МІНІСТЕРСТВО ОХОРОНИ ЗДОРОВ’Я УКРАЇНИ

ХАРКІВСЬКИЙ ДЕРЖАВНИЙ МЕДИЧНИЙ УНІВЕРСИТЕТ

Діголь Людмила Геннадіївна

УДК: 611.71:616-003.93:541.6

МОРФОФУНКЦІОНАЛЬНИЙ СТАН ТРУБЧАСТИХ КІСТОК

У ПРОЦЕСІ РЕПАРАТИВНОЇ РЕГЕНЕРАЦІЇ ПІД ВПЛИВОМ ПОЛІЕТИЛЕНГЛІКОЛІВ ТА ЇХНІХ ПОХІДНИХ

(анатомо-експериментальне дослідження)

14.03.01 – нормальна анатомія

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата медичних наук

Харків – 2001

Дисертацією є рукопис

Робота виконана в Харківському державному медичному університеті

МОЗ України

Науковий керівник: доктор біологічних наук, професор

Жегунов Геннадій Федорович

Харківський державний медичний університет,

завідувач кафедри медичної біології

Офіційні опоненти:

Заслужений діяч науки і техніки України, лауреат Державної премії України,

доктор медичних наук, професор Ковешніков Володимир Георгійович,

Луганський державний медичний університет МОЗ України, завідувач кафед-

ри нормальної анатомії

Доктор біологічних наук, професор Ковтун Михайло Фотієвич, Інститут

зоології НАН України, завідувач відділу еволюційної морфології хребетних

Провідна установа

Національний медичний університет ім. О.О.Богомольця, кафедра анатомії

людини, МОЗ України, м. Київ

Захист відбудеться “ 31” січня 2002 р. о 14 годині на засіданні

спеціалізованої вченої ради Д 64.600.03 при Харківському державному медич-

ному університеті (61022, м. Харків, проспект Правди, 12).

3 дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Харківського державного ме-

дичного університету (61022, м. Харків, проспект Леніна, 4).

Автореферат розісланий “ 29 ” грудня 2001 року

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради

кандидат медичних наук, доцент Терещенко А.О.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Проблема цілеспрямованого впливу на процес відновлення анатомічної цілісності кістки після ушкодження ніколи не втрачала своєї актуальності (Шапошников Ю.Г. з співавт., 1987; Vidal J. et al., 1988; Теодоридис К.А., 1997; Шевченко О.Г., 1997; Корж Н.А. з співавт., 2000). Однак останнім часом її рішення має особливе значення для України, тому що аналіз випадків інвалідності після травм у районах, що постраждали від чорнобильської аварії, свідчить про різке збільшення кількості відкритих переломів через підвищену “ламкість” кістки внаслідок остеопорозу (Хомяков Н.В., 1997). Уповільнення консолідації трубчастих кісток спричиняє стійку втрату працездатності в 29,6% хворих.

У зв'язку з цим зростає роль експериментальних досліджень, спрямованих на подальше вивчення біологічних закономірностей репаративного остеогенезу й обґрунтування методів і засобів, що оптимізують зрощення кістки. В останньому випадку одним зі шляхів, що ведуть до рішення поставленої задачі, є теоретично обґрунтований і цілеспрямований пошук речовин, здатних впливати на ключові біохімічні процеси, що лежать в основі репаративної регенерації кістки (Корж А.А., 1992; Панков Е.Я., Дедух Н.В., 1992; Билич Г.Л., 1996). Такими процесами вважаються біосинтез білків і ферментів диференційованими клітинами регенерату кістки з наступною мінералізацією органічного матрикса (Clingen H., Dickson G.R., 1995).

Нашу увагу привернули полімери на основі окису етилену – поліетиленгліколі (ПЕГ) і їхні похідні, здатні впливати на перебіг різних біологічних процесів як унаслідок прямої взаємодії з мембранами клітин, так і опосредковано, змінюючи фізико-хімічні властивості водяної фази (Топчиева И.Н. з співавт., 1989). Дані полімери знайшли широке застосування як консерванти трансплантатів, пролонгатори лікарських засобів, агенти, що осаджують білки, для одержання гібридів і моноклональных антитіл, як основа медичних мазей і косметичних кремових композицій, а також як емульгатори в системах штучного кровообігу й імуностимулятори (Полякова Г.П з співавт., 1983; Кабанов В.А. з співавт., 1984; Wehrle P. et al., 1988; Pittaluga J.A. et al., 1988; Heintz C., Boymond C., 1989; Юрченко Т.Н. з співавт., 1989; Перцев И.М. з співавт., 1990; Сысолятин П.Г. з співавт., 1997; Webb Murray S. et al., 1998; Ткаченко В.Л. з співавт., 1999). Така розмаїтість у застосуванні цих речовин обумовлена їх змочувальними, емульгуючими, диспергіруючими, стабілізуючими й іншими фізико-хімічними властивостями, що, у свою чергу, зв'язано зі структурою полімерів (Топчиева И.Н., 1989; Сперкач В.С. з співавт., 1997).

Широке використання поліетиленгліколів і пов'язане з цим дослідження їхніх властивостей і біологічної дії виявило здатність даних полімерів впливати на проліферацію й диференціацію клітин (Митряев А.Б., 1978; Панков Е.Я. з співавт., 1978; Глушко Т.А., Маркова О.П., 1980; Жуков В.И., 1991). Це робить перспективним їхнє подальше вивчення як речовин, що регулюють процеси репаративної регенерації.

Необхідно відзначити, що основні труднощі лікування переломів кісток обумовлені не тільки тривалістю процесів консолідації й відновлення функції ушкодженого сегмента, але й виникненням ускладнень внаслідок інфікування (Каплан А.В. з співавт., 1985; Шумада И.В., 1987; Frost H.M., 1989; Ревелл П.А., 1993; Sochen J.E., 1994; Bockhorn G. et al., 1997; Фаддеев Д.И., 1997). При розмноженні мікроорганізмів у зоні ушкодження кількість некротично змінених тканин у результаті дії мікробних токсинів різко збільшується, що сприяє розладу мікроциркуляції, який виник в результаті прямого ушкодження. Підвищення проникності судин внаслідок дії медіаторів запалення приводить до виникнення швидко наростаючого набряку. Гіпергідратація тканин в осередку запалення ушкоджуюче діє на тканинні структури, тобто веде до поширення некрозів, що, у свою чергу, сприяє посиленню набряку й розвитку гнійної інфекції (Даценко Б.М. з співавт., 1985; Swiontkowski M.F., 1989; Шалимов А.А. з співавт., 1998). Наявні в літературі дані про високу осмотичну активність поліетиленгліколів, яка обумовлює їх некролітичну дію, визначають перспективність їхнього використання в травматології з метою очищення вогнища запалення від продуктів альтерації тканин (Белов С.Г., 1988; Пінсон І.Я., 1999). Разом з тим, у літературі з’явилися повідомлення про те, що застосування гіперосмолярних речовин, поряд зі здатністю стримувати набряк тканин, може приводити до зневоднювання здорових тканин і пригніченню росту грануляцій (Bobin M.F. et al., 1989; Безуглая Е.П. з співавт., 1995). Поява таких робіт внесла неясність у відношенні біологічної дії цих речовин на репаративні процеси.

Вищевикладене свідчить про актуальність вивчення особливостей репаративної регенерації кістки під впливом поліетиленгліколів і їхніх похідних в асептичних умовах і умовах інфікування.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Робота виконана в рамках комплексної НДР Харківського державного медичного університету (№ держ. реєстрації 01980002617).

Мета і задачі дослідження.

Мета роботи – експериментальне обґрунтування біологічної дії поліетиленгліколів та їхніх похідних на репаративну регенерацію кістки.

Задачі дослідження. Для досягнення поставленої мети були визначені наступні задачі:

1.

2.

3.

4.

Об'єкт дослідження – репаративний остеогенез.

Предмет дослідження – морфофункціональний стан трубчастої кістки в процесі репаративної регенерації в асептичних умовах і умовах інфікування під впливом поліетиленгліколів і їхніх похідних.

Методи дослідження. Для вивчення впливу ПЕГ і їхніх похідних на репаративну регенерацію трубчастих кісток був застосований метод експериментального моделювання. Як модель обраний поперечний перелом стегнової кістки білого щура метадіафізарної локалізації з металоостеосинтезом фрагментів. Для створення моделі перелому стегнової кістки, ускладненого інфекцією, використовувалася культура золотистого стафілокока. У роботі зі стафілококом були застосовані сучасні стандартизовані й уніфіковані мікробіологічні методи дослідження.

Експериментальним матеріалом служила стегнова кістка білих щурів, тотальні препарати якої піддавалися макромікроскопічному, гістологічному й морфометричному дослідженню. Як структурні показники були обрані компоненти регенерату: остеогенний, хондрогенний і фіброгенний, а також некроз і фрагменти кістки, динаміка площ яких відбивала характер змін, що відбуваються в процесі репаративного остеогенезу. Співвідношення компонентів регенерату було кількісною характеристикою його морфофункціонального стану. Отримані цифрові дані оброблені методом варіаційної статистики з використанням ПК типу IBM PC/АТ.

Наукова новизна одержаних результатів. Уперше вивчено особливості морфогенезу трубчастих кісток у процесі репаративної регенерації при дії поліетиленгліколів і їхніх похідних в асептичних умовах та в умовах інфікування. Показано, що введення даних полімерів у ділянку перелому викликає морфофункціональну перебудову регенерату на ранніх етапах відновлення кістки. На основі даних експериментального дослідження виявлено загальні й часткові закономірності структурних перетворень у процесі репаративного остеогенезу, що протікає під впливом поліетиленгліколів і їхніх похідних в асептичних умовах й умовах інфікування.

Установлено залежність впливу поліетиленгліколів і їхніх похідних на репаративну регенерацію кістки від хімічної структури й властивостей цих речовин. Теоретично обґрунтовано доцільність використання поліетиленоксиду м.м. 400 і поліетиленпропіленоксиду м.м. 1500 для лікування ран, що супроводжуються переломом кістки.

Практичне значення одержаних результатів. Отримані результати розширюють існуючі уявлення про дію поліетиленгліколів і їхніх похідних на живий організм. На основі порівняльного аналізу дії поліетиленгліколів і їхніх похідних на репаративну регенерацію трубчастих кісток як в асептичних умовах, так і умовах інфікування визначено можливість використання цих речовин з метою регуляції репаративного остеогенезу. Результати роботи дозволяють рекомендувати поліетиленпропіленоксид м.м. 1500 як можливий фармакологічний засіб для оптимізації процесів репаративної регенерації кісткової тканини.

Для наукових досліджень з метою вивчення впливу на репаративний остеогенез хімічних, фізичних та біологічних факторів розроблено й запропоновано металофіксатор для міцного з'єднання фрагментів кістки після перелому. Вивчено особливості репаративного остеогенезу при експериментальному моделюванні перелому з металоостеосинтезом фрагментів кістки фіксатором даної конструкції.

Результати наукових досліджень використовуються в навчальному процесі на кафедрах медичної біології, гістології, цитології та ембріології, травматології та ортопедії Харківського державного медичного університету, на кафедрі фізіології з основами анатомії Національної фармацевтичної академії України.

Особистий внесок здобувача. Аналіз літератури за темою дисертації, виконання експерименту, морфологічні та мікробіологічні дослідження, статистична обробка матеріалу, аналіз результатів дослідження й оформлення роботи виконані автором самостійно.

Апробація результатів дисертації. Матеріали дисертаційної роботи доповідалися на наукових конференціях молодих вчених ХДМУ (м. Харків, 1988, 1990), на обласній науковій конференції “Медико-технічне забезпечення навчального і наукового процесу в морфології” (м. Харків, 1989), на конференції “Вплив антропогенних факторів на органи і системи організму” (м. Саратов, 1992), на засіданні наукового товариства анатомів (протокол № 3 від “1” березня 2001 року).

Публікації. За темою дисертації опубліковано 5 праць, з них 3 – у наукових журналах за фахом, що рекомедовані ВАК України.

Структура й обсяг дисертації. Дисертація викладена на 172 сторінках машинописного тексту (основного тексту – 118 стор.) і складається з вступу, огляду літератури, глави матеріалів і методів дослідження, глави власних досліджень, окремої глави з обговорення отриманих результатів, заключення, висновків і додатка. Текст дисертації ілюстрований 83 рисунками та 3 таблицями, містить 4 додатки. Бібліографічний перелік складає 207 найменувань, з них 143 літературних джерела на російській й українській та 64 - на іноземних мовах.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ

МАТЕРІАЛ І МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕННЯ. Дослідження проведено на 312 білих щурах популяції Вістар, самцях масою 230-240 г, яким під внутрішньочеревинним гексеналовим наркозом за допомогою дискової пилки робили поперечний перелом стегнової кістки вище дистального метаепіфіза. Кісткові відламки з'єднували спеціальним металевим штифтом, який забезпечував міцну фіксацію при мінімальній травматизації кісткового мозку.

Експеримент був поставлений у двох варіантах: в асептичних умовах і умовах інфікування. Кожний із двох варіантів включав серії експериментів з речовинами: поліетиленоксид м.м. 400 (ПЕО-400), поліетиленпропіленоксид м.м. 1500 (ПЭПО-1500), поліетиленпропіленоксид м.м. 3600 (ПЭПО-3600), поліетиленпропіленоксид м.м. 6000 (ПЕПО-6000), поліпропіленоксид м.м. 700 (ППО-700).

У першому варіанті дослідів (в асептичних умовах) тваринам відразу після операції і потім щодня протягом шести днів через дренажну трубку вводили поліетиленгліколі і їхні похідні в кількості 0,1 мл. У другому варіанті дослідів (в умовах інфікування) під час операції в рану вносили 0,1 мл суспензії штаму S. aureus 209, що містить у 1 мл 108 мікробних тіл. Ця доза достатня для розвитку інфекційного процесу (Даценко Б.М. з співавт., 1985). Потім щодня протягом шести днів вводили поліетиленгліколі і їхні похідні в кількості 0,1 мл.

Для роботи із золотистим стафілококом була використана методика одержання й стандартизації свіжого змиву культури мікроорганізму (Кривошеин Ю.С., 1986). Для підтвердження розвитку стафілококової інфекції проводили посів на кров’яний агар гнійного виділення операційної рани експериментальних тварин (Навашин С.М., Фомина И.П., 1982), при цьому виділяли культуру стафілокока, за своїми біохімічними й культуральними властивостями ідентичну вихідній. Виділення мікроорганізмів і їхню ідентифікацію проводили відповідно до Наказу МЗ СРСР № 535 від 22.04.85 і методичними рекомендаціями (Харків, 1991).

Піддослідних тварин виводили з експерименту шляхом декапітації під ефірним наркозом на 3, 7, 14, 21 добу після операції.

Для морфологічного дослідження вирізали стегнову кістку разом із прилягаючим шаром м'яких тканин. Матеріал фіксувався в 10% нейтральному формаліні. Декальцинація проводилася в рідині Ебнера, зневоднювання – у спиртах зростаючої концентрації з наступним заливанням матеріалу целлоідином. Зрізи товщиною 7-10 мк виготовлялися з центральних областей регенерату й фарбувалися гематоксиліном Вейгерта – еозином і за Ван-Гізоном (Меркулов Г.А., 1969; Киселёва А.Ф. з співавт., 1983). На підставі результатів макроскопічного дослідження виявляли ділянки, що підлягали гістологічному вивченню.

З метою узагальнення отриманих результатів і обґрунтування встановлених закономірностей тканинні компоненти на етапах відновлення кістки піддавалися кількісному аналізу (Автандилов Г.Г., 1980). Для цього було виділено 5 структурних показників: фіброгенний, остеогенний і хондрогенний компоненти регенерату, некроз і фрагменти кістки, динаміка площ яких відбивала характер морфофункціональної перебудови трубчастої кістки в процесі репаративної регенерації. Остеогенним вважався компонент регенерату, у якому визначалися кісткові трабекули (на 3-ю добу це був остеогенний шар окістя), фіброгенним – утримуючий фібробластоподібні клітини й пучки колагенових волокон, хондрогенний компонент складався з великих сплющених клітин зі слабобазофільною цитоплазмою і гіперхромними ядрами. Для оцінки ступеня зрілості регенерату визначали співвідношення остеогенного, хондрогенного й фіброгенного компонентів на одиниці його площі. Морфометрична обробка матеріалу здійснювалась по фотографіях за допомогою ПК і програми Adobe Photoshop 6.0.

Усі кількісні показники оброблялися методом варіаційної статистики з обчисленням середнього арифметичного, його помилки й середнього квадратичного відхилення з оцінкою вірогідності розходжень за критерієм Стьюдента. Вірогідність отриманих результатів не нижче 0,95.

При роботі з лабораторними тваринами керувались “Європейською конвенцією по захисту хребетних тварин, що використовуються в експериментальній та іншіх наукових цілях” (Страсбург, 18.03.86 р.); “Директивою Ради Європейського співтовариства” від 24.11.86 р., Розпорядженням МОЗ УРСР № 32 від 22 лютого 1988 р.

РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ І ЇХНІЙ АНАЛІЗ. Морфофункціональний стан стегнової кістки в процесі репаративного остеогенезу після перелому метадіафізарної локалізації було вивчено у двох варіантах: в асептичних умовах і умовах інфікування. Відновлення порушеної цілісності кістки в обох випадках реалізовувалося за рахунок реактивного формування скелетогенної тканини, клітинні елементи якої, проліферируючи, могли утворювати остео-, хондро- і десмобластичну тканину з розвитком міжклітинної субстанції. У зв'язку з тим, що при штифтуванні тканини кісткового мозку частково піддавалися руйнуванню, формування ендостальної мозолі відставало від періостальної, і з’єднання фрагментів здійснювалося за допомогою утворення періостального регенерату. Мікроскопічне дослідження виявило розходження в його структурі на проксимальній і дистальній ділянках, які виражаються в більш активних процесах кісткоутворення й резорбції кісткової речовини на дистальному фрагменті.

При вивченні й узагальненні результатів загоєння кістки в контрольній і дослідній групах було відзначено подібність початкових стадій розвитку репаративного процесу (3 доба). В усіх випадках спостерігалась активізація періосту, що приводила до розмноження остеогенних клітинних елементів і їх диференціації в остеобласти. Подальше формування регенерату кістки мало свої особливості в залежності від характеристик і властивостей речовин, які використовували в експерименті.

Відбудовні процеси, що протікають у контрольній групі тварин в асептичних умовах, характеризувалися інтенсивним розвитком періостального регенерату, який має значний обсяг і складну будову. Рівномірне розростання остеобластичної тканини на початковому етапі змінювалося на 2-3 тижні загоєння перелому прогресивним збільшенням реактивних кісткових структур в напрямку параосальних тканин. При цьому просування остеогенного компонента регенерату до лінії перелому сповільнювалося, а поблизу лінії ушкодження формувалися хондроїдно-хрящові поля. Поява в ранній термін зрощення хрящової тканини припускало її подальше заміщення кістковою, що вимагало додаткового часу на перебудову регенерату й формування кісткової мозолі. Основні закономірності репаративного процесу після перелому кістки в контрольній групі тварин (зокрема, присутність у регенераті стадії фіброзно-хрящової мозолі) відповідали описаним раніше в літературі (Русаков А.В., 1959; Хэм А., Кормак Д., 1983; Лаврищева Г.И., Оноприенко Г.А., 1996).

Результати морфологічного дослідження впливу на репаративний остеогенез досліджуваних речовин свідчили про активізацію параосальної сполучної тканини, що, як відомо, відіграє важливу роль у здійсненні початкових стадій репаративного процесу. Так, якщо в контрольній групі на 3-ю добу площа фіброгенного компонента складала 88 %, то в групах із впливом ПЕО-400, ПЕПО-1500 і ПЕПО-3600 – 92 %, ППО-700 – 95 %. Різниця між значеннями цього показника в контрольній і дослідній групах у наступний термін зростала. Так, на 7-у добу це співвідношення було таким: контроль – 63 %, ПЕО-400 – 79 %, ПЕПО-1500 – 78 %, ПЕПО-3600 – 81 %, ППО-700 – 79 %, ПЕПО-6000 – 75 %. Якщо врахувати, що новоутворення кісткових структур здійснюється не тільки за рахунок остеогенних клітинних елементів, але і за рахунок малодиференційованих сполучнотканинних, які у звичайних умовах не володіють остеогенними потенціями, значення фіброгенного компонента в процесі репаративного остеогенезу в експериментальних групах зростає.

Вважається, що швидке утворення безпосередньо кісткової мозолі при повному переломі утруднено, і в складі регенерату часто присутня хрящова тканина, що утворюється значно швидше кісткової (Nakase T. et al, 1994). У нашій роботі хондрогенний тканинний компонент був представлений тільки в групах із застосуванням ПЕО-400 і ПЕПО-6000. У першому випадку він визначався тільки на 7 і 21 добу, коли його частка в складі регенерату складала 1 % і 3 % відповідно. При введенні ПЕПО-6000 хондроїдна тканина була присутня в структурі регенерату з 7 по 21 добу, її частка на останньому тижні експерименту досягала 12 %. У серіях із впливом на репаративний остеогенез ПЕПО-1500, ПЕПО-3600 і ППО-700 появи хрящової тканини в складі регенерату не спостерігалося в жодному випадку протягом всього експерименту.

У порівнянні з результатами, отриманими в контрольній групі, площа остеогенного компонента регенерату на всіх етапах його формування вірогідно нижче при введенні ПЕГ і їхніх похідних. Найбільшого значення цей показник досягав у групі піддослідних тварин, яким вводився ПЕПО-1500, найменшого – ППО-700. До закінчення експерименту частка остеогенного компонента в структурі регенерату складала: у контрольній групі – 74 %, у групі з впливом ПЕО-400 – 83 %, ПЕПО-1500 – 82 %, ПЕПО-3600 і ПЕПО-6000 – 71 %, ППО-700 – 58 %.

Процеси внутрішньої перебудови компактної речовини фрагментів у всіх експериментальних групах протікали менш інтенсивно, чим у контролі. Вони в основному торкалися кісткової тканини дистального фрагмента і були найбільш виражені в групі з впливом ППО-700.

Площа некротично змінених тканин на 3 добу після перелому в експериментальних групах нижче, ніж у контрольній. Виключення складає група, де репаративний остеогенез протікав в умовах впливу ППО-700. У цій серії дослідів площа некрозу була не тільки більше контрольної на всіх етапах формування регенерату, але і виявляла тенденцію росту протягом 2-х тижнів після перелому. В інших експериментальних групах також, як і в контрольній, відзначалася подібна картина: некротичні процеси наростали протягом першого тижня спостережень, до 14 доби їхнє поширення обмежувалося, до 21 - відбувалося зменшення площі некрозу, що має достовірні відміни від контролю тільки в групах із впливом ПЕО-400 і ПЕПО-1500.

Таким чином, результати морфологічних досліджень свідчать про те, що під впливом ПЕО-400 і ПЕПО-1500 загоєння перелому протікало найшвидче. При застосуванні ПЕО-400 періостальна мозоля мала невеликий обсяг і складалася в основному з кісткової тканини. Хондрогенний компонент визначався тільки по периферії регенерату, був представлений невеликими фокусами й швидко замінявся новоутвореними кістковими структурами. До кінця другого тижня після операції міжфрагментарна зона заповнювалася незрілою волокнистою тканиною, яка є основою для кісткоутворюючих процесів.

Репаративні процеси на фоні впливу ПЕПО-1500 протікали однотипно з попередньою серією. Утворення періостального моста з фіброгенної тканини, що спостерігалося спочатку між кінцями відламків, змінювалося швидкою дифференціацією остеобластичних клітинних елементів й активним формуванням кісткової манжети. Серед волокнистої тканини, що заповнює міжфрагментарний простір, також визначалися клітини, що диференціюються в остеобласти. Таким чином, відновлення кістки в цій серії протікало як первинне загоєння, тобто при відсутності хрящової тканини в складі регенерату і невеликому обсязі періостальної мозолі.

У структурі регенерату, що формується в умовах впливу ПЕПО-3600, значну частку на всіх етапах загоєння перелому займав фіброгенний компонент. Відкладення кісткової речовини й формування молодих кісткових структур здійснювалося на значній відстані від місця перелому, і до закінчення експерименту в цій серії дослідів утворення кісткової спайки між фрагментами кістки не відбувалося.

Особливістю репаративних процесів, що протікають на фоні впливу ПЕПО-6000, був відносно слабкий розвиток фіброгенного компонента з максимумом наростання під кінець першого тижня спостережень. Обсяг новоутворених кісткових структур також був невеликий. В результаті уповільненого розвитку кісткової тканини компенсаторне збільшення періостальної мозолі відбувалося за рахунок розростання хондрогенного тканинного компонента.

Відновлення кістки після перелому під впливом ППО-700 характеризувалося слабко вираженою реактивністю остеогенних тканин періостальної зони, в результаті чого в цій групі регенерат мав найменшу площу. Протягом усього терміну спостережень значну частину його складав фіброгенний компонент. Остеогенний компонент був представлений вузькими полями кісткових трабекул, що формуються на значному видаленні від зони ушкодження. Іншим важливим наслідком впливу ППО-700 на перебіг репаративного процесу з’явився розвиток значних некрозів відразу після травми і їхнє поширення протягом двох тижнів експерименту. Це відбивалося на термінах формування інтермедіарної мозолі, поява якої означала б вступ у завершальний етап зрощення кістки.

При розмаїтості морфологічних картин і термінів формування кісткової мозолі на ранніх етапах загоєння перелому розвиток остеогенного компонента в дослідних групах у порівнянні з контролем затримувався. Проліферируючі остеогенні елементи періостальної зони поступово заповнювали область ушкодження клітинним регенератом, наступна диференціація якого обумовлювала формування відповідної тканинної структури. З огляду на той факт, що проліферація клітин і їх дифференціація є взаємозалежними процесами, які протікають майже паралельно з перевагою на ранніх термінах процесів проліферації, а на більш пізніх – процесів диференціації, стає очевидним, що в умовах проведеного експерименту процес прискорення відновлення кістки на клітинно-тканинному рівні виражався зміною напрямку й швидкості процесів диференціації клітинних популяцій регенерату.

Так, інтенсивне формування кісткової тканини після відміни застосованих нами речовин у групах із впливом ПЕО-400 і ПЕПО-1500 обумовлено диференціацією клітинних елементів фіброгенного компонента в остеобласти з наступною продукцією кісткової речовини. Надлишок сполучної тканини при впливі ПЭПО-3600 і ППО-700, а також поява хондрогенного компонента в складі регенерату, що формується під впливом ПЭПО-6000, обумовлено затримкою утворення і диференціації остеогенних тканин.

Процес утворення волокнистої основи кісткової тканини протікає у два етапи: біосинтез колагенового білка і протеогліканів й агрегація молекул колагена в надмолекулярні структури (Лаврищева Г.И., Оноприенко Г.А., 1996). Синтезовані на першому етапі молекули тропоколагена накопичуються поблизу клітини, утворюючи так звані тактоїди – системи, що зберігають між собою прошарки рідини і тому одержали назву “рідкі кристали”. Утворення надмолекулярних колагенових агрегатів зв'язано з видаленням води з колагенових тактоїдів, що сприяє зближенню молекул колагена й появі міжмолекулярних сил зчеплення. Поява останніх обумовлює утворення надмолекулярних структур – протофібрил, потім мікрофібрил і фібрил. У свою чергу колагенові структури служать позиційним орієнтиром для клітин кісткової тканини, впливаючи на їхній метаболізм і диференціацію (Лебедев Д.А., 1979).

Так як досліджувані полімери мають дегідратуючі властивості, можна припустити, що вони здатні впливати на процеси фібрилоутворення, тим самим прискорюючи процес репаративного остеогенезу. При цьому найбільш оптимальне співвідношення між швидкістю проліферативних процесів, диференціацією остеогенних клітинних елементів в остеобласти і фібрилоутворенням спостерігалося при застосуванні ПЕО-400 і ПЕПО-1500.

У випадку інфікування перелому стафілококом характер і терміни його загоєння в значній мірі залежали від величини ушкодження й швидкості репаративних процесів, що протікають у параосальних тканинах і тканинах кістковомозкового каналу. У порівнянні з асептичними умовами в контрольній групі тварин в умовах інфікування процеси некробіозу й гістолізу прогресували протягом двох тижнів після перелому, обмеження поширення некрозу спостерігалося тільки наприкінці експерименту. Обсяг регенерату значно уступав відповідному в асептичних умовах, а зміна тканинних структур у його складі й темпи структурної перебудови фрагментів були уповільнені.

У всіх експериментальних групах протягом першого тижня після операції альтеративні зміни були виражені в меншій мірі, чим у контролі. Тканини, що знаходяться в стані некробіозу, займали найменшу площу в групі з впливом ПЕПО-1500, найбільшу – у групі з впливом ППО-700. Навколо осередків некрозу вже на ранніх етапах загоєння перелому розвивалося демаркаційне запалення: у оточуючих некротичні маси тканинах виявлялися розширені повнокровні судини і велика кількість лейкоцитів. Регенераторне розростання сполучної тканини приводило до заміщення тканинного детриту, що обумовлювало зменшення площі некрозу в групах із впливом ПЕО-400, ПЕПО-1500, ПЕПО-3600, ПЕПО-6000. Найбільш активно процеси організації протікали в умовах впливу на репаративний остеогенез ПЕО-400. У цьому випадку вже до 14 доби відбувалася локалізація некрозу, а до кінця експерименту його площа значно зменшувалася.

У групах із впливом ПЕПО-6000 і ППО-700 після припинення введення полімерів запальні явища в області травми наростали, в результаті чого площа ушкоджених тканин різко збільшувалася. Подальше протікання деструктивно-некротичних процесів носило протилежний характер. Якщо в першій групі до закінчення експерименту некротичні процеси затихали, а репаративні активізувалися, то в другій спостерігалося прогресивне збільшення полей некрозу, особливо в параосальних тканинах.

При інфікуванні, як і в асептичних умовах, частка фіброгенного компонента в складі регенерату протягом першого тижня після перелому в експериментальних серіях була більше. Так, якщо в контрольній групі на 3-ю добу площа фіброгенного компонента складала 76 %, то в групах із впливом ПЕО-400 – 85 %, ПЕПО-1500 – 87 %, ПЕПО-3600 – 86 %, ПЕПО-6000 – 89 %, ППО-700 – 91 %. До закінчення експерименту кількість фіброгенної тканини в складі регенерату зменшувалася, однак тільки в групах із впливом ПЕО-400, ПЕПО-1500, ПЕПО-3600 її частка була нижче, ніж у контролі. Зменшення площі фіброгенного компонента, що спостерігається в процесі загоєння перелому, була зв’язана з формуванням молодої кісткової тканини. Виключенням була серія з впливом ППО-700, у якій різке зниження цього показника пояснюється прогресуванням некротичних процесів.

На ранніх етапах відновлення кістки частка остеогенного компонента в складі регенерату в експериментальних серіях була нижче контрольної. Так, якщо в контрольній групі на 3-ю добу площа остеогенного компонента складала 24 %, то в групах із впливом ПЕО-400 – 15 %, ПЕПО-1500 – 13 %, ПЕПО-3600 – 14 %, ПЕПО-6000 – 11 %, ППО-700 – 9 %. Однак вже на 14 добу цей показник переважав у групах, де початкові стадії репаративного остеогенезу протікали під впливом ПЕО-400, ПЕПО-1500, ПЕПО-3600. При введенні ПЕПО-6000 відзначалося зниження темпів приросту остеогенного компонента протягом останнього тижня експерименту. У випадку дії на загоєння ускладненого інфекцією перелому ППО-700 ріст молодих кісткових структур спостерігався тільки протягом перших двох тижнів після операції, потім відбувалося зменшення їхньої площі, обумовлене гальмуванням процесу регенерації кісткової тканини й активізацією процесів деструкції.

Процеси розпаду й розсмоктування старих кісткових структур, що розвивалися паралельно кісткоутворенню, протікали як лакунарна остеокластична резорбція й були найбільш виражені в групі з впливом ПЕПО-6000.

Результати морфологічних досліджень свідчать про те, що інфікування впливало на перебіг відновлювальних процесів при переломах кістки. Розмноження в рані патогенної мікрофлори сприяло утворенню некротично змінених тканин, що у свою чергу, будучи субстратом для бактерій, сприяло розвитку гнійної інфекції. Це приводило до дефіциту остеогенноактивних клітинних елементів і, як наслідку, затримці зрощення.

Характер відновлювальних процесів, що розвертаються в цих умовах, визначався властивостями речовини, яка вводилася. Найбільш швидкий перебіг репаративних процесів відзначався в групах із впливом ПЕО-400 і ПЕПО-1500, де вже на ранніх термінах поблизу перелому формувалися поля остеобластичної тканини, у яких спостерігалось активне відкладення остеоїда. Активізація параосальної сполучної тканини приводила до поступового заміщення некротичних мас й відмежування запальних осередків, що сприяло зменшенню запальних явищ. У кістковомозковій порожнині ініціювалося формування ендостальної кісткової мозолі, менш виражене в групі з впливом ПЕО-400.

Розростання сполучної тканини в області ушкодження, а також здатність її остеогеннопотентних клітинних елементів трансформуватися в остеобласти забезпечували в даних групах тривалість остеогенезу. Площа остеогенного компонента рівномірно збільшувалася протягом усього періоду спостережень і на 21 добу перевищувала контрольний показник. До цього терміну утворення кісткової спайки в періостальній зоні регенерату не відбувалося, однак молоді кісткові структури знаходилися на близькій відстані одна від другої, а міжфрагментарний простір заповнювався незрілою сполучною тканиною.

Некротичні й запальні зміни в піддослідній групі з впливом ПЕПО-3600 були більш виражені, їхня організація вимагала більше структурного матеріалу й додаткового часу. Це впливало на репаративні процеси: остеогенні компоненти регенерату формувалися на значній відстані друг від друга, а некротичні маси міжфрагментарного простору до закінчення експерименту були ще не цілком заміщені сполучною тканиною.

У групі з впливом ПЕПО-6000 відновлення цілісності кістки після перелому в умовах інфікування протікало в уповільненій формі. Реактивні прояви з боку кісткової тканини й фіброгенного компонента виявлялися пригніченими, відзначалося прогресування некротичних процесів. В цих умовах заміщення некротичних мас міжфрагментарного простору сполучною тканиною затримувалося, а формування нових кісткових структур протікало менш інтенсивно, чим руйнування старих. Особливістю періостальної мозолі, що формується в цій групі, була наявність хрящової тканини, кількість якої різко зростала до закінчення експерименту.

Репаративний остеогенез, що протікав під впливом ППО-700, характеризувався затримкою розвитку остеогенной тканини, в результаті чого остеогенний компонент у складі регенерату був представлений незначно. Збільшення його площі спостерігалося протягом двох тижнів після ушкодження, при цьому феномен ендостального кісткоутворення був відсутній. Внаслідок некрозів, що поширюються в параосальних тканинах, площа остеогенного компонента до кінця експерименту різко зменшувалася, що можно пояснити, очевидно, аутолітичною резорбцією суміжних з некротичними масами новоутворених кісткових структур.

Отримані результати свідчать про те, що в умовах інфікування перелому швидкість репаративного остеогенезу залежала від швидкості й ступеня відновлення оточуючих кістку тканин, що, в свою чергу, визначалося ефективністю очищення осередку запалення від мікроорганізмів і продуктів розпаду тканин. Така послідовність подій обумовлена необхідністю відновлення мікроциркуляторного русла, що забезпечує можливість оксибіотичного метаболізму, а, отже, і реалізації остеогенних потенцій.

Біологічна дія поліетиленгліколів і їхніх похідних у значній мірі обумовлена їхніми властивостями, які, у свою чергу, визначаються їхньою хімічною будовою: формою і розміром молекул, а також наявністю функціонально активних угруповань. Серед блоксополімерів стимулюючий ефект біологічної дії цих речовин на репаративні процеси зі збільшенням молекулярної маси слабшає. Гнітюча дія на репаративну регенерацію ППО-700 зв’язана з його токсичністю, обумовленою наявністю кінцевих епоксидних груп, що мають високу хімічну активність.

Більш активне протікання процесів регенерації під впливом ПЕО-400 і ПЕПО-1500 обумовлено наявністю в них не тільки осмотичних, але й бактерицидних властивостей (Белов С.Г., 1988; Жуков В.И. з співавт., 1992). Виявляючи бактерицидну дію, ці речовини знижували деякою мірою активність мікрофлори, тим самим зменшуючи утворення нежиттєздатних тканин. Некролітична дія даних полімерів на ушкоджені тканини забезпечувала більш швидке очищення кісткової рани. Тим самим підготовлявся плацдарм для розвитку фіброгенної тканини, з якою в область ушкодження привносились остеогенні клітинні елементи, що забезпечують розгортання кісткоутворюючих процесів.

У випадку впливу ПЕПО-3600 і ПЕПО-6000 оптимальні умови загоєння перелому були порушені внаслідок значних некротичних змін і недостатнього рівня кровопостачання. В даних умовах процес репаративного остеогенезу був уповільнений, і в області ушкодження кістки виникали менш вимогливі до умов кровопостачання процеси фібро- і хондрогенезу. Введення ППО-700, знижуючи остеопластичні можливості скелетогенної тканини і підсилюючи некротичні процеси в зоні ушкодження, приводило до переваги процесів деструкції кісткової тканини над процесами її утворення.

ВИСНОВКИ

У дисертації наведене теоретичне узагальнення і нове вирішення наукової задачі, яка полягала в проведенні порівняльного аналізу морфофункціонального стану трубчастих кісток у процесі репаративної регенерації під впливом поліетиленгліколів і їхніх похідних. Для цього було вивчено особливості й встановлено загальні та часткові закономірності морфогенезу трубчастих кісток у процесі репаративної регенерації під впливом поліетиленгліколів і їхніх похідних в асептичних умовах й умовах інфікування, що дозволило визначити характер біологічної дії даних полімерів і можливість їхнього використання з метою стимуляції репаративного остеогенезу.

На підставі одержаних результатів дослідження були зроблені наступні висновки:

1.

2.

3.

4.

5.

СПИСОК ПРАЦЬ, ОПУБЛІКОВАНИХ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

1.

2.

3.

4.

5.

АНОТАЦІЯ

Діголь Л.Г. Морфофункціональний стан трубчастих кісток у процесі репаративної регенерації під впливом поліетиленгліколів та їхніх похідних (анатомо-експериментальне дослідження). – Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата медичних наук за спеціальністю 14.03.01 – нормальна анатомія. Харківський державний медичний університет. Харків, 2001.

Дисертація присвячена проблемі цілеспрямованого впливу на процес відновлення анатомічної цілісності кістки після ушкодження. На експериментальній моделі поперечного перелому стегнової кістки щурів вивчений морфофункціональний стан трубчастих кісток під впливом поліетиленгліколів і їхніх похідних в асептичних умовах й умовах інфікування. Показано, що введення даних полімерів в область перелому змінює співвідношення тканинних компонентів регенерату. Встановлено залежність впливу поліетиленгліколів і їхніх похідних на репаративну регенерацію кістки від хімічної структури й властивостей цих речовин. На основі порівняльного аналізу біологічної дії даних полімерів визначена можливість їхнього використання з метою оптимізації репаративного остеогенезу. Показано доцільність застосування поліетиленоксиду м.м. 400 і поліетиленпропіленоксиду м.м. 1500 для лікування ран, що супроводжуються переломом кістки. Результати роботи є науковим обґрунтуванням розробки лікарських засобів на основі поліетиленгліколів і їхніх похідних.

Ключові слова: трубчасті кістки, репаративна регенерація, поліетиленгліколі.

АННОТАЦИЯ

Диголь Л.Г. Морфофункциональное состояние трубчатых костей в процессе репаративной регенерации под влиянием полиэтиленгликолей и их производных (анатомо-экспериментальное исследование). – Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата медицинских наук по специальности 14.03.01 – нормальная анатомия. Харьковский государственный медицинский университет. Харков, 2001.

Диссертация посвящена проблеме целенаправленного влияния на процесс восстановления анатомической целостности кости после повреждения. На модели поперечного перелома бедренной кости крысы с помощью морфологических и морфометрических методов