Національна Академія Наук України

Інститут фізіології ім. О.О. Богомольця

_____________________________________________________________________________________

Фісюнов Олександр Іванович

УДК 612.822:577.3

МОДУЛЮЮЧА ДІЯ ГІПЕРФОРИНУ НА КАЛЬЦІЄВІ КАНАЛИ Р-ТИПУ В НЕЙРОНАХ ПУРКIНЬЄ

03.00.02 - Біофізика

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

Київ – 2001

Дисертацією є рукопис

Робота виконана у відділі фізико-хімічної біології клітинних мембран Інституту фізіології ім. О.О. Богомольця НАН України.

Науковий керівник: академік НАН України, доктор біологічних наук,

Кришталь Олег Олександрович

завідувач відділу фізико-хімічної біології клітинних мембран Інституту фізіології ім. О. О. Богомольця НАН України, м. Київ.

Офіційні опоненти:

Доктор біологічних наук Веселовський Микола Сергійович, заступник директора Міжнародного центру молекулярної фізіологіі НАН України, м. Київ.

Кандидат біологічних наук Тарасенко Олександр Миколайович, старший науковий співробітник відділу загальної фізіології нервової системи Інституту фізіології ім. О.О. Богомольця НАН України, м. Київ.

Провідна установа: кафедра біофізики Національного університету імені Тараса Шевченка.

Захист відбудеться 22.05.2001 р. о 14 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.198.01 при Інституті фізіології ім. О.О. Богомольця НАН України за адресою: 01024, м. Київ-24, вул. Богомольця, 4.

З дисертацією можна ознайомитись в бібліотеці Інституту фізіології ім. О.О. Богомольця НАН України за адресою: 01024, м. Київ-24, вул. Богомольця, 4.

Автореферат розісланий 20.04.2001 р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради

доктор біологічних наук ______________ Сорокіна-Маріна З.О.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність проблеми. Потенціал-керовані кальцієві канали плазматичної мембрани збудливих клітин утворюють один з основних шляхів надходження іонів кальцію ззовнішнього середовища у клітину. Відкриваючись у відповідь на деполяризацію і пропускаючи вхідний струм, вони беруть участь у контролі трансмембранного потенціалу та в значній мірі визначають характеристики потенціалу дії, що генерується клітиною. У доповнення до сигнальної функції, кальцієві канали виконують важливу роль в сполученні електричної активності плазматичної мембрани із різними рецепторними механізмами та внутрішньоклітинними процесами. Добре відомо, що кальцій, який потрапляє у клітину із зовнішнього середовища через кальцієві канали, грає важливу роль у підтриманні та керуванні багатьох внутрішньоклітинних процесів. Іони кальція виконують регуляторну роль у таких процесах як виділення медіаторів у хімічних синапсах, м'язеве скорочення, клітинної диференціації та інше. Все це обумовлюється участю іонів кальцію у багатьох біохімічних реакціях, що визначають специфічну клітинну активність. Порушення регуляції, що відбувається завдяки надмірному входу кальцію у клітину, часто є причиною таких явищ, як ішемічне пошкодження та кальцієва смерть клітини. На рівні цілого організму, у багатьох випадках, це спричинює різні захворювання нервової та серцево-судинної системи. Зараз існує ряд антагоністів кальцієвих каналів, що здатні селективно блокувати той чи інший тип каналів, тим самим впливаючи на певні внутрішньоклітинні процеси. Застосування цих нейропротекторних засобів сприяє запобіганню перевантаженя клітини іонами кальцію. Проте, властивості відомих антагоністів кальцієвих каналів не завжди задовільняють вимогам сучасної медицини, у зв'язку з чим пошук та вивчення нових антагоністів, що мають певні властивості, є актуальною задачею.

Дотепер накопичено багато даних підтверджуючих, що препарат Hypericum perforatum (трава св. Джона або звіробій продірявлений) є ефективним протизапальним, антибактеріальним, антивірусним, протипухлинним та заспокійливим засобом. Крім того, цей препарат з успіхом застосовують при порушенні сну та при лікуванні депресії, зокрема, при лікуванні депресивних епізодів різної важкості (ICD-10, F32.0, F32.2). За даними численних досліджень, основним терапевтично і фармакологічно активним компонентом екстракту Hypericum perforatum є гіперфорин (похідне флороглуцинола). Проте, незважаючи на численні дослідження у вивченні антидепресивної дії гіперфорину, механізми, що спричиняють цю дію, досі не відомі. У багатьох роботах було показано, що гіперфорин є сильним, але неспецифічним інгібітором зворотнього захоплення серотоніну, дофаміну, норадреналіну, ГАМК та глутамату. В інших експериментах, проведених in vitro, було встановлено, що гіперфорин блокує відповіді, викликані серотоніном, брадікініном, речовиною Р, гістаміном та нікотином. Крім того, гіперфорин є модулятором хемо- та потенціал-керованих іонних каналів. У попередніх дослідженнях проведених в нашої лабораторії було показано, що гіперфорин модулює роботу як хемо-активованих каналів (рецепторів NMDA, AMPA, ГАМК та АТФ), так і потенціал-керованих Na+-, K+-, та Ca2+-каналів плазматичної мембрани центральних та периферичних нейронів. Серед перерахованих вище механізмів іонної проникності, одними з найбільш чутливими до дії гіперфорину виявилися потенціал-керовані кальцієві канали. Таким чином, вивчення впливу гіперфорину на фізіологічну активність потенціал-керованих кальцієвих каналів викликає безперечний науковий інтерес.

Зв'язок роботи з науковими роботами, планами, темами. Дослідження, що нами проводяться, є частиною програми гранту INTAS 97-0382 “Механізми, що лежать в основі клітинної загибелі, пов'язані з неврологічними хворобами: ідентифікація та характеристика патологічних форм нейронної пластичності”

Мета і задачі дослідження. Основною метою даної роботи було дослідження дії гіперфорину на електрофізіологічні характеристики кальцієвих каналів Р-типу плазматичної мембрани нейронів Пуркіньє, а також встановлення можливих механізмів, що беруть участь у модулюючій дії гіперфорину на цей струм. Для досягнення даної мети були поставлені такі задачі.

1. За допомогою методу "петч кламп" у режимі фіксації потенціалу від цілої клітини, визначити зміни в електрофізіологічних характеристиках потенціал-керованих кальцієвих каналів Р-типу, що були спричинені дією гіперфорину.

2. Використовуючи засоби фармакології та електрофізіології, встановити можливі механізми, модулюючої дії гіперфорину на кальцієві канали Р-типу.

Наукова новизна одержаних результатів. Вперше проведено дослідження дії гіперфорину на електрофізіологічні характеристики Р-струму. Встановлено, що зовнішньоклітинна аплікація гіперфорину в концентраціях від 0,04 мкМ до 0,8 мкМ спричиняє:

а) зсув максимуму вольт-амперної характеристики (ВАХ) Р-струму від -2 до -10 мВ;

б) більш ніж 10-кратне сповільнення кінетики активації Р-струму;

в) зменшення амплітуди P-струму.

У роботі вперше показано, що механізми, які беруть участь у модуляції гіперфорином Р-струму, відрізняються від раніше відомих механізмів модуляції кальцієвих каналів за участю G-білків. Встановлено наявність, принаймні, двох відмінних механізмів, що беруть участь у регуляції Р-типу кальцієвих каналів під дією гіперфорину: кальцій-незалежний механізм, який спричиняє зсув максимуму ВАХ та сповільнення у кінетиці активації Р-струму, і кальцій-залежний механізм, що зумовлює блокування гіперфорином Р-струму. Вперше, також, показано, що кальмідазол – широковідомий блокатор Ca2+-зв'язуючого білку кальмодулину повністю ліквідує викликані гіперфорином зсув максимуму ВАХ та сповільнення у кінетиці активації Р-струму. Усунення кальмідазолом модулюючої дії гіпефорину на Р-струм вказує на можливу участь кальмодуліну в регуляції Р-типу кальцієвих каналів, проте не виключно, що кальмідазол конкурує з гіперфорином за пряму взаємодію з Р-каналом, або з оточуючими канал молекулами мембрани.

Теоретичне і практичне значення одержаних результатів. Отримані результати мають, передусім, фундаментальне значення, оскільки вперше встановлено, що гіперфорин спричиняє модулюючу дію потенціал-керованих кальцієвих каналів Р-типу. Ці дані є важливими в плані формування більш повного уявлення про різні механізми, що беруть участь у регуляції цих каналів, а також в плані пошуку нових шляхів направленого фармакологічного впливу на різні типи кальцієвих каналів. Вивчення модулюючої дії гіперфорину на Р-тип кальцієвих каналів дозволяє суттєво розширити уявлення про механізми антидепресивної дії гіперфорину.

Безпосередньо практичне значення мають дані про модулюючу дію гіперфорину на Р-тип кальцієвих каналів у концентраціях від 0,1 до 0,4 мкМ, яка спостерігається в спинномозковій рідині після застосування гіперфорину в терапевтичних дозах для лікування депресії. Характерна модуляція гіперфорином кальцієвих каналів може стати зручним фармакологічним інструментом для специфічного регулювання мозкової діяльності.

Особистий внесок здобувача. Усі електрофізіологічні експерименти, а також обробка експериментальних даних були виконані особисто автором. Здобувач брав активну участь в обговоренні отриманих результатів та формулюванні висновків.

Приготування зрізів мозочку, використаних у роботі, виконувалося старшим науковим співробітником Інституту фізіології ім. О.О. Богомольца НАН України Лозовою Наталією Олексіївною.

Виготовлення екстракту та його компонентів, використаних у роботі, виконувалося доктором С. Чаттерджі та доктором М. Ньольднером.

Апробація результатів дисертації. Основні положення роботи були викладені та обговорені на: 8-ом щорічному з'їзді Ізраїльського нейронаукового товариства (1999, Ейлат, Ізраїль); Ізраїле-Українському з'їзді “Genes & Molecules of Excitability" (1999, Ейлат, Ізраїль), Міжнародному симпозіумі “Pharmacology of St. John's Wort (Hypericum perforatum L.) and its constituents" (2000, Франкфурт, Німеччина), 30-ому щорічному з'їзді нейронаукового товариства (2000, Новий Орлеан, США); семінарах Інституту фізіології ім. О.О. Богомольця (2000, 2001 Київ, Україна).

Обсяг та структура дисертації. Дисертація складається з вступу, огляду літератури, опису методів досліджень та експериментальної частини, обговорення результатів, 6 висновків та списку літератури з 247 джерел. Роботу викладено на 120 сторінках друкованого тексту та ілюстровано 25 рисунками.

МЕТОДИКА ДОСЛІДЖЕНЬ

Дослідження проводилися на свіжеізольованих нейронах Пуркіньє мозочка щура лінії Вістар ("WAG-Gsto" Росія) 12-14 денного віку. Після декапітації тварини, мозочек щура швидко переносився у розчин наступного складу (в мМ): NaCl 120, KCl 5, NaHCO3 26, глюкоза 22, MgCl2 1, рН 7,4 (розчин А). У цьому розчині тонким лезом під мікроскопічним контролем готувалися поперечні зрізи товщиною 300-400 мкм. Після цього, зрізи інкубувалися протягом 30 хвилин у розчині, що містить (в мМ): NaCl 120, KCl 5, NaHCO3 26, глюкоза 30, сахароза 40, MgCl2 1, KH2PO4 1,4, Na2HPO4 8 (розчин Б) та насичений карбогеном (95% О2 та 5% СО2), рН 7,4. Ферментативна обробка проводилася проназою E (1 мг/мл) у розчині Б при температурі +33оC протягом 40 хвилин при постійному перепусканні крізь розчин карбогену. Потім проводили тривале відмивання зрізів від ферментів у розчині Б протягом 20 хвилин. Цей метод дозволяв використовувати зрізи для отримання ізольованих нейронів протягом 6-8 годин.

Поодинокі клітини ізолювалися за допомогою послідовного пропускання зрізів (що знаходилися у розчині А, у якому NaHCO3 замінювали на еквімолярні концентрації HEPES-NaOH з доданням CaCl2 у концентрації 2 мМ, pH 7,4) через декілька скляних мікропіпеток (діаметр отвору від 0,1 до 0,5 мм). Описана послідовність обробки зрізів мозочка дозволяла отримувати ізольовані нейрони Пуркіньє, які можна було ідентифікувати візуально за їх характерною формою.

Для реєстрації іонних струмів крізь плазматичну мембрану досліджуваних нейронів було застосовано метод внутрішньоклітинної перфузії у модифікації, що дозволяє використання скляних мікропіпеток. Діаметр отвору в кінчику піпетки становив 2-3 мкм, а їх опір був не більший за 2-5 МОм. Ці піпетки заповнювалися розчином, що містить (мM) Тріс-РО4 70, ТЕА-Cl 40, MgCl2 5, Тріс-Сl 20, ЕГТА 5, АТФ 5, ГТФ 0,5 (рН=7,3). Зовнішньоклітинний розчин для реєстрації потенціал-керованих Na+-струмів містив (мM): NаСl 120, KCl 5, СаСl2 2, МgСl2 1, HEPES-NaOH 26, глюкоза 22 (рН=7,4). При реєстрації іонних струмів крізь потенціал-керовані кальцієві канали були використані розчини, що містять як іони Ba2+, так і іони Ca2+ (в мM): BaCl2 2 (CaCl2 2), MgCl2 2, холін-хлорид 100, ТЕА-Cl 40, Тріс-Cl 20, рН=7,4. Експерименти проводилися при кімнатній температурі 20-23оС.

Зміна зовнішньоклітинних розчинів, що містили в собі фармакологічно активні речовини, проводилася з використанням техніки швидкої аплікації, за методом “фіксації концентрації” та приладу “стрибаючий столик” (“Фарма робот”, Україна). Струми фільтрували з частотою зрізу 3 кГц, відцифровували з інтервалом 50, 200, 1000 мкс та запам'ятовували на диску комп'ютера за допомогою програми “Стрибаючий столик”.

Аналіз струмів і даних проводився з використанням аналітичних програмних продуктів комплекта “Фарма робот” (Україна) та Microcal Origin v. 5.0 (Microcal Software, Inc., Northampton, MA, USA). Амплітуда кальцієвого струму вираховувалась від базової лінії до його пікового значення. Положення максимуму кривої ВАХ кальцієвого струму на осі абсцис визначалося за даними методу інтерполяції поліномами експериментальних значень ВАХ. Апроксимація кінетики активації кальцієвих струмів здійснювалася експонентними функціями.

Крім особливо обумовлених випадків, всі експериментальні дані представлені у вигляді середніх арифметичних значень із стандартною похибкою вимірювань.

РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ

Реєстрація вхідного кальцієвого струму Р-типу крізь плазматичну мембрану морфологічно ідентифікованих нейронів Пуркіньє мозочка щура проводилася методом "петч кламп" в конфігурації "ціла клітина" при мембранному потенціалі, що підтримувався на рівні -70 мВ. Для усунення ефектів пов'язаних з впливом іонів Ca2+ на активність потенціал-керованих кальцієвих каналів, в усіх наших експериментах при реєстрації Р-струму, крім дослідів з ЕГТА, були використані іони Ba2+.

Рис.1 ВАХ Ba2+ струму крізь кальцієві канали Р-типу в нейронах Пуркіньє мозочка щурів. (А) Записи Ba2+ струмів крізь кальцієві канали Р-типу при мембранному потенціалі, що підтримувався на рівні -70 мВ. Записи Р-струмів були зроблені з інтервалом в 5 с при зміщенні мембранного потенціалу до рівня, вказаного біля кожного запису. (Б) ВАХ, побудована по записах Р-струмів, наведених на (А).

На рис.1 наведені оригінальні записи Р-струму при різних тестуючих мембранних потенціалах та його вольт-амперна характеристика (ВАХ). Початок активації Р-струму спостерігався при зміщенні деполяризуючого мембранного потенціалу до -55, -50 мВ. Максимальне значення амлітуди Р-струму, варіювало від 800 до 1500 пА, а відповідне йому значення мембранного потенціалу спостерігалося при -35 - -25 мВ. Кінетика активації Р-струму швидка (порядку мілісекунди), у той час як кінетика інактиваціі цього струму значно повільніша (порядку сотень мілісекунд). Така значна різниця у постійних часу активації та інактиваціі Р-струму дозволяє вивчати ці процеси незалежно один від одного. У наших експериментах кінетика активації Р-струму описувалася однією експонентною функцією з постійною часу t=0,77±0,25 мс (n=5) (для максимального значення ВАХ).

Присутність у зовнішньоклітинному розчині токсину w-Aga-IVA (селективного блокатору Р-типу кальцієвих каналів) у концентрації 0,1 мкМ призводила, за декілька хвилин, до повного (97±5%, n=5) блокування всього зареєстрованого струму.

Рис.2 Потенціал-залежне блокування токсином w-Aga-IVA Р-типу кальцієвих каналів у нейронах Пуркіньє мозочка щурів. (А) Тимчасовий хід блокуючої дії 0,1 мкМ w-Aga-IVA на Р-струм. Відновлення амплітуди Р-струму при усуненні токсину із зовнішньоклітинного розчину тільки в умовах парної стимуляції. (Б) Записи Р-струмів для вказаних номерів (див. (А)).

Як показано на рис.2, блокуюча дія цього токсину була практично необоротна при зміщенні деполяризуючого мембранного потенціалу в діапазоні від -55 до -25 мВ. Проте, ця дія легко оборотна в умовах коли перед основним деполяризуючим імпульсом подавався додатковий деполяризуючий імпульс до +100 мВ та тривалістю 100 мілісекунд. Таким чином, дані цих експериментів свідчать про те, що весь зареєстрований нами струм, є виключно барієвий струм крізь кальцієві канали Р-типу.

Зовнішньоклітинна аплікація гіперфорину в концентраціях від 0,04 мкМ до 0,8 мкМ спричиняла зсув максимуму ВАХ P-струму у бік негативних мембранних потенціалів, сповільнення кінетики активації та зменшення амплітуду цього струму. У проведених нами експериментах абсолютна величина зсуву максимуму ВАХ Р-струму складала від -2 до -10 мВ (n=31) при концентраціях гіперфорину від 0,04 мкМ до 0,8 мкМ. Середнє значення зсуву максимуму ВАХ при зовнішньоклітинній аплікації 0,4 мкМ гіперфорину становило -4±1 мВ (n=5), а при 0,8 мкМ гіперфорину подвоювалося до -8±2 мВ (n=9).

Рис.3 Модуляція гіперфорином Ba2+ струму крізь кальцієві канали Р-типу в нейронах Пуркіньє мозочку щурів. (А) Записи Ba2+ струмів крізь кальцієві канали Р-типу при мембранному потенціалі, що підтримувався на рівні -70 мВ: у контролі (l), відразу після аплікації 0,8 мкМ гіперфорину (o), через 3 хвилини після інкубації в 0,8 мкМ гіперфорину (n), відмивання від гіперфорину (m). Записи струмів були зроблені з інтервалом у 5 с при зміщенні мембранного потенціалу до рівня, вказаного біля кожного запису. (Б) Праворуч: ВАХ побудовані по записах Р-струмів, наведених вище (див. (А)). Ліворуч: ті самі ВАХ (див. (Б)), але нормовані. (В) Нормовані та накладені одне на одного записи Р-струмів у контролі (l) та після 3 хвилин інкубації в 0,8 мкМ гіперфорину (n). Значення тестуючого мембранного потенціалу вказані над відповідними записами струмів.

Як показано на рис.3 максимальне значення амплітуди ВАХ Р-струму, зареєстроване через 1 хвилину після початку зовнішньоклітинної аплікації гіперфорину, трохи більше контрольного, а час досягнення пікового значення амплітуди струму значно збільшився. Таке помітне сповільнення Р-струму, було спричинено появою у його кінетиці активації додаткової повільної компоненти. Аналіз кривої кінетики активації Р-струму, під дією гіперфорину, експонентними функціями (для максимального значення ВАХ) встановив наявність двох експонент з постійними часу: швидкої t1=0,83±0,21 мс (n=5) (аналогічної у контролі t=0,77±0,25 мс (n=5)) та повільної t2=15,7±4,7 (n=5). Для порівняння кінетики активації Р-струму на рис.3В наведені нормовані та накладені одне на одну записи струмів в контролі та через 3 хвилини після аплікації гіперфорину при різних тестуючих мембранних потенціалах. Як можна бачити на рис.3В відмінності кінетики активації Р-струму в контролі та під гіперфорином поступово зменшуються при послідовному просуванні у бік позитивних мембраних потенціалів, що вказує на потенціал-залежну дію гіперфорину на кінетику активації цього струму.

Зсув максимуму ВАХ та сповільнення кінетики активації Р-струму, під дією гіперфорину, розвивалися швидко (менш ніж за 10 секунд) та були повністю оборотні при усуненні гіперфорину із зовнішньоклітиного розчину. Зменшення амплітуди Р-струму відбувалося набагато повільніше (за декілька хвилин) та було практично необоротно пртягом 20-30 хвилин (рис.3).

Для з'ясування механізму зсуву максимуму ВАХ Р-струму під дією гіперфорину були проведені експерименти з використанням токсину w-Aga-IVA.

Рис.4 Повне блокування струму токсином w-Aga-IVA на фоні дії гіперфорину. (А) Записи Ba2+ струмів при мембранному потенціалі, що підтримувався на рівні -70 мВ: у контролі (l), відразу після аплікації 0,8 мкМ гіперфорину (o), через 7 хвилин після інкубації в 0,8 мкМ гіперфорину (n), відмивання (m). Записи струмів були зроблені з інтервалом в 5 с при зміщенні мембранного потенціалу до рівня вказаного біля кожного запису. (Б) ВАХ побудовані по записах струмів, наведених на (А).

На рис.4 показано експеримент, у якому після того як зовнішньоклітинна аплікація 0,8 мкМ гіперфорину призводила до зсуву максимуму ВАХ та сповільнення у кінетиці активації Р-струму, подальша інкубація у 0,1 мкМ w-Aga-IVA на фоні дії 0,8 мкМ гіперфорину спричиняла повне (98±3%, n=5) блокування зареєстрованого струму. У іншій серії експериментів, коли весь Р-струм, було повністю заблоковано 0,1 мкМ токсина w-Aga-IVA, зовнішньоклітинна аплікація гіперфорину в концентрації 0,8 мкМ на фоні дії цього токсину, так само як і в попередніх експериментах не спричиняла появи додаткового компонента струму. Таким чином, зсув максимуму ВАХ та сповільнення в кінетиці активації Р-струму відбуваються тільки за рахунок модуляції гіперфорином кальцієвих каналів Р-типу.

Для з'ясування місцезнаходження передбачуваного рецептора гіперфорину, що бере участь в модуляції Р-типу кальцієвих каналів, були проведені експерименти з використанням внутрішньоклітинного розчину, що містив гіперфорин. У цих експериментах було показано, що присутність у внутрішньоклітинному розчині гіперфорину в концентрації 50 мкМ, протягом 15 хвилин, практично не спричиняла зменшення амплітуди Р-струму, тоді як його присутність у зовнішньоклітинному розчині у концентрації 1 мкМ було досить для майже повного (91±10%, n=11) блокування амплітуди Р-струму за той саме час.

Рис.5 Модуляція гіперфорином Р-струму в умовах внутрішньоклітинної перфузії нейрона Пуркіньє розчином, що містить 50 мкМ гіперфорину. (А) Записи Р-струмів при мембранному потенціалі, що підтримувався на рівні -70 мВ: у контролі (l), відразу після аплікації 0,8 мкМ гіперфорину (o), через 3 хвилини після інкубації в 0,8 мкМ гіперфорину (n), відмивання від гіперфорину (m). Записи струмів були зроблені з інтервалом в 5 с при зміщенні мембранного потенціалу до рівня вказаного біля кожного запису. (Б) ВАХ побудовані по записах Р-струмів, наведених на (А).

На рис.5 показано експеримент, у якому через 15 хвилин після додавання у внутрішньоклітинний розчин "пэтч піпетки" гіперфорину в концентрації 50 мкМ, подальша зовнішньоклітинна аплікація 0,8 мкМ гіперфорину, як і раніше, викликала зсув максимуму ВАХ на -6±2 мВ (n=5), сповільнювала кінетику активації та зменшувала амплітуду Р-струму. Отже, взаємодія гіперфорину з центром зв'язування відбувається із зовнішнього боку клітинної мембрани.

На відміну від дії більшості ГТФ-аналогів або нейромедіаторів на кальцієві канали N- та Р-типу, в наших експериментах модулююча дія гіперфорину на кальцієві канали Р-типу зберігалась в умовах парної стимуляції клітини. У цих експериментах перед основним тестуючим зміщенням мембранного потенціалу подавався додатковий деполяризуючий імпульс тривалістю 100 мс до значень мембранного потенціалу +100 мВ.

Рис.6 Модулююча дія гіперфорину на Р-струм зберігається в умовах парної стимуляції клітини. (А) Записи Р-струмів при мембранному потенціалі, що підтримувався на рівні -70 мВ: у контролі в умовах звичайної (l) та парної (m) стимуляції клітини; через 3 хвилини після інкубації в 0,4 мкМ гіперфорину в умовах звичайної (n) та парної (o) стимуляції клітини. (Б) ВАХ побудовані по записах Р-струмів, наведених на (А).

Проте, як можна бачити на рис.6, зовнішньоклітинна аплікація 0,4 мкМ гіперфорину, як і раніше, викликала зсув максимуму ВАХ, сповільнювала кінетику активації та зменшувала амплітуду Р-струму. Модулююча дія 0,8 мкМ гіперфорину на Р-струм зберігалася і в тому випадку, коли була відсутня затримка між двома імпульсами. У таких експериментах, як і раніше, спостерігався зсув максимуму ВАХ на -6±3 мВ (n=7) (порівняно з контролем -8±2 мВ (n=9)), сповільнення кінетики активації та зменшення амплітуди Р-струму.

Добре відомо, що модуляція кальцієвих каналів Р-типу в нейронах Пуркіньє за участю G-білків спричиняє потенціал-залежну зміну амплітуди та кінетики активації Р-струму. У проведених нами експериментах внутрішньоклітинна перфузія нейронів Пуркіньє розчином, що містить ГТФ-g-S (аналог ГТФ, що не гідролізується) у концентрації 1 мМ, призводила до сповільнення кінетики активації та до зменшення амплітуди Р-струму. Як можна бачити на рис.7А, всі ці ефекти, могли бути повністю усунені за допомогою деполяризуючого імпульсу тривалістю 50 мс до значень мембранного потенціалу +100 мВ, який подавався перед основним зміщенням мембранного потенціалу (n=7). Таким чином, дані цих експериментів вказують на присутність у нашій експериментальній системі функціонально-активних G-білків, здатних модулювати роботу Р-каналів. Проте, подальша зовнішньоклітинна аплікація гіперфорину в концентрації 0,8 мкМ, викликала зсув максимуму ВАХ на -7±3 мВ (n=7) (порівняно з контролем -8±2 мВ (n=9)), сповільнювала кінетику активації та зменшувала амплітуду Р-струму (рис.7Б).

Таким чином, активація G-білків, що була спричинена дією ГТФ-g-S, не впливає на модулюючу дію гіперфорину на кальцієві канали Р-типу.

Рис.7 (А) Записи Р-струмів при різних протоколах стимуляції клітини, перфузованої протягом 25 хвилин внутрішньоклітинним розчином, що містить 1 мМ ГТФ-g-S. Сповільнення кінетики активації Р-струму ліквідується зміщенням мембранного потенціалу до +100 мВ. (Б) Модуляція гіперфорином Р-струму зберігається в умовах внутрішньоклітинної перфузії нейрона Пуркіньє розчином, що містить ГТФ-g-S у концентрації 1 мМ. (В) Модуляція гіперфорином Р-струму зберігається в умовах внутрішньоклітинної перфузії нейрона Пуркіньє розчином, що містить ГДФ-b-S у концентрації 1 мМ. Ліворуч: записи Р-струмів при мембранному потенціалі, що підтримувався на рівні -70 мВ: у контролі (l), відразу після аплікації 0,8 мкМ гіперфорину (o), через 3 хвилини після інкубації в 0,8 мкМ гіперфорину (n), відмивання від гіперфорину (m). Записи струмів були зроблені з інтервалом в 5 с при зміщенні мембранного потенціалу до рівня, вказаного біля кожного запису. Праворуч: ВАХ побудовані по записах Р-струмів, наведених ліворуч.

Присутність у внутрішньоклітинному розчині ГДФ-b-S (необоротнього блокатору G-білків), так само не впливала на модуляцію гіперфорином Р-струму. На рис.7В подано експеримент, у якому через 15 хвилин після початку перфузії клітини внутрішньоклітинним розчином, що містить ГДФ-b-S (аналог ГДФ, що не гідролізується) у концентрації 1-2 мМ, зовнішньоклітинна аплікація 0,8 мкM гіперфорину, як і раніше, викликала зсув максимуму ВАХ на -8±2 мВ (n=6) (порівняно з контролем -8±2 мВ (n=9)), сповільнювала кінетику активації та зменшувала амплітуду Р-струму. Таким чином, усі дані цих експериментів свідчать про те, що модуляція гіперфорином кальцієвих каналів Р-типу відбувається, без участі G-білків.

Як вже раніше було відзначено, в усіх наших експериментах при реєстрації Р-струму, замість іонів Ca2+ були використані іони Ba2+. Однак, така заміна не є еквівалентною оскільки, іони Ca2+ здатні як безпосередньо діяти на мембранні канали, так і можуть активізувати різні внутрішньоклітинні кальцій-залежні ферменти та білки. Отже, для подальшого вивчення механізмів модуляції гіперфорином кальцієвих каналів Р-типу в якості носіїв струму необхідно використовувати безпосередньо іони Ca2+.

Як показано на рис.8А, заміна у зовнішньоклітинному розчині іонів Ba2+ на іони Ca2+ не впливало на спричинений дією 0,8 мкМ гіперфорину зсув максимуму ВАХ -8±1 мВ (n=5) (порівняно з контролем -8±2 мВ (n=9)) та сповільнення кінетики активації кальцієвого Р-струму. Проте, в цих експериментах було встановлено, що блокування гіперфорином амплітуди цього струму, сильніше за блокування амплітуди барієвого Р-струму. Частка заблокованих Р-каналів від їх загальної кількості в контролі при 2 мМ зовнішньоклітинної концентрації іонів Ca2+ складала 44±15% (n=5), тоді як при 2 мМ зовнішньоклітинної концентрації іонів Ba2+ вона становила 28±10% (n=9).

Зменшення концентрації ЕГТА у внутрішньоклітинному розчині від 5 мМ до 0,5 мМ спричиняла подальше посилення блокуючої дії гіперфорину на Р-струм. Як показано на рис.8Б, зовнішньоклітинна аплікація гіперфорину в концентрації 0,8 мкМ, при наявності у внутрішньоклітинному розчині 0,5 мМ ЕГТА, як і раніше, викликала зсув максимуму ВАХ на -8±2 мВ (n=5) (порівняно з контролем -8±2 мВ, n=9) та сповільнення кінетики активації Р-типу кальцієвого струму. Однак, блокуюча дія гіперфорином амплітуди Р-струму, була ще більш сильною. У цих експериментах частка заблокованих Р-каналів від їх загальної кількості складала 71±7% (n=5) (порівняно з контролем 28±10%, n=9). Крім того, як можна бачити на рис.8Б, підвищення внутрішньоклітинного рівня іонів Ca2+ призводило до часткового відновлення амплітуди Р-струму при усунені гіперфорину із зовнішньоклітинного розчину. Таким чином, внутрішньоклітинна концентрація іонів Ca2+ відіграє значну роль у блокуванні гіперфорином кальцієвого струму Р-типу, але ніяк не впливає на зсув максимуму ВАХ та сповільнення кінетики активації цього струму.

Рис.8 Модуляція гіперфорином кальцієвого Р-струму при різних концентраціях ЕГТА у внутрішньоклітинному розчині. (А) Модуляція гіперфорином кальцієвого Р-струму при присутністі у внутрішньоклітинному розчині 5 мМ ЕГТА. (Б) Модуляція гіперфорином кальцієвого Р-струму при присутністі у внутрішньоклітинному розчині 0,5 мМ ЕГТА. Ліворуч: Записи Р-струмів при мембранному потенціалі, що підтримувався на рівні -70 мВ: у контролі (l), відразу після аплікації 0,8 мкМ гіперфорину (o), через 3 хвилини після інкубації в 0,8 мкМ гіперфорину (n), відмивання від гіперфорину (m). Записи струмів були зроблені з інтервалом в 5 с при зміщенні мембранного потенціалу до рівня, вказаного біля кожного запису. Праворуч: ВАХ, побудовані по записах Р-струмів, наведених ліворуч.

Присутність кальмідазолу в зовнішньоклітинному розчині призводила до повної ліквідації кальцій-незалежного зсуву максимуму ВАХ та сповільнення кінетики активації Р-струму, що були спричинені дією гіперфорину. У попередніх наших експериментах було встановлено, що зовнішньоклітинна аплікація кальмідазолу в коцентаціях понад 1 мкМ призводила до повного блокування амплітуди Р-струму за декілька хвилин. Як показано на рис.9, присутність цієї речовини у зовнішньоклітинному розчині у концентрації 0,5 мкМ призводила до часткового блокування амплітуди Р-струму, але не викликала ніяких змін його кінетики активації, і так само не приводила до зсуву максимуму його ВАХ. Подальша зовнішньоклітинна аплікація 0,8 мкМ гіперфорину на фоні дії 0,5 мкМ кальмідазолу вже не викликала змін кінетики активації Р-струму та не призводила до зсуву максимуму його ВАХ 0±1 мВ (n=6).

Рис.9 Кальмідазол ліквідує модулюючу дію гіперфорину на Р-струм. (А) Записи Р-струмів при мембранному потенціалі, що підтримувався на рівні –70 мВ: у контролі (l), через 15 хвилин після інкубації в 0,5 мкМ кальмідазолу (t), ще через 3 хвилини після інкубації в 0,8 мкМ гіперфорину на фоні дії 0,5 мкМ кальмідазолу (n), відмивання від гіперфорину (m). Записи струмів були зроблені з інтервалом в 5 с при зміщенні мембранного потенціалу до рівня, вказаного біля кожного запису. (Б) ВАХ побудовані по записах Р-струмів, наведених на (А). (В) Нормовані та накладені одне на одного записи Р-струмів: (верхній ряд) у контролі (l) та після 15 хвилин інкубації в 0,5 мкМ кальмідазолу (t); (нижній ряд) через 15 хвилин після інкубації в 0,5 мкМ кальмідазолу (t) та ще через 3 хвилини після інкубації в 0,8 мкМ гіперфорину на фоні дії 0,5 мкМ кальмідазолу (n). Значення тестуючого мембранного потенціалу вказані над відповідними записами струмів.

ОБГОВОРЕННЯ РЕЗУЛЬТАТІВ

Потенціал-керовані кальцієві канали є основним регулятором нейрональної активності. У більшості центральних нервових синапсів ссавців активація потенціал-керованих кальцієвих каналів N- та Р/Q-типу спричиняє виділення нейромедіатору, а отже, навіть незначні зміни у потенціал-залежних властивостях цих каналів можуть сильно впливати на ефективність синаптичної передачі у людському мозку шляхом регулювання концентрації серотоніну, норадреналіну, глутамату, ГАМК та інших нейротрансмітерів, що залучені до патогенезу депресії. Незважаючи на дійсно вражаючу роль кальцієвих каналів N- та Р-типу в контролі синаптичної передачі, досі ще не знайдено селективних агентів, здатних модулювати роботу цих каналів. У данній роботі вперше показано, що гіперфорин у концентраціях від 0,1 до 0,4 мкМ (які відповідають таким у спиномозковій рідині після застосування гіперфорину в терапевтичних дозах для лікування депресії) модулює роботу кальцієвих каналів Р-типу.

У проведених нами експериментах було показано, що зовнішньоклітинна аплікація гіперфорину в концентраціях від 0,04 мкМ до 0,8 мкМ спричиняла зсув максимуму ВАХ Р-струму від -2 до -10 мВ у бік негативних потенціалів. Величина цього зсуву залежала від зовнішньоклітинної концентрації гіперфорину і складала -4±1 мВ (n=5) при 0,4 мкМ гіперфорину та -8±2 мВ (n=9) при 0,8 мкМ гіперфорину. Крім того, зовнішньоклітинна аплікація гіперфорину в цих концентраціях також спричиняла суттєве сповільнення кінетики активації Р-струму. Ці зміни були зумовлені появою додаткової повільної компоненти з постійною часу t2=15,7±4,7 мс (n=5). Внесок цієї компоненти до кінетики активації Р-струму поступово зменшувався при послідовному просуванні у бік позитивних мембранних потенціалів. Таким чином, дія гіперфорину на кінетику активації цього струму є потенціал-залежна. Зсув максимуму ВАХ та сповільнення кінетики активації Р-струму, що спричинені дією гіперфорину, розвивались швидко (менш ніж за 10 с) та зберігались тільки за умови постійної присутності гіперфорину в зовнішньоклітинному розчині. Усунення гіперфорину з зовнішньоклітинного розчину призводило до швидкого та повного відновлення кінетики активації Р-струму та до ліквідування зсуву максимуму ВАХ. Крім усіх вищезгаданих ефектів, позаклітинна аплікація гіперфорину в тих самих концентраціях спричиняла повільне (декілька хвилин) потенціал-незалежне блокування амплітуди Р-струму. Така блокуюча дія гіперфорином Р-струму, практично необоротна протягом 20-30 хвилин.

В експериментах з використанням токсину w-Aga-IVA було показано, що він у концентрації 0,1 мкМ на фоні дії 0,8 мкМ гіперфорину повністю (98±3%, n=5) блокує струм, що реєструється. В іншій серії експериментів, коли весь Р-струм було повністю заблоковано 0,1 мкМ w-Aga-IVA, зовнішньоклітинна аплікація гіперфорину в концентрації 0,8 мкМ не спричиняла появи додаткової компоненти струму. Таким чином, зсув максимуму ВАХ та сповільнення кінетики активації Р-струму під дією гіперфорину відбувались внаслідок модуляції гіперфорином кальцієвих каналів Р-типу, а не за рахунок появи додаткової компоненти струму крізь канали інших типів.

У серії експериментів з використанням внутрішньоклітинної перфузії нейронів Пуркіньє розчином, який містить гіперфорин, було показано, що присутність гіперфорину у внутрішньоклітинному розчині у концентрації 50 мкМ практично не призводила до змін електрофізіологічних характеристик Р-струму. Крім того, у цих експериментах було показано, що присутність 50 мкМ гіперфорину у внутрішньоклітинному розчині не впливала на зсув максимуму ВАХ, сповільнення кінетики активації та зменшення амплітуди Р-струму, які були спричинені зовнішньоклітинною аплікацією 0,8 мкМ гіперфорину. Таким чином, на основі цих даних можна зробити висновок, що передбачуваний рецептор гіперфорину розташований із зовнішнього боку клітинної мембрани.

Для з'ясування механізмів модуляції гіпефорином Р-струму були проведені експерименти, в яких вивчалася можливість залучення G-білків або систем вторинних посередників. Добре відомо, що модуляція нейромедіаторами та пептидами кальцієвих каналів N-, Р/Q-типу звичайно проходить за участью G-білків. У цих випадках модулююча дія речовини на кальцієві канали виникає внаслідок потенціал-залежної зміни роботи воротного механізму, що, в свою чергу, призводить до потенціал-залежного зменшення амплітуди струму та сповільнення його кінетики активації. Нещодавно було показано, що крім добре відомої потенціал-залежної модуляції G-білками кальцієвих каналів N- та Р/Q-типів, існує так само і потенціал-незалежна модуляція за участю G-білків, яка здійснюється іншими біохімічними шляхами.

У проведених нами експериментах також встановлена наявність функціонально-активних G-білків, здатних модулювати роботу кальцієвих каналів Р-типу. Проте, на відміну від дії більшості нейротрансмітерів та ГТФ-аналогів на кальцієві канали N- та Р-типу, модулююча дія гіперфорину на кальцієві канали Р-типу зберігалася в умовах, коли функціонально-активний комплекс канал/G-білок було зруйновано стимуляцією клітини деполяризуючим імпульсом тривалістю 100 мс до значень мембранного потенціалу +100 мВ.

У подальших експериментах ми знайшли, що модулююча дія гіперфорину на Р-струм зберігалась при наявності у внутрішньоклітинному розчині ГТФ-g-S у концентрації 1 мМ (активує GTs-білки, і так само активує або інактивує GMs-білки). У цих експериментах зовнішньоклітинна аплікація гіперфорину в концентрації 0,8 мкМ, як і раніше, спричиняла зсув максимуму ВАХ на -7±3 мВ (n=7), сповільнювала кінетику активації та зменшувала амплітуду Р-струму. Використання у внутрішньоклітинному розчині ГДФ-b-S у концентрації 1-2 мМ (інактивує GTs- та GMs-білки), так само не впливало на спричинені дією 0,8 мкМ гіперфорину зсув максимуму ВАХ на -8±2 мВ (n=6), сповільнення кінетики активації та зменшення амплітуди Р-струму. Таким чином, дані цих експериментів вказують на те, що модуляція гіперфорином кальцієвих каналів Р-типу відбувається без участі G-білків. Проте, варто зауважити, що неідентифіковані на сьогодні G-білки, що мають більш високу аффінность до ГТФ, ніж до ГДФ-b-S, можуть брати участь у модулюючій дії гіперфорину на Р-струм.

Серед внутрішньоклітинних агентів, що змінюють активність кальцієвих каналів, передусім необхідно виділити самі іони Ca2+ які здатні як безпосередньо діяти на мембранні канали, так і активувати різні кальцій-залежні ферменти та білки. У проведених нами експериментах встановлено, що заміна у зовнішньоклітинному розчині іонів Ba2+ на іони Ca2+ призводить лише до незначного посилення блокуючої дії 0,8 мкМ гіперфорину на Р-струм з 28±10% (для 2 мМ Ba2+ (n=9)) до 44±15% (для 2 мМ Ca2+ (n=5)). Подальше збільшення внутрішньоклітинної концентрації іонів Ca2+ за рахунок зниження у внутрішньоклітинному розчині концентрації ЕГТА з 5 мМ до 0,5 мМ веде до подальшого посилення блокуючої дії 0,8 мкМ гіперфорину на Р-струм з 44±15% (для 2 мМ Ca2+ та 5 мМ ЕГТА (n=5)) до 71±7% (для 2 мМ Ca2+ та 0,5 мМ ЕГТА (n=5)). Проте, в усіх цих експериментах було показано, що ні заміна проникаючого катіону, ні підвищення внутрішньоклітинної концентрації іонів Ca2+ не впливають на спричинені гіперфорином зсув максимуму ВАХ та сповільнення кінетики активації Р-струму. Таким чином, отримані нами дані вказують на участь, принаймні, двох різних механізмів у модуляції гіперфорином Р-струму: кальцій-незалежний механізм, що відповідає за зсув ВАХ та сповільнення кінетики активації Р-струму, та кальцій-залежний механізм, що зумовлює блокування гіперфорином Р-струм. Така складна модуляція гіперфорином кальцієвих каналів Р-типу може мати важливе значення. Спричинений дією гіперфорину зсув максимуму ВАХ Р-струму призводить до зменшення рівня деполяризації клітини, який необхідний для входу певної кількості іонів Ca2+. Цей ефект в залежності від потенціалу збільшує Ca2+-залежний викид медіатора, однак, з іншого боку, гіперфорин спричиняє зменшення амплітуди кальцієвого струму, що в свою чергу призводить до запобігання перевантаження клітини іонами Ca2+. Таким чином, залежність між збудливістю клітини та кальцієвим входом стає в значній мірі регульованою, що може бути корисно при лікуванні певних патологічних станів, включаючи депресію.

Кальмідазол є одним з широко відомих блокаторів Ca2+-зв'язуючого білка кальмодуліну. Ця речовина крім оборотного зв'язування з кальмодуліном також блокує активацію різних кальмодулін-залежних ферментів, включаючи Ca2+/кальмодулін-залежну протеінкіназу II (CaM II), кальційнейрин (Ca2+/кальмодулін-залежну протеінфосфатазу), MPLC, аденілатциклазу та інші. Почергово ці ферменти можуть бути залучені до нейрональних процесів через фосфорилювання та дефосфорилювання специфічних білків.

У проведених нами експериментах було встановлено, що присутність кальмідазолу в зовнішньоклітинному розчині повністю ліквідує спричинені гіперфорином зсув максимуму ВАХ та сповільнення кінетики активації Р-струму. У цих експериментах зовнішньоклітинна аплікація 0,8 мкМ гіперфорину на фоні дії 0,5 мкМ кальмідазолу вже не спричиняла сповільнення кінетики активації Р-струму та зсув його ВАХ: на 0±1 мВ (n=6). На жаль, вивчити вплив цього агенту на потенціал-незалежне блокування гіперфорином Р-струму в таких експериментах не можливо, оскільки присутність у зовнішньоклітинному розчині 0,5 мкМ кальмідазолу спричиняє досить сильне блокування амплітуди цього струму.

Усунення кальмідазолом модулюючої дії гіперфорину на Р-струм вказує на можливу участь кальмодуліну в регуляції кальцієвих каналів Р-типу. Таким чином, можна зробити припущення, що гіперфорин генерує