УкраЇнсЬка академІЯ аграрнИх наук

ІНСТИТУТ ЕКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЇ І КЛІНІЧНОЇ

ВЕТЕРИНАРНОЇ МЕДИЦИНИ

Гадзевич Дмитро Вікторович

УДК 619:616.98:578.831.11:616-078

РОЗРОБКА ЗАСОБІВ ТА МЕТОДІВ ДІАГНОСТИКИ ІНФЕКЦІЙНОЇ БУРСАЛЬНОЇ ХВОРОБИ

16.00.03 - ветеринарна мікробіологія та вірусологія

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата ветеринарних наук

Харків 2001

Дисертацією є рукопис

Робота виконана в лабораторії індикації збудників інфекційних хвороб Інституту експериментальної і клінічної ветеринарної медицини Української академії аграрних наук

Науковий керівник: | кандидат ветеринарних наук Бабкін Михайло Валерійович, Інститут експериментальної і клінічної ветеринарної медицини УААН, завідувач лабораторії індикації збудників інфекційних хвороб

Офіційні опоненти: | доктор ветеринарних наук, професор, член-кореспондент УААН Герман Вячеслав Валентинович, Інститут експериментальної і клінічної ветеринарної медицини УААН, завідувач лабораторії вивчення хвороб птиці

кандидат ветеринарних наук Смолянінов Володимир Константинович, Харківський зооветеринарний університет Міністерства аграрної політики України, доцент кафедри епізоотології

Провідна установа: | Кримський державний аграрний університет Міністерства аграрної політики України, кафедра мікробіології та вірусології, м Сімферополь

Захист дисертації відбудеться “ 31 “ жовтня 20001 р. о 1300 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 64.359.01 при Інституті експериментальної і клінічної ветеринарної медицини УААН за адресою: 61023, м. Харків, вул. Пушкінська, 83.

З дисертацією можна ознайомитися в бібліотеці Інституту експериментальної і клінічної ветеринарної медицини УААН за адресою 61023, Харків, вул. Пушкінська, 83.

Автореферат розісланий “ 28 “ __вересня__ 2001 р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради,

доктор ветеринарних наук, професор КОНАРЖЕВСЬКИЙ К.Є.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. У сучасних умовах ведення галузі птахівництва однією з найбільш актуальних проблем є інфекційна бурсальна хвороба (ІБХ). Це захворювання широко розповсюджене в багатьох країнах світу і завдає промисловому птахівництву значних економічних збитків (German V.V., Krasnicov G.A., Berhane Y., 1995, Гусев Е.В., Сатина Т.А., 1999). Поряд з прямими збитками, це: загибель молодняка іноді до 50 % і вище, зниження продуктивності, змушене вибракування, додаткові витрати на годівлю і на проведення оздоровчих та профілактичних заходів, хвороба є серйозною проблемою внаслідок розвитку у інфікованих курчат імуносупресії (McFerran J., 1993, Красніков Г.А., Герман В.В., 1995, Mobiuddin S.M., 1996).

Хвороба може перебігати субклінічно, атипово та в асоційованій формі з іншими захворюваннями, що ускладнює та затримує постановку діагнозу (Радчук Л.А., 1982, Snyder D.B., 1990, Герман В.В., Красніков Г.А., 1994, Берхане Й., 1995, Борисов А.В., 1997, Сюрин В.Н., 1998, Вербицький П.І., 2000). Ефективність організації комплексних протиепізоотичних заходів залежить від наявності чутливих, специфічних та експресних методів діагностики. Помилковий або несвоєчасно поставлений діагноз приводить до значних економічних і соціальних збитків (Герман В.В., Красніков Г.А., Берхане Й.В, 1994, Герман В.В., Бусол В.О., 1995, Bayari G.R et. al., 1996). На цей час у нашій країні відсутні експрес-методи індикації збудника інфекційної бурсальної хвороби, тому розробка й удосконалення методів діагностики є актуальною проблемою й потребує невідкладного вирішення.

Необхідність в розробці й впровадженні в ветеринарну практику специфічних і експресних тест–систем діагностики ІБХ обумовила розвиток напрямку наукового дослідження й тему дисертаційної роботи.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Роботу виконували відповідно до державного завдання 07.01, номер державної реєстрації 0197V000760 - “Розробити комплексну систему діагностики та специфічної профілактики хвороби Гамборо”.

Мета та задачі досліджень. Мета роботи - розробити та впровадити в лабораторну практику для індикації збудника ІБХ реакцію імунофлуоресценції, визначити її діагностичну цінність.

Основні задачі досліджень:

-

-

-

-

Обєкт дослідження: методи діагностики інфекційної бурсальної хвороби, біологічні властивості збудника.

Предмет дослідження: технологія отримання й контролю компонентів реакції імунофлуоресценції для діагностики інфекційної бурсальної хвороби, біологічні системи для накопичення вірусу ІБХ та режими його культивування.

Методи дослідження: кількісне й якісне визначення антитіл та антигену вірусу здійснювали за допомогою серологічних реакцій: реакції непрямої гемаглютинації (РНГА), реакції дифузної преципітації (РДП), прямої реакції імунофлуоресценції (РІФ), непрямої реакції імунофлуоресценції (НРІФ), реакції зустрічного імуноелектрофорезу (РЗІЕФ), імуноферментного аналізу (ІФА). За допомогою загальноприйнятих вірусологічних методик проводили: виділення, культивування та накопичення вірусу ІБХ на чутливих лабораторних моделях; визначення інфекційної активності вірусу; вивчення пермісивності біологічних систем до вірусу та режимів культивування вірусу. За допомогою біохімічних методів проводили: виділення імуноглобулінів із сироваток крові та конюгування останніх із флюорохромом, кількісне визначення вмісту білка в біологічних рідинах, електрофорез в ПААГ. Методами біологічної статистики визначали вірогідність отриманих результатів.

Наукова новизна отриманих результатів. Уперше в Україні для діагностики ІБХ птиці розроблена та запропонована реакція імунофлуоресценції. Розроблено та відпрацьовано регламент одержання й контролю компонентів “Набору для діагностики інфекційної бурсальної хвороби методом імунофлуоресценції”.

Уперше вірус ІБХ, штам УМ-93 було адаптовано до перещеплюваної лінії клітин легенів ембріона корови (ЛЕК). Показана ефективність використання цієї клітинної системи для накопичення вірусу ІБХ. Установлена можливість підвищення репродукції вірусу при оптимізації умов культивування та адаптування вірусу до клітинної культури.

Уперше вивчена та запропонована для використання флуоресціююча речовина - 1,5-піперидил-3,7-БІС піримідил ізовалеріанат в імуноаналізі як люмінесцентний маркер специфічних до вірусу ІБХ антитіл.

Практичне значення отриманих результатів. Результати досліджень використані при розробці нормативної документації (технічних умов, інструкції по виготовленню й контролю та настанови по використанню) на “Набір для діагностики інфекційної бурсальної хвороби методом імунофлуоресценції”, яка розглянута та схвалена методичною комісією ІЕКВМ з інфекційної патології (протокол № 5 від 31.03.2000).

Вивчені фізико-хімічні властивості специфічного до вірусу ІБХ люмінесцентного конюгату, міченого флуоресціюючою речовиною 1,5-піперидил-3,7-БІС піримідил ізовалеріанат, що підтверджено патентом України (№ 37622 від 10.03.2000 р., МПК G01N33/532).

Особистий внесок здобувача. Експериментальні дослідження, аналіз отриманих даних та їх узагальнення виконані дисертантом особисто. Відпрацювання очищення та концентрування вірусу ІБХ методом ультрацентрифугування у градієнті щільності сахарози проводили в Інституті проблем кріобіології і кріомедицини НАНУ.

Апробація результатів дисертації. Основні положення дисертації доповідали й обговорювали на засіданнях і звітних сесіях вченої і методичної ради ІЕКВМ УААН (м. Харків, 1997-2000 рр.), науково-практичних конференціях: “Інфекційна патологія молодняка сільськогосподарських тварин і птиці” (9-10 червня 1999 р., м. Суми); “Стан та перспективи розвитку ветеринарної науки” (11-13 березня 1999 р., м. Харків); “Прогрессивные технологии ветеринарной медицины в промышленном птицеводстве ХХІ века” (4-6 квітня 2000 р., м. Київ); “Ветеринарная наука на пороге ХХІ века” (15-16 листопада 2000 р., м. Харків) та семінарах з підготовки лікарів вірусологічних відділів обласних лабораторій ветеринарної медицини. Проведені міжлабораторні та виробничі комісійні випробування “Набору для діагностики інфекційної бурсальної хвороби методом імунофлуоресценції”, що оформлені відповідними документами.

Публікації. За матеріалами дисертації опубліковано пять наукових праць у провідних фахових виданнях.

Структура і обсяг дисертації. Дисертація викладена на 133 сторінках машинописного тексту й складається з таких розділів: вступ, огляд літератури, матеріали та методи досліджень, результати власних досліджень, аналіз та узагальнення одержаних результатів, висновки, список використаної літератури і додатки. Роботу ілюстровано 22 таблицями, 4 рисунками, 12 фотознімками. Список використаних літературних джерел включає 170 найменувань, в тому числі 86 зарубіжних авторів. У додатку наведено 8 документів.

МАТЕРІАЛИ ТА МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ

Дослідження виконані на базі лабораторії індикації збудників інфекційних хвороб Інституту експериментальної і клінічної ветеринарної медицини УААН за період з 1997 по 2000 рік, а також птахівничих господарств східного і південного регіонів України, де проводили відбір патологічного матеріалу й сироваток крові від хворої птиці.

Для виконання поставлених завдань в роботі використовували:

Культури клітин: первинно-трипсинізовану культуру клітин фібробластів ембріонів курей (ФЕК), перещеплювані лінії клітин: легенів ембріона корови (ЛЕК), нирки ембріона свиней (СНЕВ), нирки свині (РК-15), нирки великої рогатої худоби (МDВК), нирки теляти (НТ), тестикули поросяти (ПТП).

Віруси: вакцинні штами вірусу ІБХ: “УМ-93” (5,3-7,3 lg ЕІД 50/см3), “БГ” (6,3-6,9 lg ЕІД 50/см3), “Вінтерфілд” (5,7-7,1 lg ЕІД 50/см3), “Біо- БУРС” (5,2-6,3 lg ЕІД 50/см3); вірус інфекційного ларинготрахеїту, штам “ВНДІХП” (6,3 lgЕІД 50/см3); вірус хвороби Нюкасла, штам “Ла-Сота” (7,5 lg ЕІД 50/см3); вірус інфекційного бронхіту птахів, штам “Н-120” (6,3 lg ЕІД 50/см3). Польові ізоляти вірусу ІБХ: “У-98”, “Ч-98”, “З-98”, “С-98”, “У-99”. Ізоляти були отримані при проведенні досліджень патологічного матеріалу від хворої птиці з птахогосподарств Кримської, Дніпропетровської, Чернігівської та Сумської областей.

Сироватки: специфічна до вірусу ІБХ гіперімунна сироватка кролів (10,0 log2 в РН) та курей (9,0 log2 в РН); антивидова сироватка кролів проти імуноглобулінів птиці (5 lоg2 в РДП). Сироватки були отримані в ІЕКВМ УААН.

Лабораторні тварини та інші біологічні об'єкти. У роботі було використано: 700 курчат 20-60-денного віку породи білий Леггорн та Рід Айленд, 26 кролів масою 2-4 кг породи Шиншила, 16 півнів масою 1,4-2 кг породи білий Леггорн і 1750 курячих ембріонів.

Флюорохроми: флуоресцеїнізотіоціанат (ФІТЦ, фірма Merk, Германія), 1,5–піперидил-3,7–біс-піримідил ізовалеріанат (ППІ, ІЕКВМ УААН).

Фермент – пероксидаза хрону (Serva, Германія, RZ=3,0).

Комерційні діагностичні системи: сироватка діагностична, люмінесцентна проти імуноглобулінів кроля, суха (НДІЕМ ім. М.Ф. Гамалеї, Росія); набір для діагностики інфекційної бурсальної хвороби в РДП, виробництва ВНДІХП (С.-Петербург); еритроцитарний діагностикум для визначення специфічних до вірусу ІБХ антитіл (ІЕКВМ УААН).

Інфекційну активність вірусу визначали шляхом його титрування на курячих ембріонах та культурах клітин ФЕК і ЛЕК (Перадзе Т. В., 1985). ЛД 50 розраховували за методом Ріда і Менча (1938).

Первинно-трипсинізовану та перещеплювані культури клітин вирощували в культуральних флаконах та в пробірках зі скляними пластинами за загальноприйнятим методом (Сергеев В.А., Собко Ю.А., 1990). Культуру ФЕК готували методом, запропонованим Dulbеcо i Voget у модифікації Ягнера (1954). Для вивчення пермісивності культур клітин до вірусу ІБХ проводили інфікування клітин вірусом ІБХ, штам УМ-93 у дозі 1000 ЕІД 50/см3 стандартним методом (Сюрин В.Н., 1991). Для визначення режимів культивування вірусу ІБХ на культурах клітин проводили інфікування клітин вірусом у дозі 0,1-0,0001 ТЦД 50/клітину та подальшим культивуванням при температурі 35-39 С.

Для визначення умов культивування вірусу ІБХ в курячих ембріонах проводили інфікування ембріонів 8-12-денного віку інкубування різними дозами вірусу на ХАО, в алантоїсну порожнину, в амніон та в жовтковий мішок (Сюрин В.Н., 1991).

Для детекції специфічних до вірусу ІБХ антитіл, визначення сероконверсії та індикації збудника використовували серологічні методи: РНГА, РН, РДП, РІФ, НРІФ, РЗІЕФ, гістохімічний варіант ІФА. РНГА, РДП, НРІФ проводили з використанням комерційних діагностичних тест-систем згідно чинних настанов.

Імунопероксидазні конюгати одержували методом перйодатного окислення по методиці M.B. Wilson, P.K. Nakane (1978). Визначення специфічності й активності конюгатів, а також проведення реакції здійснювали згідно методики Д. Кетті і Ч. Райкундаліа (1991).

Імунофлуоресціюючі конюгати одержували з використанням флюорохромів ФІТЦ та ППІ. Вивчення якості отриманих флуоресціюючих конюгатів здійснювали за загальноприйнятим методом з використанням позитивних та негативних тест-об’єктів (Сюрин В. М. т. ін., 1986). Реакцію проводили та обліковували згідно методики G. M. Allen (1984).

Реакцію зустрічного імуноелектрофорезу проводили в 1 % агарі Дифко на 0,05 М веронал–мединаловому буфері (рН 8,6), при силі току 4 мА на 1 см ширини пластини та при напрузі 180-200 В, протягом 120 хвилин. Лінії преципітації в гелі проявляли 1 % розчином амідочорного (Джавадов Е.Д., 1988).

Виділення імуноглобулінів з імунних сироваток проводили осадженням сульфатом амонію (Лефковитес І. т. ін., 1988) та ПЕГом-6000 (Джавадов Е.Д, 1988), іонообмінною хроматографією (Досон Р. т. ін., 1991), гельфільтрацією з використанням сефадексу G–200 (Нго Т.Т. т. ін., 1988) та сульфат–іонообмінним методом (Kulkarni D.D. еt. al., 1983).

Статистичну обробку результатів досліджень проводили за загальноприйнятими методами (Урбах В.Ю., 1964, Рокицкий П.Ф., 1973). Облік результатів здійснювали за допомогою персонального комп’ютера IBM PC/AT програми “Excel -2000”.

РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ

Вивчення біологічних властивостей вірусу інфекційної бурсальної хвороби. При вивченні чутливості первинно-трипсинізованих та перещеплюваних культур клітин до вірусу ІБХ, установлено, що рівень накопичення вірусу залежить від виду клітинної культури та пасажного рівня. Найбільш активно вірус ІБХ розмножувався в культурі ФЕК та ЛЕК (табл. 1). За даними РІФ в інфікованих клітинах культур спостерігали зони специфічної флуоресценції – фокуси флуоресценції (ФФ). Кожний ФФ складався з різної кількості уражених клітин - від 2-3 до декількох десятків, та мав вигляд яскраво-зеленої флуоресціюючої зони з ледь проглядаючою клітинною структурою. На більш пізніх стадіях накопичення вірусу в уражених клітинах, ФФ мали вигляд конгломератів жовто-зеленого світіння без вираженої клітинної структури.

Такі культури клітин, як СНЕВ, МDВК, РК-15, ПТП були менше чутливими до вірусу. Цитопатичну дію вірусу не спостерігали, або вона реєструвалась в залежності від пасажного рівня вірусу.

Таблиця 1

Визначення чутливості культур клітин до вірусу інфекційної бурсальної хвороби (ІБХ), ш. УМ-93

Вид культури клітин | Рівень пасажу вірусу в культурі клітин

Титр вірусу, lg ТЦД 50/см3 | Результати дослідження в РІФ

І пасаж | ІІ пасаж | ІІІ пасаж | І пасаж | ІІ пасаж | ІІІ пасаж

ФЕК | 5,50,1 | 6,10,1 | 6,6±0,2 | + | + | +

ЛЕК | 4,10,2 | 4,40,1 | 5,1±0,1 | + | + | +

СПЕВ | в. ЦПД | 1,50,7 | 1,7±0,8 | + | + | +

МDВК | в. ЦПД | 2,30,3 | 1,6±0,7 | + | + | +

РК-15 | в. ЦПД | в. ЦПД | в. ЦПД | + | + | +

ПТП | 1,5±0,7 | 1,7±0,8 | в. ЦПД | + | + | -

НТ | в. ЦПД | в. ЦПД | в. ЦПД | - | - | -

Примітка: + позитивні результати РІФ; - негативні результати РІФ;

в. ЦПД - відсутність цитопатичної дії вірусу.

Культура клітин НТ була непридатна для культивування вірусу. При проведенні трьох прямих пасажів вірус не розмножувався в клітинах, про що свідчить відсутність цитопатичної дії вірусу та негативні результати РІФ.

При вивченні впливу пасажного рівня вірусу на ступінь накопичення вірусної маси встановлено, що при проведенні послідовних пасажів вірусу ІБХ на лініях клітин ФЕК та ЛЕК відбувається спочатку збільшення титру вірусу до 3-4 пасажу, а потім зменшення накопичення вірусу з кожним послідуючим пасажем (табл. 2).

Таблиця 2

Накопичення вірусу ІБХ, штам УМ-93 в первинній та перещеплюваній культурах клітин в залежності від рівня пасажу

Культура клітин | Рівень пасажу вірусу в культурі клітин / Титр вірусу, lg ТЦД 50/см3

І пасаж | ІІ пасаж | ІІІ пасаж | ІV пасаж | V пасаж | VІ пасаж

ФЕК | 5,50,1 | 6,10,1 | 6,6±0,2 | 6,8±0,1 | 6,5±0,2 | 6,6±0,2

ЛЕК | 4,10,2 | 4,40,1 | 5,1±0,1 | 4,8±0,2 | 4,2±0,3 | 4,1±0,5

У ході дослідів було установлено, що для стабільної репродукції вірусу ІБХ, штам УМ-93 в культурі клітин ЛЕК, необхідно проводити проміжні пасажі вірусу на курячих ембріонах. Оптимальним було проведення 3 прямих пасажів вірусу на культурі ЛЕК та 3 послідовних проміжних пасажів на курячих ембріонах. Ця схема культивування забезпечувала високий та стабільний рівень накопичення вірусу. Після проведення 2 циклів культивування вірусу (кожний цикл складався з 3 пасажів на ЛЕК, 3 - на КЕ та знову 3 пасажів на ЛЕК) спостерігали збільшення накопичення вірусу в культурі ЛЕК до 5,40,3 lg ТЦД 50/см3. При подальшому культивуванні збудника ІБХ на культурі ЛЕК протягом 10 пасажів спостерігали стабільне накопичення вірусу із середньою інфекційною активністю 5,30,4 lg ТЦД 50/см3.

При вивченні умов та режимів культивування збудника ІБХ, штам УМ-93 в культурах клітин ЛЕК та ФЕК встановлено, що вихід вірусу був найвищим при зараженні в період енергійного розмноження клітин, при 100 % формуванні моношару клітин, і знижувався на 0,5-1,5 lg ТЦД 50/см3 при інфікуванні культур в стаціонарній фазі росту клітин. Оптимальна доза інфікування - 0,01-0,001 ТЦД 50/клітину. Найбільш сприятливою для накопичення вірусу була температура 38С та 39С, яка забезпечує високий рівень накопичення вірусу в клітинах. При зниженні температури інкубації до 35-37С спостерігали зменшення накопичення вірусу на 1,0 – 0,3 lg ТЦД 50/см3.

При проведенні досліджень по визначенню оптимального режиму культивування вірусу інфекційної бурсальної хвороби в курячих ембріонах установлено, що для підвищення виходу вірусу необхідно інфікувати ембріони 9-11-добового віку на ХАО, вірусом ІБХ (штам УМ-93 і БГ) у дозі 100-1000 ЕІД 50/см3 з подальшим культивуванням при температурі 37-38С. При дослідженні локалізації та динаміки накопичення вірусу в курячих ембріонах підтверджено, що вірус максимально накопичується в тулубі курячого ембріона, в ХАО та в алантоїсній рідині через 96 годин з моменту зараження (табл. 3).

Таблиця 3

Динаміка накопичення вірусу ІБХ, штам УМ-93 в курячих ембріонах

Строки після ін-фікування, годин | Вид матеріалу / Титр вірусу, lg ЕІД 50/см3

Алантоїсна рідина | Хоріоналантоїсна оболонка | Тулуб зародка | Кінцівки і голова зародка

24 | - | 1,2±0,6 | 1,4±0,7 | -

48 | 2,3±0,2 | 2,9±0,2 | 3,2±0,3 | -

72 | 4.6±0,2 | 5,8±0,3 | 6,2±0,3 | 1,2±0,6

96 | 5,1±0,1 | 6,3±0,2 | 7,4±0,2 | 1,9±0,2

120 | 3,4±0,2 | 6,1±0,2 | 7.1±0,2 | н/д

Примітка. н/д - не досліджували

Відпрацювання мікрометоду титрування вірусу ІБХ. Було відпрацьовано режим культивування культури ФЕК в мікропланшетах та постановку мікрометоду титрування вірусу ІБХ. Установлено, що оптимальна посівна концентрація клітин ФЕК складає 5 х 10 клітин/см3, а як ростове живильне середовище необхідно використовувати середовище Ігла з додаванням 3 % геоссену і 8 % нормальної сироватки великої рогатої худоби. Дотримування цих параметрів забезпечувало швидкий ріст клітин та виповнення моношару у всіх лунках панелі за 24 години. При визначенні концентрації клітин меншій або більшій 5 х 10 клітин/см3 та інших комбінацій ростового середовища спостерігали нерівномірній ріст клітин у лунках планшет та збільшення часу формування монашару.

Були проведені дослідження по оцінці ефективності титрування вірусу ІБХ мікрометодом та макрометодом. Для цього одночасно макро- і мікрометодом проведена титрація 10 зразків вірусного матеріалу. Статистичний аналіз отриманих даних свідчить про відсутність вірогідної різниці між титрами вірусу визначених за допомогою макро- і мікрометоду. Визначення інфекційної активності вірусу ІБХ мікрометодом в порівнянні з макрометодом є більш економічним і простішим в проведенні і обліку. Це є підставою вважати доцільним впровадити у вірусологічну практику титрування вірусу інфекційної бурсальної хвороби мікрометодом.

Розробка та застосування реакції імунофлуоресценції для діагностики ІБХ. Був розроблений метод очищення й концентрування вірусу ІБХ, який складався з трьох етапів: обробки вірусного матеріалу хлороформом до кінцевої концентрації 20 %, висолювання вірусу сірчанокислим амонієм до кінцевої концентрації 25 %, ультрацентрифугування в градієнті щільності сахарози за методикою Г.І. Кривоноса зі співавторами (1998).

Перші два етапи забезпечували попереднє очищення вірусу та концентрування вірусної маси в 10 раз. Третій етап дозволив сконцентрувати масу вірусу в 100 раз та максимально очистити від баластних речовин. Вихід вірусу був 0,05 %. Титр очищеного й концентрованого вірусу ІБХ після заключного третього етапу був 7,30,2 lg ТЦД 50/см3, в порівнянні з початковою інфекційною активністю 6,30,1 lg ТЦД 50/см3. За даними електрофорезу в ПААГ фракції вірусу після 3 етапу були гомогенні та містили незначні сліди інших білків.

При відпрацюванні методів виділення специфічних до вірусу ІБХ імуноглобулінів з імунних сироваток установлено, що оптимальний є сульфат–іонообмінний метод, який в порівнянні з іншими методами забезпечував збереження активності препарату та максимальну очистку від баласту (табл. 5).

Таблиця 5

Порівняльна оцінка методів виділення імуноглобулінів із сироватки крові

Матеріал | Метод виді-лення імуно-глобулінів | Об’єм (см3) | Концентрація білка, мг/см3 | Сума білка, мг | Вихід білка, % | Титр в РНГА, log2 | Титр в НРІФ, log2

Сироватка | - | 10,0 | 52,01,7 | 520,0 | - | 8,30,2 | 7,20,1

Імуноглобулін | Осадження сульфатом амонію | 5,0 | 11,00,3 | 55,0 | 10,6 | 9,00,1 | 8,30,2

Осадження ПЕГ-6000 | 5,0 | 9,20,5 | 46,0 | 8,8 | 6,80,3 | 6,40,1

Іонообмінна хроматографія | 5,0 | 8,10,4 | 40,5 | 7,8 | 8,80,2 | 7,80,2

Сульфат-іонообмінний метод | 5,0 | 7,60,3 | 38,0 | 7,3 | 8,80,3 | 7,50,3

Гельфільтрування за допомогою сефадексу G-200 | 5,0 | 7,90,8 | 39,0 | 7,5 | 6,90,1 | 6,50,1

У ході роботи розроблено метод конюгування антитіл ФІТЦ, який дозволяє отримувати високоспецифічні й активні діагностичні флуоресціюючі препарати. Враховуючи такі критерії, як активність, специфічність та тест на співвідношення флуорохром/білок отриманих конюгатів, було встановлено, що при конюгуванні оптимальним є використання ФІТЦ в концентрації від 20,0 до 24,0 мг/г білка.

Вивчені фізико-хімічні властивості речовини 1,5–піперидил-3,7–біс-піримідил ізовалеріанат (ППІ), яка характеризується флуоресціюючими властивостями. Установлено, що при кон’югуванні імуноглобуліну з ППІ оптимальна рН реакційної суміші - 7,1-7,2; концентрація флуоресціюючого барвника – 0,05 % в кількості 7-9 мкг/г білка, а концентрація білка - 5-6 %. Установлено, що новосинтезована флуоресціююча речовина стійка до світла, має просту методику конюгації, залишається стабільною протягом року після конюгації та не змінює спектр флуоресценції. Результати досліджень свідчать, що ППІ є перспективним для впровадження в імуноаналіз як люмінесцентний маркер.

З врахуванням результатів, одержаних при розробці методів і режимів накопичення, очищення та концентрування вірусу ІБХ, отримання гіперімунних сироваток, виділення імуноглобулінів та конюгування їх флюорохромами, були виготовлені дослідні серії специфічних до вірусу ІБХ діагностичних флуоресціюючих імуноглобулінів, мічених ФІТЦ і ППІ. При оцінці якості отриманих препаратів установлено, що вони специфічні, мають високу активність, робочий титр складав 4,40,2 lоg2 та 4,50,3 lоg2. Активність флуоресціюючих препаратів залишалася стабільною протягом року після конюгації. Для порівняльної оцінки якості отриманих антитіл, мічених ППІ і ФІТЦ відносно комерційної люмінесцентної сироватки, в РІФ було досліджено 232 препарати. При цьому не встановлено статистично вірогідної різниці між числом одержаних позитивних результатів і використаними різними кон’югатами.

При дослідженні патологічного матеріалу, відібраного в різні строки після інфікування курчат, було встановлено, що методом імунофлуоресценції вірус виявлявся в мазках-відбитках, виготовлених з бурси та нирок курчат, вже через 18 годин після інфікування (табл. 6).

Таблиця 6

Результати виявлення вірусу ІБХ в органах інфікованих курчат за допомогою РІФ

Вид мате-ріалу | Термін після інфікування, годин/діб (%, М m)

18 г | 24 г | 48 г | 72 г | 4 діб | 5 діб | 7 діб | 10 діб | 13діб | 15 діб

Бурса | 26,68,0 | 89,05,7 | 100,0 | 100,0 | 100,0 | 100,0 | 100,0 | 36,6

8,7 | 5,0

4,8 | 3,3

3,2

Нирка | 20,07,3 | 70,08,3 | 100,0 | 100,0 | 100,0 | 100,0 | 100,0 | 33,3

8,6 | 5,0

4,8 | -

Селезі-нка | 6,66,4 | 16,66,7 | 53,39,1 | 60,08,9 | 66,68,6 | 63,38,7 | 43,39,0 | 3,3

3,2 | - | -

Печінка | - | - | 24,07,7 | 40,09,7 | 44,09,9 | 44,09,9 | 28,08,1 | - | - | -

Цекальні залози | - | - | 5,2

5,0 | 32,09,3 | 44,09,9 | 44,09,9 | - | - | - | -

Тимус | - | - | - | 5,25,0 | 5,25,0 | - | - | - | - | -

Мозок | - | - | - | - | - | - | - | - | - | -

Серце | - | - | - | - | - | - | - | - | - | -

Легені | - | - | - | - | - | - | - | - | - | -

Примітка. - вірус ІБХ не виявлено

При люмінесцентній мікроскопії мазків-відбитків в уражених клітинах, що містили специфічний вірусний антиген бурсальної хвороби, спостерігали флуоресценцію у вигляді дифузного та гранулярного світіння в цитоплазмі від яскраво-зеленого до зелено-жовтого кольору. Уражені клітини виявляли поодинокими або невеликими групами. Частіше спостерігали фокусне розміщення уражених клітин – група із 3-6 клітин, іноді зустрічали конгломерати жовто–зеленого кольору з клітинною структурою, яка ледь помітна. В мазках-відбитках, виготовлених з таких тканин, як цекальні залози, тимус частіше спостерігали поодинокі уражені клітини з гранулярним світінням цитоплазми яскраво-зеленого кольору. У клітинах культур ФЕК та ЛЕК методом імунофлуоресценції вірус інфекційної бурсальної хвороби виявляли через 18-20 годин після їх інфікування. В мазках-відбитках виготовлених з нирок, бурси й селезінки інфікованих курячих ембріонів специфічну флуоресценцію спостерігали через 20 годин після зараження.

Визначення діагностичної ефективності реакції імунофлуоресценції в порівнянні з іншими лабораторними тестами. Була проведена порівняльна оцінка діагностичної ефективності реакції прямої та непрямої імунофлуоресценції, імуноферментного аналізу, реакції дифузної преципітації, реакції зустрічного імуноелектрофорезу. Результати одержані в цих реакціях порівнювали з НРІФ. Одночасно було досліджено 48 зразків патологічного матеріалу позитивних (за даними НРІФ) та 20 проб негативних. Більше всього співпадання результатів відмічено за даними НРІФ, РІФ та ІФА (табл. 7).

Таблиця 7

Результати порівняльної оцінки ефективності методів діагностики ІБХ

Метод | Позитив-них проб | Негатив-них проб | Всього | Відсоток збігу, %

позитивних та негатив-них результатів, Мm | всього

НРІФ | 48 | 20 | 68

РІФ | + | 48 | 0 | 48 | 100,0 | 100,0

- | 0 | 20 | 20 | 100,0

ІФА | + | 47 | 0 | 47 | 97,91,8 | 98,01,5

- | 1 | 20 | 21 | 100,0

РЗІЕФ | + | 38 | 1 | 42 | 79,14,9 | 83,84,5

- | 7 | 19 | 26 | 95,02,7

РДП | + | 34 | 0 | 34 | 70,15,5 | 79,44,9

- | 14 | 20 | 34 | 100

Проведені дослідження по визначенню локалізації та строків виявлення вірусу ІБХ в чутливих біологічних системах за допомогою різних лабораторних методів. За допомогою РІФ, НРІФ та ІФА вірус ІБХ виявляли в бурсі, нирках та селезінці птиці вже через 18-20 годин. За даними РЗІЕФ та РДП антиген вірусу виявляли в бурсі тільки через 72 години після інфікування курчат. За допомогою РІФ, НРІФ та ІФА вірус ІБХ виявляли в бурсі, селезінці, нирках, печінці та цекальних залозах, а в РДП та РЗІЕФ тільки в бурсі, та в селезінці на 5-6 день після інфікування. За допомогою РІФ та ІФА вірус виявлявся в бурсі та нирках протягом 10 - 13 днів після інфікування, а РЗІЕФ та РДП- 7-8 днів після зараження.

Установлено, що для проведення діагностики методами РІФ, НРІФ, ІФА найкраще використовувати бурсу і нирки, де вірус ІБХ накопичується у великій кількості і виявляється як на ранніх, так і більш пізніх стадіях інфекційного процесу. РДП та РЗІЕФ ефективні при дослідженні бурси птиці, яка була відібрана в строк 3 – 8 діб після інфікування птиці.

ВИСНОВКИ

1.

2.

3.

4.

5.

6.

7.

8.

9.

ПУБЛІКАЦІЇ

1.

2.

3.

4.

5.

Гадзевич Д. В. Розробка засобів та методів діагностики інфекційної бурсальної хвороби. - Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата ветеринарних наук за спеціальністю 16.00.03 - ветеринарна мікробіологія та вірусологія. Інститут експериментальної і клінічної ветеринарної медицини УААН, Харків, 2001.

На базі проведених досліджень розроблено та запропоновано для експрес-діагностики інфекційної бурсальної хвороби “Набір для діагностики інфекційної бурсальної хвороби методом імунофлуоресценції”. Визначена технологія одержання й контролю компонентів діагностичного набору. Підібрані та оптимізовані методи: накопичення, очищення та концентрування вірусу ІБХ; отримання гіперімунних сироваток; виділення імуноглобулінів із сироваток та конюгування їх із флюорохромом. Вивчені деякі біологічні властивості вірусу ІБХ та особливості патогенезу хвороби. Визначена діагностична цінність РІФ, проведена порівняльна оцінка її та існуючих лабораторних тестів.

Ключові слова: інфекційна бурсальна хвороба, курчата, діагностика, реакція імунофлуоресценції, флуоресціюючі конюгати.

Gadzaevich D.V. Development of means and methods to diagnose infections bursal disease. - Manuscript.

The dissertation thesis for the scientific degree of candidate of veterinary sciences by the subject 16.00.03 - veterinary microbiology and virysology. Institute of Experimental and Clinical Veterinary Medicine UAAS, Kharkоv, 2001.

On the basis of the experiments that have been conducted “The kit for diagnosis infections bursal disease by immunofluorescence” has been worked out and proposed for rapid diagnosis of infections bursal disease. The technology to receive and control the diagnostics kit the components has been determined. Methods to accumulate, clean and concentrate IBD virus, to receive the hyperimmune serum; to isolate immunoglobulins from serum and to conjugate them by fluorochrom have been defined and improved. Some biological properties of the agent of the infections bursal disease and peculiarities of the disease pathogenesis have been studied. The diagnostic value of the immunofluorescence reaction has been defined and comparative evaluation of it and the existing laboratory methods have been conducted.

Key words: infections bursal disease, chickens, diagnosis, immunofluorescence reaction, fluorochrom.

Гадзевич Д. В. Разработка средств и методов диагностики инфекционной бурсальной болезни. - Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата ветеринарных наук по специальности 16.00.03 - ветеринарная микробиология и вирусология. Институт экспериментальной и клинической ветеринарной медицины УААН, Харьков, 2001.

Проведены исследования по подбору биологической системы для культивирования вируса ИББ. Установлено, что среди исследуемых лабораторных моделей (куриные эмбрионы, клеточные культуры ФЭК, ЛЭК, MDBK, СПЭВ, РК-15, ПТП, ПТ) наиболее чувствительными к вирусу были КЭ, клеточные линии ЛЭК и ФЭК. С целью увеличения накопления вируса определены оптимальные условия и режимы культивирования. Выход вируса был самым большим при инфицировании эмбрионов 9-11-дневного возраста на ХАО, вирусом ИББ (штамм УМ-93 и БГ) в дозе 100–1000 ЭИД 50/см3 с последующим культивированием при 37С-38С в течение 96 часов. В большом количестве вирус накапливался в теле зародыша, в ХАО и в аллантоисной жидкости. Для увеличения накопления вируса в культурах ЛЭК и ФЭК необходимо инфицировать клетки на фазе 100 % формирования монослоя, вирусом ИББ, штамм УМ-93 в дозе 0,01-0,001 ТЦД 50/клетку, оптимальная температура инкубирования 38-39С.

Отработан метод очистки и концентрирования вируса ИББ, который состоит из трех этапов: обработка вирусной суспензии хлороформом до конечной концентрации 20 %, высаливание вируса сернокислым аммонием до конечной концентрации 25 %, ультрацентрифугирование в градиенте плотности сахарозы.

Подобран и отработан метод конъюгирования антител ФИТЦ. Установлено, что оптимальным является использование ФИТЦ в концентрации 20,0 - 24,0 мг/г белка.

Отработан режим конъюгирования флюорохрома ППИ с иммуноглобулинами. Установлено, что при конъюгировании белка с ППИ оптимальная рН реакционной смеси является 7,1-7,2; концентрация флюоресцирующего вещества – 0,05 % в количестве 7-9 мкг/г белка, а концентрация белка - 5-6 %. Результаты исследований свидетельствуют, что это флюоресцирующее вещество является перспективным для внедрения в иммуноанализ как люминесцентный маркер антител.

С учетом результатов, полученных при разработке методов и режимов накопления, очистки и концентрирования вируса, получения гипериммунных сывороток, выделение иммуноглобулинов из сывороток и конъюгирование их флюорохромами, были изготовлены опытные серии специфических к вирусу ИББ диагностических флюоресцирующих иммуноглобулинов меченных ФИТЦ и ППИ. Проведена оценка качества полученных конъюгатов. Установлено, что они имеют высокую специфичность и активность, рабочий титр составлял 4,60,3 lоg2 и 4,30,3 lоg2. Активность флуоресцентных препаратов оставалась стабильной в течение года после конъюгирования. Результаты сравнительной оценки полученных флюоресцирующих антител относительно коммерческой люминесцентной сыворотки, свидетельствуют об отсутствии статистически достоверной разницы между количеством позитивных препаратов, полученных при исследовании их в РИФ с использованием разных конъюгатов.

Проведена сравнительная оценка диагностической эффективности реакции прямой и непрямой иммунофлуоресценции, иммуноферментного анализа, реакции диффузионной преципитации, реакции встречного иммуноэлектрофореза. Результаты полученные в этих реакциях сравнивали относительно НРИФ. Одновременно было исследовано 48 позитивных образцов патологического материала позитивных по данным НРИФ и 20 негативных. Самое высокое совпадение результатов отмечено по данным НРИФ, РИФ и НРИФ.

Методом иммунофлуоресценции определено, что вирус бурсальной болезни накапливается в клетках фабрициевой сумки, почек, селезенки, печенки, цекальных желез и тимуса инфицированных цыплят. Выявляется в клетках фабрициевой сумки, почек, селезенки через 18-20часов после инфицирования в течение 10-13 дней. В клетках печени, цекальних желез и тимуса в пределах 36-72 часов - 5-7 дней после инфицирования. В других органах и тканях антиген не был выявлен.

Ключевые слова: инфекционная бурсальная болезнь, цыплята, диагностика, реакция иммунофлуоресценции, флюоресцирующие конъюгаты