національний аграрний університет
Федець Олег мирославович
УДК 576.32/.36:636.2:612.64:612.3
ІЗОФОРМИ ЛАКТАТДЕГІДРОГЕНАЗИ ТА БІЛКОВИЙ СПЕКТР СЛИЗОВОЇ ОБОЛОНКИ ТРАВНОГО ТРАКТУ ПЛОДА КОРОВИ В ОНТОГЕНЕЗІ
03.00.04 – біохімія
Автореферат
дисертації на здобуття наукового ступеня
кандидата сільськогосподарських наук
Київ – 2001
Дисертацією є рукопис
Робота виконана в Науково-дослідному інституті біотехнологічних основ підвищення продуктивності тварин Львівської державної академії ветеринарної медицини імені С.З.жицького Міністерства аграрної політики України
Науковий керівник
доктор біологічних наук, професор
Калачнюк Григорій Іванович,
НДІ біотехнологічних основ підвищення продуктивності тварин
Львівської державної академії ветеринарної медицини
імені С.З.жицького, директор
Офіційні опоненти:
доктор біологічних наук, професор Розгоні Іван Іванович, Інститут біології тварин УААН, головний науковий співробітник лабораторії клітинної інженерії
доктор сільськогосподарських наук, Цехмістренко Світлана Іванівна, Білоцерківський державний аграрний університет, доцент кафедри органічної та біологічної хімії
Провідна установа
Інститут біохімії імені О. В. Палладіна НАН України, відділ регуляції обміну речовин, м.Київ
Захист відбудеться “15” березня 2001 р. о 1000 годині на засіданні
спеціалізованої вченої ради Д 26.004.08 у Національному аграрному університеті за адресою: 03041, Київ – 41, вул. Героїв оборони 15, навчальний корпус № 3, ауд. 65
З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Національного аграрного університету; 03041, Київ – 41, вул. Героїв оборони 11, навчальний корпус № 10
Автореферат розісланий “14” лютого 2001 р.
Вчений секретар
спеціалізованої вченої ради _______________ Грищенко В. А.
Загальна характеристика роботи
Актуальність теми. У тканинах плодів в процесі їх розвитку накопичується значна кількість лактату (Хочачка П., 1988), що є наслідком гіпоксичного стану організму та особливостей обміну речовин. Так, для окремих тканин плодів властиве одночасне функціонування специфічного для них виду енергообміну та метаболізму як у дорослому віці. Інтенсивність цих процесів, як і біосинтетичних, визначається здебільшого видом тканин та ступінню їх диференціації (Гулий М.Ф., Мельничук Д.О., 1974; Мазур О.С., 1997). Деякі амінокислоти використовуються для синтезу білків більшою мірою, ніж у дорослих тварин. Вуглецеві метаболіти, що утворюються у результаті їх катаболізму, використовуються, головним чином, у процесах глюконеогенезу, тоді як у дорослих тварин на енергетичні потреби.
Такі відмінності в метаболічних процесах зумовлюють специфічне функціонування систем плода, дослідження яких необхідне для кращого розуміння перебудови, яка відбувається в загальному обміні речовин організму при переході до постнатального періоду розвитку, та для з’ясування шляхів корекції можливих порушень обміну речовин (Захаренко М.О., 1992; Цвіліховський М.І., 1998; Любецька Т.В., 2000).
Дослідження слизової оболонки шлунково-кишкового тракту (ШКТ) представляє інтерес з точки зору участі цієї тканини у загальному обміні речовин плода. Її вивченню у дорослих тварин присвячено низку робіт (Породко І.С., Кусень С.Й., 1966; Сологуб Л.И., 1973; Калачнюк Г.І., 1967, 1993; Цехмістренко С.І., 1999), у яких представлено відомості про ензиматичні властивості, білоксинтезуючу здатність, фракційний склад білків та інше. Проте у плодів ця тканина залишається ще мало вивченою. Основною причиною такого стану, перш за все, є проблеми з отриманням матеріалу для досліджень, та дуже малі його кількості.
На ранніх етапах ембріогенезу лактатдегідрогеназа (LDH) є маркером експресії генів і за її ізоензимним складом можна судити про ступінь диференціації клітин (Стойка Р.С., 1979; Клячко О.С., 1994). У більш пізньому плодовому етапі внутрішньоутробного періоду розвитку, коли вже сформовані усі системи ензим є важливим показником інтенсивності метаболічних процесів.
Фундаментальне дослідження LDH важливе ще і тому, що вона має клінічне значення під час діагностики ряду хвороб таких органів, як серце (Jensen A. E., 1990; Junker L., 1990), лімфатична система (Sugaya N., 1990), молочна залоза (Andersson R., 1991) та інших, а також пухлин печінки (Chen L., 1992), підшлункової (Rasschaert J., 1995) та молочної залоз (Khurana P., 1990) тощо.
Тканини плода зазнають впливу ряду екзогенних факторів (Розгоні І.І., Наконечна О.В., 1992), зокрема живлення їх матерів. Встановлено (Кравців Р.Й., Гладій М.В., Калачнюк Г.І., Шмідт Р.М. та ін., 2000), що ріпакові кормові добавки у поєднанні з сорбентами, є цінним джерелом білка і не мають негативної дії на організм дорослої тварини. Проте їхній вплив на організм плода ще не вивчений. Відсутнє глибоке біохімічне обгрунтування згодовування цих добавок вагітним тваринам, перш за все з огляду їхньої дії на організм плода в цілому, та на окремі його органи, системи і тканини, зокрема на слизову оболонку ШКТ. Оскільки її формування у внутрішньоутробний період розвитку є необхідною передумовою нормального функціонування після народження організму.
Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертаційна робота була розділом комплексних досліджень Науково-дослідного інституту біотехнологічних основ підвищення продуктивності тварин Львівської державної академії ветеринарної медицини імені С.З.жицького, які виконувались на замовлення Наукового управління Мінагрополітики України за темою Розробити нові, комплексні біотехнологічні способи підвищення вмісту рістстимулюючих речовин у природних кормових засобах (№ держреєстрації 0198U008022).
Мета і задачі дослідження. Метою нашої роботи було дослідити зміни в ізоензимах лактатдегідрогенази і білковому спектрі у слизовій оболонці рубця, сітки, книжки, сичуга, сліпої та прямої кишок плодів корів у період внутрішньоутробного їх розвитку, для встановлення їх ролі в обміні речовин плода і впливу на них екзогенних факторів.
Для цього необхідно було вирішити такі задачі:
дослідити активність та ізоензимний склад лактатдегідрогенази у цитозольно-мікросомальній і мітохондріальній фракціях слизової оболонки шлунково-кишкового тракту, а також у печінці плодів і дорослих тварин;
визначити вміст лактату і пірувату у слизовій оболонці шлунково-кишкового тракту та у печінці плодів і дорослих тварин;
встановити концентрації розчинних білків та білковий спектр у слизовій оболонці шлунково-кишкового тракту плодів та дорослих тварин;
з’ясувати міжорганні та міжвікові відмінності у плодів в активності та ізоензимному складі лактатдегідрогенази, вмісті лактату і пірувату, концентрації розчинних білків і білковому спектрі та встановити різниці між плодами і дорослими тваринами;
виявити наявність впливу на слизову оболонку шлунково-кишкового тракту плодів заміни високобілкових кормів у раціонах тільних корів на ріпакові добавки.
Об’єктом дослідження були міжорганні та міжвікові відмінності в активності та ізоензимному складі лактатдегідрогенази і спектрі розчинних білків слизової оболонки шлунково-кишкового тракту плодів корів та зміни цих показників у плодів за умови годівлі їх матерів ріпаковими кормовими добавками.
Предметом дослідження були лактатдегідрогеназа та розчинні білки слизової оболонки травного тракту плода корови.
Методи досліджень: активність лактатдегідрогенази визначали спектрофотометрично, концентрацію лактату і пірувату ензиматичним методом, ізоензимний склад лактатдегідрогенази та фракційний склад розчинних білків методом електрофорезу у поліакриламідному гелі, концентрацію розчинних білків за методом Лоурі та Петерсона.
Наукова новизна одержаних результатів. Вперше проведено дослідження активності та ізоензимного складу лактатдегідрогенази у компартментах слизової оболонки рубця, сітки, книжки, сичуга, сліпої і прямої кишок плодів корів у період внутрішньоутробного їх розвитку.
Показано, що активність лактатдегідрогенази у цитозольно-мікросомальній та мітохондріальній фракціях слизової оболонки шлунково-кишкового тракту зростає з віком плода і є вищою, ніж у дорослих тварин. З розвитком плода у слизовій оболонці накопичується лактат, кількість якого значно більша, ніж у постнатальний період їх онтогенезу. Це вказує на переважання у даній тканині плода анаеробного гліколізу, кінцевим продуктом якого є даний метаболіт.
Встановлено, що ізоензимний склад лактатдегідрогенази у компартментах слизової оболонки шлунково-кишкового тракту протягом пізньоплодового етапу пренатального періоду онтогенезу не змінюється, але він відрізняється від дорослих тварин, що зумовлене особливістю метаболічних процесів.
Виявлене значне зростання концентрації розчинних білків у слизовій оболонці усіх досліджуваних відділів шлунково-кишкового тракту з розвитком плода, та вищий їх вміст у плодів порівняно з дорослими тваринами. Це свідчить про інтенсивний розвиток даної тканини у пренатальний період онтогенезу.
Практичне значення одержаних результатів. Отримані результати досліджень слизової оболонки шлунково-кишкового тракту плодів корів розширюють існуючі відомості про формування та функціонування цієї тканини у пренатальний період розвитку, що є необхідним для встановлення етіологій хвороб травної системи та регуляції процесів травлення у неонатальний період онтогенезу.
На основі результатів проведених досліджень встановлено доцільність використання для тільних корів існуючої системи годівлі тварин ріпаковими кормовими добавками, яку викладено у рекомендаціях Біотехнологічні основи використання модифікованих ріпакових кормових добавок у тваринництві, затверджених секцією тваринництва науково-технічної ради Мінагрополітики України 23 грудня 1999 року (протокол № 5). Це підтверджують акти про виробничу перевірку та довідка про впровадження.
Особистий внесок здобувача. Дисертантом особисто проведені всі біохімічні дослідження, узагальнені їх результати, сформульовані висновки та оформлено роботу.
Автор висловлює щиру подяку доктору біологічних наук, професору Калачнюку Григорію Івановичу за запропоновану тему, керівництво під час виконання роботи і її захисту, а також співробітникам Інституту біології клітини НАН України доктору біологічних наук, професору Ростиславу Стойці та кандидатам біологічних наук, старшим науковим співробітникам Олександрові Корчинському та Ігореві Якимовичу за люб’язно надані реактиви для проведення біохімічних досліджень.
Апробація результатів досліджень. Викладені в дисертації результати доповідались на: міжнародній науково-практичній конференції Сучасні проблеми біології, ветеринарної медицини, зооінженерії та технологій продуктів тваринництва, присвяченій 100-річчю з часу надання Львівській академії ветеринарної медицини імені С.З.жицького академічного статусу (Львів, 9-11 жовтня 1997 року); міжнародній науковій конференції “Сучасні проблеми зооінженерії та шляхи їх вирішення”, присвяченій 50-річчю від дня заснування зооінженерного факультету (Львівська державна академія ветеринарної медицини імені С.З.жицького, 7-8 жовтня 1999); “Dny ivoin fyziologie” (Академія наук Чеської республіки, Трешт, 28-29 вересня 1999); біохемічній комісії Одинадцятої наукової сесії Наукового Товариства імені Шевченка (29 лютого - 25 березня, Львів-2000), до 100-річчя від дня народження дійсного члена НТШ, професора Степана жицького (14 березня); міжнародній науковій конференції “С.З.жицький і сучасна аграрна наука”, присвяченій 100-річчю від дня народження С.З.жицького (Львівська державна академія ветеринарної медицини імені С.З.жицького, 6-8 травня 2000); 2-му Західноукраїнському симпозіумі з адсорбції та хроматографії (Львів, 5-7 червня 2000); третій міжнародній конференції Актуальные проблемы биологии в животноводстве (Боровск, 6-8 сентября 2000); III Symposium Ukraine-sterreich. Landwirtschaft: Wissenschaft und Praxis (Чернівці, 14-16 вересня 2000); а також на звітних засіданнях Науково-дослідного інституту біотехнологічних основ підвищення продуктивності тварин та вченої ради Львівської державної академії ветеринарної медицини імені С.З.жицького (19972000).
Публікації. За матеріалами дисертації опубліковано 14 робіт. З них 7 статей, 6 праць конференцій і симпозіумів та науково-практичні рекомендації.
Структура та обсяг дисертації. Дисертація викладена на 186 сторінках, складається із вступу, чотирьох розділів, висновків та списку використаних джерел (213 найменувань, з них зарубіжних 177). Робота містить 6 таблиць, 57 рисунків (з них 16 фотографій) та 5 додатків (1 рисунок і 18 таблиць).
загальна методика та основні методи досліджень
Дослідження проводили на плодах, яких відбирали під час забою тільних корів на м’ясокомбінаті. Було отримано 89 плодів, їх вік встановлювали за комплексом зовнішніх морфологічних ознак та за даними Журналу штучного осіменіння корів. З метою одержання порівняльної характеристики основні біохімічні дослідження були проведені на тканинах плодів та дорослих тварин (бички 14-18 місяців). Корови, від яких одержували плоди, утримувалися на раціонах, у яких джерелами протеїну служили сойовий, соняшниковий, льоновий шроти і їх заміна на ріпаковий шрот у поєднанні із природними сорбентами.
Матеріалом для проведення біохімічних досліджень були: слизова оболонка рубця, сітки, книжки, сичуга, сліпої і прямої кишок, а також печінка від плодів різного віку та дорослих тварин.
При дослідженнях LDH, для отримання цитозольно-мікросомальної і мітохондріальної фракцій, матеріал подрібнювали за допомогою гомогенізатора Поттера-Елвегейма, а необхідні субклітинні фракції одержували методом роздільного центрифугування. Для дослідження розчинних білків слизові оболонки розтирали у фарфорофій ступці з кварцовим піском. У всіх випадках для екстракції використовували середовище такого складу (у мМ): 250,0 – сахароза, 5,0 – Na2EDTA, 1,0 – фенілметилсульфанілфторид (інгібітор серинових протеїназ), 5,0 – бензамідин (інгібітор пептидаз), 5,0 – трис–HCl буфер (pH 7,4).
Активність LDH визначали за методом, описаним L.H.Bernstein and J.Everse (1975). Для визначення ізоензимного складу LDH проводили розділення розчинних білків методом ЕФ у 7,5%-му PAGE (Маурер Г., 1968) в апараті для вертикального гель-електрофорезу (АВГЕ–1) “Хийу Каллур” (Естонія). Гелі для специфічного фарбування після закінчення ЕФ поміщали на 60 хв. при температурі 37С без доступу світла у середовище такого складу (на 100 мл): 1,14 г – лактату Li, 50 мг – –NAD, 30 мг – тетразолію нітросинього, 2 мг – феназинметосульфату, 0,2 М трис–HCl буферу (рН 7,4). Для встановлення стійкості ізоензимів LDH до температурної обробки, проби перед ЕФ поміщали на 10 хв. у водяну баню при температурі 60С. Лактат і піруват визначали у цільній тканині відповідно за методами I.Cutmann and A.W.Wahlefeld та R.Czok and W.Lamprecht (1974). Визначення концентрації розчинних білків у мітохондріальних (гепатоцити) і цитозольно-мікросомальних фракціях та екстрактах цільних тканин проводили за методом O.H.Lowry et al. (1951), а у мітохондріальних фракціях слизової оболонки за методом G.L.Peterson (1977). Для вивчення спектру розчинних білків проводили розділення тканинних екстрактів методом ЕФ у 12,5%-му PAGE з 0,1% вмістом DS–Na (Laemmli U.K., 1970). Ідентифікували окремі білкові фракції за допомогою стандартного набору білків-маркерів із відомими молекулярними масами LMW: 94,0, 67,0, 43,0, 30,0, 20,1, 14,4 kDa (Pharmacia, Швеція). Математичну обробку денситограм проводили на спеціальному аналізаторі – “АФ–1” (Львівприлад).
Статистичну обробку отриманих результатів здійснювали за допомогою програми Microcal Origin (Version: 5.0).
проведені експериментальні дослідження
Активність лактатдегідрогенази субклітинних фракцій слизової оболонки шлунково-кишкового тракту та у печінці
Одержані результати представлені у табл. 1. Вони свідчать, що у цитозольно-мікросомальній фракції досліджуваних тканин плодів віком 6–6,5 місяців найнижча активність ензиму виявлена у печінці. Порівняно з нею активність LDH у слизовій оболонці ШКТ вища. Серед окремих відділів ШКТ найнижча активність ензиму у передшлунках. Відмінності між рубцем, сіткою та книжкою незначні. У решти досліджуваних відділах шлунково-кишкового тракту порівняно із рубцем активність LDH значно вища. У плодів старшого віку та у дорослих тварин міжорганні відмінності (всередині вікової групи) практично такі ж, як і у плодів 6–6,5-місячного віку. У мітохондріальній фракції досліджуваних тканинах плодів віком 6–6,5 місяців, найнижча активність LDH у сичузі, вища у печінці і прямій кишці та найвища у сліпій кишці. У плодів віком 7–7,5 і 8–8,5 місяців міжорганні відмінності подібні, а у дорослих тварин найнижча активність ензиму у печінці, найвища у сичузі, що вказує на своєрідність функцій окремих органів в онтогенезі.
Якщо проаналізувати відмінності між окремими віковими групами, то виявиться, що в обох субклітинних фракціях з кожним місяцем пренатального періоду онтогенезу активність LDH зростає. У досліджуваних тканинах дорослих тварин порівняно з плодами віком 8–8,5 місяців активність ензиму вірогідно нижча.
Отже, у досліджуваній тканині в процесі внутрішньоутробного періоду розвитку організму, активність LDH суттєво зростає. Це є наслідком гіпоксичного стану організму плода, при якому інтенсивнішими є реакції гліколізу (Хочачка П., 1988).
Таблиця 1 - Активність LDH (мкмоль NADH / хв мг білка) у цитозольно-мікросомальній та мітохондріальній фракціях печінки і слизової оболонки ШКТ плодів різного віку та дорослих
тварин (n3–6)
Орган | Плоди (вік, місяці) | Дорослі тварини
6–6,5 | 7–7,5 | 8–8,5 | (14-18 місяців)
Mm | P | Mm | P | Mm | P | Mm | P
цитозольно-мікросомальна фракція
печінка | 1,22
0,11 | P2>0,05 | 1,38
0,02 | P2<0,05 | 1,88
0,17 | P2<0,01
P3<0,01 | 0,96
0,06
рубець | 1,39
0,10 | P1>0,05
P2>0,05 | 2,06
0,37 | P1>0,05
P2>0,05 | 2,51
0,29 | P1>0,05
P2<0,02
P3<0,05 | 1,15
0,17 | P1>0,05
сітка | 1,34
0,11 | P1>0,05
P2>0,05 | 1,59
0,15 | P1>0,05
P2>0,05 | 2,11
0,14 | P1>0,05
P2<0,01
P3<0,02 | 1,20
книжка | 1,50
P2>0,05 | 2,01
0,14 | P1<0,02
P2>0,05 | 2,12
0,03 | P1>0,05
P2>0,05
P3<0,02 | 1,54
0,23 | P1<0,05
сичуг | 1,88
P2>0,05 | 2,52
0,54 | P1>0,05
P2>0,05 | 2,75
0,39 | P1>0,05
P2<0,05
P3>0,05 | 1,50
0,12 | P1<0,02
сліпа кишка | 1,90
0,10 | P1<0,01
P2>0,05 | 1,96
0,08 | P1<0,001
P2>0,05 | 2,48
0,27 | P1>0,05
P3>0,05 | 1,35
0,14 | P1<0,05
пряма кишка | 2,02
0,22 | P1<0,02
P2>0,05 | 1,89
0,07 | P1<0,01
P2<0,01 | 2,70
P3>0,05 | 1,91
0,25 | P1<0,01
мітохондріальна фракція
печінка | 0,53
0,04 | P2<0,02
P4<0,01 | 0,66
0,01 | P2>0,05
P4<0,001 | 0,72
0,10 | P2<0,05
P3>0,05
P4<0,001 | 0,44
0,07 |
P4<0,001
сичуг | 0,27
0,05 | P1<0,01
P4<0,001 | 0,33
0,02 | P1<0,001
P4<0,01 | 0,46
0,05 | P1<0,05
P3<0,05
P4<0,001 | 0,82
0,03 | P1<0,01
сліпа кишка | 0,85
P4<0,001 | 0,99
0,03 | P1<0,001
P4<0,001 | 1,19
0,04 | P1<0,01
P2<0,001
P4<0,01 | 0,44
0,06 | P1>0,05
пряма кишка | 0,67
P4<0,01 | 0,65
0,16 | P1>0,05
P4<0,001 | 0,86
P4<0,001 | 0,62
P4<0,01
Примітка: | P1 – | вірогідність при порівнянні із печінкою того самого віку;
P2 –
P3 – | вірогідність при порівнянні із відповідним органом “сусідньої” вікової групи, тобто: плоди віком 6–6,5 місяців з плодами віком 7–7,5 місяців, 7–7,5 місяців з 8–8,5 місячними і 8–8,5 місяців з дорослими тваринами;
вірогідність при порівнянні відповідних органів плодів віком 8-8,5 і 6-6,5 міс;
P4 – | вірогідність при порівнянні до цитозольно-мікросомальної фракції.
Ізоензимний склад лактатдегідрогенази субклітинних фракцій слизової оболонки шлунково-кишкового тракту та у печінці
В обох субклітинних фракціях слизової оболонки ШКТ плодів виявлено 5 ізоензимів LDH (рис. 1, 2, 3, 4, табл. 2).
Таблиця 2 - Процентне співвідношення ізоензимів LDH субклітинних фракцій печінки та слизової оболонки ШКТ плодів віком 8–8,5 місяців; у дужках активність окремих ізоформ (Mm; n4–5)
Органи | Ізоензими
LDH–1 | LDH–2 | LDH–3 | LDH–4 | LDH–5
Печінка | 11,620,60
(0,22) | 10,010,64
(0,19) | 26,021,60
(0,49) | 42,982,30
(0,80) | 9,280,80
(0,17)
Рубець | 3,840,56
(0,10) | 8,300,84
(0,21) | 22,620,69 (0,57) | 26,021,37
(0,65) | 39,261,72
(0,98)
Сітка | 4,780,76
(0,10) | 8,400,78
(0,18) | 21,920,90
(0,46) | 24,380,95
(0,52) | 40,921,43
(0,86)
Книжка | 4,000,99
(0,08) | 8,080,59
(0,17) | 22,520,98
(0,48) | 26,761,15
(0,57) | 38,641,93
(0,82)
Сичуг | 13,81,38
(0,38) | 16,140,76
(0,44) | 29,201,25
(0,80) | 23,120,88
(0,63) | 19,140,92
(0,53)
Сліпа кишка | 11,520,63
(0,28) | 22,160,86
(0,55) | 26,561,13
(0,66) | 24,160,89
(0,60) | 16,801,14
(0,42)
Пряма кишка | 9,840,80
(0,27) | 22,280,64
(0,60) | 26,941,03
(0,73) | 23,440,70
(0,63) | 17,501,26
(0,47)
мітохондрії
Печінка |
12,301,21
(0,10) | 33,181,03
(0,24) | 37,142,16
(0,27) | 17,381,31
(0,12)—
Сичуг | 1,280,33
(0,01) | 3,661,14
(0,02) | 3,580,58
(0,02) | 14,421,47
(0,07) | 76,861,81
(0,35)
Сліпа кишка | 6,001,14
(0,07) | 10,480,36
(0,12) | 11,040,83
(0,13) | 11,681,33
(0,14) | 58,921,89
(0,70)
Пряма кишка | 6,660,92
(0,06) | 9,781,33
(0,08) | 9,720,35
(0,08) | 11,240,77
(0,10) | 60,802,83
(0,52)
Розподіл ізоформ у цитозольно-мікросомальній фракції досліджуваної тканини передшлунків ідентичний. Тут переважає LDH–5, яка становить близько 40% від загальної кількості ізоензимів. У перерахунку на субодиничну будову усіх ізоформ, LDH на 72% складається із поліпептидів А–типу і лише на 28% із поліпептидів В–типу.
У сичузі, сліпій і прямій кишках найбільша кількість гетерологічних ізоформ, тобто LDH–2, –3 і –4. Щодо субодиничної будови ензиму, то поліпептид А–типу тут становить 45-47%, а поліпептид В–типу 53-55%. Розподіл ізоформ LDH у субклітинних фракціях сліпої і прямої кишок практично ідентичний.
У мітохондріях сичуга 80% усіх ізоензимів становить LDH–5. У перерахунку на субодиничну будову частка поліпептиду А–типу складає 91%. Вміст LDH–5 у сліпій і прямій кишках дещо нижчий 60%, а на долю субодиниць А–типу припадає 75-80%. Значна кількість ізоформи LDH–5 у мітохондріях є найбільшою їх відмінністю від цитозольно-мікросомальної фракції.
В обох субклітинних фракціях гепатоцитів переважають ізоензими, які є гетерологічними по своїй будові. Тут ізоформи LDH на 57-60% складаються з поліпептидів В–типу. У кількох випадках у цитозольно-мікросомальній фракції, крім ізоформ LDH–1, –2, –3, –4 і –5, виявлено ще і мінорний компонент, який знаходиться між ізоензимами LDH–4 і LDH–5. Ми позначили його як LDH–4,5. За субодиничним складом ця субклітинна фракція більш наближена до сичуга, сліпої і прямої кишок, а порівняно із передшлунками у ній менше субодиниць А–типу. У мітохондріях печінки ізоформа LDH–5 відсутня. Порівняно із слизовими оболонками травного тракту, тут менша кількість поліпептидів А.
Ізоензимний склад LDH субклітинних фракцій печінки і слизової оболонки шлунково-кишкового тракту плодів різного віку практично ідентичний.
Після температурної обробки співвідношення ізоформ LDH зазнає суттєвих змін, які для усіх органів зводяться до зменшення кількості ізоензимів, що складаються із поліпептидів А–типу, та збільшення вмісту ізоформ побудованих із субодиниць В–типу. В першу чергу це LDH–1.
Якщо порівнювати ізоензимні спектри LDH дорослих тварин з плодами, то виявляється, що у цитозольно-мікросомальній фракції передшлунків вони подібні, але у дорослих тварин чіткіше виражена перевага ізоензимів, які побудовані із субодиниць А–типу. У печінці, сичузі, сліпій і прямій кишках є зміни зворотнього характеру. Тобто тут більший вміст поліпептидів В–типу. У мітохондріях дорослих тварин теж більша частка ізоензимів, які складаються із субодиниць В–типу. У сичузі — це LDH–1, а сліпій та прямій кишках — LDH–2 і –3. У печінці і прямій кишці ізоформа LDH–5 виявлена лише у слідових кількостях. Чутливість до термоінактивації у ізоензимів LDH із обох субклітинних фракцій досліджуваних тканин дорослих тварин така ж як і у плодів. Тобто ізоформи, що складаються із поліпептидів В–типу більш стійкі порівняно із побудованими із субодиниць А–типу.
Отже, з розвитком плода ізоензимний склад LDH у досліджуваних тканинах не змінюється. У цитозольно-мікросомальній фракції слизової оболонки передшлунків і печінки, та мітохондріальній фракції сичуга, сліпої і прямої кишок переважають ізоформи, побудовані із субодиниць А–типу, тобто ті, що більш пристосовані до перетворення пірувату у лактат. У цитозольно-мікросомальній фракції досліджуваних тканин сичуга, сліпої і прямої кишок ізоензимний склад більш рівномірний. У мітохондріях печінки переважають ізоензими, які складаються із поліпептидів В–типу, а ізоформа LDH–5 відсутня. У цитозольно-мікросомальній фракції гепатоцитів плодів між ізоензимами LDH–4 і LDH–5 виявлено мінорний компонент, що можна вважати органно-віковою ознакою ізоензимного спектру LDH.
У дорослих тварин, порівняно з плодами, в обох субклітинних фракціях слизової оболонки зростає кількість субодиниць, що більш придатні до перетворення лактату, тобто В–типу. Це свідчить про інтенсивніший перебіг тут аеробних процесів та менше енергетичне значення такого лактату, який для плодів є значно важливіший (Хочачка П., 1988). Проте винятком є цитозольно-мікросомальна фракція досліджуваної тканини передшлунків, де проходять зворотні зміни. Тут зростає кількість поліпептидів А–типу, що є результатом специфічного для слизової оболонки обміну речовин, в результаті якого утворюються значні кількості карбонових кислот, зокрема лактату.
Концентрація лактату і пірувату у слизовій оболонці
шлунково-кишкового тракту та у печінці
Результати досліджень вмісту лактату і пірувату узгоджуються з даними активності ензиму. Так, у плодів найвища концентрація лактату (рис. 5 а) виявлена у печінці. Дещо нижча вона у слизовій оболонці сітки, книжки та сліпої і прямої кишок, та найнижча у рубці і сичузі. У дорослих тварин найвищий вміст даного метаболіту у печінці та слизовій оболонці сичуга, сліпої і прямої кишок. У передшлунках, порівняно з рештою досліджуваних тканин, показник менший у 2 і більше разів. У всіх досліджуваних тканинах плодів, порівняно з дорослими тваринами, концентрація лактату вища.
Вміст пірувату (рис. 5 б) у печінці та слизовій оболонці рубця, сичуга, сліпої і прямої кишок плодів майже не відрізняється. Найвищий він у сітці та книжці. У дорослих тварин міжорганні відмінності такі ж, як і у плодів. Виключенням є лише слизова оболонка рубця, де концентрація пірувату теж досить висока. У всіх досліджуваних тканинах плодів концентрація пірувату нижча, ніж у дорослих тварин. Такі відмінності у вмісті метаболітів існують і між плодами та новонародженими тваринами (Любецька Т.В., 2000).
а) б)
Рис. 5 Концентрація лактату а) і пірувату б) у печінці–1 і слизовій оболонці рубця–2, сітки–3, книжки–4, сичуга–5, сліпої кишки–6, прямої кишки–7 плодів та дорослих тварин.
Якщо співставити щойно викладені дані з результатами досліджень LDH, то виявляється, що у тканинах з найвищою активністю ензиму є найнижча концентрація лактату і найвища пірувату. У досліджуваних тканинах дорослих тварин зниження концентрації лактату супроводжується збільшенням у ізоензимному складі LDH кількості субодиниць В–типу.
Концентрація розчинних білків у слизовій оболонці
шлунково-кишкового тракту
Концентрації розчинних білків (табл. 3) у досліджуваній тканині сітки і книжки плодів майже не відрізняються. Порівняно із слизовою оболонкою рубця, де цей показник найнижчий серед відділів ШКТ, вони незначно вищі. Проте у решти органів (у порівнянні до рубця) відмінності виражені чіткіше і становлять подекуди 2-4 рази. Такі міжорганні відмінності спільні для плодів усіх вікових груп. Якщо порівняти вміст розчинних білків між однаковими органами плодів різного віку, то виявиться, що із збільшенням віку концентрація розчинних білків зростає. Так, з 3,5 до 8,5-місяців цей показник у ряді органів збільшується у 2 рази.
У дорослих тварин найнижча концентрація розчинних білків виявлена у слизовій оболонці передшлунків. Порівняно з рубцем, у досліджуваній тканині сичуга, сліпої і прямої кишок вона вища відповідно в 1,7, 2,4 і 2,2 рази. В той же час у плодів ці різниці є у 2, 4 і 3 рази. Крім цього концентрація розчинних білків у дорослих тварин порівняно із плодами 8,5-місячного віку нижча у 1,5-2 рази.
Таблиця 3 - Концентрації розчинних білків (г / кг сирої тканини) у слизовій оболонці ШКТ
плодів різного віку і дорослих тварин
Відділ ШКТ
Рубець | Сітка | Книжка | Сичуг | Сліпа кишка | Пряма кишка
Мm | P | Mm | P | Mm | P | Mm | P | Mm | P | Mm | P
3,5 місяців (n5)
8,28
1,12 | P1>0,05– |
11,03
0,94 | P1<0,05
P3>0,05 | 11,89
0,72 | P1>0,05
P3<0,05 | 19,45
1,26 | P1>0,05
P3<0,001––––––
4–4,5 місяців (n5)
10,45
0,85 | P1>0,05
P2>0,05– |
14,97
1,24 | P1>0,05
P3<0,02 | 11,71
1,21 | P1>0,05
P3>0,05 | 23,15
1,29 | P1>0,05
P3<0,001––––––––
5–5,5 місяців (n9)
10,97
0,70 | P1>0,05
13,68
1,78 | P1>0,05
P3>0,05 | 13,14
0,94 | P1>0,05
P3>0,05 | 22,57
1,53 | P1>0,05
P3<0,001 | 42,80
2,44 | P1>0,05–
P3<0,001 | 30,72
1,46 | P1>0,05–
P3<0,001
6–6,5 місяців (n9)
12,04
0,58 | P1>0,05
P2<0,02– |
15,77
1,17 | P1>0,05
P3<0,02 | 15,23
0,89 | P1>0,05
P3<0,01 | 24,34
P3<0,001 | 44,65
3,20 | P1>0,05
P3<0,001 | 32,40
1,77 | P1>0,05
7–7,5 місяців (n9)
13,19
0,75 | P1>0,05
P2<0,01– |
17,02
1,06 | P1>0,05
P3<0,01 | 16,20
1,01 | P1>0,05
P3<0,05 | 25,87
1,74 | P1>0,05
P3<0,001 | 48,76
2,89 | P1>0,05
P3<0,001 | 35,81
3,29 | P1>0,05
8 місяців (n5)
14,12
0,76 | P1>0,05
16,76
1,90 | P1>0,05
P3>0,05 | 16,36
1,79 | P1>0,05
P3>0,05 | 25,09
2,95 | P1>0,05
P3<0,01 | 51,98
5,12 | P1>0,05
P3<0,001 | 35,08
6,62 | P1>0,05
8,5 місяців (n5)
14,83
1,78 | P1<0,05
22,49
2,38 | P1<0,01
P3<0,05 | 19,66
3,05 | P1<0,05
P3>0,05 | 31,93
4,16 | P1<0,01
P3<0,01 | 53,82
1,68 | P1<0,001
P3<0,001 | 38,04
3,60 | P1<0,01
дорослі тварини (n5)
10,36
0,72– |
9,96
0,75– |
P3>0,05 | 11,66
0,48– |
P3>0,05 | 17,05
1,44– |
P3<0,01 | 25,19
1,70– |
P3<0,001 | 22,95
1,61– |
P<0,001
Примітка: | P1 – | вірогідність при порівнянні до відповідного відділу ШКТ між віковими групами (3,5 місяців з 4–4,5 місяцями, 4–4,5 місяців з 5–5,5 місяцями ... 8,5 місяців з дорослими тваринами);
P2 – | вірогідність при порівнянні до відповідного відділу ШКТ плодів віком 3,5 місяців;
P3 – | вірогідність при порівнянні до слизової оболонки рубця відповідної вікової групи.
Таким чином, серед досліджуваних відділів ШКТ у пре- і постнатальний періоди онтогенезу найнижча концентрація розчинних білків у слизовій оболонці передшлунків. Цей відділ травного каналу навіть у неонатальний період онтогенезу зберігає ознаки ембріонального характеру і залишається слабо розвинутий, бо для організму жуйних у даний період життя немає потреби у розвитку цього відділу ШКТ. З віком плодів концентрація розчинних білків у всіх органах зростає, що свідчить про інтенсивне нагромадження цих важливих біополімерів у даній тканині.
Білковий склад слизової оболонки шлунково-кишкового тракту
Таблиця 4 - Характеристика фракцій білкового спектру слизової оболонки ШКТ
№ фракції | Молекулярна маса (kDa)
1 | >94,0
2 | >94,0
3 | >94,0
4 | >94,0
5 | 94,0
6 | 90,0
7 | 87,0
8 | 78,0
9 | 67,0
10 | 60,0
11 | 54,0
12 | 52,0
13 | 47,0
14 | 40,5-37,0
15 | 32,0
16 | 29,0
17 | 25,5
18 | 23,0
19 | 21,5
20 | 19,5
21 | 17,0
22 | 15,0-14,4
23 | <14,4
Білковий спектр слизової оболонки усіх досліджуваних органів плодів нараховує 23 основні фракції (рис. 6, 7, табл. 4). Їх процентний склад для рубця, сітки і книжки практично ідентичний. Тут переважають білки з високою і середньою молекулярними масами.
У фракційному складі білків досліджуваних тканин сичуга, сліпої і прямої кишок порівняно з рубцем існує ряд відмінностей. Так, зокрема, у них зменшений вміст 3-ї, 4-ї, 14-ї, 19-ї та 20-ї фрак-цій. При цьому різко збільшений вміст двох низькомолекулярних білкових фракції: 22-а та 23-я. Вказані відмінності є спільними для цих трьох відділів, але вони мають ще характерні особливості.
У сичузі переважання білків з високою, середньою чи низькою молекулярними масами не виявлене. Порівняно з рубцем, тут нижчий вміст 2-ї і 8-ї фракцій, та збільшені кількості таких білкових фракцій, як 5-а, 7-а і 9-а. Серед білків досліджуваних тканин сліпої і прямої кишок, порівняно з рубцем, домінують низькомолекулярні білкові фракції. Крім цього у них менший вміст 9-ої фракції, а у слизовій оболонці прямої кишки збільшена 16-а фракція. Порівнюючи білкові спектри сліпої і прямої кишок між собою, можна зроботи висновок, що вони практично ідентичні, за виключенням незначних відмінностей у кількостях 16-ї, та 22-ї фракцій. Загальна скерованість міжорганних різниць співпадає з особливостями ізоензимного складу у цій тканині.
Ці міжорганні відмінності свідчать про диференціацію відділів ШКТ і є спільні для плодів усіх вікових груп, тобто білкові спектри слизової оболонки кожного окремо взятого відділу з віком плодів практично не змінюються. Виключенням є лише 9-а фракція, кількість якої у досліджуваній тканині передшлунків 8,5-місячних плодів порівняно з 3,5-місячними значно більша.
Білкові спектри слизової оболонки ШКТ дорослих тварин мають ряд особливостей, які в цілому зводяться до того, що у плодів менший вміст білків із низькою молекулярною масою, та вищий — із середньою.
Ізоензимний склад лактатдегідрогенази і білки слизової оболонки шлунково-кишкового тракту плодів за дії факторів живлення
Не виявлено змін у ізоензимному складі LDH, її активності, концентрації лактату, пірувату і розчинних білків та у білковому спектрі слизової оболонки ШКТ плодів від корів, яким згодовували ріпакові кормові добавки у поєднанні з природними сорбентами, або інші високобілкові корми (соя, соняшник, льон). Тобто показана раніше рядом авторів відсутність негативної дії на рівні цілого організму (Гедзик М., 1999; Грицай Б., 1999; Кравців Р.Й., Гладій М.В., Калачнюк Г.І., Шмідт Р.М. та ін., 2000), тепер підтверджена нами на субклітинному та ізоензимному рівнях.
висновки
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
11.
12.
Список праць, опублікованих за темою дисертації
