НАЦIОНАЛЬНА АКАДЕМIЯ НАУК УКРАЇНИ

IНСТИТУТ МОЛЕКУЛЯРНОЇ БIОЛОГIЇ I ГЕНЕТИКИ

Гарiфулiн Олег Минiрович

УДК577.21:577.214.622

IДЕНТИФIКАЦIЯ КОМПЛЕКСIВ ГЕНIВ, ЯКI ЗМIНЮЮТЬ

НОРМАЛЬНУ ЕКСПРЕСIЮ В АСТРОЦИТАРНИХ ГЛIОМАХ

03.00.03 - молекулярна бiологiя

Автореферат

дисертацiї на здобуття наукового ступеня

кандидата бiологiчних наук

Київ-2001

Дисертацiєю є рукопис.

Роботу виконано у вiддiлi бiосинтезу нуклеїнових кислот Iнституту

молекулярної бiологiї i генетики НАН України, м. Київ.

Науковий керiвник: доктор бiологiчних наук, професор,

член-кореспондент НАН України

Кавсан Вадим Мусiйович,

Iнститут молекулярної бiологiї i

генетики НАН України, м. Київ,

завiдувач вiддiлу бiосинтезу нуклеїнових кислот.

Офiцiйнi опоненти: доктор біологічних наук

Смірнова Ірина Андріанівна

Iнститут експериментальної патологiї, онкологiї i радiобiологiї

iм. Р.Є. Кавецького НАН України, м. Київ,

провідний науковий співробітник

відділу механiзмiв лейкогенезу;

доктор бiологiчних наук

Соломко Олександр Петрович,

Iнститут молекулярної бiологiї i

генетики НАН України, м. Київ,

завiдувач вiддiлу бiохiмiчної генетики.

Провiдна установа: Київський нацiональний унiверситет iм. Тараса Шевченка,

бiологiчний факультет, м. Київ.

Захист дисертацiї вiдбудеться 12.06.2001 року о 10 годинi на засiданнi Спецiалiзованої вченої ради Д 26.237.01 Iнституту молекулярної бiологiї i генетики НАН України за адресою: Київ 03143, вул. Академіка Заболотного, 150.

З дисертацiєю можна ознайомитись у бiблiотецi Iнституту молекулярної бiологiї i генетики НАН України, Київ 03143, вул. Академіка Заболотного, 150.

Автореферат розiслано 11.06.2001 року.

Вчений секретар Спецiалiзованої вченої ради

канд. біол. наук Підпала О.B.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальнiсть теми. Астроцитарнi глiоми - новоутворення астроцитарної глiї I-IV ступеня злоякiсностi, що складають до половини усiх iнтракранiальних пухлин людини. Для клiнiки астроцитарних глiом характерна практично стовiдсоткова летальнiсть, що пов`язано з набуттям злоякiсностi у доброякiсних форм цих пухлин та значною частотою рецидивiв. За даними Управлiння медичної статистики МОЗ України випадки злоякiсних новоутворень центральної нервової системи становили 4,7 у 1996 р. та 4,8 у 1997 р. у перерахунку на 100000 населення. В нейрохiрургiчних закладах України у 1997 р. було прооперовано 1201 людину iз злоякiсними та 1716 iз доброякiсними пухлинами нервової системи (Зозуля та iн., 1999).

Астроцитарні глiоми характеризуються збільшенням пролiферативної активності клiтин, змінами їхнього iмунного статусу, набуттям клiтинами iнвазiйних властивостей, стiйкістю до фармакотерапiї, пiдвищенням ролi глiколiзу в їх метаболiчних процесах, а в цiлому для пухлини - неоваскуляризацiєю та некротичними явищами. З`являється все бiльше фактичних даних, що у формуваннi пухлинного фенотипу клітини беруть участь сотнi специфічних генiв, якi змiнюють нормальну експресiю, причому лише у поодиноких випадках за рахунок мутацій (Sager, 1997). Визначення таких генiв є прiоритетним у рядi нацiональних та мiжнародних проектiв, як наприклад, Проект анатомiї геному пухлини (Сancer Genome Anatomy Project, CGAP), присвячених молекулярно-генетичним дослiдженням канцерогенезу. Розвиток нових пiдходiв, методiв, заходiв у технологiях порiвняльного аналiзу експресії генів різних клітин забезпечує реальну можливiсть вирiшення цього завдання i для пухлин астроцитарного походження.

Зв`язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Робота вiдповiдає основному плану фундаментальних дослiджень, якi проводяться у вiддiлi бiосинтезу нуклеїнових кислот Iнституту молекулярної бiологiї i генетики НАН України (зав. вiддiлу – чл.-кор. НАН України В.М. Кавсан) за бюджетною темою N2.28.2.2 - "Вивчення регуляцiї вираження генiв у вищих еукарiот", а також спiльних проектiв: із Iнститутом нейрохiрургiї ім. акад. А.П. Ромоданова АМН України (Київ) - "Дослiдженння генетичних змiн у глiомах рiзного ступеня злоякiсностi та зiставлення iз клiнiчними та iмунологiчними проявами захворювання"; із Центром ембрiональних тканин “ЭмСелл“ (Київ) - "Отримання зразкiв ембрiональних тканин людини для проведення генно-iнженерних робiт"; із Нiмецьким центром ресурсiв i баз даних Проекту "Геном людини" (Resource Zentrum/Primary Data Base, German Human Genome Project; RZPD) мiжнародного консорцiуму по Iнтегрованому молекулярному аналiзу експресiї геному (Integrated Molecular Analysis of Genome Expression; I.M.A.G.E.) - "Determination of genetic alterations associated with initiation or progression of human brain astrocytic tumors" ("Дослiдження генетичних змiн, якi асоцiйованi з iнiцiюванням та прогресiєю пухлин астроцитарного походження").

Мета i завдання дослiдження. Метою роботи було виявити комплекси генiв, які задіяні у різних клітинних процесах злоякісної трансформації астроцитів. Отже, об`єктом дослідження було вивчення молекулярних основ канцерогенезу астроцитарних гліом; предметом дослідження – визначення генів, змiни нормальної транскрипцiйної активності яких можуть бути асоцiйованi із їх участю у формуваннi астроцитарних пухлин.

Для досягнення мети вирiшувалися такі завдання:

1. Нормалiзувати зразки РНК головного мозку людини та астроцитарних глiом за середнім вмістом транскриптів генів загальноклітинних функцій (b-актину, гліцеральдегід-3-фосфат дегідрогенази (G3PDH), a-тубуліну, убіквітину) для адекватного аналiзу вмісту мРНК дослiджуваних генiв у відповідних клітинах;

2. Виявити гени із зміною в клітинах астроцитарних гліом нормального вмiсту мРНК гібридизаційним аналізом “грид” кДНК-бібліотеки головного мозку людини із зондами тотальних кДНК головного мозку людини та астроцитарних пухлин;

3. Визначити гени із зміною нормального вмісту мРНК у клітинах гліобластом методом “електронного віднімання”;

4. Серед виявлених генів із зміною у клітинах астроцитарних гліом нормального вмісту мРНК виокремити різні за функцією групи, які можуть бути залучені до неопластичної трансформації астроцитів;

5. Нозерн-аналізом дослідити експресію генів виокремлених груп із найбільш значною зміною нормального вмісту мРНК у пухлинах головного мозку людини різного гістогенезу та ступеня злоякiсності.

Наукова новизна одержаних результатiв. Вперше показано, що біля 1% генів, які функціонують у клiтинах головного мозку людини, активуються або репресуються в астроцитарних гліомах. Нормальний вмiст мРНК біля 470 iдентифiкованих генів у клітинах глiобластом змiнено у 5-50 разiв, як це визначено для вмiсту відповідних кДНК у кДНК (SAGE)-бiблiотеках нормальних та гліобластомних тканин головного мозку людини.

Знайдено, що 4-кратне зниження кiлькостi РНК зразка астроцитарної глiоми є його нормалiзацiєю iз зразком РНК нормальної тканини головного мозку людини для адекватного нозерн-аналiзу експресії досліджуваних генiв. Такі зразки РНК достатною мірою репрезентують однакову кількість клітин того самого проліферативного стану.

Серед 203 із 470 ідентифікованих генів, для яких вiдома функцiя у клiтинi, виокремлено групи, змiни нормальної експресiї представникiв яких пов`язанi із комплексами процесiв неоваскуляризацiї, метаплазiї, некротизацiї та дедиференцiювання клiтин астроцитарних пухлин, перебудовами у регулюваннi їх клiтинного циклу, набуттям злоякiсною клiтиною специфiчного iмунологiчного статусу та метаболiзму. Для бiльшостi з 203 генiв виокремлених груп дані про зміну їхньої нормальної експресії у клітинах злоякісних астроцитарних глiом отримано вперше.

Встановлено, що ген групи транскрипцiйних факторiв Sox-2, який у нормi функціонує в ембрiональних нервових клітинах людини, експресується переважно в глiомах. У цих пухлинах SOX-2 – потенційний активатор генiв, експресія яких у нормi ідентифікована лише в пролiферуючих ембрiональних нервових клiтинах.

Визначено, що експресiя інгібованого у нормі гена хрящового глiкопротеїну 39 людини (HC gp-39), який вiднесено до групи генiв метаплазiї, значно виражена тільки в глiобластомах та набагато слабше в астроцитарних гліомах III ступеня злоякісноcті. Це може бути пов`язано з хондросаркомною (саркоглiомною) трансформацiєю значно дедиференцiйованих злоякiсних клiтин гліобластоми та/або змiною iмунологiчного статусу мононуклеарiв кровi, яке притаманне тканинi тільки злоякісних астроцитарних гліом.

Теоретичне та практичне значення одержаних результатiв. Виявленi у роботi біля 470 генів із змiненою експресiю в злоякісних астроцитарних гліомах є вагомим внеском для побудови майбутньої панелi, яка охопить усi гени, що змiнюють нормальну функцію в клітинах рiзних пухлин. Подiбнi панелi дадуть змогу визначити загальнi або специфiчнi набори генiв, якi беруть участь у канцерогенезі рiзних клітин або формуваннi пухлин рiзного ступеня злоякiсностi одного гiстогенезу.

Виокремлені комплекси 203 генiв із вiдомою функцiєю, які виявляють зміну нормальної експресiї у клітинах злоякісних астроцитарних гліом, можуть бути використанi для визначення рiзних клiтинних циклiв, а пiзнiше для їх об`єднання у загальну картину, що необхiдно для бiльш повного уявлення стосовно молекулярних основ формування астроцитарних пухлин. Встановлення функцiй інших 267 з 470 генів, які виявлені у даній роботі, буде суттєвим поповненням виокремлених комплексiв генів новими представниками.

Транскрипти визначених у роботi генiв або вiдповiднi бiлки можуть бути маркерами для дiагностики астроцитарних глiом та прогностичними факторами їх розвитку, мiшенями або iндикаторами чутливостi клiтин цих пухлин до терапiї. Так, зокрема, HC gp-39 може бути застосований як молекулярний маркер визначення глiобластом серед пухлин головного мозку людини рiзного гiстогенезу. Інгібування у гліомах активності SOX-2 та/або генів, які з ним взаємодіють, відповідними фармако- або генотерапевтичними засобами може зменшити проліферативну активність або злоякісну прогресію цих пухлин.

Особистий внесок здобувача. Результати, якi викладенi у дисертацiї, отримано здобувачем, в основному, самостiйно. Дослiднi роботи із гiбридизацiйного аналiзу кДНК-бiблiотеки були проведенi спiльно з к.б.н. В.В. Дмитренком, А.М. Марусиком та К.О. Шостак. У частинi експериментiв із нозерн-аналiзу генiв брав участь А.М. Марусик. Здобувач висловлює подяки: к.м.н. Н.Я. Гридiнiй за наданi тканини глiоми щура, а також кориснi консультацiї стосовно бiологiї пухлин головного мозку людини; спiвробiтникам Iнституту нейрохiрургiї iм. акад. А.П. Ромоданова за бiопсiї нормальних та пухлинних тканин головного мозку людини; др. Г. Цехетнеру (G. Zehetner) та спiвробiтникам RZPD за бактерiальнi клони кДНК-бiблiотек тканин людини; др. Г. Лераху (H. Lerach) за фiльтри з клонами кДНК-бiблiотеки головного мозку людини.

Апробацiя результатiв дисертацiї. Результати дослiджень були представленi на 4-му Європейському конгресi iз клітинній бiологiї (Прага, 1994); конференцiї з проблем регулювання генiв у формуваннi та патологiях печiнки (Аркашон, 1995); XV симпозиумi Європейської асоцiацiї дослiджень раку (EACR) (Стокгольм, 1998); 9-ій (Гамбург, 1997) i 10-ій (Вiдень, 1999) конференцiях Європейського товариства дослiджень раку (ECCO); конференції з проблеми Геному людини (HGM) (Едінбург, 2001), а також наукових семiнарах вiддiлу бiосинтезу нуклеїнових кислот i вiддiлу молекулярної онкогенетики Iнституту молекулярної бiологiї i генетики НАН України. У базах даних EMBL зареєстровані послiдовності кДНК 21-го відповідного гена, які визначені в цiй роботi, за такими номерами: Z69891, Z69892, Z69915, Z70024, Z70218, Z70219-70223, Z70759-70771.

Публiкацiї. За темою дисертацiї опублiковано десять робiт, із них чотири статтi у спiвавторствi, одна з яких - в закордонному виданнi, а також тези шести доповiдей, які були представлені на мiжнародних наукових конференцiях.

Структура та обсяг роботи. Дисертацiю викладено на 134 сторiнках машинописного тексту. Вона мiстить: вступ; огляд лiтератури; огляд методологiй та методiв виявлення генiв, якi беруть участь у канцерогенезi; експериментальну частину та методи дослідження; результати дослiджень; обговорення отриманих результатiв; висновки. Дисертацiю проiлюстровано 7 рисунками i 9 таблицями. Список цитованої лiтератури охоплює 343 найменування.

ОСНОВНИЙ ЗМIСТ РОБОТИ

Матерiали та методи дослiдження

Бiологiчний матерiал.

Тканини. Бiопсiї пухлин та тканин бiля пухлин головного мозку людини були отриманi з Iнституту нейрохiрургiї ім. акад. А.П. Ромоданова АМН України. Гiстопатологiчний аналiз зразкiв проводився спiвробiтниками того ж iнституту. Тканини ембрiонального головного мозку людини (12-14 тижнiв) були наданi Центром ембрiональних тканин “ЭмСелл“. Глiомна пухлина щура, яка була отримана перевиванням високозлоякiсної клiтинної лiнiї “101.8” глiоми щура, надана к.м.н. Н.Я. Гридiною. Тканину головного мозку щура отримано вiд бiлого самця лiнiї "Wistar", вiком 4-5 мiсяцiв, масою 200-300 г. Зразки тканин транспортували i зберiгали у рiдкому азотi чи у низькотемпературному холодильнику при -70 0С.

Бактерiальнi клони i кДНК-бiблiотеки. У роботi використовували "гриди"-нейлоновi фiльтри 22х22 см з упорядковано розташованими клонами (бiля 15000 на кожному) нормалiзованої кДНК-бiблiотеки головного мозку 17-тижневого ембрiона людини, які були наданi др. Г. Лерахом. Клони цієї та інших кДНК-бiблiотек тканин людини, якi використовували в роботi, були наданi др. Г. Цехетнером.

Методи.

Видiлення препаратiв нуклеїнових кислот. РНК видiляли гуанiдинтiационатним методом (Chomczynski and Sacchi, 1987). Концентрацiю препарату вимiрювали спектрофотометрично ("Beckman", США) (Маниатис и др., 1984). Плазмiдну ДНК видiляли методом лужного лiзису (Birnboim and Dohli, 1983) або кип'ятінням (Holmes et al., 1981). Для видiлення ДНК з агарози використовували набiр реактивiв i протокол "Geneclean" ("Bio101", США).

Реакцiї рестрикцiї i лiгування. Реакцiї рестрикцiї проводили з плазмiдною ДНК концентрацiєю бiля 1 мкг в 20 мкл реакцiйної сумiшi оптимальної iонної сили i значення рН, згiдно рекомендацiй фiрми-виробника ("Fermentas", Литва; "Roche", Нiмеччина; "NEBBiolabs", Велика Британiя). У реакцiї лiгування використовували лiгазу i вiдповiдний буферний розчин виробництва "Roche".

Трансформацiя бактерiальних клiтин плазмiдною ДНК. Для приготування компетентних клiтин використовували XL1 штам E.coli ("Stratagene", США). Трансформацiю бактерiй плазмiдною ДНК здiйснювали iз застосуванням хлористого кальцiю (Mandel et al., 1970).

Електрофорез нуклеїнових кислот. Електрофоретичне роздiлення фрагментiв ДНК здiйснювали в трис-боратному буферному розчинi у 0,8-1% агарозному гелi при напрузi електричного поля 5-10 В/см, використовуючи глiцериновий розчин для нанесення проб (Маниатис и др., 1984). Електрофорез РНК проводили у 0,8% агарозному гелi у присутностi 2,2М формальдегiду протягом 3-4 год при напрузi електричного поля 5-10 В/см (Маниатис и др., 1984).

Іммобілізація нуклеїнових кислот на мембранi. Перенесення РНК i ДНК з агарозного гелю на мембрану Hybond-N ("Amersham Pharmacia Biotech", Велика Британiя/Швецiя) здiйснювали за методикою Саузерна (Southern, 1975). Мембрану підсушували на повiтрi i фiксували нуклеїновi кислоти УФ-опромiненням в апаратi "Stratalinker" ("Stratagene", США) (254 нм; 1200 мкДж/см2; 15 с).

Для аналiзу РНК у дот-гiбридизацiї (Davis et al., 1986) готували двократні розведення препарату, що містили нуклеїнову кислоту у концентрації 10–0,08 мкг/мл. Нанесення проб в об`ємі 100 мкл на мембрану Hybond-N ("Amersham Pharmacia Biotech") здiйснювали iз використанням мультиканальної вакуумної фiльтрувальної установки типу "manifold" ("Schleiher & Schuell", Нiмеччина). Мембрану пiдсушували на повiтрi i фiксували РНК УФ-опромiненням як описано вище.

Гiбридизацiйний аналiз нуклеїнових кислот. Радiоактивно-мiченi зонди кДНК (вiдповiдають нуклеотиднiй послiдовностi кодуючої частини мРНК досліджених у роботі генів) отримували в реакцiї "олiгомiчення" (Feinberg et al., 1984), використовуючи набiр реагентiв "RediprimeII" та a[32Р]dCTP, згiдно рекомендацiй фiрми-виробника "Amersham Pharmacia Biotech". Продукт реакцiї очищували гель-фiльтрацiєю на сефадексi G-50. Специфiчну активнiсть зонда вимiрювали як описано (Маниатис и др., 1984). Синтез зондiв тотальних кДНК здiйснювали з використанням зворотної транскриптази iз вiрусу мiєлобластозу птахiв, яку було отримано у вiддiлi бiосинтезу нуклеїнових кислот Iнституту молекулярної бiологiї i генетики НАН України (Кавсан и др., 1974). Гiбридизацiю фiльтрiв проводили у формамiдному розчинi (Маниатис и др., 1984), радiоактивнiсть якого пiсля додавання кДНК-зонда була 108 iмп./хв х мл, протягом 10-16 год при 42 0С за допомогою пристрою "Autoblot" ("BellcoGlass", США). При вiдмиваннi фiльтрiв у жорстких умовах (65 0С, 30-60 хв) концентрацiя NaCl була 0,03 М, у нежорстких умовах (50 0С, 1,5-2 год) - 0,3 М. Для радiоавтографiї фiльтрiв використовували рентгенiвську плiвку "Kodak" (США). Iнтенсивнiсть сигналiв гiбридизацiї вимiрювали денситометрично за допомогою програми “ScionImage 1.61” (NIH; США).

Аналiз нуклеотидних послiдовностей. Визначення нуклеотидної послiдовностi ДНК проводили за методом Сенгера (Sanger et al., 1977), використовуючи a[35S]dATP i набiр реактивiв фірми "Amersham Pharmacia Biotech". Нуклеотиднi послiдовностi аналiзували з використанням BlastN та BlastX аналiзiв (Altschul et al., 1997).

"Електронне вiднiмання". ESTs (expressed sequence tags) – послідовності довжиною 100-500 н. 3`- та/або 5`-кінців кДНК, яких визначено у кДНК-бібліотеках CGAP головного мозку людини та гліобластоми, порівнювали у “цифровому диференційному дисплеї” (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/cgi-bin/UniGene/ddd). Tags – ESTs довжиною 10 н., яких отримано за результатом серійного аналізу експресії гена (Serial Analysis of Gene Expression, SAGE) (Velculescu et al., 1995) головного мозку людини та гліобластом порівнювали у http://www.ncbi.nlm.nih.gov/SAGE.

Статистичний аналiз. Бiометричну обробку даних проводили для вiрогiдностi подiї P<0,05 i P<0,001 (Рокицкий, 1969). При отриманнi результатiв “електронного віднімання” використовували метод Фiшер-тесту (Лакин, 1990).

Отриманi результати та їх обговорення

Нормалiзацiя зразкiв РНК головного мозку людини i астроцитарних глiом. У пухлинних клiтинах, порівнянно з нормальними, з одного боку, вiдбувається зменшення загального вмiсту мРНК внаслiдок їх дедиференцiювання, тобто припинення експресiї (транскрипцiйної активності) тканиноспецифiчних генiв, вмiст транскриптiв яких звичайно становить не менше половини загального вмiсту мРНК еукарiотичної клiтини (Льюин, 1987); з другого боку, збiльшено їх пролiферуючий пул, який складає 13-18% для злоякiсних та 3% для доброякiсних астроцитарних глiом (Земская и Лещинский, 1985). У пролiферуючих клiтинах зростає загальний вмiст мРНК, але ж за рахунок бiльш активного перетворення полi(А)+гяРНК на полi(А)+мРНК тих самих генiв, що експресуються в клiтинах у станi спокою (Льюин, 1987). Ці два процеси мають значний вплив на змiну нормального вмiсту мРНК, але є тiльки наслiдком канцерогенезу. Отже, для адекватного аналiзу змiн вмiсту iндивiдуальних мРНК, якi дiйсно можуть бути пов'язанi iз змiною транскрипцiйної активностi (експресiї) вiдповiдних генiв, треба нормалiзувати зразки РНК нормального головного мозку людини i астроцитарних глiом таким чином, щоб вони репрезентували однакову кiлькiсть клiтин того самого пролiферативного стану. Визначення середнього вмiсту транскриптiв генiв загальноклiтинних функцiй, експресiя яких потрiбна для забезпечення базових клiтинних процесiв, дозволяє отримати нормалiзованi зразки РНК із тканин, клiтини яких вiдрiзняються транскрипцiйною активнiстю (частиною геному, що транскрибується) та/або пролiферативним станом (Spanakis and Brouty-Boye, 1994).

У роботi використанi кДНК-зонди чотирьох генiв загальноклiтинних функцiй, визначення середнього вмiсту транскриптiв яких рекомендовано фiрмою "Clontech"

(США) для нормалiзацiї зразкiв РНК рiзних тканин (рис. 1А).

Згiдно із отриманими даними, в астроцитарних глiомах вiдбувається середнє пiдвищення у 4 рази нормального вмiсту транскриптiв генiв загальноклiтинних функцiй (рис. 1Б). У зразку РНК головного мозку дорослої людини спостерiгається зниження вмiсту транскриптiв генiв загальноклiтинних функцiй у середньому в два рази, порiвняно із зразком РНК головного мозку ембрiона людини (рис. 1Б 1, 2), що вiдображає закономiрне явище, пов`язане з процесами спецiалiзацiї нервових клiтин, тобто встановленням експресiї тканиноспецифiчних генiв (цит. за Ашапкин и др., 1984).

Рис. 1. А - радiоавтограф гiбридизацiї кДНК-зондiв дослiджених генiв загальноклiтинних функцiй з нанесеними у двократному розведенні (верхнiй та нижнiй рядки для кожного гена) зразками тотальних РНК: 1 - головного мозку ембрiона (12-14 тижнiв) людини; 2 - головного мозку дорослої людини (бiопсiя тканини бiля астроцитарної глiоми II ступеня злоякiсностi); 3, 4 - астроцитарної глiоми II ступеня злоякiсностi; 5-7 - астроцитарної глiоми III ступеня злоякiсностi (5, 6 – РНК з рiзних зразкiв бiопсiї однiєї пухлини); 8 - глiобластоми. Кожний зразок мiстить 1мкг РНК, за винятком зразка 6 (2 мкг). Б - вiдносний рiвень середнього вмiсту (вiсь ординат) транскриптiв дослiджених генiв у відповідних зразках РНК (вiсь абсцис), який визначено за денситометрiчним аналiзом радiоавтографу дот-гiбридизацiї (А).

Отже, 4-кратне зниження кiлькостi РНК зразка астроцитарної глiоми є його нормалiзацiєю для порiвняльного нозерн-аналiзу експресії досліджуваних генів iз зразком РНК нормальної тканини головного мозку людини. Таким чином, бiльш нiж 4-кратна рiзниця вмiсту транскриптiв генів у однакових за кількістю РНК (тотальної кДНК) зразках нормальних тканин головного мозку людини та астроцитарних пухлин буде визначати змiну їхньої нормальної експресiї.

Гени, якi визначенi гiбридизацiйним аналiзом "грид" кДНК-бiблiотеки головного мозку людини. Диференцiйною гiбридизацiєю бiльш нiж 15000 клонiв “гриди” iз зондами тотальної кДНК головного мозку людини i астроцитарних глiом визначено вiдмiнностi у розподiлi сигналiв гiбридизацiї для 30 клонiв (рис. 2).

Рис. 2. Фрагменти радiоавтографiв гiбридизацiї “гриди” кДНК-бiблiотеки головного мозку ембріона (17 тижнiв) людини із зондами тотальних кДНК: А - головного мозку людини (бiопсiя тканини бiля астроцитарної глiоми III ступеня злоякiсностi); Б - астроцитарної глiоми III ступеня злоякiсностi. Стрiлками вказано клони, якi по-рiзному гiбридизуються із зондами тотальних кДНК: “М” - головного мозку людини; “А”- астроцитарної глiоми III ступеня злоякiсностi. В - результат гiбридизацiї того ж фрагмента “гриди” iз зондом ДНК плазмiди pSPORT1 - вектора кДНК-бiблiотеки.

Подальшим аналiзом iдентифiкованих клонiв було визначено дев`ять генiв, вмiст транскриптiв яких збагачено в пухлинних клiтинах (Дмитренко та iн., 1998) (табл. 1). Для клону ICRFp507G2490 визначено сигнал гiбридизацiї тiльки iз зондом тотальної кДНК глiобластоми (рис. 3). ICRFp507G2490 - гомолог гена 9.8 кД бiлка з невiдомою функцiєю Caenorhabditis elegans, який у цій роботі вперше знайдений у людини. Висока консервативнiсть структури бiлка в органiзмах, які далеко знаходяться один вiд одного в еволюцiйному розвитку, свiдчить про важливiсть його функцiї у клiтинi. 3`-нетрансльована дiлянка мРНК ICRFp507G2490 мiстить Alu-повтор Sp-родини розмiром 88 п.н. Очевидно, присутність у зонді тотальної кДНК глiобластоми кДНК для Alu-транскриптiв, синтез яких може бути підвищеним у клітинах цієї, а також ряду iнших пухлин (Limborska et al., 1987), є причиною пiдсилення гiбридизацiйного сигналу для ICRFp507G2490.

Таблиця 1

Гени, якi iдентифiкованi диференцiйною гiбридизацiєю "гриди" кДНК-бiблiотеки головного мозку ембрiона (17 тижнiв) людини

ГЕН ПОСИЛАННЯ* ЗМІНА**

ГЕНИ З ВІДОМОЮ ФУНКЦІЄЮ

Білок мозку 1(Brn-1) Schreiber et al., 1997; embZ70770; H64 Зб.

Фактор 6 (TRAF6) рецептора фактора некрозу пухлин (TNF) Cao et al., 1996; H121 Зб.

Мiтохондрiальна 16S рРНК Horai et al., 1995; embZ70759; H48 Зб.

Лактат дегiдрогеназа Б Sakai et al.,1987; H45 Зб.

кДНК ГЕНІВ ІЗ НЕВІДОМОЮ ФУНКЦІЄЮ

ICRFp507G2490 Дмитренко та iн., 1998; embZ70222; H65 Зб.

ICRFp507C063 H76 Зб.

ICRFp507C1134 H122 Зб.

ICRFp507M1080 H8 Зб.

ICRFp507O073 H75 Зб.

Примiтки:

жирним шрифтом видiлено гени, для яких змiну нормальної експресiї в астроцитарних глiомах було описано iншими авторами ранiше.

* - спочатку iде посилання на статтю, потiм iдентифiкацiйнi номери кДНК у базi даних EMBL та “Колекцiї генiв, онкогенiв i штамiв IМБiГ НАН України”, вiдповiдно.

** - зб. - збiльшення iнтенсивностi сигналу гiбридизацiї кДНК вiдповiдного гена із зондом тотальної кДНК глiобластоми у порiвняннi iз зондом тотальної кДНК

головного мозку дорослої людини.

Рис. 3. Фрагменти радiоавтографiв гiбридизацiї кДНК клонiв, вiдiбраних диференцiйною гiбридизацiєю із зондами тотальних кДНК: А - головного мозку ембрiона (17 тижнiв) людини; Б - головного мозку дорослої людини (бiопсiя бiля астроцитарної глiоми III ступеня злоякiсностi); В – астроцитарної глiоми III ступеня злоякiсностi; Г - глiобластоми. Дорiжка 4 мiстить кДНК клону ICRFp507G2490. Дорiжки 1-3 и 5-7 мiстять кДНК клонiв, якi не мають значних вiдмiнностей у iнтенсивностi сигналiв гiбридизацiї.

Використання зондiв тотальної кДНК для гiбридизацiйного аналiзу клонiв кДНК-бiблiотек дозволяє виявляти змiни вмiсту збагачених мРНК для 5-10% усiх генiв, що транскрибуються в еукарiотичнiй клiтинi (Bonaldo et al., 1996). Результати диференцiйної гiбридизацiї “гриди” вказують, що з таких генiв лише декілька мають значно змінений нормальний вміст мРНК у клітинах астроцитарних глiом.

Гени, якi iдентифiкованi у базах даних CGAP по ESTs, визначених у кДНК-бiблiотеках головного мозку людини i глiобластоми. "Цифровий диференцiйний дисплей" було проведено для 13000 ESTs кДНК-бiблiотеки глiобластоми та 73000 ESTs кДНК-бiблiотек головного мозку дорослої людини, що репрезентували більш ніж 7800 генiв. Цей метод дозволив виявити 25 генiв, розподiл транскриптiв яких змiнюється (P<0,05) у відповідних клітинах. Ідентифіковані гени були згрупованi залежно вiд функцiї, яку вони виконують у клiтинi (табл. 2).

Таблиця 2

Гени функцiонально рiзних груп, вміст ESTs яких відрізняється в CGAP кДНК-бібліотеках головного мозку дорослої людини та гліобластоми

ГРУПИ ГЕНІВ ПОСИЛАННЯ ЗМІНА*

БIЛКИ ЗАГАЛЬНОКЛIТИННИХ ФУНКЦIЙ

Cульфатований глiкопротеїн хондроїтину (версикан) Dours-Zimmermann et al., 1994 Зб. 78x

Гiстон H2A (H2AFL) Dobner et al., 1991 Зб. 47x

Рибосомальний бiлок S2 (RPS2) Slynn et al., 1990 Зб. 7x

b-тубулiн (TUBB) Cleveland et al., 1985 Зм. 11x

БIЛКИ НЕРВОВОЇ ТКАНИНИ

Аполiпопротеїн E (APOE) McLean et al., 1984 Зб. 113x

Бiлок нейронального клону 23876 (спорiднений олфактомедину) Yu et al., 1997 Зм. 46x

Бiлок легкого ланцюга феритину (FTL) Boyd et al., 1985 Зб. 9x

IМУНОЛОГIЧНИЙ СТАТУС КЛIТИНИ

Цистатин С (CST3) Abrahamson et al., 1990 Зб.120x

Бiлок теплового шоку 27 кДа (HSPB1) Hickey et al., 1986 Зб.16x

Бiлок- гомолог C1q-фактора комплементу Berube et al., 1999 Зб.101x

Бiлок теплового шоку 10 кДа (HSPE1) Chen et al., 1994 Зб. 78x

Стимулюючий EGF фактор 2 (ERF-2) Nie et al., 1995 Зб. 31x

КЛIТИННИЙ МЕТАБОЛIЗМ

UDP1,4-галактозилтрансфераза, бiлок 2 (B4GALT2) Almeida et al.,1997 Зб. 217x

РЕГУЛЯТОРИ КЛIТИННОГО ЦИКЛУ

Циклiн I Nakamura et al., 1995 Зб. 6x

ТРАНСКРИПЦIЙНI ФАКТОРИ

SOX-2 (SRY- related HMG-box 2) Stevanovic et al., 1994 Зб. 109x

Iнгiбiтор диференцiювання 1 (ID1) Deed et al., 1994 Зб. 52x

Бiлок 1 із доменом HMG (HMG1) Wen et al., 1989 Зб. 7x

KRAB-асоцiйований бiлок 1 (KRAB-1) Friedman et al., 1996 Зб. 6x

ГЕНИ IЗ НЕВIДОМИМИ ФУНКЦIЯМИ

Hs.75922 Зб. 373x

Hs.144121; Hs.196711; Hs.127792; Hs.106843; Hs.50151; Hs.8364 Зб.70-93x

Примiтки:

жирним шрифтом видiлено гени, для яких змiну нормальної експресiї в астроцитарних глiомах було описано iншими авторами ранiше;

* - зб. - збiльшення; зм. - зменшення кiлькостi ESTs гена в кДНК-бiблiотецi глiобластоми у порiвняннi iз кДНК-бiблiотеками головного мозку людини.

Як показано у табл. 2, вмiст ESTs гена транскрипцiйного фактора SOX-2 збагачено в кДНК-бiблiотецi глiобластоми у 109 разiв. Постульовано, що тiльки вiдносно мала кiлькiсть транскрипцiйних факторiв може виконувати функцiї контролю транскрипцiї активних у данiй тканинi генiв (Tjian et al., 1994). Оскiльки активацiя транскрипційного фактора Sox-2 може мати важливе значення для змiн нормальної експресії комплексу регульованих ним генiв в астроцитарних глiомах, цей ген було обрано для подальшого аналiзу.

За даними нозерн-гібридизації, транскрипт приблизно 2,5 т.н., що збiгається за розмiром iз мРНК Sox-2 (Stevanovic et al., 1994), має значний вмiст у клітинах астроцитарних глiом, глiоми щура, епендимом; набагато слабше визначається в тотальних РНК головного мозку ембрiона людини, метастазі в головний мозок злоякiсної пухлини легень i саркоми головного мозку людини; не виявляється в тотальних РНК головного мозку дорослої людини, головного мозку щура, менiнгiомах (рис. 4).

Таким чином встановлено, що Sox-2 активується лише в пухлинах глiального походження, причому усiх ступенiв злоякiсностi. Як показано раніше, Sox-2 у клітинах головного мозку ссавцiв експресується лише пiд час ембрiогенезу (Collignon et al., 1996). Серед генiв, якi є мiшенями дiї SOX-2, визначено протоонкоген FGF-4 (fibroblast growth factor 4), що бере участь у канцерогенезi ембрiональних карцином мишi (Ambrosetti et al., 1997). Змiна експресiї регульованих SOX-2 генiв у канцерогенезi глiом може бути важливим фактором формування злоякiсного фенотипу клiтин цих пухлин.

Рис. 4. А - результат гiбридизацiї кДНК-зонда Sox-2 iз тотальною РНК: 1 - головного мозку ембрiона (12-14 тижнiв) людини; 2, 3 - головного мозку дорослої людини (бiопсiї бiля астроцитарних глiом II ступеня злоякiсностi); 4 - головного мозку щура (вiк 4-5 мiсяцiв) лiнiї “Wistar”; 5, 6 - астроцитарної глiоми II ступеня злокiсностi; 7-12 - астроцитарної глiоми III ступеня злоякiсностi (8-10 - РНК з рiзних зразкiв бiопсiї однiєї пухлини); 13 - глiобластоми; 14 - глiоми щура; 15 - епендимоми I ступеня злоякiсностi; 16 - епендимоми II-III ступеня злоякiсностi; 17-21 - менiнгiоми I-го ступеня злоякiсностi (17 - менiнгiома; 18, 19 - менiнготелiальна менiнгiома; 20 - менiнгiома змiшаного складу; 21 - фiбробластична менiнгiома); 22 - менiнгiоми II ступеня злоякiсностi; 23 - метастази злоякiсної пухлини легень до головного мозку людини; 24 - саркоми головного мозку людини. Б - результат гiбридизацiї цих же зразкiв РНК iз кДНК-зондом b-актину. В - забарвлення бромистим етидiєм зразкiв РНК в агарозному гелi пiсля електрофорезу до перенесення на мембрану. Кожна дорiжка мiстить 10 мкг РНК.

Гени, якi iдентифiкованi у базах даних CGAP по SAGE-аналiзу головного мозку людини i глiобластом. В базах даних CGAP депоновано більш ніж 284000 tags для біля 47000 генiв, якi були визначенi у кДНК (SAGE)-бiблiотеках головного мозку дорослої людини та глiобластом. Це дозволяє проводити порiвняльний аналiз генiв, кiлькiсть яких майже на порядок перевищує їх число, доступне для обробки у “цифровому диференцiйному дисплеї”. Результати цього аналiзу наведенi на рис. 5.

Визначенi 5-50-кратнi змiни нормального вмiсту кДНК біля 470 iдентифiкованих генів (рис. 5) будуть спостерiгатися для вiдповiдних мРНК i у нормалiзованих за 4-кратним зменшенням кiлькостi РНК зразках астроцитарних пухлин. Отже, означенi гени дiйсно змiнюють нормальну транскрипцiйну активнiсть у клітинах злоякiсних астроцитарних глiомах. Аналiз даних лiтератури про 470 iдентифiкованих генів показав, що для 268 з них функцiя у клiтинi поки що невiдома. Іншi гени можна згрупувати за принципом подiбностi до тих вiдомих функцiй, якi вони виконують та змiна яких може супроводжувати формування пухлинного фенотипу гліальної клiтини (табл. 3). У більшості випадкiв, дані про змiну нормальної експресiї генiв виокремлених груп у клітинах злоякісних астроцитарних глiом отримані вперше.

Рис. 5. А - розподiл кiлькостi генiв (вiсь ординат), tags яких збiльшено в 5-50 разiв у кДНК (SAGE)-бiблiотеках головного мозку дорослої людини (2) або глiобластом (3). 1 - усього генiв, для яких виявлено рiзницю. Б - класифiкацiя 470 унiкальних tags (5-ти кратна i бiльше рiзниця розподiлу мiж кДНК (SAGE)-бiблiотеками) вiдповiдно гомологiї з послiдовностями генiв визначеної або невiдомої функцiї.

Таблиця 3

Гени функцiонально рiзних груп, вміст tags яких відрізняється в CGAP кДНК (SAGE)-бібліотеках головного мозку людини та гліобластом

ГРУПИ ГЕНІВ ПОСИЛАННЯ ЗМІНА*

ВАСКУЛЯРИЗАЦIЯ

Рецептор Y3 нейропептиду Y (CXCR4) Tachibana et al., 1998 Зб. 15x

Тканинний iнгiбiтор металопротеїнази 4 (TIMP4) Sang et al., 1998 Зб. 13x

Адреномедулiн (ADM) Yotsumoto et al., 1998 Зб. 11x

Остеонектин (SPARC) Jendraschak et al., 1996 Зб. 10x

IМУНОЛОГIЧНИЙ СТАТУС КЛIТИНИ

Лактоферин (LTF)ембрiонального Levay et al., 1995 Зб. 56x

Ген головного комплексу гiстосумiсностi класу I гаплотипу HLA Cx52 (HLA-C) Takata et al., 1988 Зб. 43x

Компонент комплементу C1r (C1R) Journet et al., 1986 Зб. 28x

Остеопонтин (SPP1) O'Regan et al., 1999 Зб. 12x

КЛIТИННИЙ МЕТАБОЛIЗМ

Нiкотинамiд-N-метилтрансфераза (NNMT) Aksoy et al., 1992 Зб. 24x

Бiлок резистентностi до хiмiотерапiї 3 (MRP3) Kiuchi et al., 1998 Зб. 18x

Аполiпротеїн С-II (APOC2) Breckenridge et al., 1978 Зб. 16x

b-субодиниця Na+K+ ATPase (ATP1B1) Kawakami et al., 1986 Зб. 14x

МЕТАПЛАЗIЯ

Хрящовий глiкопротеїн-39 (CHI3L1) Hakala et al., 1993 Зб. 82x

Хондроцитарний глiкопротеїн-39 iз N-кiнцевим доменом YKL (CHIT1) Hu et al, 1996 Зб. 17x

Фiбромодулiн (FMOD) Lauder et al., 1998 Зб. 16x

Остеобласт-специфiчний фактор 2 (OSF2) Takeshita et al., 1993 Зб. 10x

НЕЙРОТРАНСМIТЕРИ

Синаптотагмiн I (SYT1) Chowdhury et al., 1995 Зм. 24x

Нейрональний пентраксин 1 (NPTX1) Omeis et al., 1996 Зм. 13x

Субодиниця 1 рецептора N-метил-D-аспартату (GRIN1) Planells-Cases et al., 1993 Зм. 13x

Гомолог Unc-18 Caenorhabditis elegans (STXBP1) Swanson et al., 1998 Зм. 13x

РЕГУЛЯТОРИ КЛIТИННОГО ЦИКЛУ

Циклін-залежна кiназа 4 (CDK4) Serrano et al., 1993 Зб. 33x

Нейромедин Б (NMB) Charlesworth et al., 1997 Зб. 14x

Бiлок P1-родини гомологiв факторiв реплiкацiї Mcm S. cerevisiae (Cdc46) (MCM5) Hu et al., 1993 Зб. 11x

Cdc-спорiднений Arachis бiлок 1 (PNUTL1) McKie et al., 1997 Зб. 9x

ТРАНСКРИПЦIЙНI ФАКТОРИ

Цистеїн/глiцин багатий бiлок 2 (CSRP2) Weiskirchen et al., 1997 Зб. 10x

Бiлок із доменом цинкових пальців (ZNF230) Struhl et al., 1989 Зм. 8x

Ядерний фактор b-IL6 Kinoshita et al., 1992 Зб. 6x

Ген негайно ранньої вiдповiдi 1R21 із бiлковим доменом петля-спiраль-петля (ID3) Deed et al., 1993 Зб. 5x

Примiтки:

жирним шрифтом видiлено гени, для яких змiну нормальної експресiї в астроцитарних глiомах було описано iншими авторами ранiше;

* зб. - збiльшення; зм. - зменшення кiлькостi tags гена у кДНК (SAGE)-бiблiотеках глiобластом у порiвняннi iз кДНК (SAGE)-бiблiотеками головного мозку людини.

В табл. 3 привертає до себе увагу група генiв, які можуть бути задіяні у метаплазiї, притаманній лише гліобластомі (Richman et al., 1980). Один iз них - ген хрящового глiкопротеїну 39 людини (human cartilage glycoprotein-39, HC gp-39) (Hakala et al., 1993) із збiльшенням нормального вмiсту tags у кДНК (SAGE)-бібліотеках гліобластом у 82 рази, який було обрано для подальшого аналiзу.

За даними нозерн-гібридизації, транскрипт приблизно 1,7 т.н., що збiгається за розмiром iз мРНК HC gp-39 (Hakala et al., 1993), визначено тільки у злоякісних астроцитарних гліомах, причому його вміст значно збагачений у гліобластомі (рис.8).

Рис. 8. А - результат гiбридизацiї кДНК-зонда HC gp-39 із тотальною РНК: 1 - головного мозку ембрiона (12-14 тижнiв) людини; 2, 3 - головного мозку дорослої людини (бiопсiї бiля астроцитарних глiом II ступеня злоякiсностi); 4 - головного мозку щура (вiк 4-5 мiсяцiв) лiнiї “Wistar”; 5, 6 - астроцитарної глiоми II ступеня злоякiсностi; 7-12 - астроцитарної глiоми III ступеня злоякiсностi (8-10 - РНК з рiзних зразкiв бiопсiї однiєї пухлини); 13 - глiобластоми; 14 - глiоми щура. Б - результат гiбридизацiї цих же зразкiв РНК iз кДНК-зондом b-актину. В - забарвлення бромистим eтидiєм зразкiв РНК в агарозному гелi пiсля електрофорезу до перенесення на мембрану. Кожна дорiжка мiстить 10 мкг РНК.

Оскільки SAGE-аналiз не виявив tags HC gp-39 у культурах клiтин глiобластоми, значно підвищений вміст мРНК HC gp-39 у цієї пухлини може бути наслідком того, що метапластичними в ній є клiтини хрящової або кiсткової тканини, в яких у нормi присутня мРНК гена (Hakala et al., 1993). З іншого боку, як показано раніше, експресія HC gp-39 зростає в макрофагах/нейтрофілах тканин, де вiдбуваються процеси запалення (Boot et al., 1999; Steenbakkers et al., 1999), що пов`язано iз впливом на її регуляцiю рiзних факторiв росту та цитокiнiв, які присутні при запалювальних процесах i для яких у 5`-районi гена були виявленi рiзноманiтнi регуляторнi елементи (Rehli et al., 1997). Оскiльки неоваскуляризацiя i некротизацiя мають виражений характер лише в глiобластомі, клiтини цих пухлин, що руйнуються, будуть створювати новi додатковi, у порівнянні з астроцитарними гліомами III ступеня злоякісності, запальнi стимули (прозапальнi цитокiни, ростовi фактори), що активують експресію HC gp-39 у макрофагах/нейтрофілах гліобластомних тканин.

Мабуть, усi перерахованi подiї можуть спостерігатися при значній активацiї гена HC gp-39 у глiобластомi. Очевидно, цей ген може бути одним iз молекулярних маркерiв при дослiдженнi пухлинної прогресiї астроцитарних глiом або визначеннi глiобластом серед iнших пухлин головного мозку людини.

ВИСНОВКИ

1.Отримано дані про участь у канцерогенезi злоякiсних астроцитарних глiом біля 1% генiв, що експресуються в клітинах головного мозку людини.

2. Визначено, що 4-кратне зниження кiлькостi РНК зразка астроцитарної пухлини є його нормалiзацiєю у порівнянні iз зразком РНК нормального головного мозку дорослої людини для адекватного нозерн-аналізу експресії дослiджуваних генiв.

3. З 203 ідентифікованих генів iз вiдомою функцiєю виокремлено групи, представники яких можуть брати участь у різних клітинних процесах неопластичної трансформації астроцитів.

4. Показано, що інгібований у нормі ген Sox-2 експресується переважно в гліомах, де білок, який він кодує, відіграє потенційну роль активатора ряду генiв, якi функціонують лише в проліферованих ембрiональних нервових клітинах.

5. Встановлено, що експресiя інгібованого у нормі хрящового глiкопротеїну HC gp-39 значно виражена лише в глiобластомах та набагато слабше в астроцитарних гліомах III ступеня злоякісноcті. HC gp-39 - можливий молекулярний маркер у діагностиці глiобластом серед пухлин головного мозку людини.

6. Ідентифіковані у роботі 470 генів, що змінюють нормальну експресію в астроцитарних гліомах, становлять унiкальну базу для вивчення молекулярних механiзмiв канцерогенезу, а також розвитку сучасних пiдходiв у дiагностиці та терапiї цих пухлин.

ПЕРЕЛIК НАУКОВИХ ПРАЦЬ, ОПУБЛIКОВАНИХ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦIЇ

1. Дмитренко В.В., Гарифулин О.М., Смикодуб А.Н., Кавсан В.М. Анализ экспрессии генома человека при помощи библиотек кДНК различных органов // Цитология и генетика. - 1995. - Т.29, N2. - С. 64-71.

2. Дмитренко В.В., Гарифулин О.М., Шостак Е.А., Смикодуб А.И., Кавсан В.М. Характеристика различных типов мРНК, экспрессирующихся в головном мозге человека // Цитология и генетика. - 1996. - Т.30, N5. - С. 41-47.

3. Dmitrenko V., Garifulin O., Kavsan V. Isolation and sequence analyses of the cDNA encoding subunit C of human CCAAT-binding transcription factor // Gene. - 1997. - V.197, N1-2. - P. 161-163.

4. Дмитренко В.В., Шостак К.О., Гарiфулiн О.М., Зозуля Ю.П., Кавсан В.М. Змiни експресiї генiв у клiтинах астроцитом головного мозку людини // Экспериментальная онкология. - 1998. - Т.20, N3-4. - P. 191-197.

5. Dmitrenko V., Garifulin O., Kavsan V. Tissue specific expression of human genes in fetal liver and brain // 4th European Congress of Cell Biology. – Prague (Czech Republic). - 1994. - P. 467.

6. Garifulin O., Dmitrenko V., Kavsan V. Study of expression of human genes in fetal liver and brain by hybridization analysis of high density cDNA grids // Meeting on Liver development, gene regulation and disease. - Arcachon (France). - 1995. - P. 14.

7. Kavsan V., Dmitrenko V., Garifulin O. Determination of changes of tissue-specific genes expression in human brain tumors // 9th European Cancer Conference. - Hamburg (Germany). - 1997. - P. 46.

8. Kavsan V.M., Dmitrenko V.V., Garifulin O.M., Shostak K., Zozulya Yu. Identification of differentially