УКРАЇНСЬКА АКАДЕМІЯ АГРАРНИХ НАУК

ІНСТИТУТ ТВАРИННИЦТВА

ГОНЧАРУК Оксана Петрівна

УДК 636.4:591.391.2

ВПЛИВ РІЗНИХ КУЛЬТУРАЛЬНИХ СЕРЕДОВИЩ НА МЕЙОТИЧНЕ ДОЗРІВАННЯ ООЦИТ-КУМУЛЮСНИХ КОМПЛЕКСІВ СВИНОМАТОК З НАСТУПНИМ ЇХ ЗАПЛІД-НЕННЯМ IN VITRO

03.00.20 - біотехнологія

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня
кандидата сільськогосподарських наук

ХАРКІВ– 2001

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана в лабораторії генофонду порід сільськогосподарських тварин Інституту розведення і генетики тварин Української академії аграрних наук

Науковий керівник: кандидат біологічних наук, старший науковий співробітник ГУЗЕВАТИЙ Олег Євгенович, Українська академія аграрних наук (м. Київ), завідувач Сектора агробіотехнології

Офіційні опоненти:

доктор сільськогосподарських наук, доцент ШЕРЕМЕТА Віктор Іванович, Національний аграрний університет (м. Київ), завідувач кафедри генетики тварин та біотехнології

кандидат біологічних наук, доцент ТКАЧЕНКО Сергій Васильович, Білоцерківський державний аграрний університет, вчений секретар

Провідна установа:

Державний науково-дослідний контрольний інститут ветеринарних препаратів та кормових добавок Міністерства аграрної політики України, м. Львів

Захист дисертації відбудеться "___" _______2001 року о ___ годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д65.356.02 при Інституті тваринництва УААН за адресою: 62404, Харківська обл., Харківський р-н., п/в Кулиничі

З дисертацією можна ознайомитися у бібліотеці Інституту тваринництва УААН за адресою: 62404, Харківська обл., Харківський р-н., п/в Кулиничі

Автореферат розісланий "____" ________ 2001 р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради,

кандидат біологічних наук Проніна В.В.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. В свинарстві, як і в інших галузях тваринниц-тва, в умовах інтенсифікації та індустріалізації галузі ведеться пошук нових ефективних методів створення, розведення і збереження цінних в генетичному відношенні тварин. Сучасний рівень розвитку біотехнології відкрив привабливі можливості розробки оригінальних шляхів отримання племінних особин. Визнаним шляхом прискорення селекційного процесу є метод трансплантації ембріонів (Квасницкий А.В. и др., 1988; Ruane J., 1988; Завертяев Б.П., 1989; Эрнст Л.К., Сергеев Н.И., 1989; Яблонский В.А., 1989; Seidel G., 1991; Бугров А.Д., 1995, 1997; Мартиненко Н.А. та ін., 1995, 1998; Осташко Ф.І., 1995; Шаловило С.Г., 1996; Шеремета В.І., 1997, 1999). Найскладнішою і ключовою ланкою при використанні біотехнологічних методів у свинарстві є отримання необхідної кількості повноцінних ембріонів на різних ста-діях їх розвитку. При традиційних способах відтворення з всього вели-чезного фонду яйцеклітин свиноматок (в яєчниках знаходяться десятки тисяч ооцитів) використовується лише мінімальна частина загального за-пасу, а переважна більшість клітин залишається в яєчниках, підлягає атрезії і у відтворенні участі не бере. Розробка і вирішення проблеми дозрівання ооцит-кумулюсних комплексів, запліднення in vitro яйцеклі-тин та раннього ембріонального розвитку дозволить не тільки отримувати необхідну кількість зародків свиней, а й в більш повній мірі викорис-товувати потенційний запас гамет самиць, що закладений в яєчниках. Безумовно, що вже на сучасному етапі технологія in vitro отримання за-родків інтенсивно використовується як дешеве й зручне джерело ембрі-онів для одержання клонованих і трансгенних сільськогосподарських тва-рин (Безуглий М.Д., 1995; Wilmut J. et al., 1997; Зубець М.В. та ін., 1997, 1999). Однак, отримання біологічно повноцінних ембріонів свино-маток методом запліднення in vitro дозрілих поза організмом яйцеклітин поки що, на жаль, є винятком, а ніж правилом, тому метод потребує вдосконалення (Yoshida M.et al., 1993; Nagai T. et al.,1994; Abeydeera L.R. et al., 1998, 1999).

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Робота виконувалася у лабораторії генофон-ду порід сільськогосподарських тварин Інституту розведення і генетики тварин УААН як складова на-укової теми: "Розробити методи культивування ооцитів сільськогосподар-ських тварин, умови для заморожування ооцитів корів і створити ооцито--та ембріобанк великої рогатої худоби" (номер державної реєстрації 0196 UO 16325).

Мета і завдання досліджень. Метою досліджень була розробка опти-мальних варіантів отримання біологічно повноцінних, придатних до зап-ліднення in vitro яйцеклітин свиноматок. Відповідно до мети визначали-ся наступні завдання:

1.

2. З'ясувати строки мейотичного дозрівання до метафази-2 ооцит-кумулюсних

комплексів свиноматок та динаміку зміни фаз мейозу при їх культивуванні.

3. Встановити ефективність використання різних поживних середовищ для
дозрівання поза організмом ооцит-кумулюсних комплексів свиноматок.

4. Вивчити ефект використання клітин гранульози у поживному середовищі на етапі дозрівання поза організмом гамет свиноматок.

5.

Об’єкт дослідження: яєчники, ооцит-кумулюсні комплекси і яйцеклітини свиноматок, ембріони свиней, що були отримані in vitro.

Предмет дослідження: ядерне і цитоплазматичне дозрівання ооцит-кумулюсних компплексів свиноматок у різних культуральних середовищах, розвиток зигот свиней після запліднення in vitro.

При виконанні роботи використовували біотехнологічні (дозрівання поза організмом ооцит-кумулюсних комплексів, запліднення in vitro яйцеклітин, культивування зигот і зародків), морфологічні (оцінка яєчників, ооцитів, яйцеклітин, сперматозоїдів та ембріонів за морфологічними показниками) і цитогенетичні (аналіз мейотичного дозрівання гамет самиць та дроблення зародків) методи досліджень.

Наукова новизна одержаних результатів. Проведений порівняльний аналіз використання різних поживних середовищ при дозріванні і заплід-ненні in vitro яйцеклітин свиноматок. Визначені терміни культивування, що необхідні ооцит-кумулюсним комплексам свиноматок для дозрівання по-за організмом до різних стадій мейозу. Встановлені особливості мей-отичного дозрівання гамет свиноматок у культуральному середовищі по-повненому клітинами гранульози. Виявлена залежність кількості і якості ооцитів свиноматок від способу отримання їх з яєчників забитих тварин. Встановлений позитивний вплив використання змішаної сперми від різних кнурів при заплідненні in vitro яйцеклітин свиноматок.

Практичне значення одержаних результатів. Дослідження виявили можливість дозрівання поза організмом в різних поживних середовищах ооцит-кумулюсних комплексів свиноматок з наступним їх заплідненням in vitro і отриманням ембріонів. Результати динаміки дозрівання гамет свиноматок дозволяють визначати стан хромосомного апарату клітин в любий проміжок часу культивування. Одержані ре-зультати мають цінність для поглиблення знання механізму і строків дозрівання поза організмом ооцит-кумулюсних комплексів свиноматок і можуть бути використані в роботі біотехнологічних центрів і лаборато-рій, що займаються питаннями культивування і запліднення in vitro ооц-итів ссавців.

Особистий внесок здобувача. Експериментальна робота, аналіз літератури, інтерпритація одержаних результатів, їх статистична обробка виконані автором осо-бисто. Вибір напрямку та опрацювання методики досліджень проведені разом з науковим керівником. Із спільних досліджень використано свою частину роботи.

Апробація результатів дисертації. Одержані в експериментах науко-ві матеріали доповідалися і обговорювалися на щорічних засіданнях лабораторії генофонду порід сільськогосподарських тварин і аспіра-нтських сесіях Інституту розведення і генетики тварин УААН (1995-1998 рр.), на конференціях: "Региональная конференция молодых ученых и спе-циалистов".- Оренбург, 1997; "Интенсификация производства продукции животноводства в Республике Беларусь".-Жодино, 1998; Международной конференции молодых ученых "Творческое развитие научного наследия ака-демика М.Ф.Иванова".- Аскания Нова, 1998; Третьей международной конференции “Актуальные проблемы биологии в животноводстве”.- Боровск, 2000.

Публікації. Матеріали дисертації опубліковані у 9 друкованих пра-цях.

Структура і обсяг дисертації. Дисертація викладена на 139 сторін-ках машинописного тексту, включає 16 таблиць та 17 рисунків. Дисерта-ція складається з вступу, огляду літератури, матеріалу і методики дос-ліджень, результатів досліджень і їх обговорення, висновків і практич-них пропозицій. Список літературних джерел включає 307 найменувань, в тому числі 161 іноземних авторів.

МАТЕРІАЛ ТА МЕТОДИКА ДОСЛІДЖЕНЬ

Досліди проводили на фолікулярних ооцитах, одержаних з яєчників свиноматок порід велика біла, українська степова біла і ландрас. За-гальна схема досліджень наведена на рис.1. Яєчники в лабораторію при-возили не пізніше 1,5-2,5 годин після забою тварин у термосі з фізіологічним розчином (0,9% NaCl) та антибіотиками (100 од/мл пеніциліну і 100 мкг/мл стрептоміцину) при температурі 32-380С. В лабораторії яєчники двічі промивали свіжоприготовленим фізіологічним розчином. Ооцити отримували з яєчників двома шляхами: пункцією антральних фолі-кулів або надрізаючи лезом видимі антральні фолікули. Вимивали середо-вищем Дюльбекко з 1 од/мл гепарину ("Biochemi") і антибіотиками, ви-ловлювали пастерівською пипеткою та оцінювали за морфологічними озна-ками під контролем мікроскопу МБС-9. Для культивування використовували ооцити з щільним або частково розпушеним кумулюсом, гомогенною та тон-козернистою ооплазмою.

Процедуру дозрівання проводили в чотирьохлункових планшетах ("Costor") протягом 45 годин у накритих вазеліновим маслом краплях по-живного середовища з 10% попередньо інактивованої (560С, 30 хв.) фе-тальної сироватки корів ("Sera Lab."), 50 мкг/мл гентаміцину ("Reanal") з додатками гормональних [2,5 мкг/мл фолікулостимулюючого гормону ("Schering corporation"), 1,0 мкг/мл естрадіолу ("Serva"), 2,5 МОд/мл лютеінизуючого гормону ("Serva")] та енергетичних [2,0 мМ піру-вату натрію ("Sigma") і 2,92 мМ лактату кальцію ("Sigma")] компонентів об'ємом 200 мкл на 20 клітин при температурі 38,50С та 5% CO2 у повіт-рі. В експериментах використовували 4 типи поживних середовищ: DMEM ("Sigma", кат. N D5648), M-199 ("Sigma", кат. N M2520), DME/Ham-F-12 ("Sigma", кат. N D8900), Ham-F-10 ("Sigma", кат. N N1387).

Гранульозу отримували з рідини фолікулів діаметром 2-5 мм. Фолі-кулярну рідину уміщували в центрифужні пробірки з культуральним сере-довищем, двічі центрифугували (3000 об/хв, 10 хв), кількість клітин гранульози визначали шляхом підрахування їх в гематоцитометрі, оцінку життєздатності перед постановкою на культивування проводили за допомо-гою вітального барвника – 0,4% трипанового

синього ("Serva").

Для запліднення in vitro яйцеклітин свиноматок використовували свіжоотриману сперму кнурів породи велика біла. Підготовку сперми до запліднення проводили за схемою, що запропонували Nagai T. et al. (1988).

Капацитацію сперматозоїдів здійснювали гепарином (100 од/мл) за методикою Parrish J.J. et al. (1988). Спільне інкубування яйцеклі-тин і сперматозоїдів проводили в термостаті при температурі 38,50С, 5% СО2 у повітрі, в краплях середовища Fert.-TALP. Після 10-18 годин спільного інкубування яйцеклітини і зиготи відмивали від прилиплої сперми і переносили в краплі середовища СDM для подальшого культиву-вання протягом 72 годин.

На різних етапах культивування проводили цитогенетичний аналіз ооцитів і ембріонів. Цитогенетичні препарати готували за методом Tarkowski A.K. (1966) або Ushijima M. et al. (1988), забарвлювали 10% розчином Гімза ("Fluka") і досліджували під мікроскопом.

Вірогідність результатів досліджень обраховували за допомогою використання критеріїв Ст’юдента та Пірсона – “Хі-квадрат” (Плохінський М.О., 1969; Лакін Г.Ф., 1990)

РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ ТА ЇХ АНАЛІЗ

Дослідження деяких морфологічних параметрів яєчників свиноматок, різних способів отримання з них ооцитів. Сучасні методи біотехнології, такі, як трансплантація ембріонів, їх клонування та кріоконсервація, визначення статі зародків, отримання трансгенних ембріонів, дають змогу значно прискорити процес відтворен-ня і зберегти цінний генетичний матеріал сільськогосподарських тварин, у тому числі й свиней. З'ясування певних закономірностей й розробка надійних методів прижиттєвої оцінки яєчників, фолікулів та ооцитів дозволить підвищити ефективність робіт з одержання ембріонів в умовах in vitro.

Проведеним аналізом п'яти морфологічних параметрів яєчників сви-номаток (табл.1) та кількісного і якісного складу ооцитів, отриманих з яєчників свиноматок різними методами (табл.2) встановлено, що немає статистично вірогідної різниці (Р>0,05) між лівими і правими яєчниками свиноматок за такими показниками: довжина (32,8±5,3 проти 32,1±5,2 мм), ширина (23,6±4,5 проти 22,8±4,5 мм), товщина (16,6±3,6 проти 15,4±3,8 мм), об'єм (5,9±2,5 проти 6,3±2,8 мл), маса (6,5±2,8 проти 6,5±2,9 г). Також виявлено, що немає статистично вірогідної різниці за загальною кількістю ооцитів та за кількістю морфологічно нормальних клітин придатних для культивування (68,4% і 45,4% від загальної кількості, отриманих з лівих яєчників відповідно пункцією та надрізом ан-тральних фолікулів проти 67,7% і 48,3% - з правих). Однак, незважаючи на те, що метод пункції антральних фолікулів дозволяє отримувати віро-гідно більше (Р<0,01) в процентному відношенні морфологічно якісних, придатних для культивування ооцит-кумулюсних комплексів (67,7-68,4%) порівняно з іншим методом отримання (45,4-48,3%), все ж таки метод

Таблиця 1

Морфологічні параметри яєчників свиноматок

Яєчник | Кількість яєчників | Параметри яєчників:

довжина, мм | ширина, мм | товщина, мм | об'єм, мл | маса, г

Лівий | 62 | M±m

lim | 32,8

±5,3

22–49 | 23,6

±4,5

14–38,5 | 16,6

±3,6

9–35 | 5,9

±2,5

2–17 | 6,5

±2,8

1,7–20

Правий | 62 | M±m

lim32,1

±5,2

19–54 | 22,8

±4,5

13–39 | 15,4

±3,8

8–35 | 6,3

±2,8

2–18 | 6,5

±2.9

1,7–24

Таблиця 2

Кількісний і якісний склад ооцитів, отриманих з яєчників свиноматок

Яєчник | Кількість яєчників | Метод отримання ооцитів:

пункція антральних фолікулів | надріз антральних фолікулів

всього | придатних для культивування | всього | придатних для культивування

Лівий | 20 | 17,7±2,5 а | 12,1±2,0 с | 73,1±9,3 b | 33,2±4,1 d

Правий | 20 | 19,8±3,0 а | 13,4±2,4 с | 76,4±9,6 b | 36,9±5,3 d

a:b; c:d – P < 0,001

от-римання ооцитів свиноматок шляхом надрізу антральних фолікулів більш перспективний на наш погляд, тому що дозволяє отримувати вірогідно більшу (Р<0,001) загальну кількість ооцитів з яєчника (73,1-76,4 проти 17,7-19,8) та кількість ооцит-кумулюсних комплексів придатних для культивування (33,2-36,9 проти 12,1-13,4).

Використання різних поживних середовищ при культивуванні ооцит-кумулюсних комплексів свиноматок. В значній мірі життєздатність ооцит-кумулюсних комплексів свино-маток при їх культивуванні in vitro залежить від ефективного підбору культурального середовища. Різноманітні штучні поживні середовища, які вчені мають в своєму розпорядженні й використовують в своїх дослідах, не змодельовані відповідно з in vivo умовами розвитку яйцеклітин, тому в клітинах відбуваються значні зміни в процесі їх дозрівання in vitro. Сучасні методи культивування ооцит-кумулюсних комплексів сільськогос-подарських тварин, в тому числі й свиноматок, передбачають використан-ня дуже широкого спектру поживних середовищ: Menezo, SOF, M-199, RPMI, BWW та інших (Funahashi H., Day B., 1993; Nagai T., Takahashi M., 1996).

В своїх експериментах з культивування ооцит-кумулюсних комплексів свиноматок використовували 4-и типи поживних середовищ: DMEM, M-199, Ham-F-10, DME/Ham-F-12. Аналіз результатів досліджень, як свідчать да-ні таблиці 3,

Таблиця 3

Дозрівання ооцит-кумулюсних комплексів свиноматок

у різних поживних середовищах

Варіан-ти досліду | Пожив-не середо-вище | Термін культи-вування, год. | Кількість прокульти-вованих клітин | Кількість клітин на: | Кількість клітин з хромосомними порушеннями

диплотені+ діакінезі+ метафазі-1 | анафазі+ телофазі | метафазі-2 | всього | з них на метафазі-2

n | % | n | % | n | % | n | % | n | %

1 |

DMEM |

45 |

64 |

13 |

20,3 |

4 |

6,2 |

28 | a

43,8 |

19 | f

29,7 |

4 |

21,1

2 |

M-199 |

45 |

56 |

5 |

8,9 |

6 |

10,7 |

37 | bc

66,1 |

8 | de

14,3 |

4 |

50,0

3 | DME/ Ham-

F-12 |

45 |

73 |

10 |

13,7 |

5 |

6,8 |

41 | ab

56,2 |

17 | f

23,3 |

6 |

35,3

4 | Ham-

F-10 |

45 |

58 |

9 |

15,5 |

7 |

12,1 |

35 | b

60,3 |

7 | d

12,1 |

3 |

42,9

a:b, e:f– P< 0,05; a:c, d:f– P<0,001

виявив різний рівень дозрівання до метафази-2 мейозу ооц-ит-кумулюсних комплексів свиноматок у поживних середовищах М-199, Ham-F-10, DME/Ham-F-12 і DMEM (відповідно 66,1; 60,3; 56,2 і 43,8%). Крім того, при культивуванні гамет свиноматок у середовищах М-199 і Ham-F-10 спостерігали меншу кількість клітин з дегенерацією хромосомного матеріалу порівняно з середовищами DME/Ham-F-12 та DMEM (відповідно 14,3 і 12,1% проти 23,3 і 29,7%).

Динаміка дозрівання поза організмом ооцит-кумулюсних комплексів свиноматок. Одним з важливих моментів при проведенні експериментів з заплід-нення in vitro яйцеклітин свиноматок є точне знання строків їх дозрі-вання до метафази-2 мейозу. Перезрівання клітин, рівно як і недозрі-вання, значно зменшує їх здатність до запліднення. На тривалість мей-отичного дозрівання може впливати наявність у культуральному середови-щі гормональних і енергетичних компонентів, сироватки та різних біоло-гічно активних речовин і сполучень, їх концентрація та строк контакту з клітинами, що в кінцевому рахунку прискорює або заповільнює процес дозрівання. В зв’язку з цим виникає необхідність встановлення строків дозрівання гамет свиноматок, динаміки цього процесу у кожному конкретному випадку (експериментальному варіанті) на фоні контролю. В своїх дослідженнях ми вивчали динаміку зміни стадій мейозу ооцит-куму-люсними комплексами свиноматок через кожні 3 години при їх культиву-ванні у середовищі М-199 протягом 51 години (табл.4).

В ооцитах, що були отримані з яєчників свиноматок та оцінені за морфологічними ознаками (0 годин культивування), переважна більшість ядер (83,3%) знаходяться на диплотені мейозу. В міру їх культивування через 30 годин всі клітини поновлювали мейотичне дозрівання, яке, як відомо, у ссавців блокується на стадії диплотени. За результатами на-ших даних можливо визначати термін культивування, що необхідний гаме-там свиноматок для дозрівання в цих умовах до тієї чи іншої стадії мейозу. Так, через 30 годин культивування 68,2% клітин знаходяться на стадіях діакінез і метафаза-1. При подальшому збільшенні терміну куль-тивування гамет свиноматок кількість клітин на стадіях діакінез і ме-тафаза-1 починає зменшуватись за рахунок переходу ядер клітин в нас-тупні стадії мейозу -–анафазу і телофазу. Через 42-45 годин культиву-вання більшість клітин (відповідно 58,3 і 62,1%) завершує своє дозрі-вання і знаходяться на метафазі-2 мейозу. Подальше збільшення терміну культивування до 51 години не призводить до збільшення кількості доз-рілих до метафази-2 яйцеклітин, але значно збільшується на заключних етапах дозрівання кількість клітин з порушеннями хромосомного матері-алу (27,3 і 35,3 проти 20,7% відповідно після 48, 51 і 45 годин куль-тивування), мабуть за рахунок перезрівання яйцеклітин.

Таким чином, нами встановлено, що для проведення дослідів з зап-ліднення in vitro яйцеклітин свиноматок необхідно попереднє культиву-вання ооцит-кумулюсних комплексів протягом 42-45 годин, коли переважна більшість клітин знаходиться на стадіях телофази і метафази-2 мейозу, так як в подальшому спостерігається “старіння” (перезрівання) яйцеклі-тин і їх загибель.

Таблиця 4

Динаміка дозрівання ооцит-кумулюсних комплексів свиноматок

Групи досліду | Термін культиву-вання, год. | Кількість прокуль-тивова-них клітин | Кількість клітин на: | Кількість клітин з хромосом- ними по- рушеннями

диплотені | діакінезі+
метафазі-1 | анафазі+ телофазі | метафазі-2

n | % | n | % | n | % | n | % | n | %

1 | 0 | 30 | 25 | 83,3 | 3 | 10,0–––– | 2 | 6,7

2 | 18 | 18 | 6 | 33,3 | 8 | 44,4 | 1 | 5,6–– | 3 | 16,7

3 | 21 | 14 | 4 | 28,7 | 7 | 50,0 | 1 | 7,1–– | 2 | 14,2

4 | 24 | 19 | 4 | 21,1 | 10 | 52,6–– | 2 | 10,5 | 3 | 15,8

5 | 27 | 17 | 1 | 5,9 | 11 | 64,7–– | 2 | 11,8 | 3 | 17,6

6 | 30 | 22–– | 15 | 68,2–– | 3 | 13,6 | 4 | 18,2

7 | 33 | 16–– | 6 | 37,4 | 3 | 18,8 | 4 | 25,0 | 3 | 18.8

8 | 36 | 21–– | 4 | 19,1 | 4 | 19,1 | 9 | 42,8 | 4 | 19,0

9 | 39 | 19–– | 3 | 15,8 | 2 | 10,6 | 10 | 52,6 | 4 | 21,0

10 | 42 | 24–– | 3 | 12,5 | 2 | 8,4 | 14 | 58,3 | 5 | 20,8 а

11 | 45 | 29–– | 2 | 6,9 | 3 | 10,3 | 18 | 62,1 | 6 | 20,7 а

12 | 48 | 22–– | 2 | 9,1 | 1 | 4,5 | 13 | 59,1 | 6 | 27,3 ab

13 | 51 | 17–– | 1 | 5,9–– | 10 | 58,8 | 6 | 35,3 b

a : b – P < 0,05

Спільне культивування ооцит-кумулюсних комплексів свиноматок і клітин гранульози. В багатьох лабораторіях світу клітини гранульози використовують для подолання блоку дроблення при культивуванні передімплантаційних ембріонів сільськогосподарських тварин. Встановлено, що додавання до культурального середовища гранульозних клітин позитивно впливає на мейотичне дозрівання ооцит-кумулюсних комплексів корів, однак спільне культивування ооцитів корів з клітинами гранульози часто супроводжу-ється збільшенням кількості гамет з дегенерованими хромосомами. Причи-ною цього явища може бути порушення гормонального балансу, тому що ме-тод культивування не дає можливості враховувати кількість гранульозних клітин, що оточують ооцит, які як і ті, що додають до культурального середовища є продуцентами стероїдних гормонів (Кузьмина Т.И., 1993; Позднякова Т.Э., 1994).

Дані наших дослідів з вивчення впливу додавання у культуральне середо-вище М-199 клітин гранульози на мейотичне дозрівання ооцит-кумулюсних ком-плексів свиноматок наведені в таблиці 5.

Нами виявлено незначне заповільнення мейотичного дозрівання клі-тин до метафази-2 після 44-х годинного культивування (39/74, 52,7% і 37/56, 66,1% відповідно в дослідній і контрольній групах). Збільшення терміну культивування до 48-и годин призводить до збільшення кількості дозрілих яйцеклітин (25/37, 67,6%) в дослідній групі і зменшення кількості клітин з хромосомними порушеннями (4/37, 10,8% проти 11/56, 19,6% в контрольній групі).

Таблиця 5

Вплив клітин гранульози на мейотичне дозрівання ооцит-кумулюсних комплексів свиноматок

Ва-ріан-ти дос-ліду | Наявність або відсут-ність клітин гранульо-зи | Термін культи-вування, год. | Кількість прокуль-тивова-них клітин | Кількість клітин на: | Кількість клітин з хромосом-ними порушен-нями

диплотені | діакінезі+

метафазі-1 | анафазі+

телофазі | метафазі-2

n | % | n | % | n | % | n | % | n | %

A |

+ |

44 |

74 |

2 |

2,7 |

13 |

17,6 |

8 |

10,8 |

39 | a

52,7 |

12 | d

16,2

В |

+ |

48 |

37–– |

3 |

8,1 |

5 |

13,5 |

25 | b

67,6 |

4 | c

10,8

К– |

44 |

56–– |

7 |

12,5 |

1 |

1,8 |

37 | b

66,1 |

11 | d

19,6

a:b, c:d- P<0,001

Таким чином, результати експериментів свідчать, що культивування ооцит-кумулюсних комплексів в середовищі М-199, поповненому клітинами гра-нульози, забезпечує більш оптимальні умови для дозрівання гамет свино-маток.

В наступних наших дослідах використовували різні концентрації клітин гранульози в культуральному середовищі для вивчення характеру їх впливу на мейотичне дозрівання ооцит-кумулюсних комплексів свинома-ток. Дані наведені в таблиці 6.

При культивуванні ооцит-кумулюсних комплексів свиноматок в сере-довищі М-199 поповненому клітинами гранульози в концентрації 1х106 клітин/мл і 3х106 клітин/мл (групи А і Б) протягом 48 годин стадії ме-тафази-2 мейозу досягали відповідно 25/37, 67,6% і 47/62, 75,8% клі-тин. Кількість клітин з дегенерацією хромосомного матеріалу в цих ек-спериментальних групах становила відповідно 4/37, 10,8% і 7/62, 11,3%.

Збільшення концентрації гранульозних клітин у середови-щі М-199 до 6х106 клітин/мл і 9х106 клітин/мл (групи В і Г) призвело до того, що завершили мейотичне дозрівання відповідно лише 36/69, 52,2% і 27/56, 48,2% клітин, в той час як значно збільшилась кількість клітин (відповідно 19/69, 27,5% і 18/56, 32,1%) з хромосомними порушеннями порівняно з групами А і Б.

Таблиця 6

Використання різних концентрацій клітин гранульози у середовищі М-199 для дозрівання ооцит-кумулюсних комплексів свиноматок

Варіанти досліду | Концент-рація клітин грану-льози, клітин/мл | Термін культиву-вання, год. | Кількість прокуль-тивованих клітин | Кількість клітин на: | Кількість клітин з хромосом-ними порушен-нями

диплотені+ діакінезі+ метафазі-1 | анафазі+

телофазі | метафазі-2

n | % | n | % | n | % | n | %

А |

1x106 |

48 |

37 |

3 |

8,1 |

5 |

13,5 |

25 | a

67,6 |

4 | c

10,8

Б |

3x106 |

48 |

62 |

5 |

8,1 |

3 |

4,8 |

47 | a

75,8 |

7 | c

11,3

В |

6x106 |

48 |

69 |

10 |

14,5 |

4 |

5,8 |

36 | b

52,2 |

19 | d

27,5

Г |

9x106 |

48 |

56 |

9 |

16,1 |

2 |

3,6 |

27 | b

48,2 |

18 | d

32,1

a:b, c:d- P< 0,001

Таким чином, нами встановлений позитивний ефект використання клі-тин гранульози у поживному середовищі на етапі дозрівання поза орга-нізмом ооцит-кумулюсних комплексів свиноматок. Найкращі результати за показниками кількості клітин з неушкодженим хромосомним апаратом і дозрілих до метафази-2 мейозу отримані при культивуванні ооцит-куму-люсних комплексів свиноматок у середовищі 199 з додаванням клітин гра-нульози в концентрації 1–3х106 клітин/мл.

Запліднення in vitro яйцеклітин свиноматок, що дозріли поза орга-нізмом в різних поживних середовищах. Дослідження з дозрівання поза організмом ооцит-кумулюсних ком-плексів свиноматок в середовищах DMEM, Ham-F-10, M-199, DME/Ham-F-12 виявили різну ефективність використання цих середовищ. Але найбільш об'єктивним критерієм повноцінного дозрівання ооцитів поза організ-мом, безумовно, є їх запліднення in vitro. Результати експериментів на-ведені в таблиці 7.

Таблиця 7

Запліднення in vitro яйцеклітин свиноматок, що дозріли у різних культуральних середовищах

Варіан-ти досліду | Поживне середови-ще | Термін культиву-вання, год. | Кількість прокуль-тивова-них клітин | Кількість ембріонів:

2-х кліт. | 3-х кліт. | 4-х кліт. | 5-и кліт. | 6-и кліт. | всього

n | % | n | % | n | % | n | % | n | % | n | %

1 |

DMEM |

72 |

143 |

2 |

1,4 |

1 |

0,7–––––– |

3 | a

2,1

2 |

M–199 |

72 |

108 |

10 |

9,3 |

4 |

3,7 |

7 |

6,5 |

1 |

0,9 |

2 |

1,8 |

24 | c

22,2

3 |

DME/

Ham–F12 |

72 |

134 |

13 |

9,7 |

2 |

1,5 |

2 |

1,5–––– |

17 | b

12,7

4 |

Ham–

F–10 |

72 |

122 |

12 |

9,8 |

3 |

2,5 |

5 |

4,1–– |

1 |

0,8 |

21 | bc

17,2

a:b, a:c, b:c- P< 0,001

Аналіз результатів досліджень виявив різний рівень дроблення га-мет свиноматок після їх запліднення in vitro і культивування протягом 72 годин (в 1, 2, 3, 4 варіантах досліду відповідно 2,1; 22,2; 12,7; 17,2%). Звертає на себе увагу й той факт, що в варіантах досліду 2 і 4 не тільки вищий показник дроблення клітин порівняно з варіантами 1 та 3, але й вищий показник подальшого дроблення ембріонів (від 2-х клі-тинних), відповідно 58,3 і 42,9% проти 33,3 та 35,3%.

Запліднення in vitro яйцеклітин свиноматок, що дозріли поза ор-ганізмом змішаною спермою від різних кнурів. Проблема підвищення запліднення in vitro яйцеклітин, що дозріли поза організмом за рахунок використання змішаних еякулятів сперми в біотехнології відтворення сільськогосподарських тварин не нова. Інтерес до цієї проблеми пов'язаний не тільки завдяки підвищенню ефективності запліднення in vitro, а й в першу чергу з питанням презиготичного відбору на рівні гамет. Ряд авторів (Кузьмина Т.И. и др., 1994.; Бабушкина И.А., 1995) спостерігали підвищення ефективності запліднення in vitro яйцеклітин корів.

В наших дослідах з запліднення in vitro яйцеклітин свиноматок, що дозріли поза організмом використовували свіжі еякуляти трьох кнурів (Кроссі 123/7093, Теккі 13/107, Руссо 299) та змішану сперму, виготовлену перед капацитацією злиттям рівних об'ємів. Дані експериментів наведені в таблиці 8.

Таблиця 8

Використання змішаної сперми від різних кнурів при заплідненні in vitro яйцеклітин свиноматок

Варіанти досліду | Кличка кнура | Кількість клітин, що підлягали заплідненню | Термін культивування після запліднення, год. | Кількість ембріонів

2-х кліт. | 3-6 кліт. | всього

n | % | n | % | n | %

А |

Кроссі |

52 |

72 |

4 |

7,7 |

5 |

9,6 |

9 | b

17,3

В |

Теккі |

57 |

72 |

5 |

8,8 |

0 |

0 |

5 | a

8,8

С |

Руссо |

54 |

72 |

4 |

7,4 |

4 |

7,4 |

8 | ab

14,8

А+В |

Кроссі+Теккі |

38 |

72 |

3 |

7,9 |

5 |

13,2 |

8 | bc

21,1

А+С |

Кроссі+ Руссо |

47 |

72 |

4 |

8,5 |

7 |

14,9 |

11 | bc

23,4

В+С |

Теккі+Руссо |

41 |

72 |

5 |

12,2 |

3 |

7,3 |

8 | b

19,5

А+В+С | Кроссі+

Теккі+Руссо |

32 |

72 |

3 |

9,4 |

7 |

21,9 |

10 | c

31,3

a:b, b:c- P< 0,01; a:c- P< 0,001

Аналіз результатів досліджень свідчить, що при використанні змі-шаної сперми від різних кнурів (групи А+В+С; А+В; А+С; В+С) дроблення яйцеклітин після запліднення in vitro було вірогідно вищим (відповід-но 10/32, 31,3%; 8/38, 21,1%; 11/47, 23,4%; 8/41, 19,5%) порівняно з індивідуальним (групи А, В, С) використанням сперми цих кнурів (відпо-відно 9/52, 17,3%; 5/57, 8,8%; 8/54, 14,8%). Привертає увагу й те, що подальший розвиток ембріонів (більше 2-х бластомерів) також був вищим (7,3-21,9%) після 72-х годинного культивування в групах А+В+С; А+В; А+С; В+С ніж у групах А, В, С (0-9,6%).

ВИСНОВКИ

1. Використання поживних середовищ DMEM, Ham-F-10, M-199, DME/Ham-F-12 як базових для приготування культуральних середовищ дозволяє в умовах in vitro у гамет свиноматок відновити і завершити їх мейотичне дозрівання та отримати після запліднення in vitro і подальшого культивування зародки свиней.

2. Культуральні середовища, виготовлені на основі поживних середовищ DMEM, Ham-F-10, M-199, DME/Ham-F-12, зумовлюють різну ефективність дозрівання поза організмом ооцит-кумулюсних комплексів свиноматок. Рівень дозрівання гамет свиноматок до метафази-2 мейозу в середовищах М-199 (66,1%) і Ham-F-10 (60,3%) був вищим (P<0,05), а кількість клітин з хромосомними порушеннями (відповідно 14,3 і 12,1%) нижчою (P<0,001), ніж у середовищах DME/Ham-F-12 (56,2 і 23,3%) і DMEM (43,8 і 29,7%).

3. Культивування гамет свиноматок поза організмом в середовищі М-199, поповненому клітинами гранульози в концентрації 1-3х106 клітин/мл, забезпечує більш оптимальні умови для їх дозрівання.

4. Стадії метафази-2 мейозу через 42-45 годин культивування дося-гають 58,3-62,1% ооцит-кумулюсних комплексів свиноматок. Збільшення терміну культивування не призводить до збільшення кількості дозрілих клітин.

5. Метод надрізу видимих антральних фолікулів яєчників свиноматок порівняно з методом аспірації дозволяє отримувати з яєчника більшу (P<0,001) за-гальну кількість ооцитів (73,1-76,4 проти 17,7-19,8) та кількість ооцит-кумулюсних комплексів придатних для культивування (33,2-36,9 проти 12,1-13,4).

6. Рівень дроблення зародків (22,2%) і їх подальшого розвитку (58,3%) після запліднення in vitro яйцеклітин свиноматок вищий (P<0,001) при ви-користанні середовища М-199 для дозрівання гамет самиць.

7. Застосування при заплідненні in vitro змішаної сперми від різ-них кнурів підвищує (P<0,01) дроблення клітин на 3,8-22,5%.

ПРАКТИЧНІ ПРОПОЗИЦІЇ

1. Для вдосконалення методу дозрівання поза організмом ооцит-ку-мулюсних комплексів свиноматок рекомендуємо використовувати поживні середовища M-199 і Ham-F-10 як базові культуральні середовища та дода-вати до них клітини гранульози в концентрації 1-3х106 клітин/мл.

2. Для підвищення запліднення яйцеклітин свиноматок рекомендуємо застосовувати змішану сперму від різних кнурів на товарних фермах та в наукових установах, що займаються питаннями біотехнології відтворення сільськогосподарських тварин.

3. Результати досліджень можуть бути використані при викладанні лекцій з біотехнології, генетики, морфології, біології розвитку та відтворення сільськогосподарських тварин у ВУЗах країни.

СПИСОК ОПУБЛІКОВАНИХ ПРАЦЬ
ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ.

1. Гончарук О.П., Собко Ю.М., Гузеватий О.Є. Деякі морфологічні особливості яєчників і ооцитів свиноматок// Вісник Білоцерківського державного аграрного університету: Зб. наук. праць.- 1997.- Вип.2.–-Ч.1.- С.146-149.

2. Гончарук О.П., Гузеватий О.Є. Використання різних поживних середовищ при культивуванні ооцит-кумулюсних комплексів свиноматок// Вісник Білоцерківського державного аграрного університету: Зб.наук. праць.- 1997.- Вип.3.- Ч.1.- С.228-231.

3. Гузеватий О., Гончарук О., Собко Ю. Динаміка дозрівання in vitro ооцит-кумулюсних комплексів свиноматок// Тваринництво України.-.- N 1.- С.12-13.

4. Гузеватий О.Є., Гончарук О.П. Запліднення in vitro яйцеклітин свиноматок, що дозріли в різних культуральних середовищах// Вісник Білоцерківського державного аграрного університету: Зб. наук. праць.-1999.- Вип.8.- Ч.2.- С.53-57.

5. Гузеватий О.Є., Гончарук О.П. Запліднення in vitro яйцеклітин свиноматок змішаною спермою від різних кнурів //Вісник Білоцерківського державного аграрного університету: Зб. наук. праць.- 2000.- Вип.14.- С.28-31.

6. Гончарук О.П. Временные параметры мейотического созревания in vitro ооцит-кумулюсных комплексов свиноматок// Тезисы региональной конференции молодых ученых и специалистов.- Оренбург.- 1997.- Ч.2.–-С.85-86.

7. Гончарук О.П., Гузеватый О.Е. Некоторые особенности культивирования in vitro ооцит-кумулюсных комплексов свиноматок// Интенсификация производства продукции животноводства в Республике Беларусь.- Жодино, 1998.- С.94.

8. Гончарук О.П. Використання клітин гранульози при культивуванні ооцит-кумулюсних комплексів свиноматок //Молоді вчені – тваринництву.- К.: Аграрна наука, 2000.- С.95-97.

9. Гузеватый О.Е., Собко Ю.М., Гончарук О.П. Некоторые особености созревания и оплодотворения in vitro ооцит-кумулюсных комплексов свиноматок //Актуальные проблемы биологии в животноводстве.- Боровск, 2000.- С.393-394.

Гончарук О.П. Вплив різних культуральних середовищ на мейотичне дозрівання ооцит-кумулюсних комплексів свиноматок з наступним їх заплідненням in vitro.- Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата сільськогосподарських наук за спеціальністю 03.00.20 - біотехнологія.- Інститут тваринництва УААН, Харків, 2001.

Викладений експериментальний матеріал з використання різних по-живних середовищ (DMEM, Ham-F-10, M-199, DME/Ham-F-12) для дозрівання і наступного запліднення in vitro яйцеклітин свиноматок. Запропоновані підходи підвищення повноцінності мейотичного дозрівання ооцит-кумулюс-них комплексів свиноматок з використанням клітин гранульози. В процесі мейотичного дозрівання встановлені інтервали часу проходження ооцит-ку-мулюсними комплексами свиноматок різних стадій мейозу. Виявлена залежність кількості і якості ооцитів свиноматок від способу отримання їх з яєчників забитих тварин.

Ключові слова: біотехнологія, яєчники, ооцит-кумулюсні комплекси, ембріони, дозрівання і запліднення in vitro.

Гончарук О.П. Влияние различных культуральных сред на мейотичес-кое созревание ооцит-кумулюсных комплексов свиноматок с последующим их оплодотворением in vitro.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата сельскохозяй-ственных наук по специальности 03.00.20 - биотехнология.- Институт животноводства УААН, Харьков, 2001.

Диссертация посвящена изучению вопросов получения, оценки, культивирования и оплодотворения in vitro ооцит-кумулюсных комплексов свино-маток, использования различных базовых питательных сред и добавок на этапе созревания гамет до метафазы -2 мейоза.

Данная работа основана на том факте, что современные биотехноло-гии воспроизведения сельскохозяйственных животных предполагают интен-сивное использование ооцитов на различных стадиях их мейотического созревания, зигот, эмбрионов различных стадий их развития. Кроме того, разработка методов созревания и оплодотворения in vitro - это прямой путь к расширению возможности использования популяций гамет самок, по-давляющее большинство из которых на протяжении жизни животных подвер-гается атрезии.

В значительной мере успех созревания вне организма ооцит-кумулюс-ных комплексов сельскохозяйственных животных, в том числе и свинома-ток, зависит от правильности выбора базовой питательной среды. Разные исследователи используют для культивирования гамет самок разнообраз-ные среды, такие как Menezo, SOF, Parker, BWW, RPMI, BMOC и другие. Нашими ис-следованиями изучена эффективность применения питательных сред DMEM, Ham-F-10, M-199, DME/Ham-F-12 для созревания ооцит-кумулюсных комплек-сов свиноматок до метафазы-2 мейоза и последующего их оплодотворения in vitro.

Одним из важных моментов при проведении исследований по оплодот-ворению in vitro яйцеклеток свиноматок есть точное знание сроков их созревания вне организма до метафазы-2 мейоза. Перезревание клеток, точно как и недозревание, существенно уменьшает их способность к опло-дотворению. Выявлено, что для проведения исследований по оплодотворе-нию in vitro яйцеклеток свиноматок необходимо их предварительное куль-тивирование в стандартных условиях на протяжении 42-45 часов, когда подавляющее их большинство достигает стадии метафазы-2. Дальнейшее продление сроков культивирования приводит к увеличению количества кле-ток с дегенерацией хромосомного материала.

Модификация культуральных сред путем добавления в них различных биологических веществ и соединений позволяет значительно увеличивать получение яйцеклеток пригодных для оплодотворения. Введение в культу-ральную среду клеток гранулезы позволило добиться снижения нарушений хромосомного аппарата клеток при их созревании вне организма. Определе-на оптимальная концентрация (1-3х106 клеток/мл) применения гранулезных кле-ток в культуральной среде.

Установлена зависимость количества и качества ооцитов свиноматок от способа получения их из яичников убитых животных.

Наиболее объек-тивным критерием полноценности созревания вне организма ооцит-кумулюс-ных комплексов является их оплодотворение. Выявлена различная частота дробления яйцеклеток свиноматок после оплодотворения in vitro, кото-рая вызвана использованием различных культуральных сред на этапе соз-ревания гамет до метафазы -2 мейоза. Использование при оплодотворении in vitro смеси спермы от разных хряков позволило увеличить дробление клеток на 3,8-22,5%.

Ключевые слова: биотехнология, яичники, ооцит-кумулюсные комплек-сы,

эмбрионы, созревание и оплодотворение in vitro.

Goncharuk O.P. Use of various culture medium for maturation and fertilization of pig oocyte-cumulus complexes.- Manuscript.

Dissertation on completion of the scientific degree of the candidate of agricultural sciences on the speciality 03.00.20 - biotechnology.- Institute of Animal Science, UAAS, Kharkiv, 2001.

Experimental material on use of various culture medium (DMEM, Ham-F-10,
M-199, DME/Ham-F-12) for maturation and subsequent fertilization in vitro of porcine oocyte-cumulus complexes has been accounted. It had been suggested on point of view increasing for maturation quality of porcine oocyte-cumulus complexes with using granulosa cells. Times intervals of cultivation to different meiotic stage has been fixed. It had been revealed on depending porcine oocytes quantity and quality from method of obtain slaughtered pigs ovaries.

Key words: biotechnology, ovaries, oocyte-cumulus complexes, embryos, maturation and fertilization in vitro.

Підписано до друку 12.11.2001 р. Формат 60х90/16.

Ум.друк.арк. 0,9. Обл.-вид.арк. 0,9

Тираж 100. Зам. 83.

Видавництво "Науковий світ"

Свідоцтво ДК № 249 від 16.11.2000 р.

03150, м.Київ - 150, вул.Горького, 51, оф. 1211.

227-01-89, 419-38-44