НАЦІОНАЛЬНИЙ АГРАРНИЙ УНІВЕРСИТЕТ
НАЦІОНАЛЬНИЙ АГРАРНИЙ УНІВЕРСИТЕТ
ФОМЕНКО Ірина Степанівна
УДК 577.15:591.3+591.147
ОСОБЛИВОСТІ ГЛУТАМАТДЕГІДРОГЕНАЗНОЇ ТА АМІНОТРАНСФЕРАЗНИХ РЕАКЦІЙ У СЛИЗОВІЙ ОБОЛОНЦІ ТРАВНОГО ТРАКТУ ПЛОДА КОРОВИ
03.00.04-біохімія
АВТОРЕФЕРАТ
дисертації на здобуття наукового ступеня
кандидата біологічних наук
Київ-2001
Дисертацією є рукопис
Робота виконана в Науково-дослідному інституті біотехнологічних основ підвищення продуктивності тварин Львівської державної академії ветеринарної медицини імені С.З. Ґжицького Міністерства аграрної політики України
Науковий керівник
доктор біологічних наук, професор
Калачнюк Григорій Іванович,
НДІ біотехнологічних основ підвищення продуктивності тварин Львівської державної академії ветеринарної медицини імені С.З.Ґжицького, директор
Офіційні опоненти: доктор біологічних наук, Войціцький Володимир Михайлович, Київський національний університет імені Тараса Шевченка, професор кафедри біохімії
кандидат біологічних наук Мельничук Сергій Дмитрович, Національний аграрний університет, завідувач кафедри біохімії тварин, якості та безпеки сільськогосподарської продукції
Провідна установа Інститут біохімії імені О. В. Палладіна НАН України, відділ регуляції обміну речовин, м.Київ
Захист відбудеться “14” вереcня 2001 р. о 1000 годині на засіданні
спеціалізованої вченої ради Д 26.004.08 у Національному аграрному університеті за адресою: 03041, Київ – 41, вул. Героїв оборони 15, навчальний корпус № 3, ауд. 65
З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Національного аграрного університету; 03041, Київ – 41, вул. Героїв оборони 11, навчальний корпус № 10
Автореферат розісланий “13” серпня 2001 р.
Вчений секретар
спеціалізованої вченої ради _______________ Грищенко В. А.
ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ
Актуальність теми. Відомо, що метаболічні процеси у тканинах плодів мають ряд характерних особливостей. Вони пов'язані в першу чергу з інтенсивним ростом, а також із гіпоксичним станом організму плода (Хочачка П.,1988; Федець О.М., Калачнюк Г.І. 2000). Виявлені особливості в обмінних процесах тканин і органів (Гулий М.Ф., Мельничук Д.О., 1974; Захаренко М.О. 1993; Цвіліховський М.І., 1998; Тупицька О.М. і сп., 1997; Любецька Т.В., 2000; Федець О.М., 2001) є важливими для розуміння причин і розробки шляхів корекції метаболічних зрушень в організмі при переході від пре- до постнатального періоду розвитку. У зв'язку з інтенсивним біосинтезом білка для плодів притаманне більш інтенсивне, порівняно з дорослим організмом, використання амінокислот, які поряд із глюкозою є ключовим енергетичним субстратом (Faichney G.J., 1987; Volpe E.P., 1993). Центральне місце у амінокислотному обміні займають ензими, залучені у метаболізм глутамінової кислоти і глутаміну. Глутамінова кислота є донором аміногруп у реакціях трансамінування, які поповнюють пул амінокислот для забезпечення біосинтетичних потреб ростучого організму, а також є зв'язуючою ланкою з енергетичним метаболізмом клітин (Торчинский Ю.М., 1987, LainB.,1998). З іншого боку, реакції синтезу глутамінової кислоти і глутаміну є одним із важливих механізмів знешкодження надлишків аміаку. Адже, загальновідомо, що NH3 дуже токсичний.
Найважливішими ензимами, залученими у метаболізм глутамінової кислоти є: глутаматдегідрогеназа (GDH), що каталізує реакцію відновного амінування a-кетоглутарату з утворенням глутамінової кислоти (Fisher H.F., 1985; Смовж С.А., 1998), а також амінотрансферази, які здійснюють перенесення аміногруп на a-кетокислоти. Окремо слід відмітити реакції синтезу й розпаду глутаміну, що каталізуються відповідно глутамінсинтетазою (GS) і глутаміназою.
Слизова оболонка травного тракту у дорослої жуйної тварини, завдяки специфічній будові, є місцем, де одночасно відбуваються метаболічні процеси, що каталізуються, як ензимами самої тканини, так і бактеріальними ензимами та фітоензимами, адсорбованими з вмістимого травного каналу (Базанова Н.У., Ташенов К.Т., 1987). Її дослідженню у дорослих тварин присвячено ряд робіт (Кусень С.Й., 1966, Явоненко О.Ф., 1973; Шевряков М.В., 1975; Шмідт Р.М. 1981; Калачнюк Г.І, 1967-2001). Але, не дивлячись на важливу роль слизової оболонки в обміні речовин, ця тканина у плода залишається маловивченою. А дослідження обміну глутамінової кислоти і глутаміну є важливими для з'ясування їх ролі в метаболічних процесах, детоксикації надлишків аміаку у цій тканині, розробки способів контролю та регуляції і, взагалі, представляє значний інтерес для вирішення багатьох фундаментальних та практичних проблем, пов'язаних з білковим обміном, засвоєнням азоту у системі “плід-мати”.
Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертаційна робота була розділом комплексних досліджень Науково-дослідного інституту біотехнологічних основ підвищення продуктивності тварин Львівської державної академії ветеринарної медицини імені С.З. Ґжицького, які виконувались на замовлення Наукового управління Мінагрополітики України по темі № 9/1 (№ держреєстрації 0198U008022) – “Розробити нові, комплексні біотехнологічні способи підвищення вмісту рістстимулюючих речовин у природних кормових засобах”, а також – фрагментом спільних науково-дослідних робіт, що проводяться разом з Інститутом фізіології та генетики Чеської АН та Інститутом молекулярної біології і генетики НАН України.
Мета і задачі дослідження. Метою нашої роботи було дослідити зміни в активності глутаматдегідрогенази, глутамінсинтетази і ключових ензимів трансамінування (аспартатамінотрансферази (AST) і аланінамінотрансферази (ALT)) у слизовій оболонці рубця, сітки, книжки, сичуга, сліпої та прямої кишок плода корови у процесі внутрішньоутробного періоду розвитку, для встановлення їх ролі в обміні речовин плода і впливу на них екзогенних факторів.
Для реалізації цієї мети необхідно було виконати такі задачі:
·
з'ясувати гомо- і гетерогенність глутаматдегідрогенази у слизовій оболонці рубця плода і дорослої тварини;
· дослідити особливості глутаматдегідрогеназної реакції у мітохондріальній фракції слизової оболонки травного тракту плода корови;
· оцінити міжорганні особливості амінотрансферазних реакцій на рівні внутрішньоклітинних компартментів слизової оболонки травного тракту та печінки;
· встановити міжвікові особливості амінотрансферазних реакцій у слизовій оболонці травного тракту та печінки плода;
· показати порівняльні аспекти амінотрансферазних реакцій у слизовій оболонці рубця і печінці плода та дорослої тварини;
· виявити особливості реакцій трансамінування у слизовій оболонці травного тракту плода за умов підвищеного аміакоутворення та застосування природного сорбенту;
· визначити рівень азотвмісних інтермедіатів та активності глутамінсинтетази у слизовій рубця плода і матері за дії надлишку аміаку й екзогенних факторів.
Об'єктом дослідження були міжорганні та міжвікові особливості реакцій обміну глутамінової кислоти і глутаміну у слизовій оболонці шлунково-кишкового тракту і печінки плода корови та їх зміни за умови дії екзогенних факторів, які підвищують або знижують інтенсивність процесів аміакоутворення в організмі корови-матері.
Предметом дослідження були глутаматдегідрогеназа, глутамінсинтетаза, аспартатамінотрансфераза й аланінамінотрансфераза внутрішньоклітинних компартментів слизової оболонки травного тракту і печінки плода корови.
Методи досліджень: одержання глутаматдегідрогенази проводили з допомогою поєднань препаративного виділення, ультрацентрифугування, висолювання, іонообмінної хроматографії та ін.; субклітинні фракції одержували за допомогою диференційного центрифугування з наступною солюбілізацією мітохондрій в 1%-ному розчині тритона Х-100; визначення активності ензимів – спектрофотометрично; концентрацію розчинних білків – за методом Лоурі та Петерсона.
Наукова новизна одержаних результатів. Вперше проведено дослідження активності глутаматдегідрогенази, глутамінсинтетази, аспартатамінотрансферази й аланінамінотрансферази у субклітинних компартментах слизової оболонки рубця, сітки, книжки, сичуга, сліпої і прямої кишок та печінки плода корови у процесі його внутрішньоутробного періоду розвитку.
Показано, що в слизовій оболонці рубця плода корови функціонує тільки одна форма глутаматдегідрогенази, на відміну від слизової оболонки рубця дорослої тварини, в якій наявні дві форми – тканинна і бактеріальна.
Встановлено, що активність глутаматдегідрогенази у слизовій оболонці травного тракту плода корови є низькою, у порівнянні з активністю ензиму у печінці. Поряд з цим виявлено, що активність амінотрансфераз у слизовій оболонці травного тракту є відносно високою, що вказує на домінуючу роль аміно-трансферазних реакцій, які ведуть до утворення аспарагінової кислоти й аланіну.
Процеси трансамінування суттєво посилюються з віком і найбільш виразно в слизовій оболонці передшлунків, що може вказувати на продовження процесу їх формування та на відносну стабілізацію його у тканині всіх інших відділів травного каналу.
Показано, що підвищення рівня аміакоутворення і, особливо, при дефіциті джерел енергії в організмі матері, проявляє адекватний вплив і на ензиматичну активність обміну глутамінової кислоти та глутаміну у плода. Ці дані можуть бути фундаментальною базою для розробки нових ефективних способів використання джерел азоту й енергії у живленні вагітних тварин та покращення здоров'я новонароджених.
Практичне значення одержаних результатів. Отримані результати досліджень ензиматичних реакцій обміну глутамінової кислоти і глутаміну у слизовій оболонці травного тракту плода корови розширюють існуючі відомості про їх роль у процесах утилізації азотвмісних сполук та детоксикації надлишків аміаку, а також доповнюють дані про особливості формування та функціонування цієї тканини у пренатальний період онтогенезу.
На основі результатів проведених досліджень встановлено доцільність використання для тільних корів існуючої системи годівлі тварин ріпаковими кормовими добавками у поєднанні з природними сорбентами (цеолітами), яка викладена у рекомендаціях “Біотехнологічні основи використання модифікованих ріпакових кормових добавок у тваринництві”, затверджених секцією тваринництва науково-технічної ради Мінагрополітики України 23 грудня 1999 року.
Результати досліджень впроваджені в навчальний процес кафедри біохімії Львівського національного університету ім. Івана Франка (акт від 30.03.2001р.) і кафедри біохімії та біотехнології Львівської державної академії ветеринарної медицини ім.С.З.Ґжицького (акт від 18.09.2000р.)
Особистий внесок здобувача. Дисертантом особисто проведені біохімічні дослідження, узагальнені їх результати, сформульовані висновки та оформлено роботу.
Автор висловлює щиру подяку доктору біологічних наук, професору Калачнюку Григорію Івановичу за запропоновану ним тему, керівництво під час виконання роботи і її захисту. Окремо приноситься подяка співробітникам Інституту фізіології та генетики тварин Чеської Академії наук (Прага-Уржиневес) докторам наук Яну Копечни і професору Мілану Мароунеку, а також заступнику директора з науки Інституту біології клітини НАН України, доктору біологічних наук Гончару Михайлу Васильовичу, директору Інституту молекулярної біології і генетики НАН України Мацука Геннадію Харлампійовичу та всім тим, хто люб'язно надавав реактиви і створював умови для проведення досліджень.
Апробація результатів досліджень. Викладені в дисертації результати досліджень доповідались на: Міжнародній науковій конференції “С.З. Ґжицький і сучасна аграрна наука”, присвяченій 100-річчю від дня народження С.З. Ґжицького (Львівська державна академія ветеринарної медицини імені С.З. Ґжицького, 6-8 травня 2000); 2-му Західноукраїнському симпозіумі з адсорбції та хроматографії (Львів, 5-7 червня 2000); третій міжнародній конференції “Актуальные проблемы биологии в животноводстве” (Боровск, 6-8 сентября 2000); міжнародній науковій конференції “Шляхи підвищення резистентності та продуктивності тварин” (Дніпропетровськ,17-18 травня 2001); ІІІ Symposium Ukraine-Osterreich, Landwirtschaft: Wissenschaft und Praxis (Tschernivci, 14-16 September 2000); а також на звітних засіданнях Науково-дослідного інституту підвищення продуктивності тварин, науково-технічній та вченій радах Львівської державної академії ветеринарної медицини імені С.З. Ґжицького (1998-2001).
Публікації. По матеріалах дисертації опубліковано 9 робіт. З них 5 статей, 3 праці конференцій і симпозіумів та науково-практичні рекомендації.
Структура та обсяг дисертації. Дисертація викладена на 136 сторінках, основна частина містить 14 таблиць і 38 рисунків. Робота складається із вступу, трьох розділів, висновків та списку використаних джерел літератури (210 найменувань) та 4 додатки (6 таблиць).
ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ
Загальна методика та основні методи досліджень
Дослідження проводили на плодах, які відбирали під час забою тільних корів на м'ясокомбінаті. До забою корови утримувалися на загальноприйнятих раціонах. Було одержано 75 плодів. Визначення віку плодів проводили за комплексом зовнішніх морфологічних ознак (О.М.Федець, 2000) та даними “Журналу штучного осіменіння корів”. У спеціальному досліді плоди відбирали від корів трьох груп. Першій групі тварин (контрольній (К), 5 корів) у якості джерела протеїну згодовували ріпакові кормові добавки (шрот, або макуху), виходячи з розрахунку по 550-750 г/гол. за добу. Тваринам другої (D-1) і третьої (D-2) групи (по 5 корів у кожній) згодовували у таких самих кількостях ріпакові кормові добавки, але з метою підвищення процесів аміакоутворення, додатково вводили сечовину з розрахунку 0,25 г/кг маси тварини. При цьому корови третьої групи додатково ще отримували цеолітовий порошок, який містив понад 80% діючої речовини (клиноптилоліту) Сокирницького родовища (сорт А), виходячи з розрахунку 0,5 г/кг маси тварини для часткової сорбції надлишків аміаку у передшлунках.
Матеріалом для проведення біохімічних досліджень були: слизова оболонка рубця, сітки, книжки, сичуга, сліпої та прямої кишок і печінка, а у дорослих тварин – ще й вмістиме рубця, мікробні нашарування на слизовій оболонці та кров.
Для виділення та часткової очистки препаратів GDH використовували 30% гомогенати тканин слизових оболонок і печінки у 0,01М фосфатному буфері (рН 7,5), що містив 4*10-3М Na2EDTA і 0,25М сахарози. Тритон Х-100 додавали в гомогенати до кінцевої концентрації 1%.
Для одержання цитозольно-мікросомальної і мітохондріальної фракцій тканинні зразки гомогенізували в гомогенізаторі Поттера-Элвегейма в середовищі такого складу (мМ): сахароза (250,0), трилон Б (5,0) і трис-НСl-буфер (5,0) при рН=7,4. Субклітинні фракції одержували на холоді методом диференційного центрифугування. Мiтохондрії триразово промивали в середовищі виділення і солюбілізували в 1%-ному розчині тритону Х-100. Для визначення вмісту метаболітів готували тканинні екстракти шляхом розтирання наважок тканин в охолодженій 6% ТХО або у 6%-ому свіжовиготовленому розчині хлорної кислоти (визначення інтермедіатів енергетичного обміну). З метою виявлення активності GS слизову оболонку рубця гомогенізували в 0,067М фосфатному буфері при рН 7,7. Співвідношення тканини (г) і буфера (мл) складало 1:8.
Для препаративного виділення і часткової очистки GDH проводили висолювання перекристалізованим сульфатом амонію. Одержували білкові фракції, що осаджуються в межах 20-60% насичення (NH4)2SO4 (+40C, рН 8). Після відокремлення і розчинення їх діалізували проти 0,01М фосфатного буфера (рН 7,5). Далі білкові фракції піддавали хроматографії на колонках з ДЕАЕ-целюлозою (розмір колонок - 2ґ23см). Препаративне виділення білків проводили під контролем ензиматичної активності.
Активність GDH (КФ 1.4.1.1-3) визначали за методом H.C.Reeves et al. (1977). Активність основних ензимів трансамінування AST (КФ 2.6.1.1) і ALТ (КФ 2.6.1.2) визначали за допомогою лабораторного набору Bio-La-Tests (Lachema, Brno, Bohemia). Активність GS (КФ 6.3.1.2) визначали за методом А.С.Силакової і сп. (1962). Визначення концентрації розчинних білків у мітохондріальних (печінкова тканина) і цитозольно-мікросомальних фракціях та екстрактах цільних тканин проводили за методом О.Н.Lowry et al. (1951), а у мітохондріальних фракціях досліджуваних оболонок за методом G.L.Peterson et al. (1977).
Статистичну обробку отриманих результатів здійснювали за допомогою програми Microcal Origin (Version: 5.0).
ПРОВЕДЕНІ ЕКСПЕРИМЕНТАЛЬНІ ДОСЛІДЖЕННЯ
Гомо- і гетерогенність глутаматдегідрогенази у слизовій оболонці
рубця плода і дорослої тварини
а) б)
Рис.1.ГомогенністьGDH: а) слизової оболонки рубця; б) печінки дорослої жуйної тварини
За допомогою поєднань різних способів препаративного виділення (ультрацентрифугування, висолювання, хроматографії та ін.) з тканини слизової оболонки рубця плода одержано гомогенний препарат глутаматдегідрогенази, який нами було названо GDHTRF (рис.1). Таким же шляхом із тканини печінки дорослої жуйної тварини (корови-матері) було виділено й препарат цього ж ензиму, якому дали назву GDHTLC. Ці ензими були подібними за багатьма характеристиками. Основною їх відмінністю є значно нижча активність GDHTRF у порівнянні з GDHTLC.
Однак, при виділенні препарату глутаматдегідрогенази вищевказаним шляхом із слизової оболонки рубця дорослої жуйної тварини виявляється його гетерогенність. Так, встановлено, що у ньому відмічається активність цього ензиму відразу у двох окремих білкових елюатах. З них перший знаходиться у межах фракцій низького градієнту концентрації NaCl, а другий – у межах високого (рис.2). Слід відмітити, що перший змінює свою активність у залежності від ступеня відмивання (очищення) поверхні слизової оболонки рубця від адгерованих на ній бактерій. Тому його було названо глутаматдегідрогеназою рубцевих адгерованих бактерій (GDHRАВ). А другий білковий елюат відрізняється від першого своєю більшою стабільністю та порівняно вищою ензиматичною активністю. За багатьма властивостями він був близьким до тканинних глутаматдегідрогеназ - GDHTRF і GDHTLC.У зв'язку з цим його було названо дегідрогеназою тканини слизової оболонки рубця корови (GDH TRС).
Рис.2. Гетерогенність глутаматдегідрогенази слизової оболонки рубця дорослої жуйної тварини (рис.1 і рис.2: суцільна лінія над ретушованим профілем – активність GDH, а пунктирна – концентрація білку).
Одержані препарати відрізняються між собою за коензимною специфічністю (рис.3). Так, тканинні препарати GDHTRF,TRC і TLC майже однаково проявляють найвищу специфічність до коензиму NADН. Інша тенденція відмічається при дослідженні препарату GDHRАВ, який майже у 3 рази підвищує свою активність за умов використання кофактора NADPН. Окрім цього у бактеріального ензиму не так суттєво (як у всіх тканинних GDH) знижується активність при застосуванні таких коензимів, як NAD+ і NADP+.
Рис.3 Коензимна специфічність GDH, одержаної із різних біооб'єктів (GDHRAB - ензим комплексу адгерованих бактерій на слизовій оболонці рубця дорослої жуйної тварини; GDHTRC - тканинний ензим рубцевої слизової дорослої тварини; GDHTRF - ензим тканини слизової рубця плода; GDHTLC - ензим печінки дорослої тварини. За 100% прийнято фактичну активність ензиму, відповідно з кожного об'єкту)
Дослідження показали, що тканинні і бактеріальні ензими по-різному реагують на дію активаторів і інгібіторів. Так, GTP у межах концентрацій від 10-5 до 10-3 М (рис.4) має інгібуючий ефект на всі тканинні дегідрогенази (GDHTRF,TRC і TLC). Поряд з цим, відмічається дуже відчутна активація при збільшенні (у межах 10-6 до 10-4 М) концентрацій аденозинмонофосфату (АМР) (рис.5). Однак у вказаних концентраціях ці ефектори не проявляють жодного впливу на активність мікробної глутаматдегідрогенази (GDHRАВ).
Для GDH різного походження показано інгібування підвищеними концентраціями катіонів та аніонів, важкими металами тощо. Наші дослідження показали (рис.6), що навіть порівняно незначне збільшення в інкубаційному середовищі концентрацій Zn2+ (від 10-6 до 10-4 М) здатне суттєво гальмувати (і навіть повністю блокувати) активність GDHTRF,TRC і TLC. Але такі самі зміни у концентрації двохвалентних катіонів зовсім не впливають на активність GDHRАВ. Правда, з літератури відомо (Frieden C., 1967; Lenartova V., Holovska K., Havassy I., 1981), що катіони цинку (Zn2+) можуть інгібувати і бактеріальну GDH, але у значно вищих концентраціях.
Рис.4 Інгібіція GDH гуанозинтрифосфатом Рис.5 Активація GDH аденозинмонофосфатом
Цікавими залишаються й одержані нами дані (рис.7) щодо активного впливу підвищених концентрацій (від 10-4 до 10-2 М) лейцину на рівень активності тканинних глутаматдегідрогеназ (GDHTRF, TRC і TLC). Зважаючи на те, що ця амінокислота не належить до похідних глутамату, очевидно, тому вона не викликає рефлексу ретроінгібіції, тобто – гальмування за типом зворотнього зв'язку. Це узгоджується з даними про те, що у мітохондріях є свій автономний фонд лейцину. Він же здатний повсякчас впливати на функції GDH, яка локалізується у внутрішній мембрані та матриксі цього компартменту соматичної клітини.
Рис. 6 Інгібіція GDH цинком Zn2+ Рис.7 Активація GDH лейцином (Leu)
Особливості глутаматдегідрогеназної реакції у мітохондріальній фракції слизової оболонки травного тракту плода корови
У своїх дослідженнях ми визначали активність глутаматдегідрогенази у слизовій оболонці травного тракту і печінці плода корови. Виявлено, що активність GDH у слизовій оболонці всіх досліджуваних органів (рубець, сітка, книжка, сичуг, сліпа та пряма кишки) була дуже низькою. Імовірно, що головним шляхом перетворення глутамату є його участь у реакціях трансамінування.
Разом з тим у печінці плодів виявлено порівняно високу активність GDH. Характерним є зростання активності ензиму з віком плода. Так, активність GDH у мітохондріях печінки плодів віком 6-6,5 місяців становить 0,63±0,03; 7-7,5 місяців - 0,78±0,02 і 8-8,5 місяців 2,08±0,43 мкмоль NADH/хвЧмг білка.
Реакції трансамінування на рівні субклітинних фракцій слизової
оболонки травного тракту і печінки плода корови
Представлені у табл. 1 і 2 дані свідчать, що активність AST у субклітинних фракціях слизової різних відділів ШКТ та печінки плода корови знаходиться на різних рівнях, проте майже однаковими їх активності є у передшлунках (у межах однієї вікової групи). Це ж саме стосується і рівнів активності ALТ. За перебігом реакцій трансамінування суттєво відрізняються мітохондріальна і цитозоль-мікросомальна фракції слизової оболонки протягом всього травного тракту. Аспартатамінотрансферазний шлях переамінування переважає в цитозоль-мікросомальній фракції слизової оболонки. Найвищою активність амінотрансфераз виявляється у печінці.
Існують міжвікові відмінності у активностях AST i ALT. У слизовій оболонці травного тракту вони зростають в обидвох фракціях і в найбільшій мірі в мітохондріальній. Активність амінотрансфераз найбільш суттєво підвищується з віком у компартментах слизової оболонки передшлунків плода. Очевидно, в інших відділах травного каналу формування реакцій трансамінування закінчується раніше.
Порівнюючи активності AST i ALT плода та дорослої тварини (визначені у слизовій оболонці рубця і тканині печінки), слід відмітити, що у плода вони знаходяться на значно нижчому рівні. Найбільш виразні різниці виявляються в печінці: загальна активність AST у плода майже в 20 раз нижча, ніж у дорослої тварини (2,9±0,3 мкмоль пірувату/хвЧмг білку проти 57,6±2,9) (рис.8). Це, головним чином, за рахунок дуже високої активності мітохондріальної AST дорослої тварини, яка вища у 34 раза (94,9±4,5 пірувату/хвЧмг білка проти 2,8±0,5мкмоль). Активність цього ензиму в цитозоль-мікросомальній фракції печінки плода нижча тільки в 6,7 раза (3,0±0,2 проти 20,3±1,4).
Таблиця 1 - Активність L-аспартат: 2-оксоглутарат амінотрансферази у субклітинних фракціях слизової оболонки різних відділів травного тракту та печінки плода корови з урахуванням віку (мкМоль пірувату /хвЧмг.білка М±m; n=5)
Органи ШКТ Вік плода
6-6,5 міс. 7-7,5 міс. 8-8,5 міс.
Активність AST у субклітинних фракціях: 1-цитозоль-мікросомальній; 2-мітохондріальній
1 2 1 2 1 2
M±m Р M±m Р M±m Р M±m Р M±m Р M±m Р
Рубець 1,42±0,31 - 2,00±0,25 Р2<0,2 1,68±0,16 Р1<0,5 2,33±0,08 Р1>0,2 Р2<0,01 1,60±0,32 Р1>0,5 3,54±0,27 Р1<0,01 Р2>0,001
Сітка 1,69±0,28 Р3>0,5 2,13±0,45 Р2<0,5 Р3>0,5 1,62±0,14 Р1>0,5 Р3>0,5 2,26±0,12 Р1>0,5 Р2<0,01 Р3<0,5 1,88±0,13 Р1>0,5 Р3>0,5 3,07±0,16 Р1<0,1 Р2<0,001 Р3<0,1
Книжка 1,68±0,19 Р3>0,5 2,19±0,17 Р2<0,05 Р3>0,5 1,70±0,18 Р1<0,5 Р3>0,5 2,28±0,09 Р1>0,5 Р2>0,02 Р3<0,5 1,52±0,26 Р1>0,5 Р3>0,5 3,08±0,29 Р1<0,001 Р2<0,001 Р3<0,1
Сичуг 2,53±0,10 Р3<0,05 2,93±0,42 Р2<0,5 Р3<0,02 2,20±0,09 Р1<0,05 Р3>0,02 2,56±0,10 Р1<0,5 Р2>0,02 Р3>0,1 2,12±0,18 Р1<0,1 Р3<0,5 2,30±0,42 Р1>0,2 Р2>0,5 Р3>0,01
Сліпа кишка 2,29±0,31 Р3<0,05 2,32±0,18 Р2>0,5 Р3<0,2 2,02±0,07 Р1<0,5 Р3<0,1 2,20±0,21 Р1>0,5 Р2<0,5 Р3>0,5 2,09±0,33 Р1>0,5 Р3>0,5 2,52±0,27 Р1>0,5 Р2<0,5 Р3>0,001
Пряма кишка 2,70±0,12 Р3<0,01 2,28±0,51 Р2<0,5 Р3<0,5 1,95±0,11 Р1<0,01 Р3>0,2 2,35±0,15 Р1>0,5 Р2>0,05 Р3>0,5 2,20±0,09 Р1>0,01 Р3>0,5 2,95±0,18 Р1>0,2 Р2<0,02 Р3<0,001
Печінка 2,99±0,16 Р3<0,01 2,80±0,51 Р2>0,5 Р3<0,2 2,32±0,06 Р1<0,1 Р3<0,01 2,85±0,10 Р1<0,5 Р2>0,001 Р3<0,01 2,42±0,34 Р1>0,2 Р3<0,1 3,29±0,24 Р1>0,2 Р2<0,1 Р3>0,2
Примітка: Р1–вірогідність при порівнянні до відповідного відділу травного тракту плодів віком 6-6,5 міс.; Р2-вірогідність при порівнянні між компартментами клітини; Р3- вірогідність при порівнянні до слизової оболонки рубця відповідної вікової групи.
Таблиця 2 - Активність L-аланін: 2-оксоглутарат амінотрансферази у субклітинних фракціях слизової оболонки різних відділів травного тракту та печінки плода корови з урахуванням віку (мкМоль пірувату /хвЧмг.білка М±m; n=5)
Органи ШКТ Вік плода
6-6,5 міс. 7-7,5 міс. 8-8,5 міс.
Активність ALT у субклітинних фракціях: 1-цитозоль-мікросомальній; 2-мітохондріальній
1 2 1 2 1 2
M±m Р M±m Р M±m Р M±m Р M±m Р M±m Р
Рубець 0,85±0,03 - 1,89±0,05 Р3>0,2 1,01±0,07 Р1>0,05 2,18±0,09 Р1>0,02 Р2<0,001 1,72±0,27 Р1<0,01 3,37±0,21 Р1<0,001 Р2>0,001
Сітка 0,84±0,22 Р3>0,5 1,71±0,12 Р2<0,001 Р3>0,5 1,03±0,05 Р1<0,5 Р3>0,5 2,22±0,13 Р1>0,02 Р2<0,001 Р3>0,5 1,75±0,16 Р1<0,01 Р3>0,5 3,85±0,13 Р1<0,001 Р2<0,001 Р3<0,1
Книжка 0,84±0,13 Р3>0,5 1,93±0,33 Р2<0,01 Р3>0,5 0,99±0,24 Р1>0,5 Р3>0,5 2,21±0,07 Р1<0,5 Р2>0,001 Р3<0,5 1,52±0,22 Р1>0,02 Р3>0,5 3,92±0,19 Р1<0,001 Р2<0,001 Р3<0,1
Сичуг 1,54±0,10 Р3<0,001 2,35±0,15 Р2<0,05 Р3<0,05 1,34±0,12 Р1>0,2 Р3<0,05 2,35±0,09 Р1>0,5 Р2<0,001 Р3>0,2 1,96±0,13 Р1>0,02 Р3<0,5 2,04±0,34 Р1<0,5 Р2>0,5 Р3>0,01
Сліпа кишка 1,54±0,12 Р3<0,001 2,35±0,18 Р2<0,05 Р3<0,05 1,35±0,08 Р1<0,2 Р3>0,01 2,30±0,18 Р1>0,5 Р2>0,001 Р3>0,5 1,80±0,28 Р1<0,5 Р3>0,5 2,07±0,16 Р1<0,2 Р2<0,5 Р3>0,001
Пряма кишка 2,04±0,10 Р3<0,001 2,51±0,16 Р2<0,05 Р3<0,05 1,43±0,10 Р1<0,01 Р3<0,01 2,32±0,10 Р1<0,2 Р2<0,001 Р3>0,2 1,61±0,19 Р1>0,05 Р3>0,5 2,22±0,08 Р1>0,1 Р2<0,02 Р3<0,001
Печінка 2,85±0,26 Р3<0,001 2,66±0,36 Р2>0,5 Р3<0,05 2,13±0,13 Р1<0,05 Р3<0,001 2,75±0,04 Р1>0,5 Р2>0,001 Р3<0,01 2,37±0,23 Р1>0,2 Р3<0,1 3,02±0,24 Р1<0,5 Р2<0,1 Р3>0,2
Примітка: Р1–вірогідність при порівнянні до відповідного відділу травного тракту плодів віком 6-6,5 міс.; Р2-вірогідність при порівнянні між компартментами клітини; Р3- вірогідність при порівнянні до слизової оболонки рубця відповідної вікової групи.
Слизова оболонка рубця Печінка
Рис.8 Рівень активності AST у тканинах слизової рубця та печінки (з) та їх субклітинних фракціях (ц - цитозоль-мікросомальна, м – мітохондріальна) плода (1, 3, 5) і дорослої жуйної тварини (2, 4, 6)
Своєрідно виглядає ситуація в реакціях трансамінування, де використовується аміногрупа L-аланіну і a-кетоглутарат (рис.9). В цілому, у тканинах слизової оболонки рубця і печінки, а також у їх субклітинних фракціях, активність АLТ суттєво нижча, ніж АSТ. А за загальнотканинними рівнями і локалізацією ензиму в субструктурах клітини вони принципово своєрідні. Так, у слизовій рубця плода активність АLТ нижча в 5 раз (1,4±0,04 проти 7,2±0,7) і переважно за рахунок цитозоль-мікросомальної форми. Активність цього ензиму в дорослої тварини тут вища в 11 раз (10,0 ±0,9 проти 0,9±0,03), тоді як у мітохондріальній фракції вона активніша лише у 2,3 раза (4,3±0,6 проти 1,9±0,05).
У дорослої тварини, в порівнянні зі слизовою рубця, печінка відрізняється тим, що активність її АLТ нижча, і характеризується певною стабільністю, як на загальнотканинному, так і на субклітинному рівнях. У печінці плода активність ензиму тільки дещо нижча.
Слизова оболонка рубця Печінка
Рис.9 Рівень активності ALT у тканинах слизової рубця та печінки (з) та їх субклітинних фракціях (ц - цитозоль-мікросомальна, м – мітохондріальна) плода (1, 3, 5) і дорослої жуйної тварини (2, 4, 6)
Отже, активності AST i ALT знаходяться на різних рівнях у клітинних компартментах (цитозоль і мітохондрії) слизової оболонки травного тракту плода. Існують міжвікові відмінності у активностях AST i ALT. Активність AST значно нижча у тканинах плода у порівнянні з дорослою твариною. Проте у плода в субклітинних фракціях слизової оболонки рубця і тканині печінки порівняно досить високою виявляється активність ALT, яка є лише незначно нижчою, ніж у дорослої тварини. Це, може вказувати на посилене функціонування у плода глюкозо-аланінового циклу.
Особливості реакцій трансамінування у слизовій оболонці травного тракту плода за умов підвищеного аміакоутворення та застосування природного сорбенту
Надлишок аміаку, який викликається згодовуванням сечовини, позначається на обміні речовин як у дорослої тварини, так і у плода. Цікаво, що на активність AST у цитозоль-мікросомальній і мітохондріальній фракціях клітин слизової оболонки впродовж всього травного каналу плода додавання сечовини в раціон тільної корови й відповідні з цим зміни у рубцевій ферментації та інтермедіарному метаболізмі, не проявляють значного впливу. Однак, за цих умов активність ALT в обох субклітинних фракціях вірогідно (р<0,001) зростає у всіх відділах травного тракту і печінці плода. Вона наближається до рівня контролю при згодовуванні сечовини разом з цеолітивим порошком.
З метою пошуку додаткових аргументів для пояснення одержаних даних було проведено ряд серій досліджень in vitro. Результати їх свідчать (рис.10), що внесення різних рівнів надлишку азоту сечовини в інкубаційне середовище з гомогенатами слизової рубця плода не змінює
Рис.10 Активність амінотрансфераз (AST i ALT) у слизовій оболонці рубця плода корови за впливу різного рівня надлишку аміаку і сечовини in vitro (M±m)
активність AST i ALT. Проте, підвищення надлишку аміаку в інкубаті пропорційно знижує активність AST, тоді як активність ALT спочатку зростає, потім знижується до попереднього рівня і тільки при найвищій дозі (10 мкмоль) вірогідно спадає. Це, як і вищевказані дані, дає підстави вважати, що роль глюкозо-аланінового циклу у слизовій травного тракту плода є суттєвою у знешкоджені надлишків аміаку. Звідси детоксикація аміаку у травній системі плода за умов дефіциту енергії, (передовсім АТР, необхідної для функціонування глутамінсинтетази та циклу Кребса-Гензелайта) супроводжується активацією реакцій за участю аланіну і ALT.
Отже, дія надлишків аміаку в організмі тільної корови позначається і на метаболічних процесах у плода. Детоксикація аміаку у травній системі плода за умов дефіциту енергії проходить також шляхом посилення реакцій глюкозо-аланінового циклу. Додавання в раціон тільної корови природного сорбенту, що містить понад 80% клиноптилоліту, суттєво знижує інтенсивність біохімічних реакцій, пов'язаних з детоксикаційними процесами.
Рівень азотвмісних інтермедіатів та активності глутамінсинтетази у слизовій оболонці рубця плода і тільної корови за дії надлишку аміаку із застосуванням цеоліту
Дані таблиці 3 свідчать, що у тканині слизової оболонки рубця плода всі азотвмісні інтермедіати знаходяться на вірогідно нижчому рівні, ніж у дорослої тварини. У слизовій оболонці рубця дорослої жуйної тварини відмічаються набагато ширші коливання відхилень від середніх величин.
Онтогенетичні особливості виявляються в концентрації аміаку (яка у тканині дорослої тварини більш ніж в 2 рази вища, ніж у плода), а також відносно вмісту глутаміну та АТР.
Таблиця 3 - Концентрація азотвмісних інтермедіатів у слизовій оболонці рубця плода та дорослої жуйної тварини за умов надлишку аміаку у травній системі і застосування цеоліту (M±m; n=5)
Інтермедіати Групи тварин
Контрольна; К (РШ) Дослідна-1; D-1 (РШ+Сч) Дослідна-2; D-2 (РШ+Сч+Ц)
1 2 1 2 1 2
N-аміаку (мг/1кг сирої тканини) 18,8±0,3 42,5±3,7 Р1<0,001 31,2±3,3 Р2<0,001 67,1±9,2 Р1<0,001 Р2<0,001 24,4±4,2 Р2<0,05 49,1±4,1 Р1<0,001 Р2<0,05
Глутамін (мг амідного N/1кг сирої тканини) 8,3±0,8 34,8±4,1 Р1<0,001 16,9±4,2 Р2<0,001 56,8±6,0 Р1<0,001 Р2<0,001 13,6±0,9 Р1<0,1 42,1±3,8 Р1<0,001 Р1<0,05
АТР (мг Р на 1кг сирої тканини) 219,3±9,7 372,4±39,1 Р1<0,001 47,3±8,9 Р2<0,001 231,3±19,7 Р1<0,001 Р2<0,001 174,7±9,1 Р2<0,05 297,5±26,6 Р1<0,001 Р2<0,05
Примітка: 1-плід; 2-доросла жуйна тварина; Р1- вірогідність при порівнянні між плодом і дорослою твариною; Р2- вірогідність при порівнянні між контролем і дослідними варіантами; РШ-ріпаковий шрот; Сч-сечовина; Ц-цеоліт
При аналізі даних впливу екзогенного фактора (різних рівнів аміакоутворення, в рубці) слід відмітити, що дія надлишків NH3 відбивається майже рівнозначною силою на обидвох тканинах (материнській і плодовій). Хоча, висота рівня у материнській слизовій оболонці рубця у 2 рази вища, ніж у плодовій. Різниці між контролем і дослідним варіантом (групи К і D-1) є статистично вірогідними. При додатковому згодовуванні природного сорбенту (цеоліту) тваринам групи D-2 концентрація NH3 (порівняно з групою D-1) знижується в обох тканинах на 25-45%. Подібні зміни виявляються і в концентрації глутаміну.
Хоча характер онтогенетичних особливостей щодо концентрації АТР у досліджуваних тканинах залишається майже таким, як і за вмістом NH3 та глутаміну, однак дія надлишку аміаку суттєво змінює картину її зрушень. Так у групі D-1 як у плода, так і тільної корови суттєво знижуються концентрації АТР. Це зниження сягає майже 25-35% у плода і 35-55% у матері. Згодовування коровам цеоліту в значній мірі нівелює витрати АТР на процеси детоксикації надлишків NH3 і суттєво наближає до рівня контрольної групи.
Прослідковується чітка контрастність у рівнях активності глутамінсинтетази в слизовій плода та матері (табл.4). Ця різниця перевищує десятикратний рівень її збільшення на користь материнської тканини. Обидві тканини (плодова і материнська) за рівнем активності цього ензиму практично майже однаково реагують на підвищення азоту аміаку у травній системі “плід-тільна корова”. А саме, активність її зростає у 2 рази, але при застосуванні цеоліту суттєво знижується та наближається до рівня контролю.
Таблиця 4 - Активність глутамінсинтетази у слизовій оболонці рубця плода і тільної корови за дії надлишків аміаку у травній системі та застосування сорбенту (M±m; n=5)
Групи тварин Утворилось глутаміну в мкг амідного азоту за 1 год на 1 г тканини
Плоди Дорослі тварини
Контрольна-К (РШ) 8,34±0,81 95,6±7,47 Р1<0,001
D-1 (РШ+Сч) 16,6±2,83 Р2<0,001 185,1±12,33 Р1<0,001 Р2<0,001
D-2 (РШ+Сч+Ц) 12,7±3,62 Р2<0,1 134,4±8,68 Р1<0,001 Р2<0,1
Примітка: Р1- вірогідність при порівнянні між плодом і дорослою твариною; Р2- вірогідність при порівнянні між контролем і дослідними варіантами; РШ-ріпаковий шрот; Сч-сечовина; Ц-цеоліт
Отже, надлишки аміаку надходять і до слизової оболонки рубця плода, яка також приймає активну участь у засвоєнні азоту і знешкоджені токсиканту. Згодовування тільним коровам природного сорбенту із вмістом понад 80% діючої речовини (клиноптилоліту) створює умови для суттєвого заощадження витрат ендогенного пластичного й енергетичного матеріалу на процеси асиміляції і детоксикації.
ВИСНОВКИ
1. У дисертації наведене теоретичне узагальнення і нове вирішення наукової задачі щодо дослідження особливостей каталітичних реакцій глутаматдегідрогенази, амінотрансфераз і глутамінсинтетази слизової оболонки травного тракту плода корови в пренатальний період онтогенезу та встановлення впливу на ці показники згодовування тільним коровам екзогенних джерел у поєднанні із сорбентом.
2. Встановлено, що у тканинах слизової оболонки рубця плода і печінки корови функціонує тільки гомогенна глутаматдегідрогеназа, тоді як у слизовій оболонці рубця дорослої жуйної тварини для неї властива гетерогенність, бо окрім тканинної з'являється додаткова форма цього ензиму бактеріального походження, активність якої залежить від величини нашарувань адгерентних мікробів.
3. Для глутаматдегідрогеназ досліджуваних тканин характерна підвищена чутливість до збільшення в середовищі концентрації катіонів двовалентних металів (Zn2+), гуанозинтрифосфату (GTP), що виступають ролі від'ємних модуляторів, а також аденозинмонофосфату (AMP) і лейцину, які навпаки активують реакцію. Однак у таких же концентраціях вказані ефектори зовсім не впливають на активність мікробної GDH. Всі тканинні GDH високоспецифічні до коензиму NADH, а GDH бактеріального походження стає в 3 рази активнішою при використанні NADPH.
4. Активність глутаматдегідрогенази у мітохондріях клітин слизової оболонки всього травного тракту плода залишається низькою до його народження, в той час як у печінці вона висока і зростає з віком (6-6,5 міс. - 0,63±0,03; 7-7,5 міс. - 0,78±0,02 і 8-8,5 міс. 2,08±0,04 мкмоль NADH/хвЧмг білка). Натомість реакції, які каталізуються амінотрансферазами AST i ALT у клітинних компартментах (цитозоль-мікросомальній і мітохондріальній фракціях), знаходяться на високому рівні у слизовій оболонці травного тракту плода, вказуючи на їх домінуючу роль у метаболізмі глутамінової кислоти.
5. У слизовій оболонці передшлунків плода (рубець, сітка і книжка) процеси трансамінування проходять на однаковому рівні в межах кожного етапу розвитку і з віком посилюються, тоді як у слизовій оболонці інших відділів травного тракту (сичуг, сліпа і пряма кишки) – відносно стабілізуються вже з 6-місячного віку.
6. У цитозоль-мікросомальній та мітохондріальній фракціях клітин слизової оболонки рубця і печінки плода ензиматична активність AST значно нижча, ніж у дорослої жуйної тварини. У гепатоцитах плода порівняно з печінкою тільної корови, ця різниця досягає 20 разів (2,9±0,3 проти 57,6±2,9 мкмоль пірувату/хвЧмг білка). Однак різниця в активності ALT у слизових оболонках рубця значно нижча і складає лишень 5 раз (1,4±0,04 проти 7,2±0,7 мкмоль пірувату/хвЧмг білка), що вказує на посилене використання глутамату для утворення аланіну.
7. Виявлено, що у слизовій оболонці рубця плода концентрація азотвмісних інтермедіатів (N-NH3 та глутаміну) і АТР вірогідно нижча, ніж у корови. Дія надлишків аміаку в травній системі матері суттєво позначається не тільки на метаболічних процесах у слизовій оболонці рубця корови, але й плода. Тут адекватно зростає рівень N-NH3 і глутаміну при зниженні вмісту АТР, посилюється активність глутамінсинтетази та амінотрансфераз з переважанням ALT, вказуючи і на функціонування глюкозо-аланінового циклу.
8. Рекомендовано використання природного сорбенту із вмістом понад 80% діючої речовини (клиноптилоліту) у випадках застосування легкодеградуючих джерел азоту (ріпакові кормові добавки і сечовина) у раціонах, з метою суттєвого зниження напруги у метаболічних процесах, пов'язаних із нейтралізацією та засвоєнням N-NH3.
СПИСОК ПРАЦЬ, ОПУБЛІКОВАНИХ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ
1. Калачнюк Г.І., Фоменко І.С., Калачнюк Л.Г., Каваї Ш., Мароунек М., Савка О.Г. Особливості глутаматдегідрогенази слизової рубця плода та дорослої жуйної тварини // Укр.біохім.журн.-2001.-Т.73, №2.-С.-130-137. (Дисертант брав участь в організації і проведенні біохімічних досліджень, обробці та узагальненні одержаних результатів і підготовці роботи до друку)
2. Фоменко І.С., Возна О.Є., Калачнюк Л.Г.,Калачнюк Г.І. Реакції трансамінування у слизовій оболонці травного тракту плода за дії надлишку аміаку в рубці корови // Вісник Львівського університету. Серія біологічна.-2001.-вип.27.-С.145-152. (Дисертант брав участь в організації і проведенні біохімічних досліджень, обробці та узагальненні одержаних результатів і підготовці роботи до друку)
3. Фомэнко И.С., Калачнюк Г.И. Реакции внутриклеточного трансаминирования в слизистой желудочно-кишечного тракта 6-месячного плода коровы // Доклады Российской академии сельскохозяйственных наук.-2001.-№3.- С.45-47. (Дисертант брав участь в організації і проведенні біохімічних досліджень, обробці та узагальненні одержаних результатів і підготовці роботи до друку)
4. Фоменко І.С., Калачнюк Г.І. Рівень субклітинного трансамінування у слизовій рубця і печінці плода та дорослої жуйної тварини // Науковий вісник Львівської державної академії ветеринарної медицини.-1999.-Т.1, №4.-С.62-67. Дисертант брав участь в організації і проведенні біохімічних досліджень, обробці та узагальненні одержаних результатів і підготовці роботи до друку).
5. Фоменко І.С., Калачнюк Г.І. Активність азотфіксуючих ензимів у клітинних компартментах слизової шлунково-кишкового тракту 7-місячного плода корови // Науковий вісник Львівської державної академії ветеринарної медицини.-2000.-Т.2, ч.2, №2.-С.251-256. (Дисертант брав участь в організації і проведенні біохімічних досліджень, обробці та узагальненні одержаних результатів і підготовці роботи до друку)
6. Кравців Р.Й., Гладій М.В., Калачнюк Г.І., Шмідт Р.М., Мельник С.І,, Мельник Ю.Ф., Савка О.Г., Сухорська О.П., Слука А.-М.Я., Верес Є.М., Федець О.М., Возна О.Є., Фоменко І.С. та ін. Біотехнологічні основи використання модифікованих ріпакових кормових добавок у тваринництві.- Київ, 2000.- 64с. (Дисертант брав участь у виробничих випробуваннях, впровадженні рекомендацій та в підготовці до друку).
7. Фомэнко И.С., Калачнюк Г.И. Реакции аминирования и
