МІНІСТЕРСТВО ОХОРОНИ ЗДОРОВ’Я УКРАЇНИ

НАЦІОНАЛЬНИЙ МЕДИЧНИЙ УНІВЕРСИТЕТ

ІМ.О.О.БОГОМОЛЬЦЯ

Гаркава Катерина Григорівна

УДК 547.9:612.017:57.023

РОЛЬ ЛІМФОЦИТАРНИХ КЕЙЛОНІВ У РЕАЛІЗАЦІЇ ІМУННОГО ГОМЕОСТАЗУ

14.03.08 - Імунологія та алергологія

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня доктора

біологічних наук

Київ - 2001

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана в лабораторії імунології Науково-дослідного лабораторного центру Національного медичного університету ім. О.О.Богомольця МОЗ України.

Науковий консультант:

доктор медичних наук, професор,

Бордонос Володимир Герасимович -завідувач лабораторії імунології Науково-дослідного лабораторного центру

Національного медичного університету ім.О.О.Богомольця.

Офіційні опоненти :

доктор біологічних наук, старший науковий співробітник Алексєєва Ірина Миколаївна., завідуюча відділом імунології і цитотоксичних сироваток Інституту фізіології ім. акад.О.О.Богомольця НАН України ;

доктор біологічних наук, професор Співак Микола Якович, завідувач лабораторії інтерферонів та імуномодуляторів Інституту мікробіології та вірусології ім.акад. Д.К.Заболотного НАН України;

доктор медичних наук, професор Чумак Анатолій Андрійович завідувач лабораторії тканинного типування і цитохімії Інституту клінічної радіології НЦРМ АМН України.

Провідна установа: Іінститут фтізіатрії та пульмонології ім.Ф.Г.Яновського АМН України.

Захист відбудеться 06.09.2001 року о 13-30 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д.26.003.02 при Національному медичному університеті ім. О. О. Богомольця

( 01023 м. Київ. вул. Шовковична 39/ 1, Центральна Міська клінічна лікарня, аудиторія кафедри шкірних та венеричних хвороб).

З дисертацією можна ознайомитися у бібліотеці Національного медичного університету ім. О. О. Богомольця ( 03057, м. Київ - 57, вул. Зоологічна 3 ).

Афтореферат розіслано 30.04.2001 року.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради,

доктор медичних наук Свирид С.Г.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Останнім часом на Україні, в зв’язку з впливом негативних факторів навколишнього середовища, наявності великої кількості важких металів, токсичних речовин, радіаційних чинників (Фролов В.М. и др., 1998; Бебешко В.Г. и др., 1991; Чу-
мак А.А. и др., 1992; Чумак А.А. 1996, 1998; Дранник Г.Н., 1994; Бичкова Н.Г.,1996), у людей послаблюється імунітет, спостерігається дисбаланс у роботі окремих його ланцюгів, виникають вторинні імунодефіцити, корекція яких є необхідною умовою здоров’я як для конкретної людини, так і для популяції в цілому. Тому пошук препаратів рослинного і тваринного походження, які можуть бути базою для нешкідливих лікарських сполук при лікуванні широко розповсюджених патологічних станів організму: аутоімунних, алергічних, лімфопроліферативних, є актуальним.

Пріоритетною проблемою сучасної медицини та біології є пошук ефективних імуномодулюючих, імунокоригуючих препаратів природного походження, які б селективно впливали на окремі ланки імунологічного контролю, зв’язані з порушенням функцій мононуклеарної фагоцитуючої системи або Т- та В-ланцюгів імунної системи організму (Гюллінг Е.В.,1996; Дранник Г.Н. и др., 1994; Хаитов Р.М. и др., 1995, 1996; Петров Р.В. и др., 1991, 1997). У багатьох оглядах і монографіях висвітлюється вплив речовин природного походження і їх синтетичних аналогів на розвиток імунної відповіді. Це і гормони тимуса (Гриневич Ю.А. и др., 1989), інтерферони (Ершов Ф.И и др., 1980; Спивак Н.Я. и др., 1994, 1997), мієлопептид кісткового мозку (Петров Р.В. и др., 1985), а також поліаніони, пептиди (Петров Р.В. и др., 1983; Лазарева Д.Н. и др., 1985; Труфакин В.А., 1985; Хаитов Р.М. и др., 1987, 1996), інтерлейкіни (Дранник Г.Н. и др., 1994; Кетлинский С.А. и др., 1993; Соколов Е.И. и др., 1998) та інші (Никитин А.В., 1986).

Імуномодулюючі засоби, які впливають на організм, діють на нього в дозо-часовому режимі і в залежності від біологічних ритмів викликають зміни в роботі імунної системи (Бакуридзе А.Д. и др., 1993; Лазарева Д.Н. и др., 1985; Хаитов Р.М. и др., 1995, 1996). Ці засоби поділяють на три групи:

а) біологічно активні речовини природного походження (Бакуридзе А.Д. и др., 1993; Лазарева Д.Н. и др., 1985);

б) біологічно активні речовини, що виробляються клітинами імунної системи (Дранник Г.Н. и др., 1994; Кетлинский С.А. и др., 1993; Петров Р.В. и др., 1985; Никитин А.В. и др., 1986);

в) синтетичні біологічно активні речовини (Хаитов Р.М. и др., 1987; Никитин А.В. и др., 1986; Петров Р.В. и др., 1983, 1985).

Арсенал імуномодуляторів, що використовується нині в медицині, великий, але це в основному препарати синтетичного походження, що мають побічну дію. Тому постійно здійснюється пошук речовин, що не мають токсичної, мутагенної, канцерогенної дії на організм, і цілеспрямовано впливають на імунну систему. Таким вимогам відповідають біологічно активні речовини природного походження – лімфоцитарні кейлони, створення з яких нових імунофармакологічних засобів дасть змогу отримати нові факти, які важливі для визначення закономірностей функціонування і регуляції імунної реактивності організму. Створення імунофармакологічних засобів для лікування і профілактики ряду захворювань висувають на перший план і пошук препаратів, які дають ефективні результати за умов діагностики імунопатологічних станів організму і визначення рівня імунодефіцитів.

У 70-80 роках стало відомо про новий клас біологічно активних речовин – кейлонів, які було отримано із 20 видів тканин. У ряді робіт (Bullough W.S., 1973, 1975; Klaus S., 1974; Garcіa-Gіralt E., 1973, 1975; Mathe G., 1972; Нeустроев Г.В., 1982; Кетлинский С.А. и др., 1980, 1984; Романов Ю.А. и др., 1984) були встановлені властивості кейлонів: вони звільняються із диференційованих клітин і гальмують їх розмноження. Дія кейлонів тканинно- і фазоспецифічна, але не видоспецифічна. Кейлони не токсичні, їх дія зворотна. Все це вказує на загальнобіологічний характер кейлонної регуляції, спрямованої на підтримку внутрішньoтканинного гомеостазу і говорить про універсальність кейлонної регуляції клітинної проліферації.

Лімфоцитарні кейлони вперше були виявлені у 70 роках (Garіa-Gіralt E et al., 1970; Kіger N., 1971; Mathe G., 1972; Moorhed J.F. et al., 1969). Було показано, що кейлони селезінки та тимуса гальмували проліферацію стимульованих ФГА лімфоцитів іn vіtro, знижували проліферацію лімфоцитів у фолікулах селезінки, лімфо-вузлів, галь-мували кількість бляшкоутворюючих клітин (Garcіa-Gіralt E. et al., 1970, 1973, 1975; Kіger N., 1971; Mathe G., 1972; Мооrhed J.F. et al., 1969; Моргунов И.Н. и др., 1980, 1981; Гаркавая Е.Г., 1983), подовжували строки приживлення шкіряних трансплантатів (N. Kіger et al., 1972; Chang A.C. et al., 1973; Кетлинский С.А. и др., 1978). Як усі кейлони, лімфоцитарний – має тканинну, а не видову специфічність. Питання про вузьку клітинну специфічність лімфоцитарних кейлонів до цього часу є відкритим.

Більшість дослідів по вивченню біологічних ефектів лімфоцитарних кейлонів носять феноменологічний характер, остаточно не з’ясовані механізми дії лімфоцитарних кейлонів на розвиток імунної відповіді організму та в реалізації імунного гомеостазу, немає однозначної відповіді відносно вузької клітинної специфічності лімфоцитарних кейлонів.

Таким чином, для подальшого вивчення властивостей лімфоци-тарних кейлонів необхідно було провести поряд з комплексними імунологічними дослідженнями визначення впливу лімфоцитарних кей-лонів на вільнорадикальні процеси і стан ліпідної матриці мембран лімфоцитів, щоб з’ясувати і уточнити механізми дії лімфоцитарних кейлонів на розвиток імунної відповіді організму для найбільш пов-ного розкриття їх ролі у підтримці клітинного гомеостазу імуноком-пе-тентної системи організму. Так як однією з основних проблем імунології є імунодіагностика порушень імунної системи, лікування, профілактика та прогнозування перебігу захворювань, то імунодіа-г-нос-тика і ідентифікація порушень різних ланок імунної системи за допомогою лімфоцитарних кейлонів дасть змогу підтвердити чи від-хилити той чи інший клінічний діагноз і знайти адекватне лікування для імунокорекції організму. Визначення місця і ролі лімфоцитарних кейлонів – ендогенних регуляторів у реалізації імунного гомеостазу при негативних впливах навколишнього середовища та при різних патологічних станах організму є новим і актуальним.

Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертаційна робота є фрагментом таких тем: “Вивчити епідеміологію та імунологію інфекцій, що викликають збудники патогенної природи, і розробити рекомендації по їх профілактиці”,
№ держреєстрації 81062408; “Вивчити функціонування мембранних структур клітин в умовах пошкодження печінки та серця різного генезу і розробити принципи направленої корекції препаратами антиоксидантів і модифікаторів кальцієвих каналів” № держреєстрації 01870034949; “Розробити спосіб отримання і вивчити загальні та імунофармакологічні властивості біологічно активних речовин природного походження, як імунодіагностичних препаратів”,
№ держреєстрації 0194U020880; “Науково обгрунтувати систему профілактичних і лікувальних засобів у дітей з захворюванням нирок, що проживають у зоні посиленого радіаційного контролю, на основі нових методичних підходів у діагностиці, реабілітації і використання ентеросорбентів у комплексній патогенетичній терапії”, № держ-реєстрації 0194U020884.

Мета і задачі дослідження. Наукове обгрунтування механізму дії лімфоцитарних кейлонів, як ендогенних регуляторів імунного гомеостазу в нормі, патології та за умов впливу негативних екологічних факторів та впровадження їх як діагностичних засобів при імунних розладах організму.

Для вирішення цієї мети були поставлені такі задачі:

1) виділити, очистити, визначити молекулярну масу і хімічний склад лімфоцитарних кейлонів;

2) дослідити вплив кейлонів, отриманих з Т- і В-популяцій лімфоцитів, на імунну відповідь до різних по Т-залежності антигенів;

3) встановити місце продукції лімфоцитарних кейлонів і визначити кейлончутливу популяцію лімфоцитів;

4) вивчити вплив лімфоцитарних кейлонів на проліферативну, продуктивну та метаболічну функцію лімфоцитів з урахуванням активності дезоксирибонуклеопротеїдного комплексу та стану рецепторного апарату;

5) вивчити динаміку продукції лімфоцитарних кейлонів і їх активність за умов імунної відповіді;

6) проаналізувати вплив лімфоцитарних кейлонів на гіперчутливість уповільненого типу;

7) визначити вплив лімфоцитарних кейлонів на функціональну активність макрофагів;

8) провести оцінку модифікаційних змін ліпідного складу мембран лімфоцитів в умовах розвитку імунної відповіді і впливу лімфоцитарних кейлонів;

9) визначити дію кейлонів на рівень вільнорадикальних процесів за умов імунної відповіді і визначити його антиокислювальні властивості;

10) розробити методи для використання досліджуваних кейлонів як діагностичних препаратів.

Об’єкт дослідження – дослідні тварини, на яких були створені такі моделі: а) модель гуморальної імунної відповіді; б) гіпер-чутли-вість уповільненої дії; в) -токоферолова недостатність (Є – авітамі-ноз); г) модель радіаційного ураження організму.

Люди, яким у віддалені строки після дії радіаційних чинників був верифікований діагноз гостра променева хвороба, а також діти з захворюванням нирок та шлунково-кишкового тракту.

Предмет дослідження – ендогенні та екзогенні лімфоцитарні кейлони, їх біологічні ефекти, стан лімфоцитарної кейлонної системи за умов норми та патології.

Методи дослідження. Виходячи з мети та завдань дослідження проведено статистичні та лабораторно-клінічні дослідження з використанням біохімічних, цитологічних, електронно-мікроскопічних, імунологічних методів.

Лімфоцитарні кейлони виділяли з бичачої селезінки та Т- і В-лімфоцитів селезінки, лімфатичних вузлів, тимуса свиней методом спиртового фракціювання (Bullough W.S., 1964). Т- і В-лімфоцити розділяли за допомогою метода розеткоутворення (Зинковская Л.Н. и др., 1988). Кейлони виділяли також з селезінки безпородних щурів, мишей та лімфоцитів крові дорослих людей та дітей.

Отримані кейлони використовували у фізіологічних розчинах. Тестували їх кількість по білку, концентрацію якого визначали на СФ-16 при – 280 нм і використовували в різних дозах в залежності від мети досліджень. У дослідах іn vіvo кейлони використовували у дозах 5 мкг/г, 10 мкг/г, 50 мкг/г, 100 мкг/г, а у дослідах іn vіtro – 0,2 мг/мл, 0,5 мг/мл, 0,7 мг/мл.

Вивчали амінокислотний склад білкової частини молекули, а також її вуглеводний компонент. Амінокислотний аналіз вилучених білкових фракцій проводили на амінокислотному аналізаторі (НД-1200 Е, ЧССР). Попередньо білкові фракції піддавали кислотному гідролізу в 6N HCl при t=105?C протягом 24 годин. Білок у гідро-ліза-тах визначали за допомогою нінгідрінової реакції (Сопін Е.Ф., Литви-нен-ко А.Р., 1972). Гексуронову кислоту в дослідних зразках визна-чали по кольоровій реакції з карбазолом (Bіtter T., Muіr H.M., 1962). Гексо-замін визначали колориметричним методом (Покровский А.А., 1969) на основі кольорової реакції пірролу з парадиметиламінобен-заль-де-гідом.

Для очищення лімфоцитарного кейлону використовували метод гель-хроматографії (Детерман Г., 1970). Фракціювання проводили на хроматографі фірми “LКВ-Recіchrom”, використовували сефадекс G-100. Для визначення молекулярної маси отриманих фракцій їх об’єми порівнювали з об’ємом виходу білків з відомою молекулярною масою. Це кристалічний людський сироватковий альбумін (мономер м.м. 68-69 кД), яєчний альбумін (м.м. 45 кД), цитохром С (м.м. 12-13 кД). Величини молекулярної маси розраховували за рівнянням залежності молекулярної маси від об’єму виходу білка.

Гостру токсичність лімфоцитарних кейлонів визначали за таблицею токсичності речовин (Измеров Н.Ф., 1977). З цією метою використовували сумарний препарат кейлону, фракції Т-кейлону з молекулярною масою 30-40 кД, 13-17 кД, 10 кД, та фракції В-кейлону з молекулярною масою 50-60 кД, 17-19 кД та >10 кД, які вводили одноразово безпородним мишам вагою 18-20 г у черевну порожнину.

Кон’югацію лімфоцитарних кейлонів проводили з флуорохромом ФІТЦ. На 1 мг кейлонів використовували 20 мкг ФІТЦ, Розчин кейлону і ФІТЦ постійно змішували на магнітній мішалці при кімнатній температурі на протязі 2-х годин. Після закінчення процесу кон’югації звільнялись від залишків ФІТЦ за допомогою методу гель-хроматографії на колонці G-25.

У роботі використовували тварин, які певний час утримувались на карантині і не мали ознак захворювання. Під час дослідів тварини знаходились у звичайних умовах, крім тих тварин, у яких моделювали Е-авітаміноз. Тварин, що зазнали дії радіаційних чинників утримували у стерильному боксі. У роботі було використано мишей лінії СВА – 90 голів, лінії С 57 ВІ – 120 голів, мишей лінії Ваlb/c –108 голів, безпородних мишей – 624 голів, щурів – 209 голів, морських свинок – 10 голів. Щурів та мишей забивали шляхом цервікальної дислокації під легким ефірним наркозом. Розподіл тварин по групах був проведений в залежності від мети досліджень.

Вивчались зразки крові дорослих пацієнтів – 36 осіб, із них 10 донорів та 26 осіб, яким у віддалені строки після дії радіаційних чинників був верифікований діагноз гостра променева хвороба в залежності від отриманої дози опромінення. Діагноз був встановлений на основі результатів клінічного, лабораторного, інструментального дослідження. Пацієнтів спостерігали через 5 років після опромінення. Зразки крові брали до отримання пацієнтами гормональних, цитостатичних і других препаратів, які впливають на імунні реакції організму.

У роботі також обстежувались діти, 60 – хворих на гломерулонефрит, 10 здорових та 30 з захворюванням ШКТ.

Визначення функціональної активності імунокомпетентних клітин проводили методом прямого Ерне (Jerne N.K., Nordіn A.A., 1963) і непрямого (Godіng G.M., 1976).

Реакцію бласттрансформації лімфоцитів на ФГА проводили по стандартній методиці з 3Н-тимідином (Фримель Г.Н., 1984).

Визначення метаболічної активності лімфоцитів за коефіцієн-том Ріглера (індекс – ) проводили методом флуоресцентного зондування на мазках крові та відбитках селезінки при довжині хвилі 530-640 нм на мікроцитофлюориметрі на базі ЛЮМАМ-3. Як флуо-рес-центний зонд використовували акридиновий-оранжевий у спів-відношенні 1:30000 на цитратофосфатному буфері (Карнаухов В.Н. и др., 1983). Визначення ДНК-синтетичної активності лімфоцитів про-во-дили методом флуоресцентного зондування. Метод дозволяє вияви-ти рівень ДНК-синтетичної активності лімфоцитів за ступенем ад-сорб-ції акридинового-оранжевого на ДНК-хроматині (Гаркавая Е.Г., Данова И.В., 1990). Інтенсив-ність флуоресценції надосадкової рідини дослідних і контрольних проб вимірювали при – 530 нм (збудження – 460 нм) на спектро-флюориметрі МРF-4 фірми “Hіtachі”, Японія.

Визначення тимідинкінази проводили за інструкцією до “РЕА- набор тимідинкиназа”. Радіоензиматичне визначення тимідинкінази для іn vіtro діагностики (Іnstіtute for research production and application of Radіoіsotopes Prague. Czechoslovakia, 1991). Цей метод базується на перетворенні 125І у йоддезоксіурідинмонофосфат (125І дУМФ), що каталізовано присутньою в пробі тимідинкіназою (Hasgberg H et al., 1984). Концентрацію ТК визначали за калібровочним графіком. Ензиматичну активність визначали у мед/л сироватки. Мед/л = 1,2 х 10 12 мол/с. Вимірювання радіоактивності проводили на установці для радіоімунологічних досліджень “ГАММА 12”.

Методом пасивної гемаглютинації по Бойдену визначали рівень аутоантитіл до тканин печінки, нирок, легенів (Вязов О.Е., 1967).

Визначення імуноглобулінів проводили методом імунохіміч-ного нефелометричного аналізу (Федорич В. Н. и др.,1992). Для вимірювання кількості імуноглобулінів у сироватці крові будували калібровочний графік вмісту Іg в стандартній сироватці крові людини згідно з інструкцією до приладу, використовуючи моноспецифічні антисироватки.

Цитотоксичну активність кілерних клітин визначали нерадіо-метричним методом, який базується на спектро-фото-метричному обліку гемоглобіну, що вийшов із зруйнованих кілерами еритроцитарних клітин-мішеней у процесі їх спільної інкубації (Чернушенко Е.Ф. и др., 1989).

Кисеньзалежний механізм бактерицидності фагоцитів визначали за НСТ-тестом (Нагоев Б.С., 1986). За середнім цитохімічним коефіцієнтом (СЦК) проводили оцінку активності пероксидазних систем (Нарциссов Р.П., 1970).

Фагоцитарну активність визначали за поглинальною реакцією фагоцитів частин латексу розміром d = 1,0-1,3 мкм (Чернушенко Е.Ф. и др., 1988).

Визначення розеткоутворюючих клітин (РУК) проводили методом спонтанного (Е-РУК) і методом комплементарного (ЕАС-РУК) розеткоутворення. Для визначення (Е-РУК) у щурів використовували еритроцити морської свинки (Фримель Г.Н., 1984).

Для оцінки рецепторів до кейлону на лімфоцитах використо-ву-вали мічені ФІТЦ тимічні кейлони з молекулярною масою 30-40 кД і 13-17 кД, а В-кейлон з молекулярною масою 50-60 кД і 17-19 кД. Об-числювали коефіцієнт експресії рецепторів до Т- і В-лімфоцитар-них кейлонів: Квк =BG2 /BG1; Ктк =ТG2 /TG1, де ВG2 і TG2 – кількість Т- і В-клітин, що мають рецептори до G2 кейлону, а ВG1 і TG1 – до G1 кейлону.

Визначення структури мембран імунокомпетентних клітин проводили методом газохроматографічного визначення спектра жирних кислот (ЖК) та вільного холестерину (ХС) на газовому хроматографі серії “Цвет-500” з полум’яно-іонізаційним детектором в ізотермічному режимі. Кількісну оцінку спектра ЖК фосфоліпідів проводили по методу нормування площ з визначенням долі кислот у відсотках, а вільного ХС – методом абсолютної калібровки.

Інтенсивність вільнорадикальних процесів у лімфоцитах оцінювали за рівнем малонового діальдегіду (МДА) у НАДФН- і аскорбат-залежних системах за умов реакції МДА з 2-тіобарбі-туровою кислотою (Владимиров Ю.А., Арчаков А.И., 1972), та по кількості дієнових кон’югатів у гептан-ізопропанолових екстрактах (Волчегорский И.А. и др., 1989).

Визначення антиокислювальної активності лімфоцитарного кейлону проводили зі стабільним радикалом – дифенілпікрилгідро-зилом (ДФПГ), який здатний реагувати з вільними радикалами і сполуками, що мають рухливі атоми водню (Починок Т.В. и др., 1989).

Відносну площу периартеріальних лімфоїдних фолікулів (Меркулов Г.А., 1961) у гістологічних зрізах селезінки вимірювали до та після використання кейлону.

Для вивчення ультраструктури лімфоцитів селезінки матеріал обробляли загальновідомими для електронної мікроскопії методами (Бирюзова В.И., 1963). Зразки продивлялися в електронних мікроскопах ЕМВ-125К, ЕМВ-100 БР.

Для оцінки кількісних перебудов клітини і клітинних органел (мітохондрій) використовували метод морфометричного аналізу, в основі якого лежать принципи стереометрії (Автандилов Г.Г., 1980).

Для експериментальних досліджень було використано декілька моделей: модель гуморальної імунної відповіді; модель реакції гіперчутливості уповільненого типу; модель Є – авітамінозу; модель радіаційного ураження організму.

Для гуморальної імунної відповіді використовували Т-залежний АГ – еритроцити барана (ЕБ) і Т-незалежний АГ – ліпополісахарид (ЛПС) Е. colі фірми (Dіfco). Мишам ЕБ вводили в дозі 4108 клітин внутрішньом’язово, а ЛПС – підшкірно в дозі 0,3 мг. Щурам вводили внутрішньом’язово 0,5 мл 15% ЕБ і ЛПС у дозі 0,5 мг. Антигени вводили одноразово.

Для індукції гіперчутливості уповільненого типу мишам, масою 18-20 г вводили у подушечку обох задніх лап по 0,05 мл 0,9% розчину NaCl, у якому містилося 106 ЕБ (Гюллинг Є.В., Самбур М.Б., 1981). Через 4 доби в праву лапку вводили 0,05 мл фізіологічного розчину, який вміщував 108 ЕБ (дослід), а у ліву – 0,05 мл фізіологічного розчину (контроль). Рівень реакції оцінювали через 24 години. Ступінь збільшення маси регіонарного підколінного лімфатичного вузла правої лапки відносно контрольного лімфатичного вузла лівої лапки виражали коефіцієнтом К.

Згідно моделі Є-авітамінозу, за умов -токоферолової недостатності в організмі виникає стан антиоксидантної недостатності (АОН). Для створення цієї моделі тварини були розділені на такі групи: перша, контрольна – отримувала на протязі двох місяців казеїнову дієту з добавкою вітамінів А, Д, Є; друга група – під час експерименту вітамін Є не отримувала (стан АОН). У третій групі для корекції АОН використовували -токоферол-ацетат у дозі 50 мг/кг маси тіла на протязі 4-х днів до забою. Через 1 добу після останнього введення вітаміну Є тварин забивали (Еdwіn E.E et al., 1961; Губский Ю.И. и др., 1992).

Для моделі радіаційного ураження організму використовували щурів, у яких створювали ознаки гострої променевої хвороби (Арнаутов А.К., Донафаров Г.К., 1962; Бурштейн Ш.А., 1962). На тварин діяли рентгенівським промінням. З цією метою використовували РУМ-ІІ (U - 180 кВ, І - 15 mA, h - 30 см, фільтр 0,8 мм Си + 1 мм Аl) у дозі 4,5 Гр і 6,0 Гр. Стан імунологічної реактивності вивчали у ранні і віддалені строки після опромінення.

Статистичну обробку отриманих результатів проводили за допомогою пакета стандартних програм на мікро-ЕОМ Мк-61 та програм “Statgraf” з використанням t – критерію Стюдента. Результати вважали достовірними при p<0,05.

Наукова новизна одержаних результатів. Головне значення роботи – це визначення місця і ролі ендогенних регуляторів проліферації лімфоцитів – кейлонів у загальній системі імунного гомеостазу організму. Воно витікає із сукупності прямих та опосередкованих результатів роботи і може розглядатися як нове підтвердження виняткової ролі лімфоцитарних кейлонів у реалізації імунного гомеостазу організму.

Встановлено, що лімфоцитарні кейлони мають специфічність не тільки для окремих фаз клітинного циклу, а й відносно окремих популяцій лімфоцитів, тобто вузьку клітинну специфічність. Їх дія в організмі взаємодоповнююча і взаємокомпенсаторна. Лімфоцитарні кейлони знаходяться у взаємозалежних регуляторних взаємовідно-шеннях з функціональною активністю імунокомпетентних клітин і детермінують структуру і склад ліпідного комплексу лімфоцитів. Отже, результати досліджень, на основі яких формулюється дане положення, одержані вперше і складають їх новизну.

Вперше встановлено, що лімфоцитарні кейлони, які були отри-ма-ні із різних популяцій лімфоцитів селезінки, мали найвищу супре-сорну активність відносно антитілоутворення за умов використання різних по Т-залежності антигенів. Ультраструктурні дослідження показали, що за умов використання Т-кейлону в селезінці зменшується кількість Т-лімфоцитів, а при дії В-кейлону – кількість плазматичних клітин. Однак, незалежно від природи лімфоцитарних кейлонів, зміни в Т-лімфоцитах за умов використання Т-залежного антигену були однотипними і стосувалися зміни кількісного складу та якісного стану мітохондрій і наближались до норми. Ці результати є підтвердженням регуляторного впливу лімфоцитарних кейлонів на функціональний стан імунокомпетентних клітин.

На основі проведеної гель-хроматографії Т-кейлону встановлено, що фракції з м.м. 30-40 кД, 13-17 кД відносяться по біологічній активності до G2- і G1-кейлонів, відповідно. Фракції із м.м. 50-69 кД і 17-19 кД, що були отримані із В-кейлону, відносяться по біологічній активності також до G2- і G1-кейлонів. Ці кейлони в дозах 10-100 мг/кг не мають токсичної дії. Встановлено, що кейлони, які мають фазову специфічність, відрізняються один від одного по кількісному амінокислотному складу білкового компоненту їх молекули. Ці результати є новим підтвердженням залежності біологічної активності лімфоцитарних кейлонів від молекулярної маси та хімічного складу молекули.

Вперше показано, що отримані кейлони в дослідах ін вітро та ін віво знижують синтетичну і метаболічну активність лімфоцитів, гальмують антитілоутворення, а особливо кейлони з м.м. 30-40 кД. У дослідах ін вітро Т-кейлони з м.м. 30-40 кД і 13-17 кД достовірно підвищували кількість поліненасичених жирних кислот і холестерину в ліпідній матриці мембран лімфоцитів. За умов розвитку імунної відповіді та гіперчутливості уповільненої дії зміни в жирнокислотному складі фосфоліпідів та кількісного вмісту холестерину в мембранах лімфоцитів залежать від молекулярної маси кейлонів. Встановлено особливості структури і функції імунокомпетентних клітин за умов дії лімфоцитарних кейлонів під час імунної відповіді. В цих умовах під впливом тимічних кейлонів гальмувалась цитотоксична активність лімфоцитів.

За умов Є-авітамінозу рівень продукції кейлону був підвищений і була підвищена його інгібіторна активність відносно проліферативної властивості лімфоцитів і зникала – відносно синтетичних процесів у них. За цих умов лімфоцитарний кейлон мав властивості щодо нормалізації спектра жирних кислот фосфоліпідів мембран лімфоцитів. Ці результати одержані вперше і володіють повною новизною.

Вперше встановлено, що за умов розвитку імунної відповіді продукція лімфоцитарного кейлону і його активність залежала від фаз імунної відповіді.

Вперше встановлено антиоксидантні властивості лімфо-цитарних кейлонів, що відкриває широкі перспективи в плані використання лімфоцитарних кейлонів як природних антиоксидантів за умов активації вільнорадикальних процесів при ряді патологічних станів організму

В умовах дії радіаційних чинників відмічається порушення в кейлонній лімфоцитарній системі – підвищується продукція лімфоцитарного кейлону, але падає його активність. Отже на основі отриманих результатів розроблені нові методи, що мають світовий рівень новизни, для визначення імунодефіцитних станів організму з використанням лімфоцитарних кейлонів, які мають вузьку клітинну і фазову специфічність.

Практичне значення одержаних результатів. Отримані в роботі результати є науковим обгрунтуванням їх практичного застосування. Визначення рівня продукції лімфоцитарного кейлону і його активності за умов норми і патології для оцінки порушень імунної системи є доцільним і перспективним. Це відкриває принципово нові можливості для імунодіагностики, імунопрофілактики і імунокорекції. Дослідження експресії рецепторів на лімфоцитах до кейлонів, що мають вузьку клітинну і фазову специфічність, дозволить визначити стан імунної системи і прогнозувати перебіг хвороби, а також використати їх не тільки для імунодіагностики, а й для імунокорекції. Результати дисертаційної роботи подані як винаходи (№1-3), інформаційний лист (№4), методичні рекомендації (№5) і впроваджені у слідуючих установах, що офіційно підтверджено актами про впровадження.

1. “Спосіб ідентифікації Т-хелперів і Т-супресорів”, А. св. №1709221 впроваджено на кафедрі біохімії Курського медичного інституту, кафедрі мікробіології Воронезького медичного інституту, кафедрі мікробіології і імунології та лабораторії імунології ЦНІЛ Мінського медичного інституту.

2. “Спосіб визначення Т- і В-лімфоцитів на цитологічному препараті”, А. св. №1712817 впроваджено у лабораторії тканинного типування та цитохімії Інституту клінічної радіології НЦРМ АМН України, кафедрі мікробіології та загальної імунології Національного університету ім. Т.Г. Шевченка, секторі патології і терапії лабораторії вірусології Інституту ветеринарної медицини Української академії аграрних наук.

3. “Спосіб оцінки ступеня важкості гострої променевої хвороби”, патент України №17490А впроваджено в відділі клінічної імунології Інституту клінічної радіології НЦРМ АМН України, кафедрі медичної радіології Національного медичного університету ім. О.О. Богомольця.

4. Інформаційний лист: “Спосіб оцінки біологічної активності препаратів по відношенню до ДНК-синтетичної активності лімфоцитів” впроваджений в лабораторії тканинного типування та цитохімії Інституту клінічної радіології НЦРМ АМН України, у спецкурс по імуногенетиці на кафедрі мікробіології та загальної імунології Київського університету ім. Т.Г. Шевченка, секторі патології і терапії лабораторії вірусології Інституту ветеринарної медицини Української академії аграрних наук, кафедрі мікробіології Воронезького медичного інституту ім. Н.Н. Бурденка, у відділі експериментальної терапії і біохімії фармакокінетики Інституту фармакології і токсикології АМН України.

5. Методичні рекомендації: “Визначення імунохімічним нефелеметричним аналізом вмісту ІgG, ІgM, ІgA у біологічних рідинах” впроваджені на кафедрі фтизіатрії з курсом імунології та алергології у Вінницькому державному медичному університеті ім. М.Пирогова і Вінницькому обласному протитуберкульозному диспансері.

Особистий внесок здобувача. Автором дисертаційної роботи особисто розроблено програму та методологію досліджень. Вивчення модулюючого та корегуючого впливу лімфоцитарних кейлонів на імунологічну реактивність організму проводилось самостійно дисертантом на базі відділу імунології Науково-дослідного лабораторного центру Національного медичного університету ім. О.О. Богомольця (зав. відділом д.м.н., проф. Бордонос В.Г.).

Виділення лімфоцитарних кейлонів, визначення рівня продукції, оцінка їх біологічної активності та вивчення впливу лімфоцитарних кейлонів на синтетичну, проліферативну, продуктивну та метаболічну активність лімфоцитів також було досліджено дисертантом особисто.

Дослідження впливу лімфоцитарних кейлонів на функціональний стан імунної системи, зокрема постановка методик фагоцитозу, НСТ-тесту, реакції бласттрансформації з радіоактивною міткою (3Н-тимідин), визначення цитотоксичної активності лімфоцитів, постановка методики прямого і непрямого Єрне, моделювання розвитку гумо-раль-ної та клітинної імунної відповіді зроблено дисертантом самостійно.

Вивчення ультраструктури лімфоцитів проведено спільно з співробітниками відділу ультраструктурного аналізу та морфометрії НДЛЦ НМУ (зав. відділом к.б.н. Куфтирева Т.П.).

Визначення хімічного складу лімфоцитарних кейлонів проводили спільно з к.б.н., провідним науковим співробітником НДЛЦ НМУ Радловською З.Т.

Гель-фільтрацію лімфоцитарних кейлонів, визначення їх молекулярної маси та оцінку токсичності проводили спільно з к.б.н., старшим науковим співробітником інституту фармакології і токсикології Дановою І.В.

Газохроматографічні дослідження ліпідного комплексу мембран лімфоцитів проводили спільно з к.х.н., провідним науковим співробітником лабораторії газової хроматографії Брюзгіною Т.С.

Проведення радіоімунологічних дослідів було зроблено самостійно дисертантом на кафедрі медичної радіології НМУ (зав. д.м.н., проф. Лазар А.П.).

Визначення рівня перекисного окислення ліпідів у лімфоцитах проводили спільно з асистентом кафедри біохімії НМУ к.б.н. Задоріною О.В., к.б.н., доцентом кафедри фармакології Київського медичного інституту Асоціації народної медицини Олейніком С.О. Із к.х.н., ст.н.с. кафедри фармакології Національного медичного університету ім. О.О. Богомольця Бобковим В.М., проводили дослідження з дифенілпікрилгідрозилом (ДФПГ).

Кон’югацію лімфоцитарних кейлонів з флюорохромом ФІТЦ та розробку основних принципів імунодіагностики лімфоцитарними кейлонами імунодефіцитних станів організму здійснено дисертантом самостійно.

Облік та аналіз отриманих результатів, формулювання основ-них положень та висновків, оформлення роботи належить автору.

Апробація результатів дисертації. Основні положення дисертації доповідались і обговорювались на підсумкових конференціях Науково-дослідного лабораторного центру Національного медичного університету ім. О.О. Богомольця.

Республіканських конференціях, з’їздах, нарадах: V Український біохімічний з’їзд (Івано-Франківськ, 1987),“Актуальні проблеми імунотерапії” (Київ-Ворошиловград, 1988), VII з’їзд Українського мікробіологічного товариства (Київ–Чернівці, 1989) “Нові фізичні методи в медицині” (Ворошиловград, 1990), І імунологічному з’їзді в Білорусії (Мінськ, 1990), “Багатофакторний аналіз впливу наслідків Чорнобильської катастрофи на стан кровотворення” (Київ, 1992), “Сучасні проблеми фармакології” (Полтава, 1995), “Віддалені наслідки опромінення в імунній та гемопоезних системах” (Київ, 1996), “Актуальні проблеми експериментальної медицини” (Київ, 1998, 1999); ІV Українській науково-практичній конференції з актуальних питань алергології та клінічної імунології (Київ, 1999).

Всесоюзних з’їздах, конференціях, нарадах: “Функціональна морфологія лімфатичних вузлів і других органів імунної системи і їх роль в імунних процесах” (Москва, 1983); “Використання біотехно-ло-гії у тваринництві, рослинництві і ветеринарній медицині” (Ленін-град, 1988); І-у з’їзді імунологів (Дагомис, 1989); радіобіологічному з’їзді (Київ, 1993); І Національному конгресі України з імунології, алер-го-логії та імунореабілітації з міжнародною участю (Алушта, 1998).

Міжнародних конгресах, симпозіумах, конференціях та нарадах: ІV конгресі з клітинної біології (Канада, 1988); XІV конгресі з біохімії (ЧССР, 1988); XІX конгресі з молекулярної спектроскопії (ГДР, 1989).

Публікації. Матеріали дисертації опубліковані у 20 статтях наукових журналів, збірниках наукових праць, 23 тезах матеріалів конференцій, з’їздів, конгресів, двох авторських свідоцтвах №1709221, №1712817 і патенті України №17490А. Всі друковані роботи написані та проаналізовані автором особисто, за виключенням 4-х, написаних спільно із іншими фахівцями.

Структура дисертації. Дисертація складається із семи розділів, до яких входять вступ, огляд літератури, матеріали та методи дослідів, власні дослідження, аналіз та узагальнення отриманих результатів, висновки, практичні рекомендації, список використаних джерел літератури (314 джерела, з них – 88 іноземних), додатки. Дисертація викладена на 260 сторінках машинописного тексту й проілюстрована 53 таблицями та 15 рисунками.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Результати досліджень. Результати досліджень показали, що лімфоцитарні кейлони, будучи тканиноспецифічними інгібіторами клітинної проліферації, є унікальними біологічно активними речовинами природного походження, здатними забезпечувати реалізацію імунного гомеостазу організму. Відомо, що кейлони мають фазову специфічність. Оскільки в літературі не було інформації стосовно порівняльної характеристики хімічного складу кейлонів, які мають фазову клітинну специфічність, тобто G1- і G2 лімфоцитарних кейлонів, то нами були проведені дослідження хімічного складу цих кейлонів. Було встановлено, що біля 50% усіх амінокислот, які входять до білкового компоненту молекули кейлону, було представлено глутаміновою, аспарагіновою кислотами та лізином і лейцином. Сірковмісних амінокислот не було виявлено (сліди). Також реєструвався низький вміст амінокислот гістидину, тирозину, фенілаланіну. Співвідношення усіх названих амінокислот у G1 і G2-кейлонах знаходилося в межах 0,86-1,39 і 0,67-1,1, при обрахуванні кількісного складу амінокислотних залишків у вагових відсотках і по кількості їх у молекулі білка. Відсутність сірковмісних і ароматичних амінокислот, а також високий вміст дикарбонових амінокислот (аспаргінової і глутамінової) реєструвався у сумарному препараті лімфоцитарного кейлону, який отримували інші дослідники (Рыкова В.И. и др. 1975, 1981; Grundboeck-Jusko J., 1978). У G1- і G2-кейлонах, вилучених із епідермісу також були відсутні сірковмісні амінокислоти (Окулов В.Б. и др., 1978; Романов Ю.А. и др., 1984). Вивчення у вуглеводній частині G1- і G2-лімфоцитарних кейлонів вмісту гексуронової кислоти та гексозаміну показало, що кількість гексуронової кислоти та гексозаміну в G1-лімфоцитарному кейлоні незначно відрізнялося від вмісту їх у G2-кейлоні. На нашу думку, молекула лімфоцитарного кейлону має дві активні частини; одна специфічна для клітинної мембрани і, можливо, зумовлює основну властивість кейлону – його тканиноспецифічність, друга неспецифічно стимулює активність мембранної аденилатциклази. Внаслідок чого внутріклітинна концентрація циклічного АМФ підтримується на високому рівні. Нестача попередників ДНК та РНК призводить до того, що клітина не може вступити на шлях мітозу. Такої думки дотримуються дослідники по відношенню інших кейлонів (Роничевская Г.М. и др. 1988, 1989; Романов Ю.А и др., 1984; Неустроев Г.В., 1982). Неоднозначність результатів по питанню існування лімфоцитарних кейлонів, специфічних по відношенню до різних популяцій лімфоцитів, поставило перед нами завдання – провести дослідження у цьому напрямку. Кейлони отримували із різних популяцій лімфоцитів (Т- і В-лімфоцитів) різних лімфоїдних органів свиней. Вивчення ефекту дії Т- і В-кейлонів на ДНК-синтетичну активність інтактних і стимульованих лімфоцитів показало, що ця дія залежала від типу кейлону, природи мітогену та популяційного складу лімфоцитів. Метаболічна активність фагоцитів та їх кількість у інтактних тварин залишалась на рівні норми. Проведення дослідів по визначенню рівня імунної відповіді на різні по Т-залежності антигени показало, що кейлони отримані із В-лімфоцитів селезінки мали найвищу інгібіторну активність на антитілоутворення (52% і 62%) порівняно з іншими кейлонами, хоча ефект інгібування залишався в умовах використання усіх кейлонів, отриманих із Т- і В-лімфоцитів. У зв’язку з цим було цікавим вивчити ультраструктуру лімфоцитів селезінки при дії Тс- і Вс- лімфоцитарних кейлонів, отриманих із Т- і В-лімфоцитів селезінки свиней. Результати дослідів показали, що Т-лімфоцити продукують Т- кейлон, який діє на кількість Т-лімфоцитів, а В-кейлон діє на кількість попередників плазматичних клітин, В-лімфоцити і, можливо, кейлони мають вузьку клітинну специфічність, яка не виключає їх тканинної специфічності тому, що гальмування імунологічної реактивності відбувалося в умовах використання як Т- так і В-кейлону. В той же час дія Т- і В-лімфоцитарних кейлонів на ультраструктуру Т-лімфоцитів була однотипною і не залежала від клітинної природи лімфоцитарних кейлонів можливо тому, що не виключалась дія ендогенного кейлону. На нашу думку лімфоцитарні кейлони нормалізують функціональну активність лімфоцитів та їх метаболізм, так як кількість мітохондрій та їх розподіл по площі близький до такого у інтактних тварин. Хоча на думку деяких авторів, за умов вивчення печінкового кейлону, він може роз’єднувати окисне фосфорилювання (Пашков А.И, Авдеева Т.Д., 1984), такої думки дотримуються і інші дослідники (Элбакидзе Г.М., 1979).

За умов вивчення тимічного кейлону методом гель-фільтрації було проведено його очищення і отримано три активні фракції. Визначена їх молекулярна маса 30-40 кД, 13-17 кД, 10 кД, відповідно. При гель фільтрації В-кейлону, отриманого із В-лімфоцитів селезінки було отримані фракції з молекулярною масою 50-60 кД, 17-19 кД, >10 кД. Вивчення впливу тимічних кейлонів і В-кейлонів на проліферативну і продуктивну активність лімфоцитів показало, що найвищу активність (47%) мала фракція з молекулярною масою 30-40 кД, а В-кейлону з м.м, 50-60 кД (51,2%). В результаті оцінки цих дослідів було з’ясовано, що інгібуюча активність лімфоцитарних кейлонів зменшувалась відповідно зменшення молекулярної маси.

Під дією кейлонів знижувалась метаболічна активність лімфоцитів, що визначалась за коефіцієнтом Ріглера. Цей вплив був різний в залежності від молекулярної маси. Він вірогідно знижувався під впливом фракцій Т-кейлону з молекулярною масою 13-17 кД і 10 кД. Визначення активності дезоксирибонуклеопротеїдного комплексу показало, що всі кейлони знижували синтез ДНК лімфоцитів, але найбільшу інгібуючу активність мала фракція з молекулярною масою 13-17 кД (43%), а В-кейлону з м.м. 17-19 кД (79%).

При визначенні активності тимічних кейлонів по відношенню до кисеньгенеруючої активності фагоцитів було встановлено, що кисеньзалежний метаболізм фагоцитів був достовірно вищий порівняно з нормою в умовах використання всіх фракцій (контроль – 25,6±1,5; досліди: м.м. 30-40 кД – 47,0±3,4, р < 0,001; м.м. 13-17 кД – 42,5±2,02, р < 0,001; м.м. 10 кД – 40,75±1,7, р < 0,001).

У зв’язку з тим, що на рівні мембран імунокомпетентних клітин пізнається антиген, мітоген і формується сигнал, що включає відповідну реакцію клітин, а ліпіди виконують роль матриксу для мембранних білків і створюють оптимальні умови для їх функціону-вання, вивчали жирнокислотний склад мембран лімфоцитів.

При оцінці впливу лімфоцитарних кейлонів на структуру і склад ліпідів лімфоцитарних мембран було з’ясовано, що тимічні кейлони з молекулярною масою 30-40 кД і 13-17 кД підвищували вміст поліненасичених жирних кислот і холестерину, такої чіткої залежності не відмічалось в умовах використання фракції з молекулярною масою 10 кД.

У стані розвитку імунної відповіді