнена схема розвитку радіаційних і гіпоксичних порушень стану лізосомально-вакуолярного апарату клітин ЦНС за змінами рівнів різних форм активності, компартменталізації і фізико-хімічних властивостей лізосомальних цистеїнових катепсинів В, L, Н.

Практичне значення одержаних результатів. Результати проведених досліджень і сформульовані на їх підставі висновки можуть мати загальнотеоретичне і практичне значення для розвитку радіаційної біохімії, клінічної радіології, радіобіології, радіаційної біофізики.

Теоретичне значення роботи полягає в отриманні нових даних, які вносять певний вклад в розробку проблеми механізмів адаптаційної відповіді лізосомально-вакуолярного апарату клітин ЦНС на вплив іонізуючої радіації з різною інтенсивністю, гіпоксії та пухлинної інвазії. Результати проведених досліджень свідчать, що ефекти малих доз іонізуючої радіації зумовлені пошкодженнями біомембран завдяки активації лізосомальних цистеїнових катепсинів клітин нервової тканини; вони дозволяють прогнозувати характер і рівень змін активності катепсинів, ступінь лабілізації мембран лізосом структур головного мозку дорослих щурів і мозку в постнатальному розвитку для певного діапазону доз і часу після опромінення.

Визначення показників рівня активності цистеїнових катепсинів В, L, Н у сироватці крові опромінених щурів може бути інформативним методом оцінки (тестом) пошкоджуючого ефекту іонізуючої радіації і дозволяє прогнозувати ранні функціональні ураження, а також ризик появи віддалених наслідків. Так, у крові ліквідаторів аварії на ЧАЕС встановлені довготривалі і відповідні поглинутим дозам підвищення рівнів активності досліджуваних цистеїнових лізосомальних катепсинів.

Закономірний характер змін активності цистеїнових катепсинів при пухлинному рості і променевій терапії, їх протилежна спрямованість, залежність цих зрушень від дози і режиму опромінення, а також від стадії пухлинного процесу і ефекту променевої деструкції пухлини свідчить про принципову можливість використання тесту активності лізосомальних катепсинів в якості об’єктивного показника реакції організму на променеву дію і ефективність променевої терапії пухлин.

Результати досліджень входять до програми курсу лекцій “Радіобіологія”, для студентів біолого-екологічного факультету Дніпропетровського національного університету. Отримані результати використовуються з лікувально-діагностичними цілями при проведенні клініко-біохімічних аналізів в Українському державному науково-дослідному інституті медико-соціальних проблем інвалідності.

Особистий внесок здобувача. Автором особисто розроблена наукова концепція програм та методологія досліджень, інформаційний пошук та оцінка літературних даних, виконані експериментальні дослідження, самостійно проведений аналіз первинного матеріалу, підготовлені друковані праці. Робота виконана автором самостійно, що підтверджено звітами про НДР №№ держреєстрації 76033340, 01860018175, 81067400, науковими публікаціями, доповідями на наукових зїздах і конференціях. Автор була науковим керівником держбюджетної теми № 40-96 та науковим керівником підрозділу держбюджетної теми № 02-20-97. Результати деяких підрозділів отримані безпосередньо автором та за участі аспірантів кафедри біофізики та біохімії (Ліхолат О.А. – підрозділи 6.1, 8.1, 8.2; Лещінська І.О – підрозділ 3.3; Педан Л.Ф.- підрозділ 6.2.1). Отримані результати викладені у спільних публікаціях. Публікації у співавторстві написані за безпосередньою участю дисертанта. У дисертації не використовувались ідеї або розробки, які належать співавторам публікацій

Апробація результатів дисертації. Результати досліджень були представлені на наступних конгресах, симпозіумах та конференціях: ІІ-Всесоюзний симпозіум “Структура и функции лизосом” (Новосибірськ, 1980); IV Всесоюзный симпозиум по медицинской энзимологии (Алма-Ата, 1983); Всесоюзний симпозіум “Механизмы пластичности мозга при функциональных и патологических воздействиях” (Махачкала, 1982); Республіканська наукова конференція “Біохімія-медицині” (Одеса, 1981); VIII Объединенный симпозиум биохимических обществ СССР и ГДР (Рига, 1985); IV Український біохімічний зїзд (1982); V Всесоюзный биохимический съезд (1986); VI (Київ, 1992) та VII (Київ 1997) Українські біохімічні зїзди; ІІ (Київ, 1993) та ІІІ (Москва, 1997) Радіобіологічні з’їзди; I (Київ, 1994) та II (Харків, 1998) Українські зїзди біофізичного товариства; конференція “Віддалені наслідки опромінення в імунній та гемопоетичній системах”, Київ, 1996; конференція “Проблемы противолучевой защиты”, Москва, 1998; VII Конгрес світової федерації Українських лікарських товариств, Ужгород, 1998; IV (Дніпропетровськ, 1997) та V (Дніпропетровськ, 1998) Міжнародні конференції “Франція та Україна, науково-практичний досвід у контексті діалогу національних культур”; I Міжнародна конференція “Наука і освіта98”, Дніпропетровськ, 1998; I Конференція Українського товариства нейронаук, Київ, 1998; International Scientific Conference, Львів, 1999; 23-rd Meeting of the Federation of European Biochemical Societies, (Базель, Швейцарія, 1995); 10-th International Peat Congress (Бремен, Німеччина, 1996); 25 Silver Jubilee FEBS Meeting (Копенгаген, Данія, 1998); 17-th Biennial Meeting of the International Society for Neurochemistry (ISN) and 13-th General Meeting of the European Society for Neurochemistry (ESN), (Берлін, Німеччина, 1999); 29-th Annual Meeting for Neuroscience (Маямі, США, 1999); 2-th International Medical Conference and 9-th EMSA International Scientific Symposium, (Люблін, Польща, 2000); VIІI International Meeting IBNS (Нансі, Франція, 1999); FENS winter school Federation of European Neuroscience Societies (Кітзбюгель, Австрія, 1999); XXII-nd Collegium Internationale Neuro-Psychopharmacologicum Congress (Брюссель, Бельгія, 2000).

Публікації. За матеріалами дисертації надруковано 56 робіт, з них 29 статей (15 з них без співавторів) та 27 тез, які опубліковані у профільних вітчизняних та зарубіжних журналах, збірниках наукових праць та матеріалах зїздів та конференцій.

Структура та обсяг дисертації. Дисертація викладена на 298 сторінках друкованого тексту і складається з вступу, огляду літератури, опису матеріалів та методів досліджень, результатів досліджень та їх обговорень (7 розділів), узагальнень результатів (1 розділ) та висновків. Робота містить 108 рисунків, 20 таблиць та 1 схему. Список використаної літератури включає 541 джерело, з них 308 іноземних авторів.

МАТЕРІАЛИ ТА МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ

В роботі використані реактиви та матеріали: носії для гель-хроматографії сефадекси G-25, G-50, G-75, G-100 (“Pharmacia”, Швеція); носій для іонообмінної хроматографії сефадекс DEAE-A50 (“Pharmacia”, Швеція), для афінної хроматографії сефароза 4В BrCN (“Pharmacia”, Швеція), конканавалін А (“Pharmacia”, Швеція), блакитний декстран (“Ferak”, Німеччина), сироватковий альбумін бика (“Sigma”, США), азид натрію (“Sigma”, США), глутатіон (“Reanal”, Угорщина), сечовина, тритон Х-100 (“Ferak”, Німеччина), 2-меркаптоетанол, дітіотрейтол (“Reanal”, Угорщина), синтетичні субстрати, n-нітроанілід N-бензоїл-Д,L-аргінін (БАПА) (“Fluka”, Швейцарія), етиловий ефір N-бензоїл-Д,L-аргінін (БАЕЕ) (“Reanal”, Угорщина), 2-нафтіламід N-бензоїл-Д,L-аргінін (БАНА) (“Reanal”, Угорщина), 2-нафтіламід L-лейцин (Лей-НА) (“Koch-Light Laboratories”, Англія). Реактиви для електрофорезу в поліакриламідному гелі.

Основна частина роботи виконана на щурах лінії Вістар і безпородних лабораторних щурах. Об’єктом дослідження були: головний мозок, селезінка, печінка, нирки та сироватка крові щурів різного віку (статевозрілих щурів та щурів віком 1, 6, 12, 18, 25 діб), підшкірна перещепна пухлина щурів (саркома 45), головний мозок людини, пухлини головного мозку людини (біоптичний матеріал), сироватка крові донорів та ліквідаторів наслідків аварії на ЧАЕС. Мозок людини отримували від жертв нещасних випадків, аутопсію матеріалу проводили через 12 годин після смерті людей, які не мали ушкоджень ЦНС, в обласній лікарні ім. Мечнікова м. Дніпропетровськ. Пухлини мозку (біоптичний матеріал) отримували під час операції у відділенні “Нейрохірургія” цієї ж лікарні, там же пухлини типували за гістоструктурою, гістогенезом та ступенем злоякісності.

Щурів опромінювали на апараті РУМ-17. ЦНС - синдром викликали одноразовим тотальним опроміненням за доз 50, 100, 200 Гр за технічних умов: напруга 250 кВ, сила струму - 15 мА, фільтри - 0,5 мм Cu + 1 мм Al, потужність дози 10,7 Гр/хв, фокусна відстань 30 см.

Локальне одноразове опромінення пухлин щурів - пухлиноносіїв на стегні (при захисті інших частин тіла свинцевим екраном товщиною 1 см) проводили у дозі 12 Гр: напруга 250 кВ, сила струму 15 мА, фільтри - 0,5 мм Cu + 1 мм Al, потужність дози 72 сГр/хв, фокусна відстань 50 см. Тотальне одноразове опромінення за дози 6 Гр: напруга 200 кв, сила струму 15 мА, фільтри – 0,5 мм Cu + 1 мм Al, потужність дози 34 сГр, фокусна відстань 50 см. Терміни дослідження після опромінення: 1, 3, 6, 12, 24, 48 год. для летальних доз 50, 100, 200 Гр.

У модельних експериментах шодо вивчення ефектів низьких рівнів радіації характерних для Чорнобильської катастрофи, застосовували дозу 25 сГр. Опромінювали за таких технічних умов: напруга 150 кВ, сила струму 6 мА, фільтри 0,5 мм Сu + 2 мм Cu, потужність дози 0,26 сГр/хв, фокусна відстань 1,86 м. Дозові залежності визначали через 12 годин після опромінення щурів за доз 5 , 10, 20, 25 сГр. Опромінення в малих дозах здійснювали двома засобами: одноразовий безперервний вплив протягом терміну, необхідного для досягнення дози 25 сГр; хронічний вплив, тривале фракціоноване опромінення протягом 25 діб із добовою дозою 1 сГр і сумарною дозою 25 сГр. Термін дослідження після опромінення в діапазоні низьких доз – 1, 12, 24, 120 і 168 годин. Вплив радіації з низькою інтенсивністю у дозі 25 сГр досліджували на щурах, яких поділяли на декілька груп: псевдо-опромінену контрольну; групу, яку опромінювали одноразово за дози 25 сГр; групу, що опромінювали фракціоновано (1 сГр 25 діб) та фракціоновано опромінену групу, яку через два тижні після останнього сеансу опромінення спаровували для отримання потомства. В експерименті досліджували: потомство інтактних щурів; потомство опромінених самців і контрольних самок; потомство опромінених самок і контрольних самців; потомство опромінених самок і опромінених самців. Тварин декапітували на 6, 12, 18 та 25 доби постнатального розвитку. Головний мозок розділяли на кору великих півкуль, гіпокамп, смугасте тіло, середній мозок, мозочок та Варолієв міст.

Моделювання нітритної метгемоглобінемії проводили на білих щурах вагою 180–200 г. Нітрит натрію (2% NaNO2, виготовлений на фізіологічному розчині) вводили в черево самкам протягом 14 діб щодня, з 5 до 19 доби вагітності. Загальна кількість введеного нітриту натрію одній тварині складала 0,9 мг/кг ваги (по 60 мкг/кг кожний день). Контрольним самкам вводили фізіологічний розчин в еквівалентній дозі. Нащадків, отриманих від контрольних та гіпоксичних самок, декапітували на 1, 6 та 12 добу постнатального розвитку. Ступінь тяжкості гемічної гіпоксії оцінювали за кількістю метгемоглобіну в крові щурів (Покровский А., 1969).

Гіпоксичну гіпоксію спричиняли за допомогою газогіпоксичної суміші, яка містить 10% кисню і 90% азоту (ГГС-10). При комбінованій дії рентгенівського опромінення і гіпоксичної гіпоксії контролем були дві групи тварин - інтактні та пухлиноносії. Дослідження проводили через 4 і 9 діб після дії радіації. Активність цистеїнових катепсинів при пухлинному рості досліджували на саркомі 45 щурів, яку перещеплювали шляхом підшкірного введення 0,4 мл 10% суспензії клітин пухлини на фізіологічному розчині.

Вміст глутатіону в гомогенатах мозку людини визначали флуорометричним методом (Mokrash L. et al., 1985; Mihalova H. et al., 1986). Внутрішньоочеревне введення відновленого глутатіону у дозі 150 мг/кг щурам-пухлиноносіям проводили з шостої доби після перещеплення пухлини і досліджували в динаміці розвитку пухлини на 1, 6 та 11 добу. Декапітували тварин на 16 добу. Контрольним щурам-пухлиноносіям вводили еквівалентну дозу фізіологічного розчину.

Рівень малонового діальдегіду (МДА) у сироватці крові визначали за реакцією з 2-тіобарбітуровою кислотою (Коробейникова Э., 1989). Ліпопротеіни низької густини (ЛНГ) визначали за методом Колба В. (1982). Загальну антиоксидантну активність (ЗАОА) визначали у сироватці крові (Спектор Е. и др., 1982). Пероксидазну резистентність еритроцитів (ПРЕ) визначали за стандартною методикою (Горячковский А., 1994). Інгібіторну активність сироватки крові визначали за рівнями альфа 1-антитрипсину (1-АТ) та альфа 2-макроглобуліну (2-MG) (Карягина И. и др., 1990).

Активність цистеїнових катепсинів В, L, Н визначали у 10% гомогенатах (на 0,25% розчині сахарози; на 0,025 М трис-буфері з рН 7.4, який містить 0,15 М NaCl та 1 мМ ЕДТО, а також з додаванням 0,2% тритону Х-100), неседиментованій та седиментованій фракціях, які отримували на центрифузі VAC - 601 (105 000 g 50 хв). Диференційне центрифугування проводили за схемою (Покровский А. и др., 1976; Немова Н., 1992).

Активність катепсину В досліджували за розщепленням n-нітроаніліду N-бензоїл-Д,L-аргініну (БАПА) “Fluka” (Швейцарія) (Barrett A. et al., 1981), етилового ефіру N-бензоїл-Д,L-аргініну (БАЕЕ) “Reanal” (Угорщина); 2-нафтіламіду N-бензоїл-Д,L-аргініну (БАНА) “Reanal” (Угорщина) (Barrett A. et al., 1981) з модифікаціями (Черная В. и др., 1989).

Активність катепсину L визначали за відношенням до 1% азоказеїну і азоказеїну, денатурованому 3М сечовиною (Березин В. и др., 1982). Азоказеїн синтезували за методом Сурінова Б.Г. і Манойлова С.Е. (1965).

Активність катепсину Н виявляли за гідролізом 2-нафтіламіду L-лейцину (Лей-НА) “Koch-Light Laboratories” (Англія) Schwartz W. et al., 1980) з модифікаціями (Черная В. и др., 1989).

Питому активність визначали в 1,0 мл інкубаційної суміші з 15 хв преінкубацією ферментів в присутності 2 мМ 2-меркаптоетанолу і 2 мМ Na2EDTO.

Активність виражали при застосуванні субстратів: БАПА - в мкМ р-нітроаніліну (р-НА) за 60 хв інкубації при +37оС на 1 мг,г білка; БАНА і Лей-НА - мкМ нафтіламіну, відщепленого за 120 хв інкубації при +37оС на 1 мг,г білка; БАЕЕ - в мкМ бінзоїл-L-аргініну, відщепленого за 60 хв інкубації при +37оС на 1 мг,г білка; азоказеїну - в умовних одиницях абсорбції при 366 нм за 60 хв інкубації при +37оС на 1 мг,г білка.

Виділення, очистку та дослідження деяких фізико-хімічних характеристик цистеїнових катепсинів В, Н та L проводили з тканин головного мозку щурів, людини та пухлин головного мозку людини. Середовище гомогенізації - 0,02 М трис-НСl буфер (рН 7,2) в співвідношенні 1:1,2. Гомогенати центрифугували (10 000 об/хв 20 хв). Отримані екстракти фракціонували сульфатом амонію в діапазоні 30-80% насичення (Кочетов Г., 1980). Діаліз проводили 0,05 М цитратним (або 0,02 М фосфатним) буфером з 0,8 М NaCl, 0,002 М 2-МЕ і 0,001 М ЕДТО або гель-фільтрацію на колонці з сефадексом G-25. Афінну хроматографію проводили на конканавалін-А сефарозі та азоказеїн-сефарозі (агарозі). Сорбент синтезували, застосовуючи сефарозу 4В, активовану бромціаном (Туркова Я., 1980). Білки, що не зв’язалися з колонкою вимивали буферним розчином, яким була урівноважена відповідна колонка. Елюцію білків, що зв’язалися біоспецифічно з конканавалін-А сефарозою проводили буфером, який містив 10% метил глюкoзід (Скоупс Р., 1985). Елюцію білків-ферментів, що аффінно зв’язалися з азоказеїном проводили буфером, який містив 1 М NaCl, 0,001 M 2 МЕ (рН 9,0). В деяких експериментах розчин для елюції містив 0,001 М ЕДТО.

Іонообмінну хроматографію проводили на колонках з ДЕАЕ-сефадексом А-50. Десорбція ферменту відбувалася при 0,3 М розчині NaCl на відповідному буфері (Скоупс Р., 1985). Гель-хроматографію проводили на колонках з сефадексом G-100 (75) як для подальшої очистки досліджуваних катепсинів, так і для визначення їх молекулярних мас. Кількісну оцінку загального білка в пробах проводили за методами Бредфорд (Bredford M., 1976), Лоурі (Lowry O. et al., 1951) та спектрофотометрично (Кочетов Г., 1980).

Виділення та очистку нейроспецифічної енолази (НСЕ) проводили з сірої речовини головного мозку щурів: фракціонування сульфатом амонію та дворазова хроматографія на ДЕАЕ-целюлозі. Препаративний електрофорез застосовували з подальшою електроелюцією (Grasso A. et al., 1977).Тестування чистоти препарату проводили за допомогою електрофорезу в поліакріламідному гелі (Lemmli, 1970). Виділення та очистку мембранозв’язаного гліального фібрилярного кислого білка (ГФКБ) проводили із білої речовини мозку щурів (Березин В. и др., 1984). Для визначення поліпептидного складу кори великих півкуль головного мозку використовували електрофорез в поліакриламідному гелі в присутності ДСН.

Статистичну обробку результатів проводили загальноприйнятими методами варіаційної статистики (Лакин Г., 1990). Розрахунки та побудову графіків проводили на РС –Pentium (133) з використанням комп’ютерних програм.

РЕЗУЛЬТАТИ ТА ЇХ ОБГОВОРЕННЯ

Вплив іонізуючої радіації на активність, компартменталізацію та фізико-хімічні характеристики цистеїнових катепсинів ЦНС. Для з’ясування механізмів дії іонізуючої радіації в надлетальних і малих дозах на структурно-функціональні і метаболічні властивості нервової системи на першому етапі досліджень проведено експериментальне визначення впливу тотального опромінення на організм у надлетальних дозах (50, 100, 200 Гр) на функціональний стан лізосомально-вакуолярного апарату клітин сірої речовини великих півкуль головного мозку щурів.

Порушення внутріклітинної компартменталізації протеолітичних ферментів (особливо з лізосомальною локалізацією) є одним із важливих ланцюгів розвитку променевої патології (Bednarski E. et al., 1997; Кирпиченок А. и др., 1997), тому що порушення проникності лізосомальних мембран під впливом іонізуючої радіації створює сприятливі умови для виходу катепсинів з лізосом, дезорганізуючи метаболічні процеси в клітині і посилюючи первинні радіаційні зрушення. Активність катепсинів визначали в гомогенаті, седиментованій та неседиментованій фракціях. Така постановка експерименту інформативна в плані виявлення змін компартменталізації катепсинів в клітині (Рева А. и др., 1983; Покровский А. и др., 1977). Нами доведено, що питома активність маркерного ферменту лізосом (катепсину L) максимальна у фракції легких мітохондрій (82%), що свідчить про його лізосомальну локалізацію (рис.1). Аналогічні результати отримані і для катепсинів В, Н головного мозку.

Рис. 1. Активність катепсину L у субклітинних фракціях сірої речовини великих півкуль головного мозку щурів (в од. абсорб. при 366 нм/мг білка): 1–ядерна фракція; 2-фракція важких мітохондрій; 3-фракція легких мітохондрій; 4-мікросомально-розчинна фракція (Мm, n=6).

Характерною реакцією впливу надлетальних доз іонізуючої радіації на ЦНС є дозозалежне підвищення активності цистеїнових катепсинів і фазність змін досліджуваних форм активності катепсинів В і L у динаміці перебігу ЦНС – синдрому за доз 100 Гр, 200 Гр. З’ясовано, що зміни внутріклітинної компартменталізації катепсинів відбуваються за рахунок значного підвищення неседиментованої активності (рис.2), це свідчить про радіаційно-індуковані порушення архітектоніки і стабільності лізосомальних мембран.

Визначення неседиментованої активності є найбільш поширеним і визнаним методом оцінки стабільності лізосомальних мембран (Покровский А., 1976). Наявність латентної активності катепсинів за дії різних концентрацій тритону Х-100 (0,025%, 0,05%, 0,1%, 0,2%) свідчить про певну радіорезистентність мембран лізосомально-вакуолярного апарату клітин мозку опромінених щурів за дози 200 Гр. За зміною показників рівнів неседиментованої активності цистеїнових катепсинів можна визначити ступінь ефекту променевого впливу на лабілізацію мембран лізосом. Ці зміни можуть розглядатися як важливі біохімічні індикатори тяжкості променевого пошкодження.

Рис.2. Активність катепсину L кори великих півкуль головного мозку щурів за доз 100 та 200 Гр (в % від контролю): 1-гомогенат; 2-неседиментована, 3-седиментована фракції.

З позицій класичної радіобіології неможливо пояснити ті несподівано значні ефекти, які спричиняються малими дозами радіації (Эйдус Л., 1994; Гераськин С., 1995). Загальною реакцією дії малих доз іонізуючої радіації є активація різних ферментних систем. Механізм першопричин цих змін, які приводять до прояву біологічних ефектів малих доз ще не з’ясовано.

Отримані результати динаміки рівнів активності лізосомальних цистеїнових катепсинів функціонально і морфологічно різних структур головного мозку в залежності від дози опромінення (5 – 25 сГр) дозволяють вважати, що за умов дії малих доз з низькою потужністю (0,26 сГр/хв.) проблема пошкодження мембран висувається на перший план. За дози 10 сГр спостерігається процес порушення проникності лізосомальних мембран клітин головного мозку, про що свідчить підвищення рівнів вільної активності цистеїнових катепсинів у корі великих півкуль, мозочку, а також у сироватці крові. Відомо, що в бішарі ліпідів легко розвиваються під впливом малих доз іонізуючої радіації вільнорадикальні ланцюгові реакції ПОЛ, продукти яких відіграють роль аутокалізаторів (Volpe P. et al., 1999).

За дози 25 сГр відбувається більш тривала активація ПОЛ і лабілізація мембран лізосом в усіх досліджуваних структурах головного мозку за ферментативним критерієм, тобто значним підвищенням рівня вільної активності катепсинів, що можна інтерпретувати як тригерне переключення лізосом в інший режим функціонування, коли потужність систем репарації стає недостатньою для ефективного усунення пошкоджень (рис. 3).

Рис.3. Залежність змін вільної активності катепсину L у структурах головного мозку щурів від дози опромінення (в % відхилення від контролю, Мm, n=6), * р<0,05 – порівняно з контролем.

Вірогідне збільшення активності катепсинів у сироватці крові за цієї дози можна розглядати як показник розвитку цитолітичних процесів у тканинах. Згідно з концепцією первинної активуючої дії малих доз зміни вільної активності, які спостерігаються у корі великих півкуль і мозочку мають поріг за дози 10 сГр, а стан підвищеної активності клітин мозку припадає на дозу 25 сГр. Ступінь пошкодження лізосомально-вакуолярного апарату клітин простежується і за динамікою вивільнення цистеїнових катепсинів у кров. Під дією іонізуючої радіації відбувається підвищення активності лізосомальних ферментів, перерозподіл їх із зв’язаної форми в неседиментовану і вихід протеіназ в кров (Панин Е., 1987; Давыдов Б. и др., 1991).

Встановлена нами дозова залежність активності катепсину L узгоджується з концепцією біологічної дії малих доз іонізуючої радіації (Гераськин С., 1995). З’ясовані особливості механізмів активації лізосомально-вакуолярного апарату клітин головного мозку при одноразовому і фракціонованому тотальному рентгенівському опроміненні щурів за дози 25 сГр, а саме співвідношення адаптаційно-компенсаторних і деструктивних процесів. В основі радіаційних ефектів при одноразовому опроміненні за дози 25 сГр лежать незворотні зміни збільшення вільної, неседиментованої та мембранозв’язаної форм активності лізосомальних катепсинів В, L, Н в динаміці пострадіаційного періоду (1, 12, 24, 120 та 168 годин).

При одноразовому опроміненні перші статистично достовірні зміни вільної активності катепсину В визначені через 1 годину. У корі великих півкуль, мозочку і гіпокампі визначено два максимуми: на 12-й і 168-й годині після опромінення, а у смугастому тілі і Варолієвім мості перший максимум спостерігається через 24 години після опромінення, а другий також через 168 годин після дії радіації.

Неседиментована форма активності катепсину В через 24 години після опромінення набуває максимального значення у корі великих півкуль, де вона складає 366 % від контролю, і для інших структур мозку зберігається тенденція підвищення активності. Слід відмітити односпрямованість змін з подальшим підвищенням цієї форми активності катепсину В у смугастому тілі і Варолієвім мості, мозочку, середньому мозку через 120 і 168 годин. Активність у корі великих півкуль і гіпокампі поступово знижується через 120 та 168 годин, але залишається підвищеною в 2,4 та 1,6 рази в порівнянні з контролем відповідно (рис.4А)

Рис. 4. Неседиментована активність катепсину В при одноразовому (А) та фракціонованому (Б) опроміненні за дози 25 сГр (в % від контролю, мкмоль рНА/мг білка, Mm, n=6), * - р<0,05 порівняно з контролем.

Для мембранозв’язаної форми активності катепсину В характерні менш виражені зміни саме в ранній пострадіаційний період. Представлені дані виявили високу чутливість протеолізу у функціонально і морфологічно різних структурах головного мозку до дії малих доз рентгенівського випромінювання. Виявлені зміни неседиментованої і мембранозв’язаної форм активності катепсину В свідчать про суттєвий вплив іонізуючої радіації за дози 25 сГр на цілісність і проникність мембран лізосомальних структур головного мозку, і ці зрушення можуть бути матеріальною підставою несприятливих наслідків для організму в цілому.

При фракціонованому опроміненні абсолютні значення вільної активності катепсину В менш виражені в усіх досліджуваних структурах головного мозку в порівнянні з одноразовим опроміненням. Динаміка розподілу неседиментованої форми активності катепсину В відрізняється від розподілу її при одноразовому опроміненні як за характером, так і за рівнями активності в залежності від структури головного мозку і часу після опромінення. При фракціонованому опроміненні біфазний характер зміни неседиментованої активності катепсину В спостерігається лише в корі великих півкуль. В інших досліджуваних структурах головного мозку активність має один пік. Через 168 годин відзначається тенденція зниження неседиментованої активності майже в усіх структурах головного мозку до контрольного рівня (рис. 4Б).

Нормалізація неседиментованої активності через 7 діб після фракціонованого опромінення може свідчити про процеси репарації і стабілізації фізико-хімічних властивостей мембран лізосом в цей період, а при одноразовому опроміненні неседиментована активність залишалась підвищеною в цей термін після дії радіації. Розподіл мембранозв’язаної форми активності катепсину В у функціонально і морфологічно різних структурах головного мозку фракціоновано опромінених щурів збігається з загальною закономірністю розподілу неседиментованої форми активності. При фракціонованому опроміненні встановлена висока пластичність лізосом мозку, які можуть змінювати свої властивості без прояву ознак їх деструкції за ензиматичним контролем, нами виявлені зворотні зміни неседиментованої і мембранозв’язаної форм активності катепсинів. Менш виражені пошкодження лізосомального апарату при фракціонованому опроміненні можна пояснити поступовим включенням компенсаторних механізмів клітини (Котеров А. и др., 1999).

Загальна система протеолізу головного мозку після опромінення за дози 25 сГр в усі періоди, що досліджувалися, виявилась дестабілізованою з тенденцією до активації. Виявлені особливості дії одноразового та фракціонованого опромінення в малих дозах визначаються диференційною і вибірковою чутливістю різних структур головного мозку і різних катепсинів до променевого впливу, різною спроможністю до сумації та відновлення радіаційних ушкоджень. Немає сумніву в тому, що активація лізосомального апарату нервових клітин при дії на організм іонізуючого випромінювання у дозі 25 сГр доцільна, і спрямована на адаптивну перебудову метаболізму і ультраструктур клітини.

Роль цистеїнових катепсинів В, L, Н головного мозку в деградації нейроспецифічних білків. Одноразове та фракціоноване рентгенівське опромінення щурів у дозі 25 сГр спричиняє різні за спрямованістю зміни у поліпептидних спектрах розчинних і мембранозв’язаних білків кори великих півкуль головного мозку. Встановлено, що тотальне рентгенівське опромінення за дози 25 сГр спричиняє збільшення поліпептидного складу розчинних білків кори великих півкуль головного