НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ

Міжнародний Центр молекулярної фізіології

Інститут фізіології ім. О.О.Богомольця

УДК 577.352.5+612.822

ФЕДУЛОВА СВІТЛАНА АНАТОЛІЇВНА

РОЛЬ КАЛЬЦІЄВИХ І КАЛІЄВИХ КАНАЛІВ У СИГНАЛЬНИХ

ФУНКЦІЯХ НЕРВОВИХ КЛІТИН

03.00.02 - Біофізика

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття ученого ступеня доктора біологічних наук

Київ – 2001

Дисертацією є рукопис

Робота виконана в Інституті фізіології ім. О.О.Богомольця та Міжнародному Центрі молекулярної фізіології Національної Академії Наук України

Науковий консультант: академік НАН України, доктор біологічних наук, професор П.Г.Костюк, директор Інституту фізіології ім. О.О.Богомольця НАН України

Офіційні опоненти: доктор біологічних наук, професор Зима Валентин Леонідович, професор кафедри біофізики Київського Національного університету ім. Тараса Шевченка.

доктор біологічних наук, професор Корогод Сергій Михайлович, професор кафедри експериментальної фізики, завідуючій лабораторією біофізики і біоелектроніки Дніпропетровського Національного Університету

доктор фізико-математичних наук Тесленко Віктор Іванович, провідний науковий співробітник відділу квантової теорії молекул і кристалів Інституту теоретичної фізики ім.М.М.Боголюбова НАН України

Провідна організація: Інститут біохімії ім. О.В. Палладіна НАН України, відділ нейрохімії.

Захист відбудеться 05.06.2001 р. о 14 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.198.01 при Інституті фізіології ім. О.О.Богомольця НАН України, 01024, Київ-24, вул. Богомольця, 4

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Інституту фізіології ім. О.О.Богомольця НАН України, 01024, Київ-24, вул. Богомольця, 4

Автореферат розісланий 29.04.2001 р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради

доктор біологічних наук З.О.Сорокіна-Маріна

ВСТУП

Актуальність проблеми.

Однією із властивостей нервових клітин, що забезпечують їх сигнальну функцію, є електрозбудливість. Вивчення механізмів електрозбуливості нервової клітини - найбільш актуальний напрямок сучасної нейрофізіології. Електрична активність нейронів є тим ініціюючим фактором, що приводить до викиду нейромедіатора в нервових закінченнях і запуску каскаду складних реакцій, що обумовлюють такі явища, як нейрональна пластичність, навчання і пам'ять. У сомі і нейритах нервової клітини відбувається аналіз та інтегрування сигналів, що надходять через синапси аферентних сигналів та генерація відповіді у вигляді потенціалу дії (ПД), що поширюється.

Найважливіша роль у регуляції збудливості нейрона відведена різним типам потенціалокерованих натрієвих, кальцієвих і калієвих каналів у сомі та відростках нервових клітин. Особливий інтерес представляє одержання нових даних про функціювання кальцієвих каналів, що відіграють основну роль у сполученні різних внутрішньоклітинних і мембранних процесів. Кальцієвий струм, що протікає по цих каналах, може помітно змінювати концентрацію іонів кальцію всередині клітини та активувати секрецію нейромедіаторів і різноманітні внутрішньоклітинні процеси. Синаптична передача обумовлена великою кількістю мало вивчених механізмів, що стосуються контролю вивільнення нейромедіатора, опосередкованого входом іонів Са2+ у пресинаптичне закінчення.

Вихідний калієвий струм реполяризує мембрану після її деполяризації і стабілізує мембранний потенціал. Тип, кількість і щільність розподілу калієвих каналів відіграють важливу роль у регуляції властивостей збудливості нейронів, таких як здатність генерувати потенціали дії з різною частотою і модулювати тривалість і форму ПД. Зміна тривалості ПД і рівня деполяризації мембрани приводять, у свою чергу, до зміни потоку кальцію через потенціалокеровані кальцієві канали усередину клітини, що впливає на кальцій-залежні внутрішньоклітинні процеси.

Актуальним є розуміння ролі та взаємодії різних типів каналів калієвого і кальцієвого струмів у складній системі функціювання нервової клітини, опис специфічних параметрів цих струмів, що визначають їх інтегративні властивості та забезпечують сигнальні функції нейронів. Вивчення участі кальцієвих і калієвих струмів у формуванні типу електричної активності на різних етапах онтногенетичного розвитку може дати ключ до розуміння того, як мембранні процеси визначають функціональні особливості сенсорних нейронів. Механізми зміни сили синаптичного зв'язку шляхом фармакологічного впливу на кальцієві і калієві канали поодинокої пресинаптичної терміналі нейронів центральної нервової системи (ЦНС) є найменш вивченими зі складних процесів, які регулюють викид нейромедіатора.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами.

Робота виконана в рамках наукових програм відділу загальної фізіології нервової системи Інституту фізіології ім. О.О.Богомольця НАН України: "Молекулярні механізми інтегративной функції нервових клітин у нормі і при мозковій патології", "Зміни калієвої провідності у тривалокультивованих нейронів гіпокампа", а також наукових тем Міжнародного Центра Молекулярної фізіології НАН України: "Дослідження механізмів квантової передачі в поодиноких синапсах центральних нейронів ссавців", "Дослідження механізмів гальмівної синаптичної передачі нейронів центральної нервової системи".

Мета роботи.

Мета роботи полягала у визначенні ролі кальцієвих і калієвих каналів у формуванні електричної активності нейронів у розвитку і з'ясуванні функціонального значення кальцієвої і калієвої провідностей у регуляції механізмів генерації потенціалу дії та викиду нейромедіатора, тобто у здійсненні нейронами, що належать до різних відділів нервової системи, іх сигнальних функцій.

Задачі дослідження.

1. Зробити розділення та ідентифікацію потенціалокерованих кальцієвих і калієвих струмів, що протікають через різні типи каналів соматичної мембрани сенсорних і гіпокампальних нейронів, описати електрофізіологічні і фармакологічні властивості потенціалокерованих кальцієвих і калієвих каналів.

2. Вивчити зміни щільності каналів кальцієвого та калієвого струмів нейронів в онтогенетичному розвитку і функціональну роль цих змін у формуванні електричної активності.

3. Дослідити механізми викиду нейромедіатора з поодинокої пресинаптичної терміналі гальмівних синапсів культивованих нейронів гіпокампа.

4. Вивчити вплив потенціалокерованих кальцієвих і калієвих каналів мембрани пресинаптичної терміналі нейронів гіпокампа на механізми викиду нейромедіатора.

5. Дослідити вплив на синаптичний зв'язок фармакологічних і електрофізіологічних факторів, що змінюють потенціалокеровані кальцієву та калієву провідності пресинаптичної терміналі.

Наукова новизна отриманих результатів.

1. Продемонстровано, що інтегральна калієва провідність у сенсорних нейронах формується трьома типами вихідних калієвих струмів, подібних А-, DR-, K- типам калієвих струмів, зареєстрованих у соматичнїй мембрані нейронів гіпокампа. У сомі нейронів гіпокампа, окрім цих струмів, також зареєстровано і описано D-струм.

2. Для сенсорних нейронів, вивчені зміни щільності кальцієвих і калієвих струмів в онтогенезі. Встановлено, що низькопорогові кальцієві канали, характерні для сенсорних нейронів, що розвиваються, зникають в процесі онтогенезу, у той час як високопорогові кальцієві канали присутні у соматичній мембрані протягом усього раннього онтогенезу.

3. Використовуючи експериментальні дані, що одержані при досліджені онтогенетичних змін кальцієвих і калієвих каналів, методом чисельного експерименту була проведена реконструкція можливих змін у генерації ПД, що являється однією з сигнальних функцій сенсорних нейронів. Показано, що на генерацію повторних ПД критичний вплив робить визначений баланс між низькопороговою кальцієвою провідністю і компонентом калієвої провідності, що інактивується.

4. Показано, що в культивованих нейронах гіпокампа високопороговий кальцієвий струм може бути розділений на 3 підтипи на основі їх різної фармакологічної чутливості. Показано, що основна роль у забезпеченні викиду нейромедіатора в гальмівних синапсах належить високопороговим кальцієвим каналам N- і P/Q- підтипів,а високопорогові кальцієві канали L-підтипу не беруть участі у гальмівній синаптичній передачі культивованих нейронів гіпокампа.

6. Показана можливість багатоквантового викиду нейромедіатора з поодинокої пресинаптичної терміналі нейронів гіпокампа. Викид нейромедіатора є випадковим процесом, що описується статистичним законом Пуассона. Збільшення потоку іонів Са2+ у пресинаптичну терміналь шляхом підвищення його позаклітинної концентрації або збільшення інтенсивності стимуляції приводить до росту середнього вмісту квантового викиду за рахунок збільшення ймовірності багатоквантового викиду.

7. Встановлено, що блокування потенціалокерованих калієвих каналів, опосередковано збільшуючи вхід іонів Са2+ в пресинаптичну терміналь, приводить до збільшення сили синаптичного зв'язку за рахунок збільшення ймовірності багатоквантового викиду нейромедіатора при незмінній величині одного кванта. У формуванні калієвої провідності пресинаптичного закінчення домінуючу роль грають 4-АП чутливі калієві струми (ймовірніше за все А-типу).

8. Продемонстровано, що при тривалій деполяризації пресинаптичної терміналі викид нейромедіатора може відбуватися тільки у визначені, найбільш ймовірні моменти часу, середній інтервал між викидами 2.97±0.86 мс. Кількість везикул, що вивільняються в найбільш імовірний час, є випадковою величиною. Існування найбільш імовірних часів викиду зв'язано не з виснаженням запасу везикул, готових до викиду, і не з рівнем деполяризації пресинаптичної мембрани, а залежить від потоку кальцію усередину терміналі.

Практичне значення отриманих результатів.

Дане дослідження має фундаментальне значення і значно поглиблює і розширює існуючі уявлення про функціювання кальцієвих і калієвих каналів соматичної мембрани сенсорних і центральних нейронів, їх ролі в генерації ПД, а також про механізми вивільнення нейромедіатора з нервових закінчень у центральній нервовій системі. З'ясування закономірностей експресії кальцієвих і калієвих каналів у соматичній мембрані сенсорних нейронів у процесі онтогенезу істотне для з'ясування закономірностей розвитку нервової системи. Дані про механізми синаптичної передачі в нейронах ЦНС і точний кількісний аналіз квантового викиду в поодиноких центральних синапсах мають загальнобіологічне значення, оскільки дотепер такий аналіз був практично недоступний у силу серйозних технічних обмежень. Нові знання про механізми, що лежать в основі міжклітинної комунікації, є важливими для розуміння таких явищ як навчання і пам'ять.

Проведені дослідження властивостей і функцій кальцієвих і калієвих каналів сенсорних і центральних нейронів створюють теоретичну основу для пошуку селективно діючих фармакологічних і біологічно активних препаратів і ефективної цілеспрямованої корекції патологічних станів.

Особистий внесок здобувача.

Автор самостійно розробляла методики ізоляції та культивування функціонально повноцінних нейронів різних відділів ЦНС, технічне обґрунтування методики стимуляції поодинокої пресинаптичної терміналі нейронів гіпокампа і внесла ряд удосконалень у цю методику та самостійно проводила більшу частину експериментів, аналіз, статистичну обробку й узагальнення результатів.

Деякі експерименти були проведені разом з іншими співавторами опублікованих робіт, співробітниками Інституту фізіології О.О.Богомольця НАН України: академіком П.Г. Костюком, д.б.н. М.С.Веселовським, аспірантами Д.В.Васильєвим і О.В.Ісаєвою. В роботі використовувалося унікальне електрофізіологічне устаткування, створене провідним інженером С. Г. Романюком.

Апробація результатів дисертації.

Усі матеріали дисертації представлялися на семінарах Інституту фізіології ім.О.О.Богомольця НАН України, на Всесоюзних симпозіумах і з'їздах, на щорічних зборах нейрофізіологічного товариства США (Новий Орлеан, 1997; Лос-Анжелес, 1998; Маямі, 1999), на щорічних зборах біофізичного товариства США (Сан-Франциско, 1991; Канзас-Сіті, 1998), на Міжнародних конгресах фізіологічних наук (Гельсінкі 1989; Київ, 1997) на 5-ому Всесвітньому конгресі ІБРО (Єрусалім, 1999), на зборах фізіологічного товариства Великобританії (Бірмінгем, 1999; Лондон, 2000), на конференції НАТО "Кальцієва сигналізація" (Ель Чокко, Італія, 2000), на симпозіумах "Кальцій як молекула для клітинної інтеграції" (Кент, 2000), "Мембрани і сигналізація" (Київ, 2000), на засіданнях сектора молекулярної фізіології Інституту фізіології ім. О.О.Богомольця НАН України.

Публікації

За результатами роботи опубліковано 31 стаття у провідних вітчизняних і закордонних журналах і 17 (за останні 3 роки) тез доповідей.

Структура й обсяг дисертації

Дисертація складається з вступу, огляду літератури, опису методів досліджень, результатів досліджень (6 розділів), аналізу й узагальнення результатів, висновків і списку 283 використаних літературних джерел. Робота викладена на 246 сторінках, містить 6 таблиць, проілюстрована 62 рисунками.

МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ

Об'єкти дослідження. В експериментах використовувалися неідентифіковані нейрони чотирьох поперекових пар СГ щурів (первинні сенсорні нейрони) п'яти вікових груп: ембріони 17 дня пренатального розвитку, 1, 5-6, 14-15 і 90-100-го днів постнатального розвитку. Нейрони СГ ембріонів і новонароджених щурів ізолювалися з застосуванням ферментативно-механічної обробки. Клітини залишалися в модифікованому середовищі Ігла на час електрофізіологічних досліджень.

Для приготування первинної культури нейронів гіпокампа використовувався мозок новонароджених щурів лінії Вістар. Тварин декапітували, їх мозок поміщали у фосфатний буфер, що не містив Са2+ і Mg2+ і мав такий склад (у мМ/л): NaCl – 137; KCl – 2.7; KH2PO4 – 1.47; Na2HPO4 – 8.06; глюкоза – 20; HEPES – 15; натрієва сіль бензилпеніціліна – 25 од/мл; стрептоміцина сульфату – 25 мкг/мл. Гіпокамп виділяли і поперечно розрізали на частини товщиною 2-3 мм. Після 10-ти хвилинної обробки 0,025%-ним розчином трипсину у фосфатному буфері при 34 0С тканину промивали в мінімальному середовищі Ігла з додаванням 10% кінської сироватки. У цьому розчині клітини гіпокампа механічно дисоціювалися. Щільність клітин підраховувалася на гемоцитометрі, після чого вона доводилася до остаточної щільності висіву 35000 клітин/см2 на скло, попередньо оброблені полі-L-орнітином і ламініном. Культивування проводилося при 37 0С в повітряно-газовому середовищі, збагаченному СО2 до 5%. На другий-третій день культивування в середовище додавалося 5 мкM цитозин-А-D-арабіно-фуранозіда для придушення проліферації гліальних клітин, а через 15-20 годин після цього здійснювалася повна зміна культурального середовища.

Штучні сольові розчини. При видаленні з розчинів іонів Na+ вони замінялися еквімолярною концентрацією іонів холіну. Осмотичність модифікованих розчинів підтримувалася додаванням хлориду холіну. При реєстраціях струмів методом "петч клемп" у конфігурації "ціла клітина" склад внутрішньопіпеточного розчину був наступним (у мМ/л): СsCl- 130, ТЭA-Cl- 10, MgCl2- 5, CaCl2- 1, ЭГТА- 10, трис-Cl- 10 чи CsCl - 60, CsOH - 60, EGTA - 10, HEPES - 20; рН доводили до 7,3 додаванням СsОН і DL-аспарагінової кислоти. При реєстрації вихідних калієвих струмів клітина заповнювалася наступним розчином: KF 150, Tris-HCl 30, рН доводився за допомогою Тrіs-OH до 7.3. Розчини для зовнішньої перфузії містили (у мМ/л): холіну хлориду -150, KCl-5, CaCl2-1 , MgCl2-1, HEPES-20, рН доводився до 7.4 додаванням Tris-OH. У зовнішньому розчині містився тетродотоксин (ТТХ) у концентрації 0.5-1 мкМ. Аплікація блокаторів калієвих каналів тетраетіламмонія (ТЕА) і 4-амінопіридина (4-АП) проводилася з використанням техніки швидкої локальної перфузії [Veselovsky et al., 1996] безпосередньо в області досліджуваного нейрона.

Для реєстрації викликаних гальмівних постсинаптичних струмів (вГПСС) від пари нейронів базовий розчин містив (у мM/л): NaCl - 140; KCl -3; Ca12 - 2; MgCl2 - 2; HEPES - 20; глюкоза - 30; p 7.3. Для заповнення пэтч-пипетки використовувався розчин наступного складу (у мМ/л): глюконат калію -100; KCl- 50; MgCl2 - 10; ЭГTA - 10; HEPES - 20; p 7.4. При дослідженнях поодинокої пресинаптичної терміналі розчини для зовнішньої перфузії містили (у мМ/л): NaCl-140, KCl-3, CaCl2-2 , MgCl2-2, HEPES-20, рН доводився до 7.4 додаванням Tris-OH. Внутрішньопіпеточний розчин містив (у мМ/л): KGlu-100, KCl-50, EGTA-5, MgCl2-5, pН доводився до 7.4 за допомогою Tris-OH. В позаклітинний розчин додавалися блокатори AMPA- і NMDA-рецепторів збуджуючих синапсів DNQX і D-APV у концентрації 20 мкМ кожен, що було достатньо для повного їх блокування.

Реєстрація струмів. Для виміру трансмембранних струмів ізольованих нейронів був застосований метод фіксації потенціалу в конфігурації "ціла клітина", описаний раніше [Hamill et al.,1981].

Локальна стимуляція поодинокої пресинаптичної терміналі. Візуальний контроль досліджуваного постсинаптичного нейрона та нервової терміналі виконувався при сумарному збільшенні в 1000 разів. Звичайно в полі зору (діаметр 200 мкм) знаходилися 1-2 нейрона. Проводилася стимуляція одного з нейритів клітини, що контактує з іншою клітиною, у якій при цьому виникав ГПСС (ці клітини позначалися як пре- і постсинаптичні одиниці відповідно). Реєстрація ГПСС здійснювалася за допомогою методу “петч-клемп” у конфігурації "ціла клітина". Стимулююча піпетка з внутрішнім діаметром близько 1 мкм заповнювалася зовнішнім розчином (опір 8-10 МОм) і з'єднувалася зі стимулятором з ізольованим виходом. Мала амплітуда стимулюючого потенціалу (0-25 В) продуціювала загальний струм не більше 2.5 мкА. У цьому випадку стимуляція відбувалася за рахунок локальної зміни потенціалу в позаклітинному розчині поблизу стимулюючої піпетки. Цей потенціал градуально зменшувався рівномірно у всіх напрямках, як функція відстані від кінчика піпетки. Потенціал на відстані 5 мкм від стимулюючої піпетки в поздовжньому і поперечному напрямках зменшувався до величин менших 5 мВ при стимулюючій напрузі 15 В. Звичайно стимулююча напруга, що використовувалася для стимуляції подинокої терміналі, була 6.5±3.5 В (n = 143), і діаметр зони ефективного зрушення потенціалу (0-100 мВ) не перевищував 2-3 мкм.

Аналіз даних. У процесі експерименту дані відцифровувалися аналого-цифровим перетворювачем (Axon Instruments, TL-1 interface) і зберігалися на твердому диску комп'ютера з використанням програмного пакету pClamp 6.0 (Axon Instruments). Частота відцифровки трансмембранних іонних струмів складала 0.5-10 КГц у залежності від тривалості досліджуваних подій. Аналіз струмів і даних проводився з використанням аналітичних програмних продуктів (pClamp 6.0, Axon Instruments; Origin 3.54, Microcal Software; TIDA for Windows, HEKA Elektronik). Для визначення достовірності отриманих результатів використовувався блок статистичних програм ANOVA з рівнем значимості не нижче Р = 0.05.

РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ

Опис калієвих вихідних струмів у сенсорних нейронах.

Нейрони спінальних гангліїв проводять у центральну нервову систему значну частину сенсорної інформації. Інтегральний вихідний калієвий струм соматичної мембрани спінальних гангліїв щурів міг бути розділений на три незалежних компоненти. Сімейства кривих сумарного вихідного струму реєструвалися двічі з різною схемою подачі потенціалу на мембрану досліджуваного нейрона. Ізольований струм, що швидко інактивувався (далі "швидкий") був отриманий як результат поточкового віднімання струмів, зареєстрованих під час другого етапу подачі потенціалу, від сумарного вихідного калієвого струму, отриманого під час першого етапу подачі потенціалу на мембрану досліджуваного нейрона (схема подачі потенціалу на мембрану клітини представлена на рис.1).

В усіх досліджених нейронах у відповідь на деполяризуючий зсув мембранного потенціалу виникав компонент калієвого струму, що повільно інактивувався ("повільний").

Струм затриманого випрямлення, що не інактивувався ("затриманий"), реєструвався при підтримуваному потенціалі -25 мВ, коли канали калієвих струмів іншого типу були повністю інактивовані.

Для визначення постійних часу активації всіх трьох типів калієвих струмів застосовувалася апроксімація наростаючої частини кривих струмів експоненціальною функцією в четвертій ступені. Постійна часу активації "швидкого" струму зміняювалася в діапазоні 6...1 мс при зміні потенціалу на мембрані у диапазоні –40...+40 мВ. Постійна часу активації "повільного" калієвого струму зменшувалася від 13 до 4 мс при зміні потенціалу від –10 мВ до +50 мВ. Постійна часу активації "затриманого" струму монотонно зменшувалася від 100 мс при -10 мВ до 25 мс при +50 мВ.

Спадаюча частина "швидкого" струму могла бути описана моноекспоненціальною функцією з постійною часу, що зменшувалася від 40 мс до 15 мс при зміні мембранного потенціалу від –40 мВ до +40 мВ. Спадаюча частина "повільного" струму щонайкраще описувалася сумою двох експонент. Постійна часу другої (повільної) експоненти інактивації на порядок перевищувала першу, більш швидку.

Експериментальні точки для визначення стаціонарної активації та інактивації калієвих струмів були описані рівнянням Больцмана (див Табл.1).

Додавання 2 мМ 4-АП приводило до блокування амплітуди "швидкого" струму на 80±7% (n=8), а "повільного" на 55±6% (n=8). "Затриманий" струм не мав якої-небудь значимої фармакологічної чутливості до 4-АП. ТЕА в концентрації 10 мМ блокував "повільний" струм на 40±5% (n=12), "затриманий" струм на 70±5% (n=12) і не викликав істотної зміни амплітуди "швидкого" струму.

Таблиця 1. Параметри рівняння Больцмана для стаціонарних характеристик калієвих струмів сенсорних нейронів.

Типи струмів "Швидкий" "Повільний" "Затриманий"

k, мВ V1/2 , мВ k, мВ V1/2 , мВ k, мВ V1/2 , мВ

Активація 12 -20 13.4 -13 12.5 -15

Інактивація -10 -84 -12 -55

V1/2 – значення потенціалу при досягненні половинного значення стаціонарної активації/інактивації, а k – коефіцієнт крутості.

Зміна розподілу вхідних і вихідних струмів у пре- і постнатальному розвитку.

Щільності всіх типів вхідних струмів були виміряні для п'яти вікових груп тварин: ембріони (7 днів до народження), 1, 6-7, 45-50 і 90-100 днів постнатального розвитку. У кожній віковій групі було досліджено по 76 нейронів. При вивченні щільностей вихідних струмів у вікових групах було досліджено по 50 нейронів. У процесі онтогенетичного розвитку відбувалося статистично недостовірне збільшення кількості нейронів, що експресують канали ТТХ-чутливого натрієвого і високопорогового кальцієвого струмів, одночасно помітно зменшувалася кількість клітин, що експресують канали ТТХ-нечутливого натрієвого і низькопорогового кальцієвого струмів.

Усі три типи калієвих струмів були виявлені практично в кожному дослідженому нейроні, хоча амплітуди струмів варіювали в значній мірі. Середня щільність "повільного", також як і "швидкого" калієвих струмів, статистично достовірно збільшувалася на протязі перших п'яти днів постнатального розвитку. Середня щільність "затриманого" калієвого струму зменшувалася протягом цього періоду розвитку і не змінювалася в наступному.

Функціональна роль різних іонних струмів у генерації ПД сенсорних нейронів.

Данні про функціювання різних типів потенціалокерованих іонних каналів нейрональної мембрани, опис характеристик цих каналів і данні про те, що щільності іонних струмів міняються в процесі онтогенезу, вимагають систематизації у встановленні відповідності між основними функціями нейрона і молекулярними механізмами, що забезпечують ці функції. Базуючись на експериментальних даних про іонні струми в сенсорних нейронах щурів, з використанням персонального комп'ютера була створена чисельна модель електричної активності цих нейронів. При цьому всі параметри струмів були зафіксовані на величинах, отриманих шляхом усереднення результатів дослідження 20 нейронів, і вони описують усереднений модельний нейрон. Розходження значень площі і ємності мембрани, що можуть бути істотними для нейронів на різних стадіях онтогенетичного розвитку, були враховані в експериментальних дослідженнях за допомогою нормування щільностей струму щодо вимірюваної ємності мембрани клітини. Ці щільності були перераховані в значення сумарної провідності g іонних каналів (віднесених безпосередньо до всієї мембрани усередненого модельного нейрона), що вимірялася в наносименсах.

У чисельному експерименті ПД виникав у відповідь на імпульс струму тривалістю 0.1 мс і амплітудою 6 нА. У тих випадках, коли провідності низько- і високопорогових кальцієвих струмів були зафіксовані на мінімальних зареєстрованих експериментально значеннях, модельований ПД мав класичну форму і володів вираженою слідовою гіперполяризацією.

Збільшення провідності високопорогових кальцієвих струмів викликало затягування заднього фронту ПД. При цьому співвідношення щільностей вхідних і вихідних струмів було таке, що після уповільненого спаду і виходу на плато, мембранний потенціал під дією переважно вхідного струму знову починав зміщатися в область деполяризації. При достатньому зсуві він повторно переходив поріг активації і це приводило до генерації другого ПД. Дійсно, підвищення провідності для вхідного низькопорогового кальцієвого струму забезпечувало виникнення другого ПД. До такого ж результату приводило і зниження провідності каналів компонента калієвого струму, що інактивується. Ці зміни провідностей кальцієвого і калієвого струмів безпосередньо зміщали баланс у бік вхідних струмів, тим самим викликаючи генерацію повторного ПД.

Зниження щільності повільного вхідного натрієвого струму приводило до появи другого ПД, провідність gNa,s була 85 нСм. Ефект дії повільного натрієвого струму був більш помітний при заданні екстремально високого значення провідності gNa,s. При цьому на спадаючій фазі ПД з'являлося плато на рівні – 30 мВ і підвищення провідності вхідного низькопорогового кальцієвого струму gCa,l до 27 нС виявлялося недостатнім для генерації повторного піка. Тільки при значенні gCa,l, рівному 55 нС, з'являвся другий ПД. Хід іонних струмів був таким, що до моменту, коли встановлювався приблизний баланс вхідних і вихідних струмів, натрієві струми були вже цілком інактивовані. Таким чином, зміна щільності ТТХ-нечутливого натрієвого струму може зміщувати баланс лише опосередковано – через інактивацію низькопорогового кальцієвого струму, викликану затримкою мембранного потенціалу на рівні –30 ...–50 мВ.

Зміни провідності мембрани для високопорогового струму при базових значеннях інших провідностей не приводили до генерації повторного ПД. Значне збільшення gCa,h викликало лише стійку деполяризацію мембрани. Більш того, і зменшення, і збільшення gCa,h викликали зникнення другого піка.

Зменшення провідності компоненту калієвого струму, що інактивується, викликало появу повторного ПД, а її збільшення, сприяючи зрушенню рівноваги убік вихідних струмів, перешкоджало цьому. Невелике збільшення gCa,l з 27 до 28 нСм нейтралізувало цей ефект. Значне зменшення gKi до 1300 нСм перешкоджало генерації другого ПД, причому підвищення щільності кожного з кальцієвих струмів (або обох одночасно) приводило лише до затягування плато. Причиною цього є стаціонарна інактивація низькопорогового кальцієвого струму. Виникнення плато при зниженні калієвої провідності забезпечувалося вхідними струмами, зокрема, ТТХ-нечутливим натрієвим. Затримка мембранного потенціалу на рівні -40 мВ обумовлювала повну стаціонарну інактивацію низькопорогового кальцієвого струму. При зниженні провідності gNa,s повторний ПД знову з'являвся.

Як показали результати описаних вище чисельних експериментів, ключовим для процесу генерації повторних ПД, очевидно, є баланс між компонентом калієвого струму, що інактивується, і низькопороговим кальцієвим струмом. Рівновага може спостерігатися тільки у вузькому діапазоні значень потенціалу між порогом активації низькопорогового струму (-70 мВ) і областю вище -50 мВ, у якій цей струм швидко інактивується. Траєкторія мембранного потенціалу перед генерацією повторного ПД обмежена досить вузькими рамками. Занадто різке падіння потенціалу приводить до його виходу з області активації низькопорогового струму, а занадто повільне – до стаціонарної інактивації цього струму.

Варіації іонних струмів у залежності від розміру соми сенсорних нейронів.

При дослідженні неідентифікованих нейронів, що належать одній структурі, але сильно відрізняються своїми функціональними властивостями, часто виникає питання про критерій поділу гетерогенної популяції нейронів на функціонально однотипні субпопуляції цих нейронів. Ємність нейрональної мембрани є більш об'єктивним критерієм справжнього розміру клітин, у той час як візуальна оцінка площі соми непрямим чином відбиває адгезивні властивості мембрани. Для 136 досліджених нейронів були побудовані розподіли по величині ємності мембрани, що була пропорційна розміру проекції соми, і відповідно до цього нейрони були розділені на три групи: малі, що мали середню ємність 26±5 пФ, середні - 41±5 пФ і великі - 61±4 пФ.

Нейрони, у соматичній мембрані яких був присутній ТТХ-нечутливий натрієвий струм, у більшості відносяться до клітин, що мають середній розмір соми. За рахунок присутності INa,s ПД цих нейронів має плато на спадаючій фазі і час між двома повторними імпульсаціями внаслідок цього буде затягнутий.

Нейрони, що мають низькопороговий кальцієвий струм, належать, в основному, до підгрупи з великим розміром соми. Присутність IСa,l приводить до істотного скорочення часу між повторними ПД.

Потенціалокеровані кальцієві іонні струми соматичної мембрани нейронів гіпокампа.

На сомі культивованих нейронів гіпокампа в розчині, що містив ТТХ, у відповідь на прямокутний деполяризуючий зсув мембранного потенціалу щодо підтримуваного потенціалу -90 мв виникав вхідний кальцієвий струм, вольт-амперна характеристика якого мала два піки, що відповідають низько- і високопороговому кальцієвим струмам. Транзієнтний низькопороговий кальцієвий струм виникав при деполяризації мембрани від -70 до -35 мВ і досягав максимальної амплітуди при потенціалах –45... –50 мВ (n=10). У випадку деполяризації мембрани понад -35 мВ розвивався високопороговий кальцієвий струм, амплітуда якого досягала максимуму при –15... –20 мВ (n=10).

Високопороговий компонент кальцієвого струму в досліджуваних нейронах гіпокампа розділявся на кілька підтипів на основі різної чутливості до органічних блокаторів, таких як ніфедіпін, w-CTx-GVIA і w-Aga-IVA. Фармакологічно можна було виділити, принаймні, чотири різних підтипи цього струму. Дія органічних блокаторов на різні компоненти високопорогового кальцієвого струму досліджувалася в умовах підтримки потенціалу до -60 мВ для повної стаціонарної інактивації низькопорогового кальцієвого струму, тестуючий зсув мембранного потенціалу -20 мВ, тривалість тестуючого зсуву 400 мс, частота тестуючої стимуляції була 1/600 с-1.

Аплікація 10 мкМ Cd2+ приводила до пригнічення низькопорогового кальцієвого струму тільки на 3±1%, при цьому високопороговий струм пригнічувався на 28±7% (n=5). Додавання 20 мкМ Сd2+ викликало придушення низькопорогового струму на 6±2%, а високопорогового - на 52±4% (n=5). Подальше збільшення концентрації Cd2+ (50 мкМ) не приводило до зміни максимальної амплітуди високопорогового струму, тоді як низькопороговий придушувався на 18±9% (n=3).

Ніфедіпін, відомий блокатор L-типу кальцієвих каналів, у концентрації 10 мкМ викликав зменшення максимальної амплітуди високопорогового кальцієвого струму на 23±5 % (n=6).

Високопороговий компонент кальцієвого струму блокувався на 30±5 % при дії w-CTx-GVIA у концентрації 1 мкМ (n = 4). Оскільки в нейронах w-CTx-GVIA блокує тільки N-струми, то можна зробити висновок, що у всіх досліджених нейронах були присутні кальцієві канали N-типу.

Високопороговий компонент кальцієвого струму виявляв чутливість до w-Aga-IVA- специфічного блокатору кальцієвих каналів P-/Q-підтипів, хоча ступінь блокування кальцієвого струму цим токсином була дуже варіабельна: w-Aga-IVA у концентрації 200 нм блокував кальцієвий струм на 37±13% (n=7).

В усіх досліджуваних нейронах при спільному додаванні блокаторів w-CTx-GVIA (1 мкМ), w-Aga-IVA (200 нМ) і ніфедіпіну (100 мкМ) високопороговий кальцієвий струм пригнічувався на 84±5 % (n=5). Таким чином, залишався деякий резистентний до всіх типів блокаторів низькоамплітудний компонент високопорогового кальцієвого струму. Можливо, що блокатори в застосовуваній концентрації не до кінця пригнічують досліджуваний струм і резистентний струм, що спостерігається, являє собою суму N-, L- і P-/Q-струмів, частково незаблокованих даними концентраціями блокаторов. Наявність резистентного струму можна також пояснити присутністю в нейронах гіпокампа кальцієвих каналів R-типу.

Чотири типи калієвих струмів у культивованих нейронах гіпокампа.

Склад зареєстрованих вихідних калієвих струмів і їх амплітуди при тривалому культивуванні помітно варіювали в процесі розвитку росту нейронів у культурі. Розділення калієвих струмів в соматичній мембрані нейронів гіпокампа (рис.1) виконувалося за схемою, описаною детально для сенсорних нейронів.

Калієвий струм D-типу виділявся з інтегрального вихідного струму завдяки своїй гіперчутливості до 4–АП. 4-АП у концентрації 10 мкM викликав істотне пригнічення повільного компонента калієвого

струму. Додаванння 4-АП у концентраціях понад 200 мкM не приводило до подальшого зменшення амплітуди залишкової частини повільного компонента калієвого струму. Ізольований D-струм був отриманий у результаті поточкового віднімання залишкового струму від контрольного (рис.2А). Постійні часу активації для А- DR- і К-струму монотонно зменшувалися при збільшенні тестуючого потенціалу і складали відповідно 2 мс, 12 мс, 45 мс при Vt=-10 мВ, а також 1.5 мс, 6 мс і 10 мс при Vt=+50 мВ.

Часова інактивація А-струму була апроксимована однією експонентою. Постійна часу цієї експоненти монотонно зменшувалася при збільшенні деполяризуючого зсуву потенціалу від 37 мс при -50 мВ до 17 мс при 50 мВ. У той же час інактивація калієвого струму DR-типу найкраще описувалася сумою двох експонент. Параметри часової інактивації струму DR-типу оцінювалися для нейронів, у яких амплітуда К-струму була суттєво менша за амплітуду DR-струму. Постійна часу повільної і швидкої експонент варіювала від 4500 мс і 550 мс при Vt=-20 мВ до 1800 мс і 300 мс при Vt=+40 мВ, відповідно. Спад D-струму міг бути задовільно описаний однією експонентою. Постійна часу цієї експоненти при зміні тестуючого потенціалу від –40 мВ до +60 мВ змінювалася від 1000 мс до 400 мс.

Стаціонарні активація й інактивація калієвих струмів оцінювалися за допомогою двоступінчастої схеми зсуву мембранного потенціалу. Рівень стаціонарної інактивації визначалася як відносна провідність мембрани під час фіксованого тестуючого зсуву потенціалу, після прикладеного до мембрани кондиціонуючого імпульсу, що змінювався з кроком 10 мВ.

Ця здатність ансамблю каналів пропускати струм після різних рівнів гіперполяризації мембрани може бути представлена як відносна провідність G/Gmax, де Gmax – максимальна калієва провідність. Для визначення величини стаціонарної активації каналів значення провідності визначалося як відношення амплітуди струму під час тестуючого зсуву потенціалу до електрорушійної сили: (Vm – Ek ), де Ek рівноважний потенціал для іонів калію (для даних концентрацій іонів калію у внутрішньо- і позаклітинному розчинах складав –71 мВ), Vm. – величина тестуючого потенціалу. При дослідженні А-струму перший вимір інтегрального струму під час тестуючого зсуву потенціалу проводився при відсутності затримки між кондиціонуючим і тестуючим зсувами потенціалу, другий – з використанням затримки після кондиціонуючого зсуву потенціалу. Під час затримки мембрана деполяризувалася до –45 мВ на 100 мс. Поточкове віднімання струмів, зареєстрованих у другому випадку, зі струмів, записаних у першому, дозволило ізолювати А-струм із сумарного калієвого струму.

Експериментально отримані значення для стаціонарного рівня активації й інактивації струмів визначалися за значенням відношення G/Gmax і задовільно описувалися рівнянням Больцмана.

Таблиця 2. Параметри рівнння Больцмана для стаціонарних характеристик калієвих струмів нейронів гіпокампа.

Типи струмів А-тип DR-тип K-тип D-тип

k, мВ V1/2, мВ k, мВ V1/2, мВ k, мВ V1/2, мВ k, мВ V1/2, мВ

Активація 10.8 -22 10.6 -5 11.5 -18 11.8 -36

Інактивація -7.1 -80 -10.4 -61 -9.5 -95

V1/2 – значення потенціалу при досягненні половинного значення стаціонарної активації/інактивації, k – коефіцієнт крутості.

Потенціалокеровані калієві струми в довгостроково культивованих нейронах гіпокампа мали різний ступінь фармакологічної чутливості до блокаторів калієвих каналів. Вольт-амперні характиристики А-струмів, отримані при додаванні 4-АП у різних позаклітинних концентраціях, свідчать, що взаємодія блокатора з каналом не виявляла вираженої потенціалозалежності. Величина максимальної амплітуди А-струму при даному тестуючому потенціалі залежала від концентрації блокатора, що прикладався. Для оцінки ступеня блокування IА при визначеному потенціалі і різних концентраціях 4-АП в розчині, була обрана модель адсорбції субстрату на активних центрах, що описується ізотермою Хілла. Ступінь блокування, тобто відносну величину заблокованої частини струму, визначали як (Iконтр - I)/ Iконтр, де Iконтр - амплітуда струму в нормальному зовнішньому розчині, а I - пікове значення струму при визначеній концентрації блокатора і при фіксованій частоті стимуляції не більш 2 с-1. Максимальна провідність каналів калієвого струму А-типу досягається, якщо тестуючий потенціал зміщається до +40 мВ, тому взаємодія "блокатор-канал" була досліджена при цьому мембранному потенціалі. Експериментальні значення найкраще описувалися рівнянням Хілла при коефіцієнті кооперативності, рівному 2, що припускає співвідношення: дві молекули субстрату - один активний центр. Половинне значення максимальної амплітуди А-струму досягалося, якщо концентрація 4-АП дорівнювала 2.1 мМ, 4-АП у концентрації 1 мМ блокував А-струм на 27±9% (n=4), а в концентрації 5 мМ - на 87±8% (n=5). Калієвий струм А-типу був не чутливий до позаклітинного додавання 10 мМ ТЕА.

DR-струм блокувався 10 мМ ТЕА на 55%. Позаклітинне додавання 4-АП у концентрації 1 мМ приводило до блокування DR-струму на 45%, а в концентрації 5 мМ - на 80%.

D-струм виявляв найбільшу чутливість до додавання 4-АП, оскільки додаток 4-АП у концентрації 200 мкМ викликав повне оборотне придушення цього струму. Калієвий струм, що не інактивується, не мав помітної фармакологічної чутливості до 4-АП, проте, добре блокувався ТЕА. Додавання в позаклітинний розчин 10 мМ ТЕА приводило до зменшення амплітуди цього струму на 70±5% (n=5).

Вплив кальцієвих і калієвих струмів на ефективність гальмівної синаптичної передачі.

Основна ідея моделі квантового викиду нейромедіатора полягає в тому, що медіатор вивільняється з пресинаптичної терміналі дискретними порціями, приблизно рівними по кількості нейромедіатора, що знаходиться в поодинкій пресинаптичній везикулі. Кожна везикула містить один квант (кілька тисяч молекул) нейромедіатора. Везикули прилипають до внутрішньої поверхні терміналі у визначених місцях вивільненя. У центральних синапсах кількість місць вивільнення асоціюється з загальним числом везикул, що готові до викиду, кількістю пресинаптичних терміналей і числом активних зон. Кількість морфологічно помітних активних зон в поодинокій пресинаптичній терміналі центральних нейронів визначається як одна, іноді дві. Дотепер точний аналіз квантового викиду нейромедіатора в поодинокому синапсі центральних нейронів був лімітований технічними труднощями, що не дозволяли проводити надійну реєстрацію струмів і статистичний аналіз даних.

Є загальноприйнятим, що початкова подія, що приводить до вивільнення нейромедіатора, пов'язана з потоком кальцію через потенціалокеровані канали пресинаптичної терміналі. У попередніх розділах було показано, що зареєстровані в культивованих нейронах гіпокампа кальцієві і калієві струми виявилися ідентичними за своїми параметрами струмам, що раніше були описані у свіжеізольованих нейронах і зрізах гіпокампа щурів, тому культура нейронів гіпокампа є адекватною моделлю дослідження властивостей нейронів ЦНС. Дослідження впливу змін кальцієвої і калієвої провідностей на викид нейромедіатора з поодинокої пресинаптичної терміналі може допомогти розумінню механізмів синаптичного зв'язку, що регулюються іонами Са2+.

Гальмівні постсинаптичні струми, викликані викидом ГАМК з поодинокої

пресинаптичної терміналі.

Викликані ГПСС (вГПСС) у культивованих нейронах гіпокампа досліджувалися з використанням методу "петч-клемп" у конфігурації реєстрації від цілої клітини в сполученні з методикою позаклітинної стимуляції окремого синаптичного закінчення в розчині, що вміщує ТТХ.

Викликані ГПСС виникали як відповідь на короткі (3-5 мс) деполяризуючі імпульси струму, що пропускаються через скляний мікроелектрод, заповнений позаклітинним розчином (рис.3А). Стимуляція проводилася безпосередньо в зоні досліджуваного синаптичного закінчення, зрушення стимулюючого електроду безпосередньо від центра досліджуваної поодинокої терміналі (точка R0) на 2-3 мкм у будь-якому напрямку (позначено колом з діаметром 3 мкм, точка R) приводило до повного зникнення викликаної постсинаптичної відповіді навіть у випадку збільшення стимулюючого струму і вихідної напруги в два рази (рис. 3Б). Амплітуда середніх викликаних ГПСС мала лінійну залежність від величини підтримуваного потенціалу з величиною потенціалу реверсії –16±4 мВ (n = 4). Рівноважний потенціал, розрахований по рівнянню Нернста для використаних концентрацій іонів хлору, складав –19 мВ. Додавання специфічного блокатора ГАМК-рецепторів – бікукуліна - в концентрації 2мкМ приводило до повного й оборотного зникнення викликаних струмів. Таким чином, зареєстровані вГПСС були ідентифіковані як ГАМК-індуковані Cl- струми.

Середні параметри часового ходу вГПСС оцінювалися для обраних струмів з рівними амплітудами в кожнім з 10 досліджених поодиноких синапсів. Час до піка оцінювався по наростаючій частині струму від 10% до 90% пікової амплітуди. Час до піка для вГПСС, що мали різні амплітуди, був однаковим і складав 1.1±0.4 мс (n=32).

Спад вГПСС найкраще описувався сумою двох експонент. Постійні часу для експонент, що описують спад струму, були