АКАДЕМІЯ МЕДИЧНИХ НАУК УКРАЇНИ

ІНСТИТУТ ГЕМАТОЛОГІЇ ТА ТРАНСФУЗІОЛОГІЇ

ДОВГАНИК ЗВЕНИСЛАВА ВОЛОДИМИРІВНА

УДК 616.273.52:616-073.176+577.157.2

СТВОРЕННЯ НАБОРУ ДЛЯ ВИЗНАЧЕННЯ АКТИВНОСТІ

АНТИТРОМБІНУ ІІІ І ЙОГО ПРЕПАРАТИВНЕ ВИДІЛЕННЯ НА БІОСПЕЦИФІЧНИХ СИЛОХРОМНИХ СОРБЕНТАХ

14.01.31 – гематологія та трансфузіологія

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

Київ - 2001

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана в Інституті патології крові та трансфузійної медицини АМН України

(м. Львів).

Науковий керівник: - доктор хімічних наук, старший науковий співробітник

ГАЙДА Анатолій Володимирович,

Інститут патології крові та трансфузійної медицини АМН України,

провідний науковий співробітник лабораторії коагулології

Офіційні опоненти: - доктор медичних наук, старший науковий співробітник

ТИМЧЕНКО Анатолій Сергійович,

Інститут гематології та трансфузіології АМН України,

завідувач лабораторії фракціонування плазми крові;

- доктор біологічних наук, професор

ВЕЛИКИЙ Микола Миколайович,

Національний медичний університет ім. О.О. Богомольця,

професор кафедри біоорганічної, біологічної і фармацевтичної хімії

Провідна установа: - Київська медична академія післядипломної освіти ім. П. Л. Шупика

МОЗ України, кафедра гематології та трансфузіології

Захист дисертації відбудеться “ 19 ” вересня 2001 р. о 13 год. 00 хв.

на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.612.01 в Інституті гематології та трансфузіології АМН України (04060, м. Київ, вул. М. Берлинського, 12).

З дисертацією можна ознайомитися у бібліотеці Інституту гематології та трансфузіології АМН України (04060, м. Київ, вул. М. Берлинського, 12).

Автореферат розісланий “ 3 ” серпня 2001 р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради Комісаренко В. Г.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Розлади природних інгібіторних шляхів регуляції зсідання крові відіграють важливу роль в патології гемостазу, зокрема, при тромбозах і синдромі дисемінованого внутрішньосудинного зсідання крові (ДВЗ). Серед цих розладів, які переважно вимагають невідкладної діагностики і лікування, часто зустрічається спадковий чи набутий (вторинний) дефіцит антитромбіну ІІІ (АТ ІІІ) [Я.М. Ена і співавт., 1993; Я.І. Виговська, 1999; R.M. Bertina, 1999].

АТ ІІІ – це прогресивний інгібітор тромбіну (фактору ІІа), частка якого в антитромбіновому потенціалі плазми складає понад 70 %, а також інших серинових протеїназ (факторів Xa, ХІІа, ХІа, ІХа, калікреїну). Його активність різко зростає при зв’язуванні з кофактором гепарином (негайна інгібіторна дія) [К.Н. Веремеенко і співавт., 1988]. Визначення рівня АТ ІІІ в крові залишається важливим тестом системи коагулологічних досліджень, необхідним для діагностики спадкового чи набутого дефіциту АТ ІІІ як фактора ризику тромбозів (тромбофілії), для моніторингу перебігу та лікування синдрому ДВЗ і тромбоемболій, прогнозування ефективності гепаринотерапії [В.А. Бе-лицер і співавт., 1987; U. Abildgaard і співавт., 1992; G. Lutze і співавт., 1996]. За кордоном виготовляються численні, основані на різних принципах та різного призначення набори для визначення активності або концентрації АТ ІІІ. В Україні цей показник досліджується тільки у спеціалізованих лабораторіях, переважно за рахунок комплектації низькоочищених реагентів.

Ефективність лікування коагулопатій, що виникають на ґрунті дефіциту АТ ІІІ або ним супроводжуються, значно підвищується при замісній корекції рівня АТ ІІІ в крові [R. Balk і співавт., 1998]. З цією метою фармацевтичні фірми різних країн виробляють очищені та вірусінактивовані концентрати АТ ІІІ, отримані із донорської плазми за сучасними технологіями [P. Hellstern і співавт., 1995]. В Україні препарати АТ ІІІ не випускаються і не імпортуються, а для корекції рівня АТ ІІІ застосовується свіжозаморожена плазма. Тим часом фракція ІV донорської плазми, яка найчастіше є сировиною для виготовлення АТ ІІІ, в закладах служби крові майже не використовується. В інституті нагромаджено значний досвід з технології виділення і очищення різних факторів зсідання крові [А.В. Гайда, 1993; Б.О. Кондрацький, 1996].

Таким чином, важливе значення в патології гемостазу та добрі клінічні результати замісної терапії дефіциту АТ ІІІ роблять актуальними розробку аналітично надійного набору для лабораторного визначення активності АТ ІІІ та отримання високоочищеного вірусінактивованого препарату АТ ІІІ для застосування як лікувального засобу.

Зв'язок роботи з науковими темами. Обраний напрямок досліджень безпосередньо пов’язаний з науково-дослідними роботами ІПКТМ АМН України: "Здійснити препаративне виділення та лабораторно-експериментальне вивчення препарату антитромбіну III" (№ держреєстрації 01.89.0001785) та "Створити комплекс діагностичних препаратів та наборів для діагностики тромбоемболічних захворювань та здійснити їх доклінічне вивчення" (№ держреєстрації UA 01000143p), співвиконавцем яких була здобувач.

Мета роботи. Вдосконалення лабораторної діагностики розладів гемостазу за допомогою розробленого набору для кількісного визначення активності АТ ІІІ та створення технології одержання із продуктів переробки донорської плазми очищеного препарату АТ ІІІ, придатного для виготовлення лікарського трансфузійного засобу.

Задачі дослідження:

1. Вивчити виділення тромбіну методом афінної хроматографії на силохромних сорбентах з різними сульфополісахаридними лігандами і отримати очищений препарат ?-тромбіну для коагулологічних досліджень.

2. Вдосконалити процедуру різних коагулологічних і хромогенних методів визначення активності АТ ІІІ і оцінити їх аналітичну якість.

3. Створити набір для визначення активності АТ ІІІ, вивчити його аналітичну придатність, опрацювати нормативно-технічну документацію.

4. З’ясувати діагностичну інформативність набору в умовах клінічних лабораторій.

5. Дослідити умови сорбції і десорбції АТ ІІІ на різних афінних силохромних сорбентах, розробити технологічну схему виділення очищеного концентрату АТ ІІІ, придатного для виготовлення лікарського препарату, встановити його властивості.

Об’єкт дослідження – інгібітор серинових протеїназ крові антитромбін ІІІ.

Предмет дослідження – методи і набір для кількісного визначення активності АТ ІІІ в крові; рівень активності АТ ІІІ в крові хворих; способи очищення і препарат АТ ІІІ для створення лікувального засобу.

Методи дослідження - афінна хроматографія тромбіну та АТ ІІІ на силохромних сорбентах з сульфополісахаридними лігандами; коагулологічні і біохімічні методи кількісного визначення активності АТ ІІІ; методи контролю аналітичної якості коагулологічних тестів; клініко-лабораторне дослідження активності АТ ІІІ у хворих; доклінічне біологічне вивчення препарату АТ ІІІ; статистичний аналіз.

Наукова новизна одержаних результатів. Встановлено вплив низки факторів на доаналітичній і аналітичній стадіях (взяття крові, приготування і зберігання дослідної та нормальної плазми; якість, склад і співвідношення реагентів; тривалість етапів тощо) на аналітичну точність основних коагулологічних і амідолітичних (хромогенних) методів визначення активності АТ ІІІ, виявлено джерела можливих похибок цих методів і опрацьовано способи їх подолання. Вдосконалено і оптимізовано процедуру цих тестів, що дозволило досягнути підвищення їх аналітичної якості та діагностичної інформативності. Вперше проведено порівняння аналітичної придатності різних методик визначення активності АТ ІІІ, що стало науковою підставою для створення діагностичного набору. Обґрунтовано доцільність включення визначення активності АТ ІІІ в комплекс основних (скринінгових) коагулологічних тестів. Вперше з’ясовано закономірності сорбції тромбіну на нових біоспецифічних сорбентах з силохромною матрицею, що містять різні сульфополісахаридні ліганди (гепарин, фурцеларан і філофоран). Доведено, що гепарин-силохром і фурцеларан-силохром можна успішно використовувати для виділення і очищення тромбіну з відходів переробки плазми (фракції ІІ+ІІІ), а також для розділення ?- і ?-/г-?орм тромбіну. Виділений ?-тромбін придатний для визначення активності АТ ІІІ та для інших коагулологічних тестів. Вперше продемонстровано можливість використання модифікованих кремнеземних сорбентів для отримання АТ ІІІ із утильної фракції плазми IV. Досліджено процеси хроматографічного очищення АТ ІІІ на іммобілізованих сульфополісахаридах гепарині, фурцеларані та філофорані. Виявлено, що сорбційні властивості гепарин-силохромів залежать від способу іммобілізації гепарину (довжини спейсера). Розроблено вперше умови хроматографічного виділення АТ ІІІ на гепарин-епіхлоргідрин-силохромі (HES). Сульфополісахариди водоростей фурцеларан і філофоран, які є конкурентними інгібіторами зсідної активності тромбіну і не впливають на його амідазну активність, не зв’язують АТ ІІІ і, на відміну від гепарину, не є його кофакторами. Встановлено вплив окремих чинників під час різних стадій виділення АТ ІІІ (осадження домішкових білків поліетиленгліколем, афінної хроматографії на HES, пастеризації) на біологічні властивості АТ ІІІ, що дозволило створити технологічну схему і виготовити очищений пастеризований препарат АТ ІІІ.

Практичне значення одержаних результатів. Вперше в Україні створено діагностично ефективний набір для визначення активності АТ ІІІ коагулометричним способом з використанням як реагенту виготовленого очищеного тромбіну з питомою активністю 1000-1200 од. NIH/мг. Цей набір був апробований з позитивним результатом на кафедрі лабораторної діагностики Львівського медичного університету ім. Данила Галицького. Він знайшов застосування в роботі клінічних лабораторій Львівської міської клінічної лікарні швидкої допомоги, 5-ої міської клінічної лікарні, Львівської обласної дитячої спеціалізованої клінічної лікарні, консультативної поліклініки та диспансерно-методичного відділення гемофілії і коагулопатій Інституту патології крові та трансфузійної медицини. Результати лабораторного використання набору засвідчили його аналітичну придатність, простоту і швидкість процедури визначення. На набір розроблена нормативно-технічна документація, на підставі якої він може виготовлятися серійно. Впровадження набору в роботу клінічних лабораторій України розширить можливості діагностики і моніторингу різних розладів системи зсідання крові.

Технологічна схема виділення АТ ІІІ і створений на її основі лабораторний регламент виробництва можуть бути застосовані для напівпромислового одержання препарату в закладах служби крові. Запропонований метод узгоджується з загальною схемою виробництва лікарських препаратів крові на станціях переливання крові і є економічно вигідним, оскільки дозволяє більш повно використати продукти переробки плазми крові (фракцію IV). Виготовлений препарат АТ ІІІ за своїми біологічними властивостями (електрофоретично гомогенний, з питомою специфічною активністю 3,5±0,2 од./мг білка, терміном зберігання при +(4-6) 0С протягом 18 місяців, пастеризований, ліофільно висушений, непірогенний, нетоксичний) відповідає зарубіжним концентратам АТ ІІІ. Результати роботи є підставою для створення лікувального препарату АТ ІІІ, застосування якого в клініці значно полегшить лікування деяких спадкових та набутих коагулопатій з дефіцитом АТ ІІІ.

Особистий внесок здобувача. Автор особисто відібрала і критично проаналізувала весь обсяг вітчизняної та зарубіжної літератури на тему дослідження. Вона розробила програму і методи вирішення поставлених завдань, співставила, проаналізувала і інтерпретувала отримані результати. При виконанні експериментальної частини роботи здобувач особисто проводила хроматографічне виділення і очищення тромбіну та АТ ІІІ, налагодила коагулометричні та хромогенні методи визначення активності АТ ІІІ, виконала внутрішньолабораторний контроль їх якості, скомпонувала набір реагентів для визначення активності АТ ІІІ, опрацювала технологічну схему одержання препарату АТ ІІІ, провела його лабораторне і біологічне дослідження. Визначення активності АТ ІІІ в лабораторних умовах та аналіз його результатів (міжлабораторний контроль якості набору) проведено спільно з науковими співробітниками клінічних відділів ІПКТМ та працівниками лабораторій лікувальних закладів м. Львова, які є співавторами наукових праць здобувача. В процесі вдосконалення окремих стадій отримання концентрату АТ ІІІ та виготовлення серій препарату брали участь співробітники лабораторії біохімії крові ІПКТМ, які стали співавторами публікацій. При аналізі та узагальненні результатів досліджень автор користувалася порадами наукового керівника д.х.н. А.В. Гайди та консультаціями д.мед.н., проф. В.А. Монастирського.

Апробація результатів дисертації. Основні результати роботи були представлені та обговорені на: ІІІ-му симпозіумі “Химия протеолитических ферментов” (Москва, 1993), ІІІ-му Українському з'їзді гематологів і трансфузіологів (Суми, 1995), II-й Всеросійській конференції "Патология гемокоагуляции" (Москва, Росія, 1995), ХІІІ-му з’їзді Міжнародного товариства гематологів (ISH; Istanbul, Туреччина, 1995), 40-му щорічному з’їзді Міжнародного товариства з тромбозів та гемостазу (ISTH; Interlaken, Швейцарія, 1996), науково-практичній конференції, присвяченій 25-річчю створення ЛМКЛШМД (Львів, 1997), I-му Західноукраїнському симпозіумі з адсорбції та хроматографії (Львів, 1997), XIV-му з’їзді Міжнародного товариства гематологів (ISH, Stockholm, Швеція, 1997), VІ-му регіональному європейському конгресі Міжнародного товариства з переливання крові (ISBT; Jerusalem, Ізраїль, 1999), 4-му конгресі Європейської асоціації гематологів (EHA; Barcelona, Іспанія, 1999), ІV-му Українському з'їзді гематологів і трансфузіологів (Київ, 2001).

Публікації. За темою дисертації опубліковано 17 робіт, з них 5 статей в провідних фахових журналах та збірниках наукових праць, 12 – в збірниках матеріалів і тез з'їздів, симпозіумів, конференцій.

Обсяг і структура дисертації. Дисертаційна робота обсягом 222 сторінки складається з вступу, огляду літератури, восьми розділів власних досліджень, висновків, списку використаних джерел, який включає 255 найменувань (24 сторінки тексту), та 4 додатків (18 сторінок). Робота ілюстрована 18 таблицями та 39 рисунками, розміщених на 32 сторінках тексту.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ

Огляд літератури з’ясовує сучасні погляди на біологічну роль, методи визначення, отримання та застосування АТ ІІІ. Проведено аналіз основних відомостей про структуру і фізіологічні функції АТ ІІІ, спадкову і набуту недостатність, методи кількісного визначення, методи виділення і очищення АТ ІІІ та застосування препаратів. Обґрунтовано актуальність наукової задачі дисертації, спрямованої на вдосконалення діагностики і лікування коагулопатій з дефіцитом АТ ІІІ.

Загальна методика і основні методи дослідження. Робота включає методи, зв’язані зі способами визначення активності АТ ІІІ і створенням набору, та методики виділення і очищення тромбіну та АТ ІІІ, лабораторного і біологічного дослідження препарату АТ ІІІ.

Для визначення активності АТ ІІІ налагоджено і опрацьовано коагулологічні та амідолітичні методи. В тестах і в створеному наборі для визначення активності АТ ІІІ використано реагенти: -тромбін, отриманий нами; фібриноген, виділений із фракції І плазми в лабораторії коагулології ІПКТМ методом Є.В. Титової і співавт. (1988); специфічні хромогенні субстрати Chromozym TH (Behringwerke AG, Німеччина) та С 1250 Tos-Gly-Pro-Arg-pNA-HCl, синтезований в НДІ генетики і селекції промислових мікроорганізмів (Москва, Росія); комерційні гепарин, апротинін.

Визначення аналітичної якості тестів активності АТ ІІІ і створеного набору проводили шляхом дослідження одного зразка плазми ”від визначення до визначення”, зразків плазми з різною активністю АТ ІІІ, парних спостережень з використанням дослідного і контрольного методу чи набору. Застосовували методи внутрішньолабораторного і міжлабораторного контролю. Результати досліджень з контролю якості аналізували методами дескриптивної статистики (В.В. Меньшиков, 1997; M.L. Bishop і співавт., 2000). Вони включали визначення середніх величин, стандартного відхилення, коефіцієнтів індивідуальної та аналітичної варіації, показника аналітичної похибки, який повинен бути <0,4, а при парних спостереженнях – аналіз лінійної регресії з визначенням систематичної (постійної і пропорційної) та випадкової похибок методу, кореляції (добра узгодженість парних результатів при r>0,95). З’ясовували характер чинників, що можуть вплинути на результат дослідження.

Матеріалом досліджень активності АТ ІІІ були: нормальна цитратна плазма, зразки дослідної плазми здорових осіб (донорів крові та дітей) і хворих. Клініко-лабораторні дослідження діагностичної інформативності створеного набору проведено у 25 здорових дорослих осіб (донорів крові) та 10 здорових дітей, 9 вагітних жінок, 145 дорослих хворих та 28 хворих дітей, які знаходилися на лікуванні в різних медичних закладах м. Львова. У більшості хворих одночасно з активністю АТ ІІІ визначали продукти деградації фібриногену (РПДФ і РФМК), у дітей – інші основні коагулологічні показники за допомогою створених в лабораторії коагулології наборів. Для статистичного порівняння середніх величин груп спостереження використано t-критерій; вірогідність різниці приймалася при p<0,05.

Вихідною сировиною для виділення тромбіну і АТ ІІІ були свіжовиготовлені або заморожені при -30 є? осади фракцій за Коном відповідно III або ІІ+ІІІ і IV (Львівська ОСПК) з терміном зберігання не більше ніж 1 міс., отримані із донорської плазми, перевіреної з негативним результатом на сифіліс та вірусні збудники згідно з нормативними вимогами. Для фракціонування осадів використовували ПЕГ-115 (М.м. 4800, Івано-Франківський завод тонкого органічного синтезу). Афінну хроматографію проводили на кремнеземних сорбентах з ковалентно іммобілізованим гепарином: гепарин-А-силохромі (НАS), гепарин-Т-силохромі (HTS), гепарин--силохромі (HS), виготовлених на хімічному факультеті МГУ (Росія), гепарин-Е-силохромі (НЕS), гепарин-G-силохромі (HGS), а також на силохромних сорбентах з іммобілізованими сульфополісахаридами червоних водоростей родів Furcellaria i Phyllophora - фурцелараном (FuS) i філофораном (PhS), синтезованих в лабораторії коагулології ІПКТМ (З.В. Логінська і співавт., 1998). Для порівняння застосовували гепаринові біоорганічні сорбенти: гепарин-целюлозу (НCel; НДІ особливо чистих білкових препаратів, СПб, Росія) та гепарин-сефарозу (HSeph; Pharmacia, Швеція).

Афінну хроматографію тромбіну виконували при 20 ?С в пластикових колонках об'ємом 10 мл на сорбентах, які зрівноважували 0,05 М тріс-НCl буфером (рН 8,0) з 0,15 М NaCl. На всі сорбенти наносили по 5000 од. NIH активованого протромбінового комплексу з питомою активністю 200 од. NIH/мг. Тромбін десорбували послідовно розчинами 1 М NaCl і 1 М NaCl з 25% ізопропанолу (NaCl/iProH) у стартовому буфері. Швидкість потоку розчинів для елюції складала 0,05-0,15 мл/хв на см2. Відбирали фракції по 3,0 мл, визначали в них концентрацію білка за Bradford (1976), а також зсідну і амідолітичну активності.

Афінну хроматографію АТ ІІІ здійснювали в аналогічних умовах. На колонки наносили по 200 мл супернатанту фракції плазми IV з питомою активністю 0,02 од./мг. Колонки промивали 0,02 М фосфатним буфером (рН 7,8) з 0,15 М NaCl. АТ ІІІ відмивали послідовно 0,5 М NaCl та 2 М NaCl в стартовому буфері. У фракціях визначали концентрацію білка та специфічну активність. Електрофорез білків виконували в поліакриламідному гелі в системі Laemmli (1970).

Зсідну активність тромбіну визначали в од. NIH за калібрувальним графіком, вимірюючи при 37 °С час зсідання фібриногену. Для побудови калібрувального графіка використовували 1-й Міжнародний стандарт (код 70/157). Амідолітичну активність тромбіну (в мкмолях/хв) виявляли за приростом оптичної щільності (А405) розчину хромогенного субстрату Z-Gly-Pro-Arg-pNA після додавання тромбіну (L. Stendsen і співавт., 1972). Активність АТ ІІІ визначали хромогенним методом. За одиницю активності АТ ІІІ приймали таку його кількість, яка міститься в 1 мл плазми.

Інгібування зсідної активності тромбіну сульфополісахаридами проводили за різних концентрацій фібриногену. Каталіз розщеплення хромогенних субстратів тромбіном досліджували за зростанням оптичної щільності. Кінетичні лінії розраховували за методом найменших квадратів, а константу інгібування (Кі) та константу каталізу (Ккат) визначали за методом Dixon (1982).

Стерильність препарату АТ ІІІ перевіряли за методикою, описаною в "Инструкции по бактериологическому контролю консервированной крови, ее компонентов, препаратов, консервированного костного мозга, кровезаменителей и консервирующих растворов", затвердженій МОЗ 22.06.89 р. Біологічні дослідження препарату АТ ІІІ на пірогенність та гостру первинну токсичність здійснювалися за методикою, описаною в Державній Фармакопеї (ГФ XI, в.2, С. 183), на експериментальних тваринах: кроликах породи шиншила масою 1,5-2,5 кг (15 шт.) і білих мишах масою 18-23 г (30 шт.).

Результати власних досліджень, їх аналіз і узагальнення.

Ключовим реагентом багатьох коагулологічних тестів, в тому числі і визначення активності АТ ІІІ, є тромбін. При вивченні дії сульфополісахаридів червоних водоростей фурцеларану і філофорану на тромбін виявилося, що обидва є конкурентними інгібіторами зсідної активності тромбіну (Ki відповідно 0,03 і 7,4 мМ), не впливаючи на його амідазну активність. Досліджено процеси сорбції і десорбції тромбіну із фракції плазми ІІ+ІІІ на нових силохромних сорбентах з лігандами гепарином (HES i HGS), фурцелараном і філофораном (FuS, PhS) порівняно з біополімерними сорбентами (HCel i HSeph). На силохромних сорбентах при елюції 1М NaCl отримують тромбін з низькою зсідною активністю, і тільки більш жорстка елюція розчином NaCl/iPrOH забезпечує виділення тромбіну з питомою активністю >1000 од. NIH/мг за однакової амідазної активності. На біоорганічних сорбентах вимивання тромбіну відбувається 1М NaCl. Таким чином, силохромні сорбенти дозволяють розділити нативну (-) і частково деградовану (/-) форми тромбіну з добрим виходом (до 85% на HGS). Після діалізу, стабілізації альбуміном і ліофільного висушування виготовляли препарат -тромбіну з терміном зберігання 1 рік за +(4±2) °С, який використано як реагент набору для визначення активності АТ ІІІ.

В роботі застосовано і проаналізовано такі методи визначення активності АТ ІІІ:

1. Коагулометричні - а) метод за негайною інгібіторною дією (за наявності кофактора гепарину) на основі методики A.Abildgaard і співавт. (1970), модифікований і вдосконалений нами в процесі дослідження, що стало основою для створення набору; б) метод за кінетикою прогресивної дії Е.П. Іванова і Л.А. Бізюка (1989) згідно авторської процедури.

2. Амідолітичні (хромогенні) за негайною інгібіторною дією - а) двоточковий мануальний метод, оснований на методиці O.R. Odegaard і співавт. (1977), вдосконалений нами; б) апаратний метод за кінетикою розщеплення хромогенного субстрату, зареєстрованою спектрофотометром біохімічного аналізатора FP-901 Labsystems (Фінляндія).

Вивчаючи аналітичну придатність і вдосконалюючи процедуру різних методів визначення активності АТ ІІІ, ми виходили з наступних вимог під час вибору методики для створення набору: а) метод повинен бути надійним, достатньо точним, легко відтворюваним і порівняльним за результатами з іншими методами; б) метод повинен бути простим і швидким у виконанні, для використання в невідкладних станах (шок, травма, синдром ДВЗ); в) метод повинен бути недорогим за рахунок використання доступних і в той же час якісних реагентів; г) метод повинен узгоджуватися з іншими коагулологічними тестами та наблизитися до міжнародних стандартів (G. Lutze і співавт.,1996; M. Matэљkovб, J. Zavшelovб, 1998).

Процедура тестів включала три етапи:

1. Приготування основного розведення нормальної та дослідної плазми, в якому активність АТ ІІІ приймається за 100% (1:20 в мануальних способах і 1:100 в апаратному), за допомогою буферу чи сольового розчину; в методах визначення негайної інгібіторної дії він містить гепарин, котрий утворює комплекс і активує АТ ІІІ; одночасно готують додаткові розведення нормальної плазми для побудови калібрувального графіку;

2. Інкубація розведень плазми, які містять комплекс АТ ІІІ-гепарин, впродовж визначеного часу з узятою в надлишку точною кількістю тромбіну; частина тромбіну інактивується АТ ІІІ;

3. Вимірювання кількості залишкового тромбіну за часом зсідання фібриногену (коагулометричні методи) або інтенсивністю розщеплення хромогенного субстрату і звільнення pNA, який визначається фотометричним способом при 405 нм (амідолітичні методи).

Більшої уваги заслуговує доаналітична стадія коагулологічних тестів, оскільки тут можуть критися причини значних похибок. Запропоновано регламентовану процедуру взяття зразків крові, отримання цитратної плазми і умов зберігання дослідних зразків для визначення активності АТ ІІІ. Оскільки активність АТ ІІІ вимірюється порівняно з нормальною плазмою, важливо встановити коректний порядок виготовлення останньої. В роботі аналогічно до існуючих регламентів та стандартів інших країн визначено процедуру отримання, приготування і зберігання нормальної цитратної плазми (як пулу рівних об’ємів плазми не менш ніж від 10 здорових осіб, однакової кількості чоловіків і жінок віком 18-55 р., які не приймали ліків) для визначення активності АТ ІІІ.

Проведено детальне вивчення коагулологічного методу кількісного визначення активності АТ ІІІ за Abildgaard і співавт. (1970), що ґрунтується на негайній інгібіторній дії АТ ІІІ на тромбін в присутності гепарину з наступним визначенням залишкової активності тромбіну за часом зсідання фібриногену. На основі цих досліджень та порівняння з відповідними описами варіантів методики і комерційних наборів експериментально вибрано оптимальні умови та розроблено модифікацію цього тесту. Вона, не зачіпаючи основного принципу класичного методу, стосувалася складу, концентрації і співвідношення реагентів, тривалості окремих етапів. Експериментально встановлено активність робочого розчину тромбіну 10 од. NIH/мл з наступною її корекцією за тромбіновим часом (9±0,5) с. Оптимальним для розведення плазми виявився буферний розчин, що містив 0,01 М тріс-HCl (рН 8,0) з 0,15М NaCl та 4 од./мл гепарину. Субстрат фібриноген використовували в концентрації 4 мг/мл. При опрацюванні процедури визначення активності АТ ІІІ модифікованим коагулометричним способом встановлено вихідне розведення нормальної та дослідної плазми (1:20), підібрано оптимальний час для виявлення негайної інгібіторної дії комплексу АТ ІІІ-гепарин на тромбін (2 хв). За таких умов в межах вимірювання (50-125%) існує прямо пропорційна лінійна залежність між часом зсідання фібриногену і активністю АТ ІІІ. Нормальні величини та референтний інтервал, отримані за допомогою модифікованого методу, відповідають даним літератури (табл. 1).

До переваг методу відносяться висока специфічність, гепаринонезалежність, простота і швидкість виконання. В створеній модифікації вилучено вплив рівня фібриногену дослідної плазми, активації повільних інгібіторів тромбіну і НС ІІ, а також посиленого фібринолізу на результати тесту. Аналіз можливих джерел аналітичних похибок цього методу показав, що вони в даній модифікації усунені або, принаймні, їх вплив на результат дослідження значно зменшено.

Проведено вивчення коагулометричного методу визначення активності АТ ІІІ за кінетикою прогресивної інгібіторної дії (Е. П. Іванов, Л. А. Бізюк, 1989) з використанням отриманих нами реагентів. З’ясовано, що він дає значні аналітичну та систематичні (постійну і пропорційну) похибки (табл. 1), технічно громіздкий і складний, непридатний для досліджень гепаринізованої плазми і при гепаринотерапії хворих і, на наш погляд, малоспецифічний (визначає загальну антитромбінову активність плазми).

В основі багатьох сучасних діагностичних наборів для визначення активності АТ ІІІ лежать амідолітичні (колориметричні) методи. В роботі опрацьовано хромогенний метод для мануального (двоточкового) визначення активності АТ ІІІ за його негайною інгібіторною дією. Експериментальним шляхом визначена для цього методу концентрація тромбіну в робочому розчині становить 1 од. NIH/мл, оптимальний склад буфера для розведення плазми, що особливо важливо для створення сприятливих умов каталізу субстрату, - тріс-HCl (рН 8,0; І=0,01) з 0,15М NaCl, гепарином 4 од./мл та апротиніном 0,65 од./мл для запобігання можливої дії на субстрат плазміну дослідної плазми. Показано, що хромогенний субстрат С 1250 Tos-Gly-Pro-Arg-pNA за своїми властивостями (специфічністю, здатністю до ензиматичного каталізу під дією тромбіну) подібний до субстрату Chromozym TH (лінії кінетики розщеплення обох субстратів подібні; Ккат відповідно 200 і 220 с-1) і може використовуватися в коагулологічних тестах. Концентрація хромогенного субстрату, підібрана за кінетичною лінією, складає 1,9 ммоль/л. Співвідношення реагентів та час їх взаємодії під час процедури тесту, як от залишкового тромбіну з субстратом (2,5 хв), підібрані шляхом численних досліджень і є оптимальними за цих умов.

Двоточковий мануальний метод відзначається добрими аналітичними якостями: високоспецифічний, надійний, швидкий, надається для серійних досліджень, проте його практична придатність обмежена високою вартістю хромогенного субстрату (табл. 1).

Таблиця 1

Аналітична якість і техніко-економічна характеристика опрацьованих методів визначення активності АТ ІІІ

Показник

якості методу | Коагулологічні методи | Амідолітичні методи

за негайною

інгібіторною дією{1} | за кінетикою

прогресивної інгібіторної дії {2} | мануальний

двоточковий {3} | автоматизо-ваний кінетичний {4}

1 | 2 | 3 | 4 | 5

Нормальні величини, % :

·

·

·

100,0 2,1

10,5

80-120 |

100,0 2,3

7,6

85-115 |

98,9 1,9

8,5

82-116 |

100,0 2,5

11,3

77-123

Коефіцієнт індивідуальної варіації (CVбіол.), % | 10,5 | 7,6 | 8,6 | 11,3

Коефіцієнт аналітичної варіації (CVаналіт.), % |

3,4 | АТ ІІІ 75 % - 4,3

АТ ІІІ 50 % - 7,2 |

3,3 |

4,5

Показник аналітичної похибки

(CVаналіт./CVбіол.) |

0,32 | АТ ІІІ 75 % - 0,57

АТ ІІІ 50 % - 0,95 |

0,38 |

0,40

Порівняння дослідного методу (у) з іншими методами (х):

·

·

·

реагентів:

у=2,06+0,94х1; у=-1,54+х2

S1у/х= 2,16; S2у/х= 1,45

r1 = +0,994; r2 = +0,996 |

з {1}:

у=31,98+0,66х

Sу/х= 2,19

r = +0,968 |

з {1}:

у=7,18+0,91х

Sу/х= 2,09

r = +0,991 | з Berichrom

AT III

r = +0,970

Специфічність | висока | низька | висока | висока

Гепариночутливість | - | + | - | -

Фактори, що можуть вплинути на результат

аналізу | висока концентрація

фібриногену | активація інших прогресивних інгібіторів |

- |

-

Складність процедури тесту | - | + | - | -

Складність підрахунку результату | - | + | - | -

Можливість суб’єктивної помилки при аналізі | + | - | -

Висока вартість реагентів | - | - | + | +

Автоматизований фотометричний метод визначення активності АТ ІІІ за кінетикою розщеплення синтезованого хромогенного субстрату і звільнення pNA, опрацьований в роботі з використанням субстрату С 1250, характеризується значною об’єктивністю і добрими аналітичними якостями, які відповідають аналогічним зарубіжним наборам (Berichrom AT III, Німеччина), проте вимагає наявності біохімічного аналізатора з реєстраційним спектрофотометром.

Перед остаточним вибором методу, який повинен стати основою набору, було співставлено показники, що характеризують аналітичну якість, техніко-економічні властивості, узгодженість результатів порівняльного тестування активності АТ ІІІ опрацьованими методами та іншими методами чи наборами (табл. 1). Встановлено, що за наших умов найбільш придатним для застосування в клініко-діагностичних лабораторіях і для створення набору є коагулологічний метод, що грунтується на визначенні негайної інгібіторної дії АТ ІІІ. Цей метод має порівняно з іншими методами високу надійність і відтворюваність (низький коефіцієнт аналітичної варіації та показник аналітичної похибки); отримані за його допомогою результати мають низьку систематичну та випадкову похибки; специфічний і гепаринонезалежний; технічно простий і надається для експрес-діагностики; в ньому використовуються реагенти, технологія отримання яких розроблена нами; не вимагає спеціального обладнання.

Створено набір для визначення активності АТ ІІІ коагулометричним способом, розроблена нормативно-технічна документація на нього (інструкція з використання, лабораторний регламент та проект технічних умов). Проведений внутрішньо- і зовнішньолабораторний контроль аналітичної якості створеного набору довів його аналітичну надійність, достатню точність (табл. 1).

Клінічне лабораторне вивчення набору проведено у здорових осіб (дорослих і дітей), вагітних та 145 хворих з вродженими та набутими коагулопатіями, тромбозами судин, хворобами імунного генезу, пухлинами, хронічними хворобами нирок. Визначення активності АТ ІІІ за допомогою розробленого набору дозволяє виявити у хворих дефіцит АТ ІІІ (табл. 2). Рівень активності АТ ІІІ в поєднанні з іншими коагулологічними тестами, особливо, з концентрацією РФМК і РПДФ, часто дає можливість диференціювати причину недостатності АТ ІІІ (коагулопатію споживання, порушення синтезу чи підвищену втрату АТ ІІІ). Запропонований набір для визначення активності АТ ІІІ, а також інші розроблені в лабораторії біохімії крові набори, використано для комплексної діагностики стану системи гемостазу у 28 дітей, хворих на гостру лімфобластну лейкемію (ГЛЛ). Дослідження показали, що в значній частині випадків, особливо під час інтенсивної цитостатичної терапії, виникають розлади гемостазу (у 50% дітей в період лікування низька активність АТ ІІІ). Інформативність показника активності АТ ІІІ, таким чином, зростає при його включенні в комплекс основних (скринінгових) гемостазіологічних тестів.

Сучасні методи отримання очищених концентратів АТ ІІІ грунтуються на поєднанні традиційного методу фракціонування плазми за допомогою етанолової преципітації з наступною біосепарацією та очищенням цього фактора за допомогою хроматографії (T.Burnouf, 1991). При розробленні процедури виділення і очищення АТ ІІІ, придатного для клінічного застосування, ми виходили із класичної схеми M.Wickerhauser і співавт. (1979).

Сировиною служила фракція IV донорської плазми з терміном зберігання до 1 міс при -30 0С. На першій стадії проводили осадження домішкових білків ПЕГ-115. Виділений після осадження

Таблиця 2

Активність антитромбіну ІІІ, рівень розчинних фібрин-мономерних

комплексів (РФМК) і ранніх продуктів деградації фібриногену (РПДФ) у

здорових людей, вагітних та при різних захворюваннях

№ |

Групи обстежених осіб |

n | Активність АТ ІІІ (%) | Рівень РПДФ і РФМК (мг/л)

та хворих | Mm | К-сть осіб з активністю <75 % | Mm | К-сть осіб з рівнем

> 4 мг/л

1 | Здорові люди (донори) | 25 | 1002,1 | 0 | 1,01,0 | 0

2 | Вагітні (3-й триместр) | 9 | 52,01,3* | 9 (100 %) | 1,11,0 | 0

3 | Спадкові коагулопатії (гемофілія) з кровотечею |

7 |

65,73,7* |

5 (71,4 %) |

3,01,7* |

1 (20 %)

4 | Тромбози судин | 30 | 69,53,0* | 19 (63,3%) | 1,21,1 | 0

5 | Імунні захворювання:

- імунна тромбоцитопенічна пурпура

- геморагічний васкуліт

- імунні хвороби сполучної тканини:

- загострення

- ремісія |

23

1

4

9 |

66,74,9*

130

71,84,2*

64,15,0* |

17 (73,9%)

0

2 (50 %)

6 (66,7 %) |

2,31,5*

256

1281,5*

1,41,4 |

3 (23,1 %)

1

3 (100 %)

0

6 | Шок | 6 | 65,82,3* | 6 (100 %) | 36,01,8* | 6 (100 %)

7 | Злоякісні пухлини:

- гостра мієлобластна лейкемія

- гостра лімфобластна лейкемія

- хронічні лімфопроліферативні процеси

- рак різної локалізації |

7

15

7

4 |

82,614,0

68,56,0*

72,62,3*

79,36,7* |

3 (42,8 %)

12 (80 %)

5 (71,4 %)

1 (25 %) |

23,72,2*

106,11,9*

8,02,4*

45,33,8* |

5 (71,4 %)

13 (86,7%)

3 (42,8 %)

3 (75 %)

8 | Доброякісні пухлини | 8 | 72,55,8* | 3 (37,5 %) | 1,01,0 | 0

9 | Хронічні хвороби нирок | 16 | 68,93,5* | 11 (68,8%) | 1,01,0 | 0

10 | Хвороби жовчних шляхів | 8 | 80,53,6 | 1 (12,5 %) | - | -

Примітка. * позначено величини, які істотно (p < 0,05) відрізняються від показників у

здорових осіб (група 1).

Таблиця 3

Характеристика очищення АТ ІІІ на сорбентах різного типу

Сорбент |

Довжина спейсера | Питома активність,

од./мг білка |

Ступінь очищення, разів |

Вихід,

% | Ємність

сорбенту,

од./мг гелю

Початкова | Кінцева

HAS | 3C | 0,02 | 0,5 | 25 | 10 | 0,25

HTS | 7C | 0,02 | 2,6 | 130 | 60 | 2,3

HS | 7C | 0,02 | 3,0 | 150 | 55 | 2

HES | 7C | 0,02 | 3,7 | 185 | 80 | 2,75

HGS | 9C | 0,02 | 2,0 | 100 | 40 | 1,5

FuS | 7С | 0,02 | 0,1 | 20 | 15 | -

PhS | 7С | 0,02 | 0,05 | 10 | 5 | -

HCel | 0,02 | 2,5 | 145 | 65 | 1,5

ПЕГ-115 екстракт АТ ІІІ низькоочищений, тому ми поставили перед собою завдання досягнути більш високого ступеню чистоти препарату за допомогою афінної хроматографії. Як відомо, найчастіше її проводять на біоорганічних сорбентах, лігандом в яких виступає гепарин (H. Nunes, W.H. Drogan, 1991). Оскільки силохромні матриці мають ряд переваг перед органічними (А.В. Гайда, 1993), ми випробували 7 силохромних сорбентів, що відрізнялися методом пришивання сульфополісахариду до матриці. В результаті встановлено, що силохромні сорбенти, які містять як активну групу кофактор АТ ІІІ гепарин, дозволяють виділити АТ ІІІ з високою питомою активністю із фракції IV плазми (табл. 3). Сорбційні властивості цих хроматографічних носіїв залежать від способу іммобілізації гепарину: оптимальними є спейсери довжиною 7 вуглецевих атомів. Найвищий ступінь очищення та вихід АТ ІІІ одержано на гепарин-Е-силохромі (HES; ємність сорбенту 2,75 од. АТ ІІІ/мг гелю, ступінь очищення 185 разів, вихід 80%), який за своїми сорбційними властивостями не поступається гепарин-целюлозі (рис. 1). Силохромні сорбенти, модифіковані сульфополісахаридами червоних водоростей (фурцелараном та філофораном), непридатні для очищення АТ ІІІ, тому що, очевидно, ці полісахариди не є кофактором АТ ІІІ (табл. 3).

В зв’язку з найвищими сорбційними властивостями в основу створеного способу отримання АТ ІІІ ми поклали його хроматографічне очищення на сорбенті НЕS. Експериментально розроблено оптимальні умови хроматографічного виділення АТ ІІІ на НЕS, визначено оптимальне співвідношення сорбенту та екстракту АТ ІІІ після фракціонування ПЕГ-115 (75:1), склад промивних (0,08 М фосфатний буфер; 0,5 М NaCl + 0,02 М фосфатний буфер, рН 7,8) та елюційного (2 М NaCl + 0,02 М фосфатний буфер, рН 7,8) розчинів, процедуру десорбції.

В результаті проведених досліджень розроблено технологію напівпромислового одержання очищеного препарату АТ ІІІ та лабораторний регламент виробництва АТ ІІІ людини. Технологічна схема (рис. 2) включає наступні етапи: отримання екстракту АТ ІІІ із фракції IV шляхом осадження домішкових білків ПЕГ-115; хроматографічне очищення на НЕS з адсорбцією в статичних умовах та елюцією в хроматографічній колонці; елюат АТ ІІІ концентрують за допомогою ліофільного висушування. Концентрат АТ ІІІ стабілізують 0,5 М натрію цитратом і пастеризують. Далі концентрат діалізують, проводять стерилізаційну фільтрацію, розливають у флакони та ліофільно висушують, одержуючи препарат АТ ІІІ.

Всього нами було виготовлено 8 серій стерильного ліофільно висушеного препарату. Біохімічне дослідження препарату показало, що він не містить сольових та білкових домішок, має питому специфічну активність 3,5 0,2 од/мг білка, що відповідає питомій активності препарату

АТ ІІІ фірми Baxter-Immuno (Австрія) (P. Hellstern a.o., 1995). З’ясовано, що термін зберігання нашого препарату в холодильнику за +(4-6) °С становить до 18 міс. з втратою не більше ніж 15% початкової активності, а за –(20-25) °С – 36 міс., що також відповідає зарубіжним аналогам.

Проведені біологічні дослідження свідчать про те, що виготовлений препарат є апірогенним, стерильним і позбавленим первинної токсичності, що дає підставу для його подальшого вивчення і створення на його основі лікувального засобу.

ВИСНОВКИ

1. В дисертації наведено теоретичне узагальнення і нове вирішення наукової задачі, а саме: на основі модифікованого коагулометричного методу створено набір для визначення активності АТ ІІІ в плазмі крові, який відзначається аналітичною придатністю для лабораторної діагностики розладів гемостазу, та розроблено технологію виділення із фракції IV донорської плазми і очищення методом афінної хроматографії на гепарин-Е-силохромі препарату АТ ІІІ.

Дефіцит АТ ІІІ часто є фактором ризику або виникає при важких розладах гемостазу (тромбоемболії, синдром ДВЗ, шок) та зумовлює низьку ефективність гепаринотерапії. Тому актуальною науковою задачею є забезпечення належної якості лабораторної діагностики і створення технології одержання препарату плазми для замісної трансфузійної терапії недостатності АТ ІІІ.

2. За допомогою афінної хроматографії на нових силохромних сорбентах, активна група яких представлена сульфополісахаридами гепарином і фурцелараном, отримано із відходів переробки людської плазми (фракція ІІ+ІІІ) стабільний препарат ?-тромбіну активністю 1000-1200 од. NIH/мг для коагулологічних досліджень, в тому числі для визначення активності АТ ІІІ.

3. При співставленні аналітичної придатності коагулометричних та хромогенних (амідолітичних) способів визначення активності АТ ІІІ експериментально опрацьовано оптимальні умови тестів (якість, склад і співвідношення реагентів, час взаємодії, підрахунок результатів, вплив додаткових факторів), відкореговано