НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ

ІНСТИТУТ КЛІТИННОЇ БІОЛОГІЇ ТА ГЕНЕТИЧНОЇ ІНЖЕНЕРІЇ

ДВОРНИК Анжела Степанівна

УДК 633.88+575.224.6+581.143.6

ДОСЛІДЖЕННЯ АНТИМУТАГЕННИХ ВЛАСТИВОСТЕЙ ЕКСТРАКТІВ БІОМАСИ КУЛЬТИВОВАНИХ КЛІТИН ДЕЯКИХ ЛІКАРСЬКИХ РОСЛИН

03.00.15 – генетика

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

Київ – 2001

Дисертацією є рукопис.

Роботу виконано у відділі генетики клітинних популяцій Інституту молекулярної біології і генетики НАН України, м. Київ.

Науковий керівник – доктор біологічних наук, професор, член-кор. НАН України

Кунах Віктор Анатолійович,

Інститут молекулярної біології і генетики НАН України,

завідувач відділу генетики клітинних популяцій.

Офіційні опоненти –доктор біологічних наук

Парій Федір Микитович,

Інститут цукрових буряків УААН,

провідний науковий співробітник лабораторії селекції цукрових буряків. –

кандидат біологічних наук, старший науковий співробітник Карпова Ірина Сергіївна,

Інститут молекулярної біології і генетики НАН України,

відділ генетики людини.

Провідна установа: Київський національний університет ім. Тараса Шевченка, кафедра загальної і молекулярної генетики.

Захист дисертації відбудеться "30 жовтня" 2001р. о 14.00 год. на засіданні спеціалізованої ради Д.26.202.01 Інституту клітинної біології та генетичної інженерії НАН України за адресою: 03143, Київ-143, вул. Академіка Заболотного, 148.

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Інституту клітинної біології та генетичної інженерії НАН України за адресою: 03143, Київ-143, вул. Академіка Заболотного, 148.

Автореферат розіслано "30" вересня 2001 р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради

кандидат біологічних наук В.Д. Науменко

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Насичення довкілля генотоксичними факторами різної природи призводить до неухильного підвищення рівнів спадкової та неспадкової мінливості, наслідками чого є зростання кількості спадкових та онкологічних захворювань, вроджених пороків розвитку, безпліддя. У зв'язку з цим особливого значення сьогодні набуває виявлення препаратів з антимутагенними властивостями. Пошук генопротекторів ведеться, насамперед, серед препаратів природного походження, зокрема рослинного. Саме вони краще, ніж синтетичні, сприймаються організмом і відповідають таким вимогам, як нетоксичність, відсутність побічних ефектів, можливість тривалого застосування.

Перспективним джерелом одержання ефективних антимутагенних препаратів може служити біомаса культивованих in vitro клітин та тканин рослин-адаптогенів як цінна екологічно чиста та стандартизована фармакологічна сировина. Висока біологічна активність ряду сумарних біотехнологічних препаратів рослинного походження дозволяє припускати наявність у них генопротекторних властивостей, котрі значно розширять спектр їх застосування.

У даній роботі досліджували антимутагенну активність водно-спиртових екстрактів, одержаних із біомаси культивованих клітин наступних рослин: женьшеня справжнього Panax ginseng C. A. Mey. та полісціасу папоротелистого Polyscias filicifolia Bailey із родини Araliaceae; родіоли рожевої Rhodiola rosea L. із родини Crassulaceae; унгернії Віктора Ungernia victoris Vved. ex Artjuschenko із родини Amaryllidaceae.

Відбір речовин з можливою антимутагенною дією потребує наявності широкого набору чутливих тест-систем. З цією метою поряд із застосуванням стандартних тестів необхідно розробляти нові системи тестування, залучаючи нові тест-об'єкти, нові показники та методи аналізу генетичної активності. Застосування як тест-об'єктів бактеріофагів дозволить проводити швидкий скринінг антимутагенів, оскільки прокаріотичні тест-системи є відносно простими, економними та зручними у використанні.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Робота виконувалась у відділі генетики клітинних популяцій Інституту молекулярної біології і генетики НАН України за темою 2.2.4.5. "Вивчення особливостей мінливості рослинного геному в культурі in vitro та пошук шляхів її регуляції" та у лабораторії мутагенезу і антимутагенезу Українського наукового центру медичної генетики НАН та МОЗ України.

Мета і задачі дослідження. Метою роботи було вивчення антимутагенних властивостей водно-спиртових екстрактів біомаси культивованих клітин ряду лікарських рослин щодо мутагенів різного способу дії; розробка простої системи реєстрації мутагенного та антимутагенного ефекту та випробування у ній активності екстрактів.

Для проведення цієї роботи необхідно було вирішити такі завдання:

1. Вивчити у тесті Еймса вплив екстрактів біомаси культивованих клітин ряду лікарських рослин на рівень спонтанного та хімічно індукованого мутагенезу.

2. Підібрати умови використання системи Escherichia coli – бактеріофаг l для вивчення захисної щодо мутагенів активності рослинних екстрактів.

3. Випробувати ефективність даної системи при застосуванні нативних та попередньо мутагенізованих тест-об'єктів.

4. Вивчити у системі E.coli – бактеріофаг l активність рослинних екстрактів при застосуванні різних варіантів фага l та різних способів їх обробки мутагеном та екстрактами.

Об'єкт дослідження – водно-спиртові екстракти біомаси культивованих клітин P.ginseng, P.filicifolia, Rh.rosea, U.victoris.

Предметом дослідження були рівні хімічно індукованих маркерних генних та летальних ушкоджень у двох прокаріотичних системах.

Методи дослідження: визначення кількості індукованих колоній ревертантів Salmonella typhimurium; визначення частоти індукованих h-мутантів бактеріофага l-4; визначення рівня інактивації різних варіантів бактеріофага l; стандартні методи статистичної обробки результатів.

Наукова новизна одержаних результатів. Вперше проведено дослідження та порівняльний аналіз антимутагенної активності водно-спиртових екстрактів біомаси культивованих клітин P.ginseng, P.filicifolia, Rh.rosea та U.victoris. У тесті Еймса показано, що досліджені екстракти не впливають на спонтанний рівень мутантів S.typhimurium та ефективно пригнічують мутагенність ряду хімічних сполук.

Вперше для пошуку потенційних антимутагенів запропоновано використовувати систему E.coli – бактеріофаг l. У даній системі показана протекторна та антимутагенна активність екстрактів біомаси культивованих клітин P.ginseng, P.filicifolia, Rh.rosea та U.victoris.

Практичне значення одержаних результатів. Виявлення протекторної та антимутагенної дії досліджених рослинних екстрактів обумовлює доцільність їх подальшого вивчення з метою застосування для профілактики та усунення мутаційних ушкоджень, індукованих шкідливими факторами довкілля.

Систему E.coli – бактеріофаг l можна застосовувати для первинного скринінгу препаратів на антимутагенну активність, аналізуючи їх вплив на рівень інактивації тест-об'єкту, обробленого мутагеном за умов in vitro.

Особистий внесок здобувача. У процесі виконання дисертаційної роботи автором особисто відібрано та проаналізовано наукову літературу за темою наукового дослідження. Результати, які викладені у дисертації, отримано здобувачем самостійно. Дослідні роботи з використанням тесту Еймса виконано у співробітництві з д.мед.н., професором І.Р. Бариляком та д.б.н. О.М.Дуганом у лабораторії мутагенезу і антимутагенезу Українського наукового центру медичної генетики НАН та МОЗ України. Аналіз та обговорення результатів досліджень проведено з науковим керівником.

Апробація результатів дисертації. Результати роботи були представлені на IV Міжнародній конференції з медичної ботаніки (м. Київ, Україна, 1997) та на II Міжнародному симпозіумі "Plant Biotechnology" (м. Київ, Україна, 1998), а також обговорювались на наукових семінарах відділу генетики клітинних популяцій Інституту молекулярної біології і генетики НАН України.

Публікації. За матеріалами дисертації опубліковано сім робіт; із них чотири статті у співавторстві, одна стаття підготовлена самостійно та тези двох доповідей, які були представлені на міжнародних наукових конференціях.

Структура і обсяг дисертації. Дисертація містить: перелік умовних скорочень; вступ; розділи "Огляд літератури", "Матеріали та методи", "Результати і обговорення"; заключення; висновки; список використаних джерел; додаток. Повний обсяг роботи складає 153 сторінки друкованого тексту. Дисертацію проілюстровано 24 рисунками та 16 таблицями; список використаних джерел (197 найменувань, з них 64 іноземні) займає 23 сторінки, додатки (3) займають 13 сторінок.

МАТЕРІАЛИ ТА МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ

Досліди у стандартному напівкількісному тесті Еймса проводили згідно з методичними розробками [Фонштейн Л.М. и др., 1977]. Тест-об'єктом служили гістидинзалежні штами S.typhimurium, котрі реєструють виникнення зворотніх генних мутацій від ауксотрофності за гістидином до прототрофності за двома механізмами: штам ТА 98 – за типом зсуву рамки зчитування, штам ТА 100 – за типом заміни пар основ. Штами S.typhimurium отримали з музею бактеріальних культур Українського наукового центру медичної генетики НАН та МОЗ України.

Модельними мутагенами для штаму ТА 98 слугували ДДДТДП (2,4-диокси-4,5-диоксо-4,5,9,10-тетрагідро-9,10-діазопірен), етидіум бромід, промутагени бензидин та бенз[а]пірен; для штаму ТА 100 – тіо-ТЕФ, азид натрію (NaN3), біхромат калію (K2Cr2O7); а також сполуки важких металів – хлориди марганцю (MnCl2), цинку (ZnCl2), кадмію (CdCl2), ацетат свинцю (Pb(CH3COO)2) – для обох штамів. Для активації промутагенів застосовували мікросомальну фракцію із печінки білих нелінійних щурів.

Досліди проводили також у системі E.coli – бактеріофаг l, у якій бактеріофаг слугував тест-об'єктом. Як модельний мутаген використовували азотисту кислоту. Молекулярний механізм генотоксичної дії азотистої кислоти полягає у дезамінуванні аденіну та цитозину, що веде до мутагенного ефекту внаслідок транзицій, та в дезамінуванні гуаніну, що викликає переважно летальний ефект. Тест-об'єкт обробляли мутагеном за умов in vivo (обробка внутріклітинного фага) та in vitro (обробка позаклітинного фага).

У дослідах за умов in vivo тест-об'єктом служив фаг l-4, отриманий у нашій лабораторії. Внаслідок делеції у сайті att, на відміну від фага l+ дикого типу, він утворює прозорі негативні колонії, завдяки чому їх підрахунок стає зручнішим [Перерва Т.П. и др., 1996]. Загальний титр фага визначали висіванням на E.coli С 600. Як маркерну генетичну ознаку використовували h-мутацію фага ll-4, наявність якої реєструється за здатністю мутантів рости на E.сoli CR 63, стійкій до немутантного фага ll-4. Аналізували вплив досліджуваних екстрактів на частоту індукції азотистою кислотою h-мутацій фага l-4. Штами E.coli С 600 та E.coli СR 63 отримали з Інституту біохімії та фізіології мікроорганізмів РАН (Пущіно-на-Оці).

У дослідах за умов in vitro тест-об'єктами слугували фаг l+ дикого типу та фаг l-4, використані як у нативній формі (необроблений фаг), так і у формі попередньо мутагенізованих фагів. Препарати попередньо мутагенізованих фагів l+ та l-4 отримували в результаті їх вирощування на середовищі з мутагеном: фаг l+ ІІІ пас. (три пасажі вирощування фага l+) та фаг l-4 І пас. (один пасаж вирощування фага l-4). Умови попередньої мутагенізації фагів – 0,05 М CH3COOH і 0,0125 М NaNO2, рН 4,5.

У даних дослідах тест-фаг (0,1 мл) обробляли розчином азотистої кислоти (1,0 мл; 0,05 М CH3COOH, 0,2 М NaNO2, рН 4,5) протягом 1-2 год при 37°С. Проби фага відбирали через певні проміжки часу, готували розведення (10-2 - 10-6), що забезпечувало повне припинення реакції, та висівали на чашки Петрі. Проводили два варіанти експериментів: 1 – інактивація фага мутагеном у пробірці у присутності екстрактів (виявляли протекторний ефект екстрактів), 2 – вирощування фага, попередньо інактивованого мутагеном, на чашках у присутності екстрактів (виявляли антимутагенний ефект екстрактів). Відповідно до цього екстракти вносили у реакційну пробірку (0,1 мл) або на чашку (0,2 мл). У контрольних варіантах замість екстракту вносили відповідний об'єм фізіологічного розчину NaCl. Аналізували вплив досліджуваних екстрактів на інактивуючий ефект азотистої кислоти.

Досліджували активність екстрактів, одержаних стандартним методом перколяції сухої біомаси культивованих клітин 40% етиловим спиртом. Кінцеве співвідношення спирт : біомаса становило 10 : 1. Джерелом біомаси слугували: біомаса культури тканин женьшеня справжнього Panax ginseng C.A. Mey. із родини Araliaceae (штам Panax БІО-2МК, колекційний № 11, ККК ІМБіГ НАН України, Київ) – далі екстракт P.ginseng; полісціасу папоротелистого Polyscias filicifolia Bailey із родини Araliaceae (штам Polyscias F-2, колекційний № 6, ККК ІМБіГ НАН України, Київ) – далі екстракт P.filicifolia; родіоли рожевої Rhodiola rosea L. із родини Crassulaceae (штам ЗК-1, колекційний № 29, ВСКК-ВР, Москва, Росія) – далі екстракт Rh.rosea; унгернії Віктора Ungernia victoris Vved. ex Artjuschenko із родини Amaryllidaceae (штам UV-2, колекційний № 10, ККК ІМБіГ НАН України, Київ) – далі екстракт U.victoris. Використані штами клітинних культур лікарських рослин одержані у відділі генетики клітинних популяцій Інституту молекулярної біології і генетики НАН України.

Методом перколяції готували також 40% етанольний екстракт натурального кореня родіоли рожевої (місце походження – Алтай) – далі екстракт Rh.rosea нат. Для роботи у системі E.coli – бактеріофаг l екстракти випаровували за допомогою вакуумно-ротаційного випаровувача при 40°С майже до сухого залишку і розчиняли у стерильній дистильованій воді об'ємом у 10 раз меншому, ніж вихідний об'єм екстракту.

Статистичну обробку одержаних даних проводили стандартними методами [Лакин Г.Ф., 1980].

РЕЗУЛЬТАТИ І ОБГОВОРЕННЯ

1. Вивчення антимутагенної активності рослинних екстрактів у тесті Еймса

Здатність рослинних екстрактів впливати на хімічно індукований мутагенез була спочатку випробувана нами у тесті Еймса як найбільш поширеній бактеріальній тест-системі для скринінгу потенційних антимутагенів. Досліджені екстракти не викликали достовірної зміни спонтанного рівня мутування штамів S.typhimurium ТА 98 і ТА 100 (табл. 1).

Таблиця 1

Вплив екстрактів біомаси культивованих клітин ряду лікарських рослин на спонтанний рівень мутантів штамів S.thyphimurium ТА 98 і ТА 100

Варіант досліду Кількість колоній ревертантів, M±m

ТА 98 ТА 100

Panax ginseng 31,7±3,3 62,3±5,0

Polyscias filicifolia 30,0±3,3 71,0±7,6

Rhodiola rosea 32,7±3,7 72,0±6,1

Ungernia victoris 26,0±2,6 67,0±7,4

Вода (контроль) 30,3±1,4 68,3±7,3

Враховуючи цей факт, при вивченні впливу екстрактів на рівень саме хімічно індукованих мутантів відповідні значення спонтанного фону мутантів віднімали від значень позитивних контролів та варіантів з екстрактами. Ефективність захисної дії екстрактів оцінювали за відсотком пригнічення мутагенності, котрий вказує на частку мутантних колоній, відсутніх у варіанті з екстрактом порівняно з позитивним контролем.

Для позитивних контролів ми використали як типові для сальмонелли модельні мутагени, так і ті, котрі мають найбільш реальну загрозу для здоров'я людини, а саме: фармакологічний препарат тіо-ТЕФ, для котрого вже встановлені мутагенні властивості, канцерогени, а також поширені сполуки важких металів.

У першій серії експериментів вивчали антимутагенну активність екстрактів щодо мутагенів прямої дії, тобто таких, генотоксичний ефект яких зумовлений активністю вихідної сполуки. Модельними прямими мутагенами слугували сполуки з різним механізмом генотоксичної дії: для штаму S.typhimurium ТА 98 – ДДДТДП (кластоген), етидіум бромід (інтеркалятор ДНК); для штаму S.typhimurium ТА 100 – тіо-ТЕФ (монофункціональний алкілуючий агент), азид натрію (інгібітор дихання), біхромат калію (сильний окисник); а також сполуки важких металів – хлориди марганцю, цинку, кадмію, ацетат свинцю (кластогени) – для обох штамів.

Захисну активність екстрактів вивчали також і щодо мутагенів непрямої дії (промутагенів). Промутагени самі по собі генетично неактивні, однак їх метаболічна активація (мікросомальне окислення) сприяє утворенню генотоксичних продуктів, котрі безпосередньо реагують з мішенями ДНК. Для активації модельних промутагенів – бензидину та бенз[а]пірену – застосовували мікросомальну фракцію із печінки щурів. Самі екстракти в умовах метаболічної активації мутагенної активності не виявили.

Загалом, отримані результати свідчать про те, що всі досліджені рослинні екстракти виявили антимутагенні властивості (табл. 2), причому краще вони інгібували дію ряду мутагенів прямої дії, тоді як дію промутагенів та сполук важких металів інгібували слабше.

Серед випробуваних екстрактів найвищий антимутагенний ефект щодо мутагенів прямої дії відмічений для екстрактів Rh.rosea та P.filicifolia. Так, лише вони виявили достовірний захисний ефект щодо сполук важких металів, а дію ряду мутагенів знижували майже до спонтанного рівня: екстракт Rh.rosea знижував

Таблиця 2

Рівень пригнічення мутагенності різних сполук рослинними екстрактами у тесті Еймса

Штам S.typhi-murium Модельні мутагени Пригнічення мутагенності екстрактами, %

Rh.rosea P.filicifolia P.ginseng U.victoris

ТА 98 прямої дії ДДДТДП* 92,9±7,5 90,1±7,5 35,1±8,7 25,1±7,5

Етидіум бромід 88,0±5,9 69,5±5,9

MnCl2 39,9±8,1 48,8±9,4 ѕ ѕ

CdCl2 34,1±7,5 28,8±4,2 ѕ ѕ

ZnCl2 80,6±9,7 74,1±8,4 ѕ ѕ

Pb(CH3COO)2 62,8±8,3 27,5±4,3 ѕ ѕ

непря-мої дії Бензидин 39,7±4,2 ѕ** 47,2±5,3 ѕ

Бенз[а]пірен 26,9±5,3 ѕ 33,7±4,5 ѕ

ТА 100 прямої дії K2Cr2O7 81,6±9,1 92,9±9,9

Тіо-ТЕФ*** 64,7±9,2 92,1±6,3

NaN3 67,1±4,5 74,4±4,5

MnCl2 30,6±3,0 42,7±9,9 ѕ ѕ

CdCl2 52,4±7,5 57,5±6,1 ѕ ѕ

ZnCl2 30,1±7,9 31,1±6,5 ѕ ѕ

Pb(CH3COO)2 53,1±7,6 52,7±4,9 ѕ ѕ

Примітки: ДДДТДП* – 2,4-диокси-4,5-диоксо-4,5,9,10-тетрагідро-9,10-діазопірен;

ѕ** при відсутності достовірного зменшення кількості колоній ревертантів у варіанті з екстрактом порівняно з відповідним позитивним контролем (Р>0,05) відсоток пригнічення не вираховувався;

тіо-ТЕФ*** – тіотриетиленімінофосфат.

мутагенність ДДДТДП на 92,9±7,5%, екстракт P.filicifolia – мутагенність ДДДТДП на 90,1±7,5%, біхромату калію на 92,9±9,9% та тіо-ТЕФ на 92,1±6,3%. Екстракти P.ginseng та U.victoris серед мутагенів прямої дії достовірно пригнічували лише активність ДДДТДП (на 25-35%).

Іншу картину щодо вираженості захисного впливу різних екстрактів ми бачимо при застосуванні мутагенів непрямої дії бензидину та бенз[а]пірену: захисну активність виявили екстракти P.ginseng (47,2±5,3% та 33,7±4,5% відповідно) та Rh.rosea (39,7±4,2% та 26,9±5,3% відповідно), причому у цих експериментах відмічена тенденція екстракту P.ginseng діяти сильніше, ніж екстракт Rh.rosea.

Отже, екстракти Rh.rosea, P.filicifolia, P.ginseng та U.victoris виявили у тесті Еймса антимутагенні властивості, виражені в тій чи іншій мірі в залежності від штаму S.typhimurium та використаного мутагену.

2. Використання системи Escherichia coli - бактеріофаг l для вивчення антимутагенної дії рослинних екстрактів

У попередньому розділі показано достовірний антимутагенний ефект екстрактів Rh.rosea, P.filicifolia, P.ginseng та U.victoris у тесті Еймса щодо ряду хімічних мутагенів прямої та непрямої дії. Більш повна характеристика їх антимутагенної активності може бути досягнута при використанні додаткових тест-систем. Для вивчення антимутагенних ефектів ми використали систему бактеріальна клітина - бактеріофаг, у якій бактеріофаг виступає тест-об'єктом. На користь такого підходу свідчить той факт, що бактеріофаги здавна використовувались [Захаров И.А., Кривиский А.С., 1972] і продовжують використовуватись [Smith L.A., Drake J.W., 1998] як зручні об'єкти для вивчення механізмів інактивуючої та мутагенної дії різних хімічних сполук та опромінення. Особливо цікавими є результати дослідів in vitro, де позаклітинний фаг можна розглядати як неметаболізуючу ДНК, захищену лише білковою оболонкою.

Ми провели вивчення генетичної активності екстрактів у системі E.coli – бактеріофаг l, де тест-об'єктами слугували фаг l+ дикого типу та фаг l-4. Обидва фагові варіанти використовували як у нативній формі, так і у формі попередньо мутагенізованих фагів. При цьому ми виходили з припущення, що розширення набору фагових варіантів за рахунок введення поряд з дикою формою фага (фаг l+) делетованої форми фага (фаг l-4) та застосування попередньої мутагенізції тест-об'єкту (фаги l+ ІІІ пас. та l-4 І пас.) дозволить сформувати достатньо чутливу тест-систему, здатну ефективно реагувати на обробку мутагеном та потенційним антимутагеном.

Принципова придатність системи E.coli – бактеріофаг ll для реєстрації впливу рослинних екстрактів на рівень летальних та маркерних генних мутацій показана у дослідах за умов in vivo. Уже перші їх результати свідчили про те, що випробувані нами екстракти впливали не тільки на рівень індукції маркерних мутантів, але й на рівень інактивації фагової популяції. Важливо відмітити, що при вирощуванні у присутності екстрактів загальні титри інактивованого фага та титри індукованих h-мутантів коливались синхронно. Враховуючи цей факт, а також ту обставину, що інактивація може бути зумовлена набагато ширшим спектром ушкоджень, ніж індукція маркерних мутацій, у серії експериментів за умов in vitro ми вивчали вплив екстрактів саме на інактивацію тест-об'єкту.

Використання обробки тест-фага досліджуваними речовинами за умов in vitro дає змогу розрізняти генетичні ефекти, що відбуваються на рівні фагової частки, від генетичних ефектів, опосередкованих клітинними системами. Це, в свою чергу, дозволяє розмежувати в певній мірі протекторну та антимутагенну активності досліджуваних екстрактів. Протекторна активність потенційного антимутагену може бути зареєстрована як послаблення інактивації фага, обробленого за умов in vitro одночасно мутагеном та антимутагеном, порівняно з контролем. Антимутагенна дія, яка опосередковується в даному випадку роботою клітинних систем, може бути зареєстрована як підвищення, порівняно з контролем, титру фага, попередньо обробленого мутагеном за умов in vitro та вирощеного у присутності екстрактів.

Метою першої серії експериментів було виявлення протекторних властивостей екстрактів, тобто їх здатності перешкоджати процесу індукції летальних ушкоджень саме на етапі безпосередньої взаємодії мутагену з тест-об'єктом за умов in vitro. Умови експерименту забезпечували одночасну дію мутагену та можливого протектора на позаклітинний фаг.

Спочатку порівняли темпи інактивації різних варіантів фага l (l+, l+ ІІІ пас., l-4 та l-4 І пас.), оброблених за умов in vitro лише азотистою кислотою. Як можна бачити з рис. 1, міра інактивації фагів зростала у ряду: l+ < l+ ІІІ пас. < l-4 < l-4 І пас., тобто фаг l+ інактивувався найслабше, фаг l-4 І пас. – найсильніше. Отже, в даному випадку наявність у фага делеції (l-4) та попередня мутагенізація

фагів (l+ ІІІ пас. та l-4 І пас.) сприяли підвищенню їх чутливості як тест-б'єктів до інактивуючої дії мутагену, порівняно з вихідним фагом.

Інгібуючий (протекторний) вплив екстрактів на інактивацію використаних чотирьох об'єктів виражався різною мірою. Найсильніший ефект був досягнутий при використанні фага l-4 І пас. Так, із рис. 2 видно, що дія екстрактів виявлялась вже у точці 0 год, яка обіймає 2-3 хвилини, потрібних для приготування препаратів, і була дуже виразною у точці 1 год.

Екстракти Rh.rosea та P.filicifolia у точці 1 год підвищували загальний титр фага порівняно з контролем у 679 та 712 разів відповідно. Екстракт Rh.rosea нат. інактивував фаг l-4 І пас. у перші хвилини реакції. Далі інактивація фага у варіанті з цим екстрактом проходила майже паралельно контролю (рівень загального титру фага становив 48% від контролю у точці 0 год та 40% від контролю у точці 1 год). Виходячи з того, що швидкість інактивації фага екстрактом Rh.rosea нат. практично не мінялась впродовж обробки, імовірно припустити, що антивірусні компоненти екстракту досить швидко знешкоджувались мутагеном. Різна активність екстрактів родіоли природного та біотехнологічного походження може свідчити про відмінний склад як самих препаратів, так і джерел їх отримання.

При застосуванні як тест-об'єктів фагів l+, l+ ІІІ пас. та l-4 показана значна протекторна активність екстрактів P.filicifolia, P.ginseng та U.victoris (рис. 3), однак її вираженість була нижчою, ніж у дослідах з фагом l-4 І пас. (рис. 2),

оскільки на жодному з цих тест-фагів не було зареєстровано таких високих результатів.

Аналіз ефективності екстрактів у дослідах з фагами l+, l+ ІІІ пас. та l-4 дозволив відмітити явну залежність сили захисного ефекту від фонового рівня інактивації. Так, у точці 1 год захисний ефект екстрактів був більш вираженим на фагах l+ та l-4, ніж на фагу l+ ІІІ пас. (рис. 3 а). Зауважимо, що дещо менший вплив екстрактів на фаг l+ ІІІ пас. у цій точці відповідає слабшій його інактивації порівняно з іншими фагами (рис. 1). Захисний ефект рослинних екстрактів на фагах l+ ІІІ пас. та l-4 підвищувався у точці 2 год порівняно з попередньою точкою (1 год), тоді як у випадку фага l+ дія екстрактів не посилювалась і навіть виявилась ще слабшою, ніж у попередній точці (рис. 3 б). В цілому, це відповідає зниженню втричі темпу інактивації фага l+ протягом другої години процесу (рис. 1).

Що торкається різниці між самими екстрактами, то порядок їх розташування за силою захисного ефекту був наступним: U.victoris > P.ginseng > P.filicifolia (рис. 4).

Не зважаючи на те, що для фагів l+, l+ ІІІ пас. та l-4 екстракт P.filicifolia був найслабшим, для фага l-4 І пас. його захисний ефект був виражений дуже сильно (рис. 2). Очевидно, це свідчить про те, що фаг l-4 І пас. можна розцінювати як найбільш чутливий тест-об'єкт, а попередню мутагенізацію тест-об'єкту – як цікавий підхід до підвищення чутливості тест-системи в цілому.

Отже, пов'язуючи чутливість фага до дії екстрактів та його інактивацію, можна припустити, що на фоні сильнішого інактивуючого ефекту захисна дія екстрактів виявляється більш вираженою. Однак, простежена відповідність не завжди носила такий чіткий характер для фагів l+ ІІІ пас. та l-4 (рис. 3).

У наступній серії експериментів вивчали вплив екстрактів на ефективність реалізації потенційних летальних ушкоджень, індукованих мутагеном у позаклітинного фага, тобто антимутагенні властивості екстрактів. Для цього екстракти вносили на етапі висіву на чашку проб фага, обробленого азотистою кислотою за умов in vitro. Вплив екстрактів реєструвався як коливання ефективності посіву інактивованого фага при вирощуванні його без та у присутності екстрактів.

Серед випробуваних тест-об'єктів (l+, l+ ІІІ пас., l-4 І пас.) найбільш виражений ефект спостерігали при використанні фага l-4 І пас. Як можна бачити із рис. 5, вирощування цього фага, інактивованого попередньо впродовж однієї години, у присутності екстрактів Rh.rosea та P.filicifolia забезпечувало зростання порівняно з контролем загального титру фага у 7,7 та 2,9 разів відповідно.

Це свідчить про те, що екстракти знижували ефективність реалізації потенційних летальних ушкоджень. Зовсім протилежний ефект виявляв екстракт Rh.rosea нат. Він не тільки не сприяв репарації ушкоджень, індукованих мутагеном, але й знижував у 4 рази виживання обробленого фага (рис. 5 б).

Захисна активність рослинних екстрактів в аналогічних експериментах з використанням як тест-об'єктів фагів l+ та l+ ІІІ пас. була значно нижчою і не завжди досягала достовірного рівня. Загалом, застосування фагів l+ та l+ ІІІ пас., порівняно з фагом l-4 І пас., було менш ефективним для вивчення антимутагенності.

Таким чином, чутливість системи E.coli – бактеріофаг l залежить від стану об'єкту тестування, а саме: делетована форма бактеріофага (l-4), а також попередньо мутагенізований бактеріофаг (вирощений на середовищі з мутагеном) сильніше піддавались мутагенному та антимутагенному впливам, ніж нативний бактеріофаг дикого типу (l+).

На найбільш чутливому тест-об'єкті – фаг l-4 І пас. – екстракти Rh.rosea та P.filicifolia виявили високу протекторну та дещо слабшу антимутагенну активності. Порівняльний аналіз активності екстрактів Rh.rosea та P.filicifolia свідчить про те, що за величиною протекторного ефекту вони рівні, тоді як антимутагенна дія більш виражена для екстракту Rh.rosea. Можливо, певні клітинні системи, зокрема репаративна, більш ефективно активуються у присутності екстракту Rh.rosea порівняно з екстрактом P.filicifolia.

На інших об'єктах тестування (фаги l+, l+ ІІІ пас., l-4) показано значні протекторні властивості екстрактів, котрі за силою захисного ефекту можна розташувати в ряд U.victoris > P.ginseng > P.filicifolia. Тут ефект екстракту U.victoris виявився найвищим, хоча і не досягав величин, зареєстрованих для екстрактів Rh.rosea та P.filicifolia при використанні фага l-4 І пас. При вивченні антимутагенності дані тест-об'єкти були мало ефективними, оскільки зареєстрована активність екстрактів була низькою.

Слід відзначити, що протекторна активність екстрактів виглядала більш вираженою порівняно з їх антимутагенною дією. Серед можливих механізмів протекторного ефекту, насамперед, слід виділити безпосередню взаємодію, можливо хімічну, мутагену з рослинним препаратом, що дезактивує мутагенні властивості. Наступним механізмом протекторного ефекту є взаємодія компонентів рослинного екстракту з білковою оболонкою фага. Поєднання цих властивостей екстрактів, очевидно, забезпечує більш ефективний захист тест-об'єкту від впливу мутагену, ніж це спостерігається при відновленні ушкодженої структури на рівні ДНК.

ВИСНОВКИ

1. Водно-спиртові екстракти біомаси культивованих клітин женьшеня справжнього Panax ginseng, полісціасу папоротелистого Polyscias filicifolia, родіоли рожевої Rhodiola rosea та унгернії Віктора Ungernia victoris не впливали на спонтанний рівень мутантів та пригнічували хімічно індукований мутагенез у тесті Еймса та системі Escherichia coli – бактеріофаг ll.

2. У тесті Еймса найсильніший антимутагенний ефект щодо ряду мутагенів прямої дії виявили екстракти Rh.rosea та P.filicifolia (65-93% пригнічення мутагенності). Дію промутагенів знижували екстракти P.ginseng та Rh.rosea (на 30-50%).

3. Показана можливість використання системи E.coli – бактеріофаг ll для вивчення впливу рослинних препаратів на рівень індукованих маркерних та летальних ушкоджень. Найбільш чутливим тест-об'єктом був варіант бактеріофага l, отриманий при попередньому вирощуванні його делетованої форми (l-4) на середовищі з мутагеном.

4. Обробка тест-фага мутагеном за умов in vitro (поза клітиною) дає змогу розмежувати протекторну та антимутагенну активності досліджуваних препаратів. Протекторна дія вивчених екстрактів була значно вищою, ніж їх антимутагенна активність. Найвищий протекторний ефект мав екстракт U.victoris, антимутагенний – екстракт Rh.rosea; екстракт натурального кореня Rh.rosea демонстрував антивірусну активність.

5. Для первинного скринінгу препаратів на антимутагенну активність у прокаріотичних системах доцільно обмежитись вивченням їх впливу на інактивацію тест-об'єкту, обробленого мутагеном за умов in vitro.

6. Антимутагенна активність екстрактів у використаних системах (тест Еймса та система E.coli – бактеріофаг ll) проявилась різною мірою як у кількісному, так і в якісному відношеннях, причому більш чіткі кількісні результати одержані при використанні системи E.coli – бактеріофаг ll.

СПИСОК РОБІТ, ОПУБЛІКОВАНИХ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

1. Дворник А.С., Дуган О.М., Кунах В.А. Антимутагенна дія екстрактів із біомаси культивованих клітин деяких лікарських рослин // Доповіді НАН України. – 1999. – № 7. – С. 166-169.

2. Дуган О.М., Бариляк І.Р., Нестер Т.І., Дворник А.С., Кунах В.А. Дослідження антимутагенної активності екстрактів із біомаси культивованих клітин деяких лікарських рослин у тесті Еймса // Цитология и генетика. – 1999. – 33, № 6. – С. 19-25.

3. Дворник А.С., Перерва Т.П., Мойса Л.М., Кунах В.А. Використання системи Escherichia coli – бактеріофаг l для вивчення антимутагенної дії рослинних екстрактів // Биополимеры и клетка. – 2000. – 16, № 1. – С. 69-74.

4. Дворник А.С., Перерва Т.П., Кунах В.А. Антимутагенна дія рослинних екстрактів у тест-системі Escherichia coli - бактеріофаг l в умовах in vitro // Доповіді НАН України. – 2000. – № 7. – С. 188-190.

5. Дворник А.С. Антимутагенна активність рослинних екстрактів у системі Escherichia coli - бактеріофаг l // Бюлетень інституту сільськогосподарської мікробіології. – 2000. – № 7. – С. 15-16.

6. Можилевская Л.П., Кунах В.А., Дворник А.С., Музыка В.И. Получение и результаты изучения культуры тканей Ungernia victoris // IV Міжнародна конференція з медичної ботаніки. Тези доп. – Вересень, Київ. – 1997. – С. 337-338.

7. Dvornyk A.S., Dugan A.M., Mozhylevs'ka L.P., Kunakh V.A. Estimation of antimutagenic activities of the extracts from the biomass of cultured cells of some medicinal plants // II International Symposium on Plant Biotechnology. Abstracts. – 4-8 October, Kyiv (Ukraine) . – 1998. – P. 35.

АНОТАЦІЇ

Дворник А.С. Дослідження антимутагенних властивостей екстрактів біомаси культивованих клітин деяких лікарських рослин. – Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 03.00.15 – генетика. – Інститут клітинної біології та генетичної інженерії НАН України, Київ, 2001.

Дисертацію присвячено вивченню антимутагенних властивостей водно-спиртових екстрактів біомаси культивованих клітин лікарських рослин – женьшеня справжнього Panax ginseng C. A. Mey., полісціасу папоротелистого Polyscias filicifolia Bailey, родіоли рожевої Rhodiola rosea L. та унгернії Віктора Ungernia victoris Vved. ex Artjuschenko. У тесті Еймса досліджені екстракти не впливали на рівень спонтанних мутантів штамів S.typhimurium ТА 98 і ТА 100 та ефективно пригнічували хімічно індукований мутагенез. Найсильніший антимутагенний ефект виявили екстракти Rh.rosea та P.filicifolia щодо мутагенів прямої дії. Дію промутагенів інгібували лише екстракти P.ginseng та Rh.rosea.

Для виявлення антимутагенних ефектів препаратів запропоновано використовувати систему Escherichia coli – бактеріофаг l. Показано, що найбільш чутливим тест-об'єктом був варіант бактеріофага l, отриманий при попередньому вирощуванні його делетованої форми (l-4) на середовищі з мутагеном. Обробка тест-фага мутагеном за умов in vitro (поза клітиною) дає змогу розмежувати протекторну та антимутагенну активності екстрактів. Протекторна дія вивчених екстрактів була значно вищою, ніж їх антимутагенна активність. Найвищий протекторний ефект мав екстракт U.victoris, антимутагенний – екстракт Rh.rosea; екстракт натурального кореня Rh.rosea демонстрував антивірусну активність.

Обгрунтовано, що для первинного скринінгу препаратів на антимутагенну активність у прокаріотичних системах доцільно обмежитись вивченням їх впливу на інактивацію тест-об'єкту, обробленого мутагеном за умов in vitro.

Ключові слова: антимутагенез, лікарські рослини, біомаса культивованих клітин, прокаріотичні тест-системи.

Дворник А.С. Исследование антимутагенных свойств экстрактов биомассы культивируемых клеток некоторых лекарственных растений. – Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.15 – генетика. – Институт клеточной биологии и генетической инженерии НАН Украины, Киев, 2001.

Диссертация посвящена изучению антимутагенных свойств экстрактов биомассы культивируемых клеток некоторых ценных лекарственных растений – женьшеня настоящего Panax ginseng C. A. Mey., полисциаса папоротниколистного Polyscias filicifolia Bailey, родиоли розовой Rhodiola rosea L. и унгернии Виктора Ungernia victoris Vved. ex Artjuschenko. Установлено, что в тесте Еймса экстракты P.ginseng, P.filicifolia, Rh.rosea и U.victoris не владеют генотоксическими свойствами и показали антимутагенное действие. Наиболее сильный эффект исследуемые экстракты показали относительно мутагенов прямого способа действия, в первую очередь экстракты Rh.rosea и P.filicifolia. Действие промутагенов ингибировали только экстракты P.ginseng и Rh.rosea.

Для изучения антимутагенных эффектов препаратов предложено использовать систему Escherichia coli – бактериофаг l. Показано, что наиболее чувтсвительным тест-объектом был вариант бактериофага l, полученный при предварительном выращивании его делетированной формы (l-4) на среде с мутагеном. Обработка фага мутагеном в условиях in vitro (вне клетки) даёт возможность разграничить протекторную и антимутагенную активности экстрактов. Протекторное действие изученных экстрактов было более существенным, чем их антимутагенная активность. Наивысший протекторный эффект был у экстракта U.victoris, антимутагенный – у экстракта Rh.rosea, экстракт натурального корня Rh.rosea демонстрировал антивирусное действие.

Обоснованно, что для первичного скрининга препаратов на антимутагенную активность в прокариотических системах целесообразно ограничиться изучением их влияния на инактивацию объекта, мутагенизированного в условиях in vitro.

Ключевые слова: антимутагенез, лекарственные растения, биомасса культивируемых клеток, прокариотические тест-системы.

Dvornyk A.S. Studies on the antimutagenic properties of the extracts from the biomass of some medicinal plants' cultured cells. – Manuscript.

Thesis for a candidate's degree by the specialty 03.00.15 – genetics. Institute of Cell Biology and Genetic Engineering of National Academy of Sciences of Ukraine, Kyiv, 2001.

Antimutagenic properties of aqua-alcoholic extracts from the biomass of some valuable medicinal plants' cultured cells, those of Panax ginseng C. A. Mey., Polyscias filicifolia Bailey, Rhodiola rosea L. and Ungernia victoris Vved. ex Artjuschenko, have been studied in two prokaryotic systems. In Ames test the extracts under study failed to affect the level of spontaneous mutants of S.typhimurium TA 98 and TA 100 and effectively inhibited the chemically induced mutagenesis. Most extensive antimutagenic effect (over 90 % of mutagenicity inhibition) showed Rh.rosea and P.filicifolia extracts relative to the mutagens of direct effect. Promutagens effect was counteracted only by P.ginseng and Rh.rosea extracts (around 40 % of mutagenicity inhibition).

To reveal the antimutagenic effects of the preparations use of Escherichia coli – bacteriophage l system, in which bacteriophage would act as a test-object, was proposed. The extracts activity was evaluated by their contribution to inactivation of the test-phage to be treated by the mutagen in conditions in vitro (extracellularly). Test-phage treatment by mutagen in conditions in vitro would allow to discriminate between the protective and antimutagenic extracts activities. The protective effects of the extracts involved significantly exceeded their antimutagenic activities.

Most responsive test-object was shown to be the variant of bacteriophage l to be generated as a result of the bacteriophage deleted form (l-4) maintenance on the medium added with mutagen. In this test-object Rh.rosea and P.filicifolia extracts exhibited extensive protective and somewhat slighter antimutagenic activities, Rh.rosea natural root extract displayed antiviral effect. Other variants of phage l being used as test-objects demonstrated extracts protective activities, which by the intensity of the protective effect could be arranged in a row as follows U.victoris > P.ginseng > P.filicifolia.

It was substantiated, that to ensure the starting screening of preparations for antimutagenic activity in prokaryotic systems it is worth while to restrict oneself by estimation of their contribution to inactivation of the test-object to be exposed to mutagen in conditions in vitro.

Key words: antimutagenesis, medicinal plants, biomass of cultured cells, prokaryotic test-sysytems.