НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ наук України

Інститут молекулярної біології і генетики

Дубровський Олексій Леонідович

УДК 577.152.611

Клонування, бактеріальна експресія та цитокіноподібна активність

С-кінцевого некаталітичного модуля тирозил-тРНК синтетази вищих еукаріотів

03.00.03 – молекулярна біологія

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

Київ -2001

Дисертацією є рукопис.

Роботу виконано у відділі структури та функції нуклеїнових кислот Інституту молекулярної біології та генетики НАН України та в лабораторії молекулярної онкології Ноттінгемського університету, Велика Британія.

Науковий керівник

доктор біологічних наук, професор,

Корнелюк Олександр Іванович,

Інститут молекулярної біології та генетики НАН України,

провідний науковий співробітник відділу структури та функції нуклеїнових кислот

Офіційні опоненти:

доктор біологічних наук, старший науковий співробітник,

Козлов Едуард Андрійович,

Інститут молекулярної біології та генетики НАН України,

провідний науковий співробітник відділу механізмів трансляції генетичної інформації,

доктор біологічних наук, професор

Галкін Анатолій Павлович

Інститут біоорганічної хімії та нафтохімії НАН України , завідувач відділу біоінженерії.

Провідна установа:

Київський національний університет імені Тараса Шевченка, кафедра біохімії.

Захист відбудеться 24.04.2001 року о годині

на засіданні спеціалізованої Вченої ради Д 26. 237. 01 Інституту молекулярної біології та генетики НАН України за адресою: 03143, м. Київ-143, вул. Заболотного, 150.

З дисертацією можна ознайомитися у бібліотеці Інституту молекулярної біології і генетики НАН України, : 03143, м. Київ-143, вул. Заболотного, 150.

Автореферат розіслано 20.03.2001 року.

Вчений секретар спеціалізованої Вченої ради

кандидат біологічних наук Підпала О. В.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Аміноацил-тРНК синтетази є ключовими ферментами дорибосомного етапу біосинтезу білка і каталізують реакцію приєднання амінокислоти до відповідної тРНК. Крім своєї основної, канонічної функції аміноацил-тРНК синтетази можуть також виконувати функції, які безпосередньо не пов'язані з участю у біосинтезі білка. Так, продемонстровано участь тирозил-тРНК синтетази з Neurospora crassa у сплайсингу інтронів першої групи (Akins et al., 1987). Вивчено регуляторну роль аміноацил-тРНК синтетаз у біогенезі амінокислот як у прокаріотів (Hinnebush et al., 1988), так і у еукаріотів (Andrulis et al., 1979). За допомогою синтезу вторинних внутрішньоклітинних месенджерів, таких як олігоаденілати, аміноацил-тРНК синтетази беруть участь у регуляції стресових станів клітини (Rapaport et al., 1976).

Клонування та секвенування гена тирозил-тРНК синтетази ссавців виявило несподівано високу гомологію амінокислотної послідовності С-кінцевого некаталітичного модуля цього ферменту до нового цитокіну ЕМАРІІ – 52% ідентичності (Леванець та ін., 1997; Kleeman et al., 1997). Раніше цитокін EMAPII (від англ. endothelial monocyte activating polypeptide II) було відкрито при вивченні факторів, які забезпечують підвищену чутливість мікроциркуляторного русла деяких пухлин до фактора некрозу пухлин (TNF) (Kao et al., 1992). Подальші дослідження EMAPII показали, що він має антипухлинні та протизапальні активності, бере участь в ангіогенезі, ембріогенезі та деяких патологічних процесах, індукує апоптоз клітин ендотелію. Пізніше було встановлено, що білком-попередником цього цитокіну є p43 -один з білків мультиферментного комплексу аміноацил-тРНК синтетаз із вищих еукаріотів (Quevillon et al., 1997). Все це дозволило зробити припущення про можливу цитокіноподібну активність С-кінцевого некаталітичного модуля тирозил-тРНК синтетази ссавців.

Вивчення потенційної цитокіноподібної активності С-кінцевого некаталітичного модуля тирозил-тРНК синтетази має великий теоретичний інтерес, оскільки дозволяє глибше зрозуміти механізми сенсибілізації пухлин до TNF і зробити припущення про наявність системи, яка дублює клітинні ефекти EMAPII, що є характерним для функціонування мережі цитокінів. Крім того, безпосередню участь білків, які здійснюють дорибосомний етап біосинтезу білка, в регуляції взаємодії пухлина – хазяїн, ембріогенезі і апоптозі не було раніше продемонстровано, хоча вона є цілком логічною.

Як відомо, дослідження процесів, які лежать в основі взаємодії злоякісних новоутворень з організмом-хазяїном, мають теоретичні підстави для розробки нових антипухлинних препаратів і підходів до лікування онкологічних захворювань. Це надає важливе практичне значення пошуку цитокінової активності у некаталітичного модуля тирозил-тРНК синтетази ссавців.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертація відповідає основному плану науково-дослідних робіт відділу структури і функції нуклеїнових кислот Інституту молекулярної біології і генетики НАН України за темою "Структурно-функціональне дослідження еукаріотичної тирозил-тРНК синтетази методами білкової інженерії". Роботу виконували також у рамках міжнародного конкурсного проекту EMBO, ASTF 9231, “Cytokine-like domain of tyrosyl-tRNA synthetase: identification of protein regions responsible for its cytokine-like activities.”

Мета і завдання дослідження. Метою даної роботи було клонування та експресія С-кінцевого некаталітичного модуля тирозил-тРНК синтетази ссавців та вивчення його можливих цитокіноподібних активностей.

Для досягнення цієї мети необхідно було вирішити такі завдання:

1) Субклонувати фрагмент кДНК, що кодує С-кінцевий некаталітичний домен тирозил-тРНК синтетази ссавців, в вектор для бактеріальної експресії родини рЕТ-векторів.

2) Експресувати, виділити та очистити до гомогенного стану рекомбінантний С-кінцевий модуль тирозил-тРНК синтетази .

3) Експресувати в бактеріальній системі експресії та очистити цитокін ЕМАРІІ .

4) Вивчити антигенні властивості отриманих рекомбінантних білків.

5) Вивчити вплив С-домена тирозил-тРНК синтетази на ендотеліальні клітини і моноцити людини та порівняти отримані ефекти з впливом цитокіну ЕМАРІІ.

Об'єктом даної роботи є вивчення потенційної можливості залучення С-кінцевого некаталітичного модуля тирозил-тРНК синтетази ссавців у процеси сенсибілізації мікроциркуляторного кровоносного русла злоякісних пухлин та запальні процеси. Висока гомологія С-кінцевого некаталітичного модуля тирозил-тРНК синтетази ссавців та цитокіну ЕМАРІІ дозволила зробити припущення про наявність у першого цитокінової активності, яке потребувало експериментальної перевірки. Оскільки отримання ізольованого С-кінцевого модуля тирозил-тРНК синтетази із природних джерел є практично неможливим, це зумовило необхідність клонування та експресії кДНК, що кодує С-модуль, з метою подальшого вивчення його біологічних активностей.

Основні методи, що використані в роботі є клонування фрагментів кДНК у вектори для бактеріальної експресії, бактеріальна експресія та виділення рекомбінантних білків, металохелатуюча афінна хроматографія білків, імунохімічні методи дослідження, методи клітинних культур. Предметом даного дослідження є вивчення впливу ізольованого некаталітичного С-кінцевого модуля тирозил-тРНК синтетази ссавців на ефекторні клітини імунної системи і клітини ендотелію та співставлення отриманих результатів із активностями цитокіну ЕМАРІІ.

Наукова новизна одержаних результатів. У даній роботі вперше виявлена цитокіноподібна активність С-кінцевого некаталітичного модуля тирозил-тРНК синтетази ссавців (одночасно з групою під керівництвом професора П. Шиммеля (Wakasugi & Schimmel, 1999).

Отримано бактеріальну експресію рекомбінантного некаталітичного модуля бичачої тирозил-тРНК синтетази із використанням рЕТ-системи експресії. Розроблено схему очищення і виділення в денатуруючих умовах рекомбінантного некаталітичного модуля з наступною ренатурацією. Використовуючи флуоресцентні методи дослідження, показано відновлення третинної структури рекомбінантного білка після ренатурації. Розроблено схему експресії і виділення рекомбінантного С-кінцевого домена в нативних умовах з наступним розщепленням ентерокіназою та очисткою ізольованого С-модуля.

Досліджено вплив ізольованого некаталітичного С-кінцевого модуля тирозил-тРНК синтетази на фізіологію ендотеліальних клітин і моноцитів. Показано збільшення прокоагуляційної активності ендотеліальних клітин в результаті підвищення експресії тканинного фактора. Виявлено ефект хемотаксису рекомбінантного С-кінцевого модуля та ЕМАРІІ на клітини моноцитарного походження.

Досліджено імунологічні властивості білка і показано відсутність імунохімічного перехресту з цитокіном ЕМАР-ІІ у вестерн-блот аналізі.

Виявлено ефект синергізму дії С-кінцевого некаталітичного модуля тирозил-тРНК синтетази в індукції тканинного фактора ендотеліальними клітинами з іншим цитокіном - TNFa.

Практичне значення одержаних результатів. Відкриття цитокіноподібної активності С-кінцевого некаталітичного модуля бичачої тирозил-тРНК синтетази дозволяє зробити припущення про принципово нову неканонічну функцію аміноацил-тРНК синтетаз. Вивчення цієї активності та залучення синтетаз в онкогенез і запальні процеси може потенційно бути основою для розробок нового покоління антипухлинних препаратів і підходів до лікування онкологічних захворювань і гострих запальних процесів.

Особистий внесок здобувача. Роботу виконано під керівництвом

д. б. н., професора О. І. Корнелюка у співробітництві з докторами Маартеном Тасом, Джоан Браун та Кліффордом Мюрреєм (Ноттінгемський університет, Велика Британія ), з якими автор має спільні публікації. Особистий внесок автора полягає у плануванні та виконанні експериментів, аналізі отриманих результатів. Експериментальні дані, які наведені в дисертації, отримані безпосередньо автором.

Апробація результатів дисертації. Матеріали роботи доповідалися на робочій нараді Європейської Молекулярно Біологічної Організації “EMBO Workshop on Structure and Function of Aminoacyl-tRNA Synthetases”, Mittelwihr, France, (Міттельвір, Франція, 1998) і на наукових семінарах відділу структури і функції нуклеїнових кислот ІМБіГ НАН України.

Публікації. За матеріалами дисертації опубліковано 3 статті і тези двох доповідей.

Структура та обсяг роботи. Дисертація складається зі вступу, огляду літератури, матеріалів та методів дослідження, результатів та їх обговорення, висновків та списку літератури, який охоплює 118 посилань. Роботу викладено на 127 листах машинописного тексту і проілюстровано 22 рисунками та 6 таблицями.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ ДИСЕРТАЦІЇ

матеріали та МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕННЯ

Для одержання ізольованого С-кінцевого некаталітичного модуля тирозил-тРНК синтетази використовували бактеріальну експресію у векторах родини рЕТ. Для цього фрагменти кДНК, що кодують С-кінцевий некаталітичний модуль тирозил-тРНК синтетази ссавців і зрілу форму цитокіну EMAPII клонували у вектори для бактеріальної експресії рЕТ15b і рЕТ32а. Генноінженерни маніпуляції проводилися за стандартними протоколами.

кДНК тирозил-тРНК ссавців було люб'язно надано м. н. с. О. Леванець (Інститут молекулярної біології і генетики НАН України), кднк, що кодує EMAPII було люб'язно надано доктором Маартеном Тасом (лабораторія молекулярної онкології, Ноттінгемський університет, Велика Британія).

Експресію проводили в штамі клітин E.coli BL21(DE3). Для конструкцій у векторі рЕТ15b використовували стандартний протокол. Культури вирощувались на поживному середовищі LB, що містило 100 мкг/мл ампіциліну. Нічна культура розводилась 1/500 і вирощувалась до OD600= 0,8 – 1,0 при температурі +37 ОС. Експресію індукували додаванням IPTG до кінцевої концентрації 1 мМ і продовжували вирощувати культуру ще протягом 5 год.

Експресію конструкцій у векторі рЕТ32а проводили на поживному середовище ТВ, що містило 200-500 мкг/мл карбеніцеліну. Для зниження базальної експресії у середовище до індукції додавали 1% глюкози. Протягом культивування проводили дві повні зміни поживного середовища для зниження рівня позаклітинної b-лактамази. Експресію індукували 0,1 мМ ITPG при OD600= 0,4 і культуру продовжували культивувати протягом 3 год при +30 ОС.

Білки, які експресувалися конструкцією на основі вектора рЕТ15b, виділяли у денатуруючих умовах із наступною ренатурацією. Отриманий осад бактерій ресуспендували у буфері, який містив 0,1 M Na2HPO4; 20 мМ трис-HCl, pH 8,0 та 4 М сечовини. Отриманий лізат центрифугували при 10000 g, +4ОС, протягом 15 хв. Надосадову рідину наносили на хроматографічну колонку з Ni-NTA агарозою (“Qiagen”) та промивали колонку 10 об'ємами буфера для нанесення. Для ренатурації білків, які були зв'язані з колонкою, носій промивали 40 об'ємами буфера для нанесення з лінійним градієнтним зниженням концентрації сечовини від 4М до 0 у присутності 0,1% b-меркаптоетанолу. Цільовий рекомбінантний білок елюювали буфером, що містив 0,5 M NaCl, 20 мМ трис-HCl, pH 7,8 та 0,3 M імідазолу. Відтворення третинної структури після ренатурації контролювали за зміною спектра триптофанової флюоресценції білка. Спектри флюоресценції реєстрували на спектрофлюориметрі Hitachi Model 850 (Японія).

Білки, які експресувалися конструкцією на основі вектора рЕТ32а, виділяли у нативних умовах. Осад бактеріальних клітин ресуспендували у буфері, що містив 50 мМ NaH2PO4, pH 8,0; 300 мМ NaCl; 20 мМ імідазолу, з додаванням PMSF до 1 мМ і b-меркаптоетанолу до 15 мМ. Клітини руйнували ультразвуком і отриманий лізат центрифугували при 10000 g на протязі 15 хв при +4ОС. Надосадову рідину наносили на хроматографічну колонку з Ni-NTA агарозою. Колонку промивали 10 об'ємами буфера для нанесення, а потім послідовно 5 об'ємами буферів для промивки такого складу: WI – 50 мМ NaH2PO4, pH 6,5; 300 мМ NaCl; 50 мМ імідазолу; WII – 50 мМ NaH2PO4, pH 8,0, 1 моль NaCl; 50 мМ імідазолу; WIII– 50 мМ NaH2PO4, pH 8,0; 300 мМ NaCl; 0,5% Тритон Х-100; 20 мМ імідазолу. Рекомбінантний білок елюювали ступінчастим градієнтом імідазолу від 30 до 130 мМ.

Розщеплення рекомбінантних білків ентерокіназою проводили при

+4О С, протягом 16-18 год у буфері, що містив 20 мМ трис-HCl, рН 7,4, 2 мМ CaCl2, 50 мМ NaCl. Продукти протеолізу розділяли хроматографією на Ni-NTA агарозі. Чистоту препарату білка контролювали методом денатуруючого SDS-гель-електрофорезу, з подальшим забарвленням кумасі синім.

Біологічні активності отриманих рекомбінантних білків вивчали в реакції індукції тромбопластину на поверхню ендотеліоцитів і в реакції індукції хемотаксису в моноцитів.

Реакцію індукції тромбопластину на поверхні ендотеліоцитів проводили на клітинах ендотелію пупкового канатика людини. Ендотеліоцити висівали на 24-лунковий планшет. Клітини культивували при +37ОС, 5% СО2 до утворення суцільного моношару. Культуральне середовище видаляли і вносили ростове середовище, що містить відповідні розведення досліджуваних білків і клітини культивували за тих самих умов ще 4 години. Після цього середовище видаляли, двічі промивали стерильним PBS і вносили розчин хлориду кальцію (кінцева концентрація 10 мМ), буфер Оуена і цитровану плазму крові людини. Проби інкубували на водяній бані при +37ОС до утворення згустку, та визначали час утворення згустку. Концентрацію тромбопластину на поверхні ендотеліоцитів визначали з використанням програми Excel, виходячи з нормальної калібрувальної кривої.

Для вивчення хемотаксису у відповідь на рекомбінантні білки, свіжовиділені моноцити суспендували в RPMI-1640 з додаванням фетальної сироватки великої рогатої худоби до 10% і кінцевої концентраціі клітин 2ґ106 клітин/мл. Розчини досліджуваних білків (31 мкл) у зазначених концентраціях наносили на дно лунки камери для дослідження хемотаксису ChemTx (NeuroProbe, Inc). Фільтри розміщували поверх розчинів таким чином, щоб забезпечити сполучення струмів рідини між верхньою і нижньою камерами. Аліквоту суспензії моноцитів (27 мкл) наносили на фільтр поверх кожної лунки і проводили інкубацію протягом 1,5 години при +37ОС /5%СО2 . Після інкубації, клітини зв'язані з мембраною фіксували додаванням 15 мкл охолодженого на льоду 20% формальдегіду у фосфатно-буферному розчині та аналізували під мікроскопом за допомогою гемоцитометра.

Усі наведені дані стосовно біологічних активностей рекомбінантних білків є результатом узагальнення трьох експериментів.

Поліклональні антитіла проти EMAPII були люб'язно надані доктором Мартеном Тасом (лабораторія молекулярної онкології, Ноттінгемский університет, Велика Британія).

отримання експресуючих конструкцій

Клонування та експресія фрагменту кДНК, що кодує С-кінцевий модуль тирозил-тРНК синтетази в вектор pET15b. Фрагмент плазміди pKCTD розміром 767 пн., що містив кодуючу послідовність тирозил-тРНК синтетази (амінокислотні залишки D322-S528) та фрагмент 3'-некодуючої ділянки , був клонований по сайту BamHI у вектор для бактеріальної експресії pET15b (конструкція pEYCD2). Присутність специфічної вставки та правильність її орієнтації була підтверджена рестрикційним картуванням по сайту EcoRV та частковим секвенуванням нуклеотидної послідовності вставки.

Для проведення експресії отриманої конструкції плазміда pEYCD2 була трансформована в клітини BL21(DE3). Поява нової білкової смуги після додавання IPTG , розмір якої за даними гель-електрофорезу по Леммлі складав близько 27 кДа, свідчила про експресію специфічного білкового продукта.

Клонування та експресія фрагменту кДНК, що кодує С-кінцевий модуль тирозил-тРНК синтетази, в вектор pET32а. EcoRI фрагмент розміром 1186 пар нуклеотидів з плазміди pKCTD було клоновано у вектор рЕТ32а. (конструкція pEYCD3). Поява нової білкової смуги в сумарному білковому спектрі клітин BL21(DE3), що містили конструкцію, після додавання IPTG, розмір якої за даними гель-електрофорезу по Леммлі складав 36 кДа, свідчила про експресію специфічного білкового продукту.

Клонування та експресія фрагменту кДНК, що кодує цитокін ЕМАРІІ, в вектор pET32а. Для клонування послідовності, що кодує зрілу форму цитокіну ЕМАРІІ був застосований метод ПЛР. Як матрицю було використано плазміду pGEX-4t-EMAP2. В цій конструкції ДНК, що кодує послідовність proEMAP-II, була клонована по EcoRI сайту. Для ампліфикації була обрана пара праймерів Е1 и 3'-pGEX. Праймер Е1 специфічно гібридизується з послідовністю кДНК EMAPII. Праймер 3'-pGEX специфічно гібридизується з послідовністю плазміди pGEX-4t-ЕМАР2 у положеннях 1019-1041. Праймер Е1 містить у своїй послідовності сайт рестрикції NcoI. Продукт ПЛР розміром приблизно 550 пар нуклеотидів було клоновано по сайтах рестрикції NcoI та SalI у вектор рЕТ32а. Отримані клони аналізували рестрикційним картуванням по сайту StyI. Потім проводили секвенування нуклеотидної послідовності вставки. Аналіз продуктів експресії показав наявність специфічної білка з молекулярною масою приблизно 35 кДа.

Плазмідна нестабільність конструкцій в pET32a. Під час експресії конструкцій рEYCD3 та pEMAP2 спостерігався високий рівень плазмідної нестабільності, що значно зменшувало кількісний вихід білка. Для вирішення цієї проблеми було застосовано протокол експресії для токсичних білків. Плазмідна нестабільність, можливо, була викликана РНК-зв'язуючою активністю білкових продуктів. Високий рівень експресії міг призводити до виснаження популяції тРНК, а можливо, і мРНК, та, як наслідок, до блокування білкового синтезу.

Виділення рекомбінантних білків

Виділення рекомбінантного С-кінцевого модуля тирозил-тРНК синтетази, що експресувався у pET15b. При експресії pEYCD2 в BL21(DE3) приблизно 40% необхідного білкового продукту виявляли в розчинній фракції. Однак його зв'язування з металохелатним носієм не спостерігалось, що вказувало на можливе екранування епітопу, що забезпечує зв'язування з носієм (гексагістидинова послідовність) у нативних умовах. Тому хроматографію проводили в денатуруючих умовах (у присутності 4 М сечовини) з наступною ренатурацією цільового білка у зв'язаному з носієм стані. Отриманий у такий спосіб препарат білка мав гомогенність близько 95% згідно даним SDS-гель-електрофорезу. Даний рекомбінантний білок позначали як YCD2 (рис.1).

Для характеристики відтворення нативної третинної структури білка після його ренатурації були виміряні спектри триптофанової флюоресценції. Встановлено, що положення максимума флюоресценції білка після ренатурації становить близько 327 нм, що відповідає повністю екранованому стану залишка триптофану W505 в білковій глобулі, що є характерним для нативної структури білка.

Виділення рекомбінантного некаталітичного модуля тирозил-тРНК синтетази, що експресувався у pET32а. У даному векторі рекомбінантний білок експресувався у вигляді гібридного білка, що містить з N-кінця послідовність тіоредоксину, яку можна видалити при розщепленні рекомбінантного продукту ентерокіназою . Даний рекомбінантний білок позначали як YCD3 (рис.1). При експресії у вигляді злитого з тіоредоксином гібридного білка розчинність продукту складала майже 100%.

Рис. 1. Будова рекомбінантних білків YCD2 та YCD3.

Отриманий у такий спосіб гібридний білок зв'язувався з металохелатним носієм у нативних умовах. Після цього гібридний білок розщеплювали ентерокіназою, і отриману суміш поліпептидів розділяли з використанням металохелатного носія Ni-NTA агарози. Гомогенність препарату білка складала близько 93% за даними SDS-гель-електрофорезу (рис. 2). Після відщеплення константної частини рекомбінантного поліпептиду ізольований С-домен позначали як YCD3е.

Вивчення цитокінової активності С-кінцевого модуля ТИРОЗИл-тРНК синтетази

Вивчення впливу рекомбінантних білків на прокоагуляційну активність ендотеліоцитів. Експерименти із вивчення впливу білка YCD2 на концентрацію тканинного фактора (тромбопластину) на поверхні ендотеліоцітів проводили, використовуючи зростаючі концентрації досліджуваного білка: 1, 10 і 100 пМ. Як негативний контроль використовували ростове середовище. Ефект зіставляли з ефектом рівних концентрацій рекомбінантного EMAPII (рис. 3). Як видно з рис. 3, при концентрації білка YCD2 100 пМ концентрація тромбопластину порівняно з контролем зростала більш ніж у 3,8 рази. Додавання цитокіну EMAPII при тій же концентрації приводило до збільшення концентрації тромбопластину та зростання прокоагуляційної активності клітин ендотелію приблизно в 3 рази.

Для вивчення ЕМАР-ІІ цитокіноподібної активності білка YCD3е і зіставлення її з активністю білка YCD2 було досліджено вплив YCD3е на концентрацію тромбопластину на поверхні ендотеліоцитів вени пупкового канатика людини. Тест проводили в трьох паралелях, використовуючи

зростаючі концентрації досліджуваного білка 1, 10, 100 пм і 1 нм. Як контроль використовували ростове середовище. В тесті використовували сироватку крові, яка є сумішшю сироваток крові шести здорових донорів. Максимальний ефект YCD3е виявляє при концентрації 1 нМ, при цьому концентрація тромбопластину на поверхні ендотеліоцитів збільшується в 4,7 раза порівняно з контролем.

Вивчення впливу рекомбінантних білків на хемотаксис моноцитів. Для вивчення впливу ізольованого некаталітичного домену TyrRS було досліджено ефект білка YCD2 на хемотаксис моноцитів. Аналізували ефект зростаючих концентрацій в діапазоні від 1 пм до 1 нм. Як негативний контроль використовували ростове середовище. Ефект зіставляли з ефектами ЕМАР-ІІ, proEMAP-ІІ, протеолітично модифікованою формою бичачої TyrRS (каталітичний модуль, 40 кДа) і трипептидом fMLP (рис. 4)

Рис. 4. Вплив рекомбінантних білків YCD2, ЕМАРІІ та контрольних речовин на хемотаксис моноцитів.

Вивчення синергічної дії С-домену ТИРОЗИл-тРНК СИНТЕТАЗи та фактору некрозу пухлин , TNFa.

Один із ефектів EMAPII полягає у потенціації дії TNFa на транслокацію тромбопластину на поверхню ендотеліальних клітин. Для перевірки наявності подібного ефекту у ізольованого некаталітичного домену TyrRS було досліджено ефект YCD2 на концентрацію тканинного фактора, тромбопластину на поверхні ендотеліоцитів у присутності 5 пМ TNFa. Досліджувані білки тестували при концентраціях 1, 10 і 100 пМ. Як контроль використовували ростове середовище, що містило 5 пм TNFa. Максимальний ефект С-домен тирозил-тРНК синтетази (YCD2) виявляв при концентрації 10 пМ (рис. 5), при цьому концентрація тромбопластину збільшувалася приблизно у 8 разів порівняно з контролем. В аналогічних умовах максимально ефективна концентрація EMAPII (1 пМ) спричиняла збільшення концентрації тромбопластину приблизно в 5 разів.

Рис. 5. Синергічна дія TNFa та некаталітичного модуля тирозил-тРНК синтетази (а) і ЕМАРІІ (б) на концентрацію тканинного фактора в клітинах ендотелію людини.

Вивчення імунохімічного перехресту між рекомбінантними С-кінцевим модулем ТИРОЗИл-тРНК СИНТЕТАЗи та ЕМАРІІ

З метою подальшої характеристики білка YCD3e було проведено вестерн-блот аналіз із використанням поліклональних антитіл проти ЕМАРІІ. Результати вестерн-блотингу подано на рис.6. Як видно, поліклональні антитіла проти ЕМАРII взаємодіють з ЕМАРII, але не взаємодіють з С-доменом тирозил-тРНК YCD3е, що вказує на відсутність перехресно реагуючих антигенних детермінант. Як відомо, антигенні детермінанти є ділянками білкової молекули, які експоновані на поверхні білкової глобули. Взаємодія цитокіну зі своїм рецептором може також здійснюватись через ділянки, які є експонованими на поверхні білка. Відсутність перехресно реагуючих антигенних детермінант може вказувати на те, що поверхнево-експоновані ділянки білкових молекул для ЕМАРІІ та білка YCD3е можуть бути досить відмінними. Отриманий результат є досить несподіваним, оскільки наявність ЕМАРІІ-подібної активності дозволяла зробити припущення про зв'язування YCD3e з рецептором до ЕМАРІІ. Але таке зв'язування потребує спільного епітопу на поверхні обох молекул. Таким чином, можливі два пояснення відсутності перехресної імунохімічної реакції: спільний епітоп є низько антигенним, або ефекти ЕМАРІІ і YCD3e здійснюються через різні рецептори.

На підставі отриманих експериментальних даних та даних літератури можна запропонувати таку схему сенсибілізації пухлин до дії TNF за участю ЕМАРІІ та некаталітичного модуля тирозил-тРНК синтетази. Невелика субпопуляція клітин пухлини зазнає апоптозу. Активована каспаза 7 розщеплює р43 з утворенням функціонально активного ЕМАРІІ, який секретується в міжклітинний простір. Разом з цим інша протеаза (можливо, тіолова) розщеплює тирозил-тРНК синтетазу з утворенням ізольованого С-кінцевого некаталітичного модуля, який теж секретується за межи клітин. Можливий інший варіант, коли при апоптозі секретується повнорозмірна форма тирозил-тРНК синтетази, яка далі розщеплюється протеазами у міжклітинному просторі. ЕМАРІІ та некаталітичний модуль зв'язуються з рецептором на поверхні ендотеліальних клітин і спричиняють підвищення експресії р55 – рецептора до TNFa, та індукують апоптоз. Це призводить до тромбування судин, що живлять пухлину, та як наслідок до регресу пухлини. Крім того, ЕМАРІІ та некаталітичний модуль спричиняють хемотаксис фагоцитів, які сприяють фізіологічному видаленню залишків клітин, що зазнали апоптозу чи некрозу . Розщеплення білка р43 – попередника ЕМАРІІ та тирозил-тРНК синтетази на пізніх етапах апоптоза призводить до блокування біосинтезу білка з одного боку та індукції апоптоза у суміжних клітинах, і блокування живлення пухлини з іншого.

ВИСНОВКИ

Аміноацил-тРНК синтетази є багатофункціональними ферментами, які беруть участь у регуляції власної експресії, сплайсингу РНК, регуляції метаболізму та ін. С-кінцевий некаталітичний модуль тирозил-тРНК синтетаз вищих еукаріотів має високу гомологію з цитокіном ЕМАРІІ, який сенсибілізує злоякісні пухлини до дії TNFa, та має хемотактичну дію, тому важливо вивчити можливі цитокіноподібні активності ізольованого С-кінцевого модуля тирозил-тРНК синтетази. Оскільки отримання некаталітичного модуля тирозил-тРНК синтетази в нативному стані з природних джерел є практично неможливим, тому:

1. Клоновано ДНК, що кодує С-кінцевий некаталітичний модуль тирозил-тРНК синтетази ссавців у вектори для бактеріальної експресії рЕТ15b і рЕТ32а та отримано експресію відповідних рекомбінантних білків.

2. Розроблено схеми виділення та очищення рекомбінантного некаталітичного С-кінцевого модуля до гомогенного стану як в денатуруючих умовах з наступною ренатурацією для конструкції в рЕТ15b , так і в нативних умовах для конструкції в рЕТ32а .

3. Експресовано у векторі рЕТ32а та очищено до гомогенного стану цитокін ЕМАРІІ.

4. Показано, що отримані рекомбінантні білки мають цитокінові активності: а).спричиняють позитивний хемотаксис моноцитів, б). зростання концентрації тканинного фактора, тромбопластину, та збільшення прокоагуляційної активності клітин ендотелію людини.

5. Продемонстровано синергізм ефекту зростання концентрації тромбопластину та збільшення прокоагуляційної активності ендотеліальних клітин з дією TNFa, що дозволяє зробити припущення про участь некаталітичного домену тирозил-тРНК синтетази у роботі мережі цитокінів.

6. Запропоновано гіпотетичну модель сенсибілізації пухлин до дії TNFa під дією ізольованого С-кінцевого некаталітичного модуля тирозил-тРНК синтетази як дублюючої системи функцій цитокіну ЕМАРІІ.

Перелік наукових праць, ОПУБЛІКОВАНИХ за ТЕМою ДИСЕРТАЦІЇ

1. Дубровский А. Л., Савинская Л. А., Корнелюк А. И.. Клонирование и бактериальная экспрессия цитокинподобного некаталитического домена бычьей тирозил-тРНК синтетазы // Биополимеры и клетка.-1998.-Т.14, № 5.-С.449-452.

2. Kornelyuk A.I.,Tas M., Dubrovsky A. L., Murray J.C.Cytokine activity of the non-catalytic EMAP-2-like domain of mammalian tyrosyl-tRNA synthetase // Биополимеры и клетка.-1999.-Т.15, № 2.-С.168-172.

3. Дубровский А. Л., Браун Дж.,. Корнелюк А. И, Мюррей К., Мацука Г. Х.. Бактериальная экспрессия полноразмерных и усеченных форм цитокина ЕМАР-2 и цитокинподобного домена тирозил-тРНК синтетазы млекопитающих // Биополимеры и клетка. –2000. –Т .16, № 3. – С.229-235.

4. Kornelyuk A. I., Tas M., Dubrovsky A., Murray J. C. Cytokine-like activity of the non-catalytic EMAP 2-like domain of mammalian tyrosyl-tRNA synthetase // EMBO Workshop on structure and function of aminoacyl-tRNA synthetases.- Mittelwihr (France).- 1998.- P.106.

5. Dubrovsky A. L., Brown Jo., Kornelyuk A. I., Murray J. C. Cytokine-like activity of non-catalytic domain of mammalian tyrosyl-tRNA synthetase // Conference on genetics and molecular biology.- Lviv (Ukraine).- 2000.- P.133

Анотації

Дубровський О. Л. Клонування, бактеріальна експресія та цитокіноподібна активність С-кінцевого некаталітичного модуля тирозил-тРНК синтетази вищих еукаріотів. – Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 03.00.03 – молекулярна біологія. –Інститут молекулярної біології і генетики НАН України, Київ, 2001.

Показано цитокіноподібну активність С-кінцевого некаталітичного модуля тирозил-тРНК синтетази з печінки бика, що виявляє високу гомологію з цитокіном EMAPII. Досліджували біологічну активність рекомбінантного ізольованого С-кінцевого некаталітичного модуля тирозил-трнк синтетази. Показано прокоагуляційний ефект некаталітичного модуля на клітини ендотелію пупкового канатика людини, що полягає в збільшенні концентрації тромбопластину на клітинній поверхні. Даний ефект некаталітичного модуля синергічний з подібним ефектом TNFa. Виявлено також хемокінову активність некаталітичного модуля. Даний ефект полягає в індукуванні міграції моноцитів. Показано відсутність імунологічного перехресту з рекомбінантним EMAPII у Вестерн-блот аналізі.

Ключові слова: тирозил-тРНК синтетаза, бактеріальна експресія, цитокінова активність, синергізм цитокінів.

Дубровский А. Л. Клонирование, бактериальная экспрессия и цитокиновая активность некаталитического модуля тирозил-тРНК синтетазы высших эукариот.– Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.03 – молекулярная биология. –Институт молекулярной биологии и генетики НАН Украины, Киев, 2001.

В диссертационной работе проведено исследование EMAPII-подобной активности С-концевого некаталитического модуля тирозил-тРНК синтетазы из печени быка.

Фрагменты кДНК, кодирующие С-концевой некаталитический модуль тирозил-тРНК синтетазы были клонированы в вектора для бактериальной экспрессии рЕТ15в и рЕТ32а. Бактериальная экспрессия производилась в E. coli BL21(DE3). Рекомбинантные белки очищались до гомогенного состояния из суммарного бактериального лизата методом металхелатной хроматографии на носителях, содержащих иммобилизированные катионы двухвалентного никеля. Степень чистоты получаемых препаратов оценивалась методом денатурирующего гельэлектрофореза в SDS-геле, окрашенного кумаси синим. Рекомбинантный белок, получаемый из конструкции на основе вектора рЕТ15в, выделяли в денатурирующих условиях с последующей ренатурацией в связанном с носителем состоянии. Он получил обозначение YCD2 Рекомбинантный белок, получаемый из конструкции на основе вектора рЕТ32а, выделяли в нативных условиях. Последний белок содержал в своем составе достаточно большую гибридную часть (109 аминокислотных остатка). Гибридную часть удаляли протеолизом энтерокиназой, после чего полученную смесь полипептидов разделяли на металхелатном носителе. Полученный белок обозначали как YCD3e.

Для изучения наличия общих или родственных антигенных детерминант на рекомбинантном изолированном С-концевом некаталитическом модуле тирозил-тРНК синтетазы и рекомбинантном цитокине EMAPII был проведен Вестерн-блот анализ с использованием поликлональных антител против EMAPII. Вопреки ожидаемому, поликлональные антитела против EMAPII не реагировали с некаталитическим модулем тирозил-тРНК синтетазы.

Было изучено влияние полученных рекомбинантных белков на уровень экспрессии тканевого фактора (тромбопластина) в эндотелиоцитах пупочного канатика человека. Показано, что оба белка вызывали доззависимое повышение уровня экспрессии тканевого фактора, сопоставимое по величине ответа с эффектом EMAPII. Максимальный эффект белка YCD2 соответствовал концентрации в 100 пМ, а максимальный эффект белка YCD3e соответствовал концентрации 1 нМ.

Был показан синергизм эффекта повышения концентрации тканевого фактора на поверхности эндотелиоцитов под влиянием рекомбинантных белков с действием TNFa. Для этого эндотелиоциты подвергались совместному воздействию возрастающих концентраций исследуемых белков и 5 пМ TNFa. Концентрация TNFa является допороговой для прокоагуляционного эффекта (т. е. повышение уровня тканевого фактора). При этом совместный эффект белка YCD2 и TNFa значительно превышал алгебраическую сумму их эффектов, т. е. был синергичным.

Было также продемонстрировано влияние полученных рекомбинантных белков на хемотаксис моноцитов. Оба белка вызывали положительный хемотаксис моноцитов, сопоставимый по величине ответа с эффектом EMAPII на моноциты.

Ключевые слова: тирозил-тРНК синтетаза, бактериальная экспрессия, цитокиновая активность, синергизм цитокинов.

A. L Dubrovsky. Cloning, bacterial expression and cytokine-like activity of C-terminal non-catalytic module of eukaryotic tyrosyl-tRNA synthetase. – Manuscript.

Thesis for a degree of candidate of biological sciences, specialization 03.00.03. –Iinstitute of Molecular Biology and Genetics of National Academy of Science of Ukraine, Kyiv, 2001.

Cytokine-like activity of C-terminal non-catalytic module of bovine tyrosyl-tRNA synthetase, which share high homology with cytokine EMAPII was shown. The studies were carried on recombinant C-terminal module of bovine tyrosyl-tRNA synthetase. Recombinant non-catalytic module of bovine tyrosyl-tRNA synthetase modulate endothelial cells from umbilical vein coagulant properties through induction of increasing of tissue factor on cell surface. This activity of non-catalytic module is synergistic with procoagulant properties of TNFa. The recombinant protein also has a chemokine-like effect: it was shown that non-catalytic module stimulate a monocyte migration. Western-blotting analysis shown that recombinant non-catalytic module of bovine tyrosyl-tRNA synthetase and EMAP-II has no cross-reactivity.

Key words: tyrosyl-tRNA synthetase, bacterial expression, cytokine activity, cytokines synergism.