К И Ї В С Ь К И Й Н А Ц І О Н А Л Ь Н И Й У Н І В Е Р С И Т Е Т

імені Т А Р А С А Ш Е В Ч Е Н К А

ГАВРИШ ЛАРИСА ІВАНІВНА

УДК 599:539.1.047+577.122.5

РЕГУЛЯТОРНИЙ ВПЛИВ КАЛЬМОДУЛІНУ ТА

ФОСФОРИЛЮВАННЯ НА АКТИВНІСТЬ КАЛЬЦІЙЗАЛЕЖНИХ

ФЕРМЕНТІВ ЛІМФОЦИТІВ СЕЛЕЗІНКИ ЩУРІВ В УМОВАХ

ОПРОМІНЕННЯ

03. 00. 04 – біохімія

А В Т О Р Е Ф Е Р А Т

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

КИЇВ - 2001

Дисертацією є рукопис

Робота виконана в лабораторії фізико-хімічної біології кафедри

біохімії біологічного факультету Київського національного університету

імені Тараса Шевченка.

Науковий керівник: доктор біологічних наук

Остапченко Людмила Іванівна,

професор кафедри біохімії Київського національного університету імені

Тараса Шевченка.

Офіційні опоненти: доктор біологічних наук

Дружина Микола Олександрович, науковий співробітник Інституту

експериментальної патології, онкології і радіобіології

ім. Р.Є. Кавецького НАН України.

доктор біологічних наук

Тугай Василь Андрійович,

провідний науковий співробітник

Інституту біохімії

імені О. В. Палладіна НАН України.

Провідна установа: Чернівецький державний університет ім. Юрія Федьковича.

Захист дисертації відбудеться “22” - _жовтня_2001р. о 16 год. на засіданні

спеціалізованої вченої ради Д26.001.24 в Київському національному

університеті імені Тараса Шевченка за адресою:

03127, м. Київ, пр-т Глушкова 2, корпус 12 (біофак), ауд. 215.

Поштова адреса: 01033, Київ, вул. Володимирська, 64, спецрада Д26.001.24,

біологічний факультет.

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці університету: 01033, Київ,

вул. Володимирська, 58.

Автореферат розісланий “20” - вересня 2001р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради О.В. БРАЙОН.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Вступ. Мембрани відіграють ключову роль як в структурній організації, так і в функціонуванні всіх типів клітин (Squier, 2000). Вони не тільки розділяють клітини на окремі компартменти, але приймають участь і у регуляції всіх зв’язків, які здійснюються між зовнішнім та внутрішнім середовищами (Choquette, 1994). В основі цих взаємодій лежить фізичне перенесення іонів та молекул крізь мембрану або передача інформації за допомогою конформаційних змін які відбуваються у мембранних компонентах. З мембранами пов’язані численні білки, зокрема ферменти (Шалободов, 2000), одні з яких каталізують трансмембранні реакції, утворюючи ланцюги послідовних перетворень через взаємодію з мембранозв’язаними субстратами, а інші – приймають участь у модифікації транспортних систем, завдяки регуляції їх функціональної активності (Ernmelot, 1998).

Роль фосфорилювання білків в регуляції різноманітних клітинних процесів з’ясовується у багатьох сучасних дослідженнях. Встановлено фундаментальну роль процесів білкового фосфорилювання в розвитку різних патологічних станів організму. Це пов’язано з тим, що фосфорилювання є головним компонентом регуляції багатьох сигнально-транспортних ланцюгів, від якого залежить динаміка та послідовність цілого ряду клітинних подій: таких як ріст, поділ, зміна форми, рух, диференціювання та загибель.

Актуальність теми. На теперішній час доведено, що ключовою ланкою різноманітних клітинних реакцій є ферментативні транспортні системи, за допомогою яких здійснюються процеси селективного іонного транспорту, проникності та водночас структурної реорганізації мембран. Роль функціональної модифікації транспортних систем шляхом фосфорилювання їх амінокислотних залишків, поки що, досліджена недостатньо.

Безпосередньо доведено, що рентгенівське випромінення здатне ініціювати розлад системи активного транспорту іонів, що позначається на вмісті внутрішньоклітинного Са2+ та, відповідно, на функціонуванні таких регуляторних систем клітинного метаболізму як циклонуклеотид- та Са2+- залежне фосфорилювання.

Поряд з реакціями білкової модифікації важливим регуляторним внутрішньоклітинним фактором, є кальційзалежний тригерний білок – кальмодулін, який виконує ключову роль у процесах супряження електричного та гормонального збудження клітини та формування її відповідної реакції.

Зв’язок роботи з науковою програмою. Робота відповідає плану науково-дослідної роботи кафедри біохімії біологічного факультету Київського національного університету імені Тараса Шевченка та виконана згідно з технічним завданням теми № 97083 “Біохімічні механізми розвитку променевого ураження після дії іонізуючої радіації ” в рамках комплексної наукової програми “Здоров’я людини”.

Мета і задачі дослідження. Дослідити молекулярні механізми регуляторної дії різних протеїнкіназ та кальмодуліну на функціонування систем транспорту, активність мембранозв’язаних ферментів та процеси їх внутрішньоклітинної транслокації в лімфоцитах селезінки тварин за дії різних доз іонізуючої радіації.

Для досягнення мети необхідно було вирішити такі задачі:

1) охарактеризувати зміни структурних компонентів та стану мембран лімфоцитів селезінки щурів за умов дії рентгенівського випромінення;

оцінити роль різних протеїнкіназ в фосфорилюванні білків плазматичних мембран лімфоцитів селезінки та вплив даного типу модифікації на регуляцію активності Са2+-залежних ферментів;

ізолювати Са2+-кальмодулінзалежну протеїнкіназу з лімфоцитів контрольних та опромінених щурів;

проаналізувати особливості регуляції активності КМ-кінази автофосфорилю-ванням, кальцієм та кальмодуліном;

дослідити механізми регуляції активності Са2+- залежних ферментів комплексом Са2+- кальмодулін.

Наукова новизна одержаних результатів. Вперше проведено порівняльний аналіз регуляторної ролі кальцій- та циклонуклеотидзалежного фосфорилювання білків плазматичної мембрани лімфоцитів. Досліджено вплив даних процесів на функціонування кальційзалежних ферментів.

Вперше встановлено, що в лімфоцитах селезінки щурів найбільш чутливою до дії рентгенівського опромінення в дозах 0,5 та 1,0 Гр є кальційзалежна система фосфорилювання, пострадіаційне порушення функціонування якої призводить до суттєвих змін в регуляції активності цілого ряду мембранозв’язаних ферментів.

Виділено, вивчено властивості та регуляцію КМ-кінази Са2+- кальмодулінзалежної протеїнкінази. Встановлено, що пострадіаційні порушення в функціонуванні обумовлені зміною ступеню автофосфорилювання холоферменту та зменшенням спорідненості до комплексу Са2+- кальмодулін.

Практичне значення одержаних результатів. Отримані дані розширюють існуючі уявлення про біохімічні механізми адаптації лімфоїдних клітин до дії променевого фактору в сублетальних дозах. Встановлені пострадіаційні порушення модулюючого ефекту кальмодуліна та Са2+- і циклонуклеотид-залежного фосфорилювання на системи активного транспорту іонів, можуть бути підставою для розробки засобів спрямованих на корекцію радіоіндукованих змін та на формування адаптивного потенціалу імунокомпетентних клітин.

Обгрунтованість і достовірність проведених досліджень. Достовірність отриманих в дисертаційній роботі результатів забезпечується використанням сучасного аналізу і підтверджується узгодженням аналогічними результатами, що отримані іншими авторами.

Особистий внесок здобувача. Здійснення інформаційного пошуку та оцінка літературних даних, проведення експерименту, аналіз та теоретичне обгрунтування результатів дослідження виконані дисертантом особисто. Планування та розробка методичних підходів виконання комплексу експериментальних досліджень проведені з науковим керівником. Результати по визначенню вмісту цитоплазматичного Са2+ в лімфоцитах отримані разом із співробітниками лабораторії збудливих систем біологічного факультету Київського національного університету імені Тараса Шевченка.

Апробація результатів дисертації. Матеріали дисертації викладені на Міжнародному радіобіологічному з’їзді (Тбілісі, 1998), Міжнародному екологічному конгресі (Санкт-Петербург, 2000), професорсько-викладацькій конференції біологічного факультету (Київ, 2000).

Публікації. За темою дисертації опубліковано 5 статей в наукових журналах та 2 тез у матеріалах конгресу та з’їзду.

Структура й обсяг дисертації. Дисертаційна робота складається з вступу, огляду літератури, матеріалів і методів дослідження, результатів роботи та їх обговорення, заключної частини, висновків, списку літератури, що включає 238 джерел. Дисертація викладена на 133 стор., має в своєму складі 14 рисунків, 3 таблиці.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ ДИСЕРТАЦІЇ

Матеріали і методи досліджень

В дослідженнях використовували білих щурів лінії Вістар обох статей масою 130-150 г. Тварин опромінювали на установці РУМ-17 в дозах 0,5 і 1,0 Гр за умов: потужність поглинутої дози – 24,5 сГр/хв, фільтри 1 мм Сu + 0,5 мм Аl, напруга 200 кВ, сила струму 5 мА, відстань до поверхні шкіри тварин 50 см.

Дослідження проводили через 12 годин після опромінення тварин, що є терміном найбільш виражених порушень основних ланок метаболізму лімфоїдних клітин після опромінення в дозах 0,5 та 1,0 Гр (Кучеренко, 1996; Остапченко, 1998).

Лімфоцити селезінки отримували центрифугуванням клітинної суспензії на градієнті Ficoll-Paque (густина 1,077) за методом (Boyum, 1968). Фракцію плазматичних мембран отримували за рекомендаціями (Древаль, 1989) з використанням градієнту сахарози (26%). Визначення активності маркерних ферментів плазматичної мембрани проводили як запропоновано в роботі (Рибальченко, 1994).

Визначення флуоресцентних характеристик мембранних препаратів проводили за рекомендаціями (Владимиров, 1980).

Реакцію Е-розеткоутворення проводили за методом (Jongal, 1992) з використанням еритроцитів морської свинки.

Для дослідження впливу циклонуклеотид- та Са2+- залежного фосфорилювання мембранних білків на активність Са2+, Mg 2+- АТФази плазматичних мембран лімфоцитів селезінки щурів ферменти були виділені та очищенні з використанням рекомендацій (Gill, 1997; Остапченко, 1986). Визначення активності Са2+, Мg2+-АТФази плазматичної мембрани лімфоцитів проводили за методом (Древаль, 1990). Вміст неорганічного фосфату визначали за методом (Lowry, 1955).

Виділення кальмодуліну із мозку щурів проводили за методом (Schreiber, 1989). Про активність кальмодуліну судили по його здатності активувати фосфодиестеразу цАМФ.

Виділення, очищення та автофосфорилювання Са2+/кальмодулін-залежної протеїнкінази ІІ здійснювали методом (Ikebe, 1990).

Концентрацію білка визначали за методом (Lowry, 1951) та (Bradford, 1976).

Кінетичний аналіз отриманих результатів виконували за допомогою модифікованої програми “ENSFITTER”. Статистичну обробку результатів та побудову графіків проводили на IBM PC ET з використанням стандартних пакетів прикладних програм.

Необхідність визначення молекулярних механізмів променевого порушення функціонування найбільш радіочутливих клітин – лімфоцитів обумовило послідовність проведення нашої експериментальної роботи.

Досліджено особливості структурної організації біологічних мембран методом флуоресцентних зондів з застосуванням АНС (Владимимров, 1987).

Встановлені пострадіаційні зміни інтенсивності флуоресценції (F), які із збільшенням дози опромінення поглиблюються (рис.1).

Найбільш виражене збільшення інтенсивності флуоресценції спостерігалося через 12 год. після опромінення в дозі 1,0 Гр. Отримані результати вказують на зміни в структурі мембран лімфоцитів та можуть бути пов’язаними з порушенням метаболізму ліпідів (Петрик, 1992) і впершу чергу з інтенсифікацією процесів їх перекисного окислення.

Цей процес супроводжується зміною їх в’язкостісті, що, в свою чергу, приводить до порушень ліпід-білкових взаємодій [59]. Вивчення ліпідного складу клітинної мембрани лімфоцитів в умовах опромінення в заданому діапазоні доз показало, що іонізуюче випромінювання суттєво впливає на розподіл фракцій ліпідних компонентів (табл.1).

Встановлені порушення структурного стану та складу ліпідних компонентів мембран лімфоцитів за умов дії радіації безперечно призведе до зміни їх функціональної активності.

Оцінка стану поверхневих рецепторів лімфоцитів за допомогою проведення реакції розеткоутворення показала, що здатність клітин утворювати ці структури після опромінення суттєво (більше ніж у 2 рази) зменшується (рис.2).

Встановлене порушення розеткоутворюючої здатності лімфоцитів може бути пов’язане з втратою поверхневих рецепторів клітин, що неодноразово було підтверджено дослідженнями інших авторів (Жербин, 1989).

Виділення клітинних мембран пов’язане з деякими складностями отримання високоочищених мембранних препаратів. В зв'язку з цим велике значення для проведення експериментів має чистота, везикульованість і орієнтація виділених мембранних препаратів. Оскільки за даними електронної мікроскопії важко судити про ступінь забрудненості препаратів іншими субклітинними фракціями, нами було визначено активності маркерних ферментів: Na+,K+-АТФази, аденілатциклази, 5'-нуклеотидази, глюкозо-6'-фосфатази, мітохондріальної NаN3-чутливої АТФази, сукцинатдегідрогенази, а також фермента – Ca2+,Mg2+-АТФази, враховуючи її важливу роль у підтримці кальцієвого гомеостазу плазматичних мембран.

Активність Na+,K+-АТФази везикульованих препаратів мембран лімфоцитів збільшувалась у порівнянні з вихідним нефракціонованим гомогенатом клітин у 18 разів в контролі (табл.2).

Встановлено, що препарат плазматичних мембран лімфоцитів характеризувався високою активністю Na+,K+-АТФази, 5'-нуклеотидази і аденілатциклази.

Вивчення активності мітохондріальної NaN3-чутливої АТФази і сукцинатдегідрогенази, а також глюкози-6'-фосфатази показують, що вони у виділеній мембранній фракції нижчі, ніж в гомогенаті. Це свідчить про те, що мітохондрії і ендоплазматичний ретикулум не суттєво забруднюють препарати мембран лімфоцитів. Опромінення в досліджуваних дозах не мало суттєвого впливу на перерозподіл субклітинних фракцій досліджуваних клітин, проте, викликало суттєві порушення в функціонуванні таких важливих ферментів, як аденілатцикдаза та Са2+,Mg2+-АТФаза.

У результаті проведених досліджень впливу опромінення на активність Са2+,Mg2+-АТФази в мембранах лімфоцитів селезінки щурів, було відзначено її двократне збільшення порівняно з клітинним гомогенатом в контролі (табл.2). Опромінення в дозі 0,5 Гр та 1,0 Гр підвищувало ферментативну активність у мембранному препараті (в 7 та 4 рази відповідно), активності Са2+,Mg2+-АТФази в клітинній суспензії при цьому була дуже низька. Такий вплив опромінення може бути пов’язаний з порушенням регуляторного ефекту на досліджуваний фермент з боку аденілатциклазної системи.

Таким чином, отримані результати дозволяють зробити висновок, що виділена нами мембранна фракція являє собою достатньою мірою очищений везикулярний препарат мембран лімфоцитів з незначними домішками мембран ретикулума і мітохондрій і може бути використана для вивчення різноманітних процесів, пов’язаних з функціональною активністю мембран.

До регуляторних систем, що контролюють функціонування Са2+,Mg2+-АТФази, слід віднести такий білковий активатор, як – кальмодулін, а також циклонуклеотид- та кальційзалежне фосфорилювання плазматичних мембран лімфоцитів. (Chan,1994; Francis, 1988)

Процес фосфорилювання, який здійснюється системою протеїнкіназ, інтегрує основні метаболічні шляхи, зокрема, транспорт іонів в плазматичній мембрані різноманітних клітин. Досліджуючи вплив екзогенного фосфорилювання плазматичних мембран лімфоїдних клітин цАМФ-, та цГМФ-залежними протеїнкіназами ми встановили підвищення активності Са2+,Мg2+-АТФази (у 3 рази) в порівнянні з модифікованими формами мембран ( на рис.3 прийняті за 100%). Опромінення в досліджуваних дозах повністю знімало активуючий ефект циклонуклеотидзалежного фосфорилювання.

Дослідження регуляторного Са2+,фосфоліпідзалежного, та Са2+, кальмодулінзалежного фосфорилювання Са2+, Мg2+-АТФази показало, що активність ферменту в мембранах, які було профосфорильовано, значно вища в порівнянні з неактивованими формами. Вплив опромінення в досліджуваних дозах зберігав чітку тенденцію до різкого зменшення активності ферменту (рис.3).Треба відмітити більш високу ступінь активуючого ефекту на досліджувану АТФазу Са2+-залежного фосфорилювання мембран лімфоцитів в порівнянні з циклонуклеотидзалежним.

Узагальнюючи отримані результати можна зробити висновок, що через циклонуклеотид- та Са2+-залежну систему фосфорилювання здійснюється регуляція активності Са2+,Мg2+-АТФази плазматичних мембран лімфоцитів селезінки щурів. Досліджені регуляторні механізми є чутливими до дії тотального рентгенівського опромінення в дозах 0,5 та 1,0 Гр.

Як було зазначено раніше, вплив рентгенівського опромінення у досліджуваних дозах характеризувався частковою інактивацією ПК-С та КМ-ПК у лімфоїдних клітинах селезінки. Нами була здійснена спроба з’ясувати можливі причини радіоіндукованого порушення функціонування даних ферментів як важливих регуляторних механізмів активації Са2+, Mg2+- АТФази.

Досліджено процес автофосфорилювання холоферменту С-кінази, яку було виділено з цитозолю лімфоцитів селезінки. Встановлено зменшення спорідненості молекули С- кінази до АТФ після опромінення, що може бути причиною зниження інтенсивності автофосфорилювання досліджуваного нами ферменту (рис.4).

Вивчення особливостей перебігу фосфотрансферазної реакції, яка каталізувалась дефосфо- та фосфоформами С-кінази, показало, що автофосфорилювання знижує спорідненість ферменту до субстрату реакції як у контролі, так і після опромінювання, але суттєвого не впливає на швидкість протікання реакції.

З метою з’ясування можливих механізмів регуляції активності КМ-ПК у рамках досліджуваної моделі було виділено та частково очищено на колонці з ДЕАЕ – целюлозою кальмодулінзалежну протеїнкіназу з мембран лімфоцитів селезінки в контролі та через 12 годин після опромінення тварин у дозах 0,5 та 1,0 Гр.

Профілі елюції ферменту, який було отримано з лімфоцитів опромінених у дозах 0,5 та 1,0 Гр тварин, суттєво не відрізнялися від профілю елюції ферменту з клітин контрольних тварин. Вивчення субстратної специфічності виділеного ферменту, яке проводили у присутності оптимальних концентрацій Са2+ та кальмодуліну показали, що найкращим субстратом для ферменту з лімфоцитів були легкі ланцюги міозину (рис.5).

Дія іонізуючого випромінювання в дозах 0,5 та 1,0 Гр не виявило суттєвих змін субстратної специфічності досліджуваного ферменту (рис. 5).

Визначені кінетичні характеристики виділеного ферменту та представлені дані про субстратну специфічність свідчать про те, що КМ-кіназу з лімфоцитів селезінки можна віднести до типу ІІ, основним регуляторним механізмом функціонування яких є автофосфорилювання. Дослідження швидкості цього процесу від концентрації АТФ показало, що автофосфорилювання досягає своїх максимальних значень при досить низьких концентраціях ліганду (10 мкМоль/л АТФ).

Після опромінення тварин у досліджуваних дозах було встановлено збільшення швидкості автофосфорилювання в 1,5 рази, що, імовірно, пов’язано з підсиленням взаємодії ферменту з АТФ при протіканні фосфотрансферазної реакції.

Крім автофосфорилювання важливим регулятором активності КМ-ПК є комплекс кальцію з цитозольним білком кальмодуліном. Досліджено вміст внутрішньоклітинного вільного Са2+ в лімфоцитах селезінки контрольних та опромінених в дозах 0,5 та 1,0 Гр щурів, та вплив на цей показник різних лігандів, які мають різні механізми впливу на кальцієвий обмін в клітині (рис.6). Порівняння вмісту Са2+ в лімфоцитах селезінки щурів за фізіологічних умов та за умов дії опромінення в досліджуваних дозах показало, що радіація викликає збільшення вмісту кальцію в лімфоцитах майже у 2 рази.

Для з’ясування можливих механізмів пострадіаційних змін внутрішньоклітинної концентрації Са2+ лімфоцити преінкубували з мітогенними лектинами (фітогемаглютинін- ФГА; ліпосахарид- ЛПС) та кальцієвим іонофором А23187.

Аналіз зміни вмісту [Ca]i при інкубації клітин вищезгаданими лігандами показав певну однотипність дії ЛПС, ФГА та А23187, що у першу чергу виражається у значному підвищенні концентрації вільного внутрішньоклітинного кальцію, що на нашу думку, можливо, пов’язано як із структурними змінами проникливості клітинної мембрани для іонів Са2+, так і з порушеннями у Са2+ - залежному ланцюгу процесу стимуляції клітин.

Перерозподіл вмісту кальцію потенціює ряд перетворень у функціонуванні залежного від нього білкового модулятора – кальмодуліну і ферментів, активність яких залежить від співвідношення цих чинників у клітині та від їх здатності утворювати комплекси.

Дослідження залежності активності Са2+,Мg2+-АТФази плазматичних мембран лімфоцитів від концентрації кальмодуліну проводили у широкому діапазоні концентрацій (2–20мкМ). Максимальний активуючий ефект кальмодуліну спостерігався при концентрації його в середовищі інкубації – 13 мкМ. Опромінення тварин в дозі 0,5 Гр призводила до зниження його активуючого ефекту, а при опроміненні в дозі 1,0 Гр спостерігалося суттєве підвищення активності Са2+, Мg 2+ -АТФази (рис.7).

Першочергово, причину такої різнонаправленої дії кальмодуліну ми передбачали у вірогідній зміні його ендогенного вмісту в умовах опромінення. Проте, визначення розподілу КМ в лімфоцитах селезінки щурів за умов дії радіації в дозах 0,5 та 1,0 Гр, не виявило статистично значимих змін його рівня. Встановлений факт дав нам підстави вважати, що вірогідною причиною порушення активуючого ефекту КМ є конформаційні зміни в молекулі білка, які безпосередньо пов’язані з встановленими раніше (Остапченко, 1997) пострадіаційними порушеннями у взаємодії КМ з іонами кальцію.

Ще однією, і досить вагомою причиною порушень активації кальмодуліном Са2+,Мg2+-АТФази, безсумнівно, може бути постпроменеве ураження самого ферменту.

Результати проведених досліджень дозволяють зробити висновок, що в регуляції активності Са2+,Мg2+-АТФази плазматичних мембран лімфоцитів селезінки щурів – кальмодулін відіграє особливу роль. Процес взаємодії ферменту з активатором АТФазної реакції характеризується певною радіочутливістю.

В И С Н О В К И

1. Встановлено, що кальмодулін та процеси білкового фосфорилювання опосередковують регуляцію активності кальційзалежних ферментів плазматичних мембран лімфоцитів селезінки щурів в умовах опромінення в дозах 0,5 та 1,0 Гр.

2. За допомогою одержаних характеристик структурної організації мембран лімфоцитів, визначення вмісту фосфоліпідів, оцінки стану поверхневих рецепторів та аналізу активності мембранозв’язаних ферментів показано, що опромінення в досліджуваних дозах призводить до функціональної деградації досліджуваних імунокомпетентних клітин.

3. Вивчено роль протеїнкіназ у процесі активації Са2+,Мg2+-АТФази плазматичних мембран лімфоцитів селезінки та встановлена пріоритетна роль Са2+-залежного фосфорилювання у регуляції активності досліджуваного ферменту як у нормі, так і в умовах дії променевого фактора.

З лімфоцитів селезінки щурів нами ізольована Са2+, кальмодулінзалежна протеїнкіназа. Показано, що найкращим субстратом для неї є легкі ланцюги міозину. Встановлено, що опромінення в дозах 0,5 та 1,0 Гр не впливає на субстратну специфічність досліджуваного ферменту та його каталітичні властивості.

5. Визначена роль автофосфорилювання холоферментів у функціонуванні Са2+, кальмодулін- та Са2+, фосфоліпідзалежних протеїнкіназ виділених з лімфоцитів селезінки щурів. Показано зміну ступеню автофосфорильованості молекул досліджуваних ферментів за умов дії радіації, що обумовлює порушення їх активності.

6. Встановлено значне підвищення [Са]і в лімфоцитах селезінки щурів за умов активації клітин мітогенними лектинами (ЛПС та ФГА) та їх преінкубації з іонофором А23187. Рентгенівське опромінення як в дозах 0,5 так 1,0 Гр призводило до перерозподілу рівня іонів кальцію, що в свою чергу, потенціювало порушення в утворенні активного регуляторного Са2+-кальмодулінового комплексу

СПИСОК ПРАЦЬ, ОПУБЛІКОВАНИХ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

1. Остапченко Л.І., Нальовіна О.Є., Гавриш Л.І., Гарматіна Е.К. Вплив рентгенівського опромінення на морфофункціональний стан лімфоцитів селезінки щурів // Вісник КУ.– 1998, № 28.– С. 59.

2. Остапченко Л.І., Нальовіна О.Є., Гавриш Л.І., Кірпенко Т.О. Вплив рентгенівського опромінення в дозах 0,5 та 1,0 Гр на особливості регуляції активності Са2+, фосфоліпід залежних протеїнкіназ лімфоцитів // Вісник КУ.– 1999, № 29.– С. 18.

3. Гавриш Л.І., Харченко О.І., Михайлик І.В., Вечеря О.О., Грищенко П.Г.

Активність маркерних ферментів в препаратах мембран лімфоцитів селезінки щурів в умовах опромінення // Вісник КУ.– 2000, № 31.– С. 15.

4. Гавриш Л.І., Томачинська Л.І., Шаповал І. Регуляція кальмодуліном активності Са2+ ,Mg2+-АТФази плазматичної мембрани лімфоцитів селезінки щурів за умов дії радіації // Вісник КУ.– 2000, № 32.– С. 22.

5. Кучеренко М.Е., Остапченко Л.І., Гавриш Л.І., Томачинська Л.І. Вплив фосфорилювання білків плазматичної мембрани лімфоцитів та кальмодуліну на активність Са2+, Mg2+- АТФази за умов дії радіації // ДАН України.– 2001.– № 2.– С. 179-182.

6. Гавриш Л.И., Гадилия E.П., Харченко О.И., Кучеренко Н.Е. Оценка активности циклонуклеотид- и Са2+-зависимых протеинкиназ в лимфоцитах селезёнки крыс // Международный радиобиологический съезд.– Тбилиси.– 1998.

7. Прохорова А.А., Бутенко О.А., Гавриш Л.И. Влияние радиации и кадмия на нуклеазную активность и содержание нуклеиновых кислот в тонком кишечнике крыс // Международный экологический конгрес “Новое в экологии жизнедеятельности”.– Санкт- Петербург.– 2000.

АНОТАЦІЯ

Гавриш Л.І. Регуляторний вплив кальмодуліну та фосфорилювання на активність кальційзалежних ферментів лімфоцитів селезінки щурів в умовах опромінення. – Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 03.00.04 – біохімія. – Київський національний університет імені Тараса Шевченка, Київ, 2001.

Узагальнено результати досліджень регуляції активності кальцій-залежних ферментів плазматичних мембран лімфоцитів селезінки щурів процесами білкового фосфорилюванням та клітинним модулятором – кальмодуліном за умов радіаційного впливу. Встановлено, що через циклонуклеотид- та Са2+-залежну систему фосфорилювання здійснюється регуляція активності Са2+,Мg2+-АТФази плазматичних мембран лімфоцитів селезінки щурів. Ці регуляторні механізми чутливі до дії опромінення в дозах 0,5 та 1,0 Гр, що виражається у частковій інактивації ПК-С та КМ-ПК. При цьому зменшується спорідненість ферментів до АТФ і знижується інтенсивність автофосфорилювання холоферментів. Комплекс Са2+- КМ активує Са/КМ-залежну протеїнкіназу, найкращим субстратом якої є легкі ланцюги міозину. Дія іонізуючого випромінювання в дозах 0,5 та 1,0 Гр не впливає на субстратну специфічність Са/КМ-залежної протеїнкінази, але призводить до перерозподілу рівня кальцію в лімфоцитах селезінки щурів, що потенціює порушення в утворенні активного регуляторного комплексу Са2+- кальмодуклін.

Ключові слова: плазматичні мембрани, протеїнкінази, кальмодулін, Са2+,Мg2+-АТФаза, рентгенівське випромінювання, лімфоцити селезінки.

A N N O T A T IO N

Gavrish L.I. A regulatory influence of calmodulin and phosphorylation on the activity of calcium-dependent enzymes in rat spleen lymphocytes in conditions of irradiation.

Dissertation for the obtaining of the scientific degree of the specialized in 00.03.04 – Biochemistry, Taras Shevchenko Kyiv national university. Kyiv, 2001.

It has been summarized the researched results of regulation of calcium-dependent enzymes activity in rat spleen lymphocytes plasma-membranes by calmodulin and protein phosphorylation processes under the radiation influence. It has been established that cyclonucleotide - and Са2+-dependent phosphorylation systems are implicated in regulation of Са2+,Мg2+-АТФase activity in rat spleen lymphocytes plasma-membranes. These regulatory mechanisms are sensitive to the X-ray radiation influence in doses of 0.5 and 1 Gy that is revealed as a partial inactivation of protein kinase C and Са2+/calmodulin-dependent protein kinase. At that ATP-binding ability of protein kinase C is decreased after irradiation and autophosphorylation of this enzyme is less intensive. Complex Са2+- calmodulin regulates ATPase functioning and activates Са2+/calmodulin-dependent protein kinase, optimal substrate of the latter is myosin light chains. The investigation of ionizing radiation action in doses of 0.5 and 1 Gy has not revealed any significant alteration of Са2+/calmodulin-dependent protein kinase’s substrate specificity.

Key words: plasma-membranes, protein kinases, calmodulin, Са2+, Мg2+- ATPase, X-ray radiation, spleen lymphocytes.

А Н Н О Т А Ц И Я

Гавриш Л.И. Регуляторное влияние кальмодулина и фосфорилирования на активность кальцийзависимых ферментов лимфоцитов селезёнки крыс в условиях облучения. – Рукопись.

Дисcертация на соискание научной степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.04 – биохимия. – Киевский национальный университет имени Тараса Шевченко, Киев, 2000.

Нормальное функционирование клетки находится под контролем многообразных регуляторных систем. В клетке существует довольно ограниченное количество универсальных регуляторов. К их числу относятся некоторые производные фосфолипидов, циклические нуклеотиды, ионы кальция и некоторые другие низкомолекулярные соединения. Эти факты и вызвали наш интерес к исследованию наиболее универсальных систем клеточной регуляции – белкового фосфорилирования, а так же тригерного белка кальмодулина, который играет ключевую роль в формировании клеточного ответа на гормональное возбуждение. В наше время доказано, что рентгеновское облучение, в низких дозах, способно инициировать дисфункцию вышеупомянутых регуляторных систем.

В результате исследований было установлено, что через циклонуклеотид- и Са2+- зависимую систему фосфорилирования осуществляется регуляция активности Са2+,Мg2+-АТФазы плазматических мембран лимфоцитов селезёнки крыс. Данные регуляторные молекулярные механизмы являются чувствительными к действию тотального рентгеновского облучения в дозах 0,5 та 1,0 Гр. Влияние облучения в исследуемых дозах характеризовалось частичной инактивацией Са2+, фосфолипид- и Са2+, кальмодулинзависимой протеинкиназы. При этом наблюдается уменьшение сродства ферментов к АТФ, что приводит к снижению интенсивности автофосфорилирования исследуемых холоферментов. Фактором, активирующим работу транспортных АТФаз, является комплекс кальций-кальмодулин, который активирует Са2+, кальмодулинзависимую протеинкиназу. Оптимальным белковым субстратом для последнего фермента являются лёгкие цепи миозина как в контроле, так и после влияния облучения.

Полученные експериментальные данные позволяют заключить, что пострадиационные изменения в функционировании мембраносвязанных ферментов в лимфоцитах селезёнки обусловлены нарушением способности регуляторного белка кальмодулина взаимодействовать с цитоплазматическим кальцием, а также нарушением в процессах автофосфорилирования.

Ключевые слова: плазматическая мембрана, протеинкиназы, кальмодулин, Са2+,Mg2+-АТФаза, рентгеновское излучение, лимфоциты селезёнки.