НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ

ІНСТИТУТ ЕКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЇ ПАТОЛОГІЇ,

ОНКОЛОГІЇ І РАДІОБІОЛОГІЇ ІМ. Р. Є. КАВЕЦЬКОГО

ХРАНОВСЬКА НАТАЛЯ МИКОЛАЇВНА

УДК: 616-089.843.001.6:616-006

ВПЛИВ ТРАНСПЛАНТАЦІЇ КЛІТИН АЛОГЕННОГО

КІСТКОВОГО МОЗКУ ТА КЛІТИН ЕМБРІОНАЛЬНОЇ

ПЕЧІНКИ НА ПРОТИПУХЛИННУ РЕЗИСТЕНТНІСТЬ

ОРГАНІЗМУ

14.01.07 - онкологія

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

Київ - 2001

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана в Інституті онкології АМН України

Науковий керівник - доктор медичних наук, професор

Гріневич Юрій Якимович

завідувач лабораторії клінічної імунології

Інституту онкології АМН України

Офіційні опоненти: - доктор біологічних наук

Воронцова Ада Леонідівна

провідний науковий співробітник відділу

експериментальних клітинних систем

Інституту експериментальної патології,онкології та

радіобіології ім. Р. Є. Кавецького НАН України

- кандидат біологічних наук

Маєвська Людмила Павлівна

старший науковий співробітник відділу інформації,

впровадження та координації НДР Інституту

онкології АМН України

Провідна установа - Інститут нейрохірургії АМН України, відділ нейроімунології, м. Київ.

Захист відбудеться “16”травня 2001 року о 13 годині 30 хвилин на засіданні спеціалізованої вченої ради Д.26.155.01 в Інституті експериментальної патології, онкології і радіобіології ім. Р. Є. Кавецького НАН України ( 03022, м. Київ, вул. Васильківська, 45).

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці ІЕПОР ім. Р. Є. Кавецького НАН України

Автореферат розісланий “ 14” квітня 2001р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради,

доктор медичних наук Н. В. Бородай

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність проблеми. Підходи до терапії онкологічних захворювань передбачають широке застосування цитостатиків і опромінення, що часто супроводжується розвитком у хворих загальнотоксичного синдрому, зокрема, цитопенії, порушень імуногенезу тощо. З метою усунення або послаблення цих негативних наслідків основного лікування використовуються численні засоби супроводу ад”ювантної та неоад”ювантної терапії зокрема - трансплантація аутологічних або алогенних стовбурових кровотворних клітин (СКК) (Долгополов И. С., 1998; Абдулкадыров К. М., 2000; Dillman R. O., 1995; Leyvraz S., 1995).

Експериментальними та клінічними дослідженнями доведена доцільність застосування трансплантації клітин алогенного кісткового мозку (КАКМ) не тільки як гемопоезстимулюючого засобу, а і як методу біотерапії. Показано, що за цих обставин у реципієнтів розвивається стійка реакція “трансплантат проти пухлини”, що супроводжується суттєвим збільшенням тривалості життя хворих (Барретт А. Ж., 1997; Glass B., 1996; Sykes M., 1999).

Однак важливим фактором все ще незадовільних результатів лікування у випадку алогенних трансплантацій клітин кісткового мозку є ціла низка ускладнень, пов’язаних з подоланням перепони гістосумісності між донором клітин та реципієнтом, зокрема, профілактикою реакції “трансплантат проти господаря” (РТПГ) (Окулов В. Б., 1992; Le Maistre C. F., 1990 ). Іншим джерелом СКК може бути ембріональна печінка, оскільки на ранньому етапі розвитку ембріона в ній міститься багато СКК з високим проліферативним потенціалом, а поодинокі лімфоцити функціонально неповноцінні, що виключає можливість розвитку важких імунологічних конфліктів (Торубарова Н. А., 1998; Гольцев А. Н., 2000; Lobintseva G., 2000). До того ж, дані експериментальних і клінічних досліджень свідчать про не меншу ефективність трансплантації клітин ембріональної печінки (КЕП) у відновленні кровотворення та імуногенезу (Селидовкин Г. Д., 1991; Bethel C. A., 1993; Thomas D. B., 1993; Kelly K. A., 1994).

Досвід використання трансплантації КЕП в програмах терапії онкологічних хворих невеликий. Є поодинокі повідомлення про збільшення тривалості безрецидивного періоду у хворих на гострий лейкоз (Lucarelli G, 1980; Sanhadji K., 1992) і про застосування КЕП, як гемопоезстимулюючого засобу, при комплексному лікуванні хворих на солідні новоутворення (Білинський Б. Т., 1996; Балтайтис Ю. В., 2000; Смикодуб А., 2000). Даних про вплив трансплантації КЕП на розвиток рецидивів і метастазів солідних пухлин, на ефективність лікування онкологічних хворих та на механізми, що лежать в основі формування протипухлинної резистентністі організму реципієнта немає. Зазначене коло питань і визначило мету даної роботи.

Мета дослідження: дослідити вплив трансплантації клітин алогенного кісткового мозку та клітин ембріональної печінки на ріст та метастазування експериментальних пухлин, на ефективність лікування хворих на рак тіла та шийки матки і на деякі механізми протипухлинної резистентності, асоційовані із згаданим впливом.

Задачі дослідження:

1. Дослідити вплив трансплантації КАКМ та КЕП на ріст та інтенсивність метастазування меланоми В16, карциноми легенів Льюїс у мишей С57Bl/6 та саркоми 37 у нелінійних мишей в різних експериментальних умовах.

2.Визначити вплив трансплантації КАКМ та КЕП на стан імунної системи тварин з пухлинами.

3. Вивчити можливості модифікації впливу трансплантації КАКМ та КЕП на бластомний процес препаратами тимуса, індукторами ендогенного синтезу інтерферону (ІФН) та екзогенним / - ІФН.

4. Оцінити ефективність застосування трансплантації КЕП в комплексному лікуванні хворих на рак шийки та тіла матки на підставі імунологічних та деяких клінічних показників (тривалість безрецидивного періоду, 2-4 - річне виживання).

Об”єкт дослідження: нелінійні миші та миші ліній С57Вl/6, СВА, хворі на рак шийки та тіла матки.

Предмет дослідження: вплив трансплантації КАКМ та КЕП на ріст та метастазування експериментальних пухлин, на стан імунної системи.

Методи дослідження: імунологічні, гематологічні, статистичні та моделі експериментальної онкології.

Наукова новизна. Вперше в експерименті встановлено пригнічуючий вплив трансплантації КЕП на перебіг бластомних процесів у експериментальних тварин, в тому числі в умовах хірургічного видалення пухлини та тотального опромінення в дозі 4 Гр. Встановлено, що серед механізмів, які можуть обумовлювати даний феномен, є зміни в стані імунологічної системи, що проявляються в підвищенні рівнів ІФН та тимічного сироваткового фактору (ТСФ) в циркуляторному руслі і в посиленні цитотоксичної активності спленоцитів. Вперше доведено, що трансплантація КЕП мишам з розповсюдженою карциномою Льюїс після видалення у них первинної пухлини завжди суттєво пригнічує метастатичний процес. Показано, що антиметастатичний ефект трансплантації КЕП підвищується інтерферонотерапією, а трансплантації КАКМ - тимоптином. Клініко-лабораторними дослідженнями доведено здатність трансплантації КЕП хворим на рак шийки та тіла матки стабілізувати імунологічні показники в процесі лікування, підсилювати продукцію ІФН, ТСФ, що опосередковує її позитивний вплив на ефективність лікування хворих.

Практичне значення роботи. В експериментальних дослідженнях доведена протипухлинна та антиметастатична ефективність трансплантації КАКМ та КЕП; обгрунтована доцільність її використання за умов видалення первинної пухлини або проведення циторедуктивної терапії. Клініко-лабораторними дослідженнями доведено, що пересадка КЕП сприяє стабілізації імунологічних показників в процесі лікування у хворих на рак шийки та тіла матки, підвищує рівні ІФН та ТСФ в крові. Виявлені зміни показників природньої протипухлинної резистентності асоційовані з пролонгацією безрецидивного періоду на 6 місяців та збільшенням 2-ох річного виживання на 18 %, 3-4 річного - на 16,7 %.

Особистий внесок здобувача. Ідею, мету дисертаційної роботи і загальне керування науковим дослідженням здійснено професором Ю. Я. Гріневичем. Автором особисто здійснені підбір і аналіз даних літератури, обгрунтовані адекватні методи досліджень, сплановані і виконані експериментальні і клініко-лабораторні дослідження, проведений аналіз експериментального первинного матеріалу, статистична його обробка, сформульовані положення та висновки роботи.

Зв`язок роботи з науковими програмами, планами, темами.

Роботу виконано у відповідності до планових НДР лабораторії клінічної імунології: “Оценить возможность профилактики гематогенных метастазов в легких с помощью трансплантации алогенного костного мозга и некоторых иммуномодуляторов” (№ держреєстрації РН.18.00.0014); “Разработать методику повышения противоопухолевой резистентности организма трансплантацией стволовых клеток эмбриональной печени при комбинированном лечении больных злокачественными новообразованиями” ((№ держреєстрації ИА 01.006163Р); “Оцінити ефективність застосування трансплантації стовбурових клітин ембріональної печінки при комплексному лікуванні хворих на злоякісні новоутворення”(№ держреєстрації 01974016202).

Апробація роботи. Матеріали даної роботи представлені та обговорені на конференції “Імунотерапія при лікуванні злоякісних новоутворень” (Київ, 1998 р.); ХVII, XVIII, XIX наукових конференціях молодих вчених та спеціалістів Інституту онкології АМН України (Київ,1997,1998,1999рр.); 2-му з`їзді онкологів країн СНД (Київ, 2000).

Публікації результатів досліджень. Основний зміст дисертаційної роботи викладений у 12 публікаціях, серед яких 4 статті у провідних фахових виданнях, 1 методичні рекомендації, 7 матеріалів та тез вітчизняних і міжнародних конгресів, конференцій, з”їздів.

Структура та обсяг дисертації. Дисертація викладена на 140 сторінках машинописного тексту, складається з вступу, огляду літератури, трьох розділів власних досліджень та їх обговорення, висновків, списку використаних джерел. Текст ілюстровано 27 таблицями та 7 рисунками. Список використаної літератури включає 253 джерел (101 вітчизняних та 152 закордонних).

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Матеріали та методи дослідження. Експериментальні дослідження проведені на 1245 мишах лінії С57Вl/6 з розплідника віварію Інституту експериментальної патології, онкології та радіобіології (ІЕПОР) ім Р. Є. Кавецького НАН України, 60 мишах лінії СВА та 100 нелінійних мишах розводки віварію Інституту онкології (ІО) АМН України. Також використані 1 півень, 1 кролик, як донори еритроцитів, розводки віварію ІО АМН України. В експериментах використано такі штами пухлин мишей: карциному легенів Льюїс, меланому В 16, що метастазують в легені та асцитну форму саркоми 37, що були люб”язно надані відділом експериментальних клітинних систем ІЕПОР ім Р. Є. Кавецького НАН України.

Вплив трансплантації КАКМ та КЕП на розвиток пухлинного процесу визначали на 14, 21 добу за такими показниками: масою первинного пухлинного вузла, кількістю та об”ємом метастатичних вузлів в легенях (об”єм метастазів визначали, виходячи з формули об”єму шару), індексом гальмування метастазування та росту пухлини за формулою:

ІГ= (К-О) ] х 100%,

К

де К- середній об’єм метастазів або маса пухлини у мишей контрольної групи, О - у мишей дослідної групи, а також за середньою тривалістю життя тварин з пухлинами. При проведенні експериментів з хірургічним видаленням первинної пухлини на 28 добу розвитку карциноми Льюїс інтенсивність метастатичного процесу досліджували на 52-у добу після перещеплення пухлини.

Свіжевиготовлені клітинні суспензії вводили мишам в ретроорбітальний венозний синус під легким ефірним наркозом. З метою створення алогенної системи в якості донорів клітин використовували нелінійних мишей. Термін гестації ембріонів для одержання суспензії клітин ембріональної печінки складав 16-18 днів.

В іншій серії експериментів з метою створення стану імуносупресії тварин тотально опромінювали в сублетальній дозі 4 Гр. за 3-и доби до перещеплення пухлини (Ярмоненко С. П., 1987).

В роботі використано такі препарати: природній препарат мишачого /-ІФН, індукований in vitro в гомологічних спленоцитах вірусом хвороби Ньюкасла - використовували для інтерферонотерапії тварин; препарат дс-РНК - як індуктор ендогенного ІФН; препарат рекомбінантного 2b-ІФН людини - лаферон, який використовували в якості стандарта при визначенні рівня ІФН в сироватці крові людини; тималін та тимоптин - для обробки клітин до трансплантації з метою підвищення її ефективності.

Ефективність трансплантації КЕП в клініці досліджували в групі з 30 хворих, яку склали - 27 хворих на рак шийки матки (4-ІІ Б, 1-ІІІА, 22-ІІІБ, стадія за класифікацією FIGO), 3 хворих на рак тіла матки (І, ІІ, ІV стадії) віком від 31 до 70 років (52,62,4 роки). Діагноз був верифікований гістологічно. Хворі отримували поєднану променеву терапію (ППТ) в два етапи. Перший етап - дистанційне опромінення ділянки малого таза до СОД 30 Гр. Перед кожним сеансом опромінення вводився 5-фторурацил (сумарна доза 3,5-5,0 г). Через 7-10 днів починали другий етап - внутрішньопорожнинну гама-терапію на апараті “АГАТ-ВУ” до СОД 50-70 Гр та продовжували дистанційне опромінення (СОД - 55-60 Гр). Контрольну групу склали 30 хворих на рак шийки матки (4 -ІІ Б, 26 -ІІІ Б стадія). Основна та контрольна групи були репрезентативні за віком, режимом ППТ. Трансплантацію КЕП проводили одноразово, внутрішньовенно, крапельно після першого етапу опромінення.

КЕП людини одержували із центру ембріональних тканин “Em cell” (директор к. м. н. А. І. Смикодуб). Кожна клітинна суспензія мала сертифікат якості.

Хворим на рак шийки або тіла матки вводили 0,8-4,5х108 клітин, що містять ядра, в об’ємі 2-4 мл суспензії і вмістом 0,15-0,35х108 CD 34+- клітин в даному об’ємі. Кількість CD 34+ - клітин визначали за допомогою тесту непрямої флюоресценції з моноклональними антитілами до поверхневого антигену CD 34 серії Leu фірми “Becton Dickinson”, США. Кількість живих клітин визначали за методом фарбування трипановим синім ( вона складала не менше 70 %).

Титр ТСФ визначали у тварин в різні терміни після перещеплення пухлин і у хворих на рак тіла та шийки матки в динаміці лікування за тестом Bach J. F. et. al, 1973. Для оцінки індукторних властивостей трансплантації КЕП щодо речовин з тимозиноподібною активністю (РТПА) визначали їх вміст за допомогою вищезазначеного методу в сироватці крові тимектомованих мишей СВА.

Цитотоксичну активність спленоцитів мишей досліджували за допомогою нерадіометричного методу шляхом визначення концентрації гемоглобіну в осаді курячих еритроцитів, що не зруйнувалися після їх 16-годинної інкубації при 370 С з клітинами - ефекторами (Гордиенко С. М., 1984). Кількість великих лімфоцитів, що містять гранули (ВГЛ) визначали шляхом їх підрахунку в мазках крові, забарвлених за Романовським - Гімза.

Функціональну активність макрофагів перитонеального ексудату визначали за тестом відновлення нитросинього тетразолію (НСТ-тест) (Miller F., 1989) та за тестом, що оцінює здатність цих клітин до адгезії (Бутаков А. А., 1991).

ІФН, що міститься в сироватці крові, титрували проти 100 ТЦПД50 вірусу везикулярного стоматиту (ВВС) на клітинах L929 (ІФН мишей) та А549 (ІФН людини). Типування ІФН проводили за критерієм кислото- та термолабільності.

Кількість лімфоцитів різних популяцій визначали за допомогою реакції спонтанного розеткоутворення ( Клаус Д. Ж., 1990).

Вміст імуноглобулінів класів A, M, G визначали за методом радіальної імунодифузії в агарі (Mancini G., 1965). Для визначення концентрації циркулюючих імунних комплексів використано метод, що заснований на селективній преципітації їх в 3,75 % поліетиленгліколі

Фагоцитарну активність (ФА) та фагоцитарний індекс (ФІ) нейтрофілів периферійної крові визначали шляхом підрахунку кількості клітин, що поглинули бактерії інактивованого прогріванням при 900 С протягом години штаму St. aureus 209, та середньої кількості поглинених бактерій однією фагоцитуючою клітиною.

Отримані дані оброблені статистично з визначенням середнього арифметичного (М) і середньої похибки (m). Оцінку вірогідності різниць отриманих середніх величин проводили за допомогою “t” критерія Стьюдента з використанням відповідної комп”ютерної програми.

РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ ТА ЇХ ОБГОВОРЕННЯ

Вплив трансплантації клітин алогенного кісткового мозку та ембріональної печінки на розвиток експериментальних пухлин.

В залежності від кількості та сроків введення мієлоцитів, типу експериментальної пухлини спостерігалися різні ступені гальмування росту первинної пухлини та розвитку її метастазів у тварин. При аналізі отриманих даних на моделі меланоми В 16 спостерігали зворотню

залежність ступеня антиметастатичної та протипухлинної ефективності трансплантації КАКМ від кількості введених клітин. Так, максимальний антиметастатичний ефект мав місце при трансплантації 5х106 КАКМ на 8-у добу після перещеплення пухлини (таблиця 1). В цій же групі тварин метастази в легенях з”явилися у 52,9 % мишей порівняно з 72,7 % в контрольній. Збільшення кількості трансплантованих клітин у 2,5 або 4 рази не покращувало ефективність трансплантації. Зміна терміну її проведення на більш ранній по відношенню до терміну розвитку пухлини (3-я доба після перещеплення) не вплинула на ріст пухлини та метастазування.

Аналогічний ефект трансплантації КАКМ спостерігали на іншій експериментальній моделі - карциномі Льюїс. Аналіз отриманих результатів цієї серії експериментів показав, що найвиразніший антиметастатичний ефект викликає введення КАКМ (у вищезазначеній кількості) за 3 доби до і через 3 доби після перещеплення пухлини (таблиця.1). Індекс гальмування метастазування становив 20,1 та 50,0 % відповідно. Введення КАКМ за 3 доби до перещеплення супроводжувалося також проявом протипухлинного ефекту: індекс гальмування росту пухлини в цьому випадку склав 26,9 %. Трансплантація клітин на 8-у добу після перещеплення пухлини викликала лише незначне зменшення кількості метастатичних вузлів в легенях тварин.

При застосуванні іншого джерела СКК для трансплантації - клітин ембріональної печінки - в серії експериментів була підібрана кількість клітин (0,5х106 на мишу) , що не викликає загибелі тварин при введенні їх в орбітальний венозний синус.

Трансплантація КЕП, проведена на 3-ю або 8-у добу після перещеплення карциноми Льюїс, не впливала на масу пухлини, проте суттєво пригнічувала розвиток метастазів. Індекс гальмування метастазування склав 59,6 та 75,9 % відповідно. Трансплантація КЕП тваринам з розповсюдженою карциномою Льюїс (28 доба розвитку пухлини під шкірою стопи) практично не впливала на динаміку

формування метастатичних вузлів, однак, після хірургічного видалення первинної пухлини завжди ефективно пригнічувала метастатичний процес аж до повної відсутності метастазів в легенях у 33,3 % тварин (p<0,001).

Дослідження впливу трансплантації КЕП на виникнення метастазів в динаміці росту пухлини дозволили встановити термін його тривалості (рис.1). Відсутність метастатичних вузлів в легенях тварин на 11-у добу після трансплантації КЕП на відміну від контроля свідчить про те, що антиметастатичний ефект від введення клітин триває приблизно 10 діб.

Таблиця 1

Вплив трансплантації КАКМ на масу пухлини і розвиток метастазів у мишей лінії С57Bl/6 з меланомою В16

Г р у п а | Термін | Кількість тварин | Кількість | Коливання | Об`єм | Коливання | Маса

| т трансплан-

тації КАКМ

(доби) | всього | з них з м метастазами |

метастазів

| кількості

метастазів | метастазів

(мм3) |

об`єму

метастазів

(мм3) | пухлини

(г)

1 | 3 | 23 | 20 (87 %) | 5,8 1,0 | 0 - 18 | 2,9 0,8 | 0 - 12,3 | 3,5 0,3

2 | 8 | 17 | 9 (53 %) | 0,9 0,2хо | 0 - 4 | 0,1 0,0хо | 0 - 1,2 | 3,2 0,6

3 | контроль | 22 | 16 (73 %) | 4,1 1,0 | 0 - 18 | 3,8 1,3 | 0 - 23,7 | 4,2 0,5

Вплив трансплантації КАКМ на масу пухлини і розвиток метастазів у мишей лінії С57Bl/6 з карциномою Льюїс

Трансплантація КАКМ д о перещеплення пухлини

1 | 8 | 8 | 8 (100 %) | 14,8 2,7 | 6 - 27 | 56,8 31,2 | 4,9 - 256,3 | 5,7 0,7

2 | 3 | 9 | 8 (89 %) | 6,4 1,5х | 0 - 13 | 14,7 8,7 | 0 - 77,6 | 3,8 0,4х

Трансплантація КАКМ після перещеплення пухлини

3 | 3 | 11 | 9 (82 %) | 5,6 1,4х | 0 - 15 | 9,2 4,3 | 0 - 45,6 | 5,3 0,6

4 | 8 | 10 | 9 (90 %) | 9,5 2,7 | 0 - 26 | 36,9 11,6 | 0 - 109,5 | 6,1 0,8

5 | контроль | 14 | 14 (100 %) | 19,6 1,0 | 4 - 17 | 18,4 8,3 | 0, 7 - 113,0 | 5,2 0,4

Примітки.

1. - показники дані як Мm;

2. - х - р < 0,05 в порівнянні з показниками контрольної групи;

3.- о - р < 0,05 в порівнянні з показниками 1 групи.

Рис. 1 Динаміка кількості і об’єма метастазів карциноми Льюїс

у мишей лінії С57Bl/6 в різні терміни після трансплантації КЕП.

Трансплантація КЕП не втрачає своєї ефективності і у тварин, що зазнали впливу тотального опромінення в сублетальній дозі 4 Гр: на кінцевому терміні спостереження (21 доба після перещеплення пухлини) індекс гальмування метастазування склав 57,5 %. Слід зазначити, що ефект трансплантації КЕП супроводжувався подовженням середньої тривалості життя тварин з карциномою Льюїс на 64 % (р<0,05). Збільшення кількості трансплантацій до 3-х дозволило покращити цей показник. Введення КЕП мишам з асцитною формою саркоми 37, яка характеризується дуже злоякісним перебігом, збільшувало тривалість життя тварин на 16,6 % (р>0,05).

На підставі даних літератури про важливу роль тимічних гормонів в диференціюванні стовбурових кровотворних клітин і становленні їх біологічних функцій (Гріневич Ю. А., 1989) та на підставі загальновизнаної уяви про антипухлинні, антиметастатичні та імуномодулюючі ефекти інтерферонів (Воронцова А. Л., 1987,1991,2000) було проведено спробу підсилити ефект трансплантації КАКМ та КЕП на бластомний процес цими засобами: преінкубацією106 клітин протягом 2 годин при 370 С з препаратами тимуса - тималіном (0,03 мг/мл) або тимоптином (0,6 мкг/мл), а також сумісним застосуванням трансплантації КАКМ та КЕП з індукторами ендогенного синтезу ІФН і екзогенним ІФН.

Показано, що антиметастатичний ефект від трансплантації преінкубованих з тимоптином КАКМ суттєво кращий за такий від трансплантації нативних, не оброблених КАКМ. Індекс гальмування метастазування при цьому досягає 81,5 %. Разом з тим, преінкубація КАКМ в тих же умовах з тималіном суттєво не впливає на процес метастазування, а трансплантація КЕП, преінкубованих в присутності вищезгаданих біологічно активних факторів тимуса навіть погіршує антиметастатичний ефект трансплантації нативних клітин (р<0,05). Застосування в якості індуктора інтерфероногенеза дс РНК сумісно з трансплантацією КАКМ помітно не впливало ні на ріст первинної пухлини, ні на процес метастазування.

Проведена серія досліджень на карциномі Льюїс по застосуванню сумісно з трансплантацією КЕП інтерферонотерапії дозволила суттєво підвищити антиметастатичний ефект. При цьому, індекс гальмування метастазування карциноми Льюїс збільшувався на 59,5 % і досягав 92,2 % по відношенню до контроля.

Таким чином, трансплантація КАКМ та КЕП суттєво гальмує розвиток метастазування в залежності від схеми експерименту і кількості введених клітин. Антиметастатичний ефект трансплантації підвищується при її поєднанні з інтерферонотерапією і при преінкубації клітин з тимоптином.

Щодо механізмів зазначеного феномену, то суттєве пригнічення розвитку метастазів під дією трансплантації клітин може бути опосередковано її імуномодулюючим ефектом, зокрема, активуючим впливом на систему природньої протипухлинної резистентності.

Результати досліджень показали, що внаслідок трансплантації

КАКМ спостерігається посилення знижених в процесі росту пухлини інтерферонсинтезуючих властивостей клітин організму щодо продукції ІФН у відповідь на введення деспіралізованої РНК та двократне підвищення рівня ТСФ (р<0,05).

Виявилося, що трансплантація КЕП є ефективним індуктором вищезазначених цитокінів. Рівень ІФН в сироватці крові підвищується і досягає піка вже через 24 години після введення КЕП і повертається до вихідного рівня на 3-ю добу після трансплантації. Типування ІФН на піку його продукції показало його належність до кислото- та термостійкого - ІФН.

Підвищена продукція ТСФ в крові тварин реєструвалася через 4 доби з досягненням піка на 11 добу після трансплантації КЕП. На ранніх етапах після введення клітин цей факт може бути пов”язаний з індукцією синтезу речовин з тимозиноподібною активністю (РТПА). Це підтверджується результатами досліджень на тимектомованих мишах лінії СВА: синтез зазначених речовин починався вже через 4 години і досягав максимума до3-4 доби після трансплантації.

Як наслідок посилення продукції цитокінів, мав місце факт стимуляції клітинної ланки неспецифічного протипухлинного захисту, зокрема, цитотоксичної активності спленоцитів, яка зростала більше, ніж в 2 рази (рис. 2). Також суттєво підвищувалася кількість ВГЛ (які є морфологічним гомологом природніх кілерних клітин) в периферійній крові тварин (р<0,05). Разом з тим, не було отримано даних за будь-який вплив трансплантації КЕП на функціональну активність макрофагів перитонеального ексудату. Здатність цих клітин до відновлення НСТ суттєво зростала тільки у тварин, що отримували інтерферонотерапію разом із трансплантацією КЕП (р<0,05).

Спираючись на результати досліджень та на загальновідомі факти про важливу роль ІФН (Воронцова А. Л., 2000) та тимічних факторів (Гріневич Ю. А., 1992) у стимуляції природньої кілерної активності і в формуванні неспецифічних протипухлинних реакцій організму можна логічно припустити, що підвищення продукції цих цитокінів є одним з механізмів, за рахунок яких трансплантація КАКМ та КЕП пригнічує метастатичний процес.

Рис. 2 Цитотоксична активність спленоцитів і кількість ВГЛ в

периферійній крові у мишей лінії С57Bl/6 з карциномою Льюїс

після трансплантації КЕП

Вплив трансплантації клітин ембріональної печінки на результати лікування хворих на рак шийки та тіла матки.

В процесі поєднаної променевої терапії (ППТ) (після першого її етапу) у хворих на рак шийки та тіла матки спостерігається достовірне зниження абсолютної кількості Т-, В- лімфоцитів, ВГЛ в порівнянні з відповідними показниками практично здорових людей. Для всіх хворих характерне значне підвищення кількості імунних комплексів в сироватці крові та наявність дисімуноглобулінемії за рахунок підвищення або зниження рівня того чи іншого класу імуноглобулінів. У хворих також спостерігається незначне зниження фагоцитарного індексу і фагоцитарної активності нейтрофілів. Подальші дослідження показали, що трансплантація КЕП у даних хворих не супроводжується суттєвим імунореабілітуючим ефектом. Не було відмічено суттєвих змін в стані клітинної та гуморальної ланок імунної системи. В той же час, з 7 доби після трансплантації КЕП спостерігалось збільшення абсолютної кількості лімфоцитів (з 0,480,04 х 109/л до 0,890,19 х109/л, р<0,05), яке відбувалося, в основному, за рахунок недиференційованих, так званих, “0” - лімфоцитів. Однак, при цьому привертає увагу протекторна дія трансплантації КЕП на лімфоцити: до завершення лікування їх кількість залишалася вищою за передтрансплантаційний рівень (через місяць після трансплантації КЕП становила 0,650,14 х 109/л), в той же час в контрольній групі відмічалася тенденція до подальшого зниження абсолютної кількості лімфоцитів - до 0,44 0,03 х 109/л.

Проведені дослідження показали, що після трансплантації КЕП на рівні тенденції збільшується рівень ІФН в сироватці крові тільки на 3-7 добу, а також рівень ТСФ в циркуляторному руслі на 10-18 добу.

Таким чином, проведені клініко - лабораторні дослідження свідчать про здатність трансплантації КЕП хворим на рак шийки та тіла матки стабілізувати імунологічні показники, підсилювати продукцію ІФН та ТСФ, що могло опосередковувати її позитивний вплив на ефективність лікування хворих. І дійсно, як свідчать результати спостережень, проведених у відділенні променевої терапії ІО АМН України (керівник відділення к.м.н. В. С. Іванкова) за 4 роки у хворих були відмічені позитивні наслідки трансплантації КЕП щодо перебігу пухлинного захворювання: рецидивів в основній групі хворих через 6 місяців після проведеного лікування не спостерігалось, в той час, як в контрольній групі вони з”явились у 13 % хворих (р>0,05). Характерно, що до двох років після лікування рецидиви виникли у 10 % основної та у 23 % хворих контрольної групи (р<0,01). За цей час в основній групі померла 1 хвора (3 %) проти 3 хворих (10 %) в контрольній групі, без ознак рецидивів і метастазів жили 72 % хворих основної та 53 % хворих контрольної групи. Таким чином, включення трансплантації КЕП в комплексне лікування хворих на рак шийки та тіла матки призводить до покращення їх 2-х річного виживання на 18,3 %, 3-х річного на 16, 7 % (p>0,05). Аналіз віддалених результатів лікування - через 4 роки показав, що досягнений ефект збільшення показників виживання хворих основної групи зберігається.

Отримані дані свідчать, що включення трансплантації КЕП в комплексне лікування хворих на рак шийки та тіла матки позитивно впливає на протипухлинну резистентність організму, що, в свою чергу, могло опосередковувати її позитивний вплив на ефективність лікування хворих, на його безпосередні та віддалені результати.

ВИСНОВКИ

1. Трансплантація клітин алогенного кісткового мозку та клітин ембріональної печінки мишам на 3 або 8-му добу після перещеплення пухлин пригнічує ріст саркоми 37, ріст та метастазування в легені карциноми Льюїс і меланоми В16, збільшує тривалість життя тварин з карциномою Льюїс на 64 % та з саркомою 37 на 16 %.

2. Трансплантація клітин ембріональної печінки мишам з розповсюдженою карциномою Льюїс суттєво не впливає на виникнення метастазів, а після видалення первинної пухлини завжди ефективно пригнічує метастатичний процес.

3. Антиметастатичний ефект трансплантації клітин ембріональної печінки підвищується при її поєднанні з інтерферонотерапією (природній / - ІФН), а ефект трансплантації клітин алогенного кісткового мозку - при їх преінкубації з тимоптином.

4. Трансплантація клітин алогенного кісткового мозку та ембріональної печінки мишам з карциномою Льюїс супроводжується суттєвим підвищенням рівнів ІФН в сироватці крові, тимічного сироваткового фактору та двократним зростанням цитотоксичної активності спленоцитів порівняно з контролем.

5. Клініко-лабораторними дослідженнями доведено, що пересадка клітин ембріональної печінки хворим на рак шийки та тіла матки сприяє стабілізації в процесі лікування імунологічних показників: кількості Т- та В- лімфоцитів, імуноглобулінів класів A, M, G, фагоцитарної активності нейтрофілів, підвищує рівні тимічного сироваткового фактору та сироваткового інтерферону. Виявлені зміни показників природньої резистентності асоційовані із пролонгацією безрецидивного періоду на 6 місяців, збільшенням 2-ох річного виживання на 18 % та зменшенням кількості рецидивів, що виникли за цей час на 13 %, збільшенням показників 3-4 річного виживання на 16,7 %.

СПИСОК ОПУБЛІКОВАНИХ ПРАЦЬ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

1.

2.

3.

4.

5.

6.

7.

8.

9.

10.

11.

12.

АНОТАЦІЯ

Храновська Н. М. Вплив трансплантації клітин алогенного кісткового мозку та ембріональної печінки на протипухлинну резистентність організму. - Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 14.01.07. - онкологія. - Інститут експериментальної патології, онкології і радіобіології ім. Р. Є. Кавецького НАН України, Київ, 2001.

Дисертацію присвячено вивченню впливу трансплантації клітин алогенного кісткового мозку (КАКМ) та клітин ембріональної печінки (КЕП) на протипухлинну резистентність організму, на ріст та метастазування карциноми Льюїс, меланоми В 16, саркоми 37 та дослідженню ефективності включення методу трансплантації КЕП в традиційну схему комплексного лікування хворих на рак шийки та тіла матки.

В експериментах доведена висока антиметастатична ефективність трансплантації КАКМ та КЕП, в тому числі при її використанні поряд з хірургічним видаленням первинної пухлини, тотальним опроміненням тіла в сублетальній дозі, у комбінації з інтерферонотерапією та застосуванням препаратів тимуса (тимоптину та тималіну).

Пересадка КЕП хворим на рак шийки та тіла матки в процесі проведення поєднаної променевої терапії (ППТ) не супроводжувалася суттєвим імунореабілітуючим ефектом, але сприяла стабілізації показників клітинної та гуморальної ланок імунної системи в процесі лікування хворих. Відмічено зменшення частоти рецидивів раку шийки або тіла матки протягом двох років після ППТ та трансплантації КЕП (р<0,01) та покращання на рівні тенденції (p>0,05) 4-річного виживання хворих.

Одержані експериментальні дані та результати клініко - лабораторних досліджень свідчать про доцільність застосування трансплантації КЕП в комплексному лікуванні хворих на злоякісні новоутворення з метою підвищення його ефективності.

Ключові слова: клітини алогенного кісткового мозку, клітини ембріональної печінки, карцинома Льюїс, меланома В16, саркома 37, метастазування, рак шийки та тіла матки, імунологічні показники.

АННОТАЦИЯ

Храновская Н. Н. Влияние трансплантации клеток аллогенного костного мозга и клеток эмбриональной печени на противоопухолевую резистентность организма. - Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук по специальности 14.01.07 - онкология. - Институт экспериментальной патологии, онкологии и радиобиологии им. Р. Е. Кавецкого НАН Украины, Киев, 2001.

Диссертация посвящена изучению влияния трансплантации клеток аллогенного костного мозга (КАКМ) и клеток эмбриональной печени (КЭП) на противоопухолевую резистентность организма, на рост и метастазирование злокачественных опухолей в эксперименте и исследованию эффективности включения метода трансплантации КЭП в традиционную схему комплексного лечения больных раком шейки и тела матки.

Для трансплантации в эксперименте использовали свежеприготовленные суспензии аллогенных клеток. Срок гестации эмбрионов для получения КЭП составил 16-18 дней. Криоконсервированные КЕП человека получали из центра эмбриональных тканей “Em cell” (директор к.м.н. А. И. Смыкодуб).

Вводилось 0,8-4,5х108 ядросодержащих клеток 9-12-недельного эмбриона.

Противоопухолевую и антиметастатическую эффективность трансплантации КАКМ и КЭП изучали на моделях экспериментальных, метастазирующих в легкие, опухолей - меланоме В 16, карциноме Льюис, а также асцитной форме саркомы 37. Установлено, что трансплантация КАКМ и КЭП существенно тормозит рост первичной опухоли и процесс метастазирования, а индекс торможения метастазирования зависит от количества клеток и сроков их введения.

Следует отметить, что трансплантация КЭП животным с распространенной карциномой Льюис не сопровождается существенным антиметастатическим эффектом. Однако, после хирургического удаления первичной опухоли трансплантация КЭП всегда эффективно угнетает метастатический процесс вплоть до полного подавления метастазов в легких у 33 % животных.

Антиметастатический эффект трансплантации КЭП удалось существенно повысить последующей интерферонотерапией, а эффект трансплантации КАКМ предварительной инкубацией клеток в присутствии тимоптина. Выяснены некоторые механизмы, возможно опосредующие данный феномен. Оказалось, что трансплантация КЭП является эффективным индуктором синтеза интерферона и веществ с тимозиноподобной активностью, повышенные уровни которых регистрировались в циркуляторном русле уже в первые сутки после введения клеток. Под действием трансплантации КАКМ также наблюдается повышение сниженных в процессе роста опухоли интерферонсинтезирующих свойств клеток организма. Вследствие усиления продукции цитокинов имел место факт стимуляции клеточного звена неспецифической противоопухолевой защиты, в частности, цитотоксической активности спленоцитов, которая возрастала более, чем в 2 раза (р<0,05).

Эффективность трансплантации КЭП в клинике изучали у 27 больных раком шейки и 3-х - тела матки, получавших сочетанную лучевую