УКРАЇНСЬКА АКАДЕМІЯ АГРАРНИХ НАУК
УКРАЇНСЬКА АКАДЕМІЯ АГРАРНИХ НАУК
ІНСТИТУТ ТВАРИННИЦТВА
ІВАШУРА АНДРІЙ АНАТОЛІЙОВИЧ
УДК 636.2.082:575:619
ГЕНЕТИЧНИЙ ПОЛІМОРФІЗМ ЛІМФОЦИТАРНИХ АНТИГЕНІВ
І МОЖЛИВІСТЬ ЇХ ВИКОРИСТАННЯ В СЕЛЕКЦІЇ
НА РЕЗИСТЕНТНІСТЬ ДО ХРОНІЧНОГО ЛІМФОЛЕЙКОЗУ
ВЕЛИКОЇ РОГАТОЇ ХУДОБИ
06.02.01-розведення та селекція тварин
Автореферат
Дисертації на здобуття наукового ступеня
кандидата сільськогосподарських наук
Харків – 2001
Дисертацією є рукопис
Робота виконана в лабораторії генетики Інституту тваринництва Української академії аграрних наук
Науковий керівник: кандидат сільськогосподарських наук,
старший науковий співробітник
Розсоха Володимир Іванович,
завідувач лабораторії генетики,
заступник директора Інституту тваринництва УААН
Офіційні опоненти: доктор сільськогосподарських наук,
Рубан Сергій Юрійович,
завідувач відділу технології виробництва молока
Інституту тваринництва УААН
кандидат сільськогосподарських наук,
Хохлов Анатолій Михайлович,
доцент кафедри генетики та біотехнології
Харківської державної зооветеринарної академії
Міністерства аграрної політики України
Провідна установа: Інститут розведення і генетики тварин
Захист відбудеться 16.01.2002 року о 10 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д65.356.01. Інституту тваринництва УААН, 62404,
м. Харків, п/в Кулиничі, вул..7-ї Гвардійської Армії, 3.
З дисертацією можна ознайомитися в бібліотеці Інституту тваринництва УААН.
Автореферат розісланий 14.12.2001 року
Вчений секретар спеціалізованої вченої ради Помітун І.А.
ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ
Актуальність теми
Боротьба з хворобами сільськогосподарських тварин – важливий фактор інтенсифікації у тваринництві. Захворювання різко знижують темпи генетичного удосконалення популяцій тварин. Тому селекція на резистентність є дуже важливим та ефективним напрямком у системі заходів по створенню високопродуктивних порід, ліній та типів великої рогатої худоби (ВРХ). Можливість та перспективність такої селекції підтверджується експериментальними даними про існування міжвидових та внутрішньовидових відмінностей за стійкістю до захворювань. Непрямий відбір на резистентність здійснюють за показниками імунореактивності та генетичними маркерами, які корелюють з резистентністю та визначаються без експериментального зараження тварин ( Слепченко А.Р., Іткін Б.З., 1979; Анохін С.М., 1992).
Дослідження спадкової резистентності ВРХ до хронічного ліфмолейкоза (ХЛЛ) є актуальним напрямком селекційній роботі. Використання природних маркерів, якими є антигени головного комплексу гістосумісності (ГКГС) відкриває можливість діагностування схильності тварин до цього захворювання. Проведені дослідження ВРХ за лімфоцитарними антигенами відповідають сучасним міжнародним вимогам, що ставлять до селекції сільськогосподарських тварин. Результати роботи доцільно використовувати при розробці ефективних селекційних заходів при створенні нових порід, ліній та типів ВРХ, резистентних до ХЛЛ.
Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами Дисертаційна робота тісно зв'язана з Державною науково-технічною програмою: 03.05. “Селекція тварин за природною резистентністю з використанням клітинної та генної інженерії”. Завдання: 03.05.00./017-93 Резис. Розробити систему оцінки резистентності великої рогатої худоби для використання у селекційній роботі при створенні нових порід, типів, ліній та високопродуктивних стад. (№ держреєстрації UA01001311P).
Комплексний проект 03.05.00./002до-95; з науково-дослідної роботи: Розробити енерго- та ресурсозберігаючі конкурентноспроможні технології виробництва молока, що забезпечують річний надій 5-8 тис. кг. на фуражну корову у підприємствах різних форм господарювання. Розробити методи удосконалення селекційного процесу молочної худоби на основі використання полігенних систем крові та цитогенетичних критеріїв.(1996-2000 рр. № держреєстрації 0196U011388).
Мета та задачі досліджень Метою роботи є удосконалення селекційного процесу та розробка нових методичних підходів до використання лімфоцитарних антигенів у селекції ВРХ на резистентність до ХЛЛ.
Для виконання мети були поставлені наступні завдання:
1.Провести аналіз захворюваності на лейкоз ВРХ у господарствах Харківської області.
2.Створити банк моноспецифічних сироваток для типування великої рогатої худоби
3.Визначити частоту та характер розподілу антигенів класу 1 BoLА-системи у популяціях порід: чорно-рябої голштинської, червоно-рябої голштинської, симентальської, швіцької, українських чорно-рябої молочної та червоно-рябої молочної.
4.Визначити частоту та характер розподілу антигенів класу 1 BoLA - системи в групах здорових тварин, хворих на ХЛЛ та вірусоносіїв (РИД+) чорно-рябої та червоно-рябої голштинської худоби.
5.Визначити частоту та характер розподілу антигенів класу 1 BoLA - системи в групі чорно-рябої голштинської худоби серед тварин, хворих на ХЛЛ, мастит, ендометрит.
6.Визначити наявність “сприятливих” та “несприятливих” антигенів класу І BoLa-системи.
Об'єкт дослідження – велика рогата худоба (6 порід).
Предмет дослідження - лімфоцитарні антигени Головного комплексу гістосумісності великої рогатої худоби.
Методи дослідження – ветеринарні - визначення стану здоров'я тварин і ознак захворювання; імуногенетичні – виготовлення антилімфоцитарних сироваток-реагентів, типування тварин за антигенами BoLA-системи; статистичні - визначення частоти антигенів та відповідних до них генів, середнього відхилення; біометричні - визначення критерію відповідності, ризику захворювання, етіологічної фракції, атрибутивного ризику; селекційна роль генетичних маркерів.
Наукова новизна отриманих результатів. Дослідження різних порід ВРХ за лімфоцитарними антигенами ГКГС проведено вперше в Україні. Виявлено маркерні антигени BoLA-системи, які пов'язані із стійкістю-сприйнятливістю до ХЛЛ у популяціях чорно-рябої та червоно-рябої голштинської порід. Визначено маркерний BoLА-антиген резистентності до ХЛЛ, маститу та ендометриту. Проведено дослідження можливості раннього діагностування великої рогатої худоби на сприйнятливість до ХЛЛ. Запропоновано програму для обробки результатів BoLA-типування та створення банку даних “BoLА-тест”, яку включено у програмне забезпечення АРМЕКС.
Практичне значення отриманих результатів Результати роботи відкривають можливість прогнозування важливих у селекційному плані ознак: природної стійкості або, навпаки, сприйнятливості до ХЛЛ великої рогатої худоби. Маркерні антигени резистентності до ХЛЛ можуть використовуватись при формуванні стада племінних тварин, резистентних до ХЛЛ.
Створено науково-методичну базу для подальших досліджень великої рогатої худоби за лімфоцитарними антигенами з метою використання результатів у селекційній роботі. Виявлення резистентних до ХЛЛ тварин може значно підвищити ефективність селекційно-ветеринарних заходів по оздоровленню стада за рахунок використання резервів спадкової резистентності до захворювань.
Особистий внесок здобувача. Дисертант брав безпосередню участь у організації та проведенні науково-виробничих та лабораторних досліджень, отримав первинні дані, які були статистично оброблені та проаналізовані. Здобувачем самостійно проведено узагальнення одержаних результатів, сформульовано висновки та пропозиції виробництву, що логічно завершують дослідження.
Апробація результатів дисертації. Результати повідомлені і схвалені:
на II-ій Міжнародній конференції з молекулярно-генетичних маркерах тварин (ІЖ УААН, м. Харків, 7-8 лютого 1996г.), зроблено доповідь на тему: ”Резистентність до хронічного лімфолейкозу великої рогатої худоби у зв'язку з лімфоцитарними антигенами (BоLA).”;
на І-ій Міжнародній науково-виробничій конференції: ”Проблеми сельскогосподарьского виробництва на сучасному етапі і шляхи їх вирішення.”(Бєлгородська сільськогосподарська академія, м. Бєлгород, 1998р.), зроблено доповідь на тему: “Контроль резистентности к ХЛЛ местной популяции черно - пестрого скота с использованием лимфоцитарных антигенов BоLA”;
Публікації: Основні положення дисертації висвітлено в міжвідомчих наукових збірниках та матеріалах конференцій. Всього по темі дисертаційної роботи опубліковано 7 наукових праць.
Структура й обсяг дисертації. Дисертація викладена на 119 сторінках машинописного тексту, складається із вступу, огляду літератури, методики і матеріалу досліджень, власних досліджень, аналізу й узагальнення результатів досліджень, висновків, пропозицій виробництву, списку використаної літератури, додатків; включає 35 таблиць, 155 літературних джерел, з них 126 іноземною мовою.
МЕТОДИКА І МАТЕРІАЛ ДОСЛІДЖЕНЬ
Представлена робота є частиною комплексних досліджень корів голштинської чорно-рябої та червоно-рябої породи у господарствах Харківської та Сумської області, а також симентальської, української червоно-рябої, української чорно-рябої та швіцької худоби з п'яти господарств різних областей України, що проводились протягом 1993-2001 рр. у лабораторії генетики ІЖ УААН. Дані про захворюваність великої рогатої худоби на ХЛЛ отримано від співробітників районної ветеринарної станції та обласної ветеринарної бактеріологічної лабораторії на підставі планових та спеціальних обстежень ВРХ. Матеріалом для дослідження BoLA-системи були лімфоцити, що виділялися з периферійної крові ВРХ. Ідентифікація антигенів гістосумісності проводилася за стандартним двоступінчастим мікроцитотоксичним тестом, модифікованим для великої рогатої худоби (Cardwell та ін., 1977; Слепченко А.Р., Іткін Б.З., 1979). Для BoLA-типування використовували 11 стандартних моноспецифічних сироваток, що пройшли міжнародний іспит, а також отриманих у лабораторії генетики Інституту тваринництва УААН. Результати типування антигенів гістосумісності були відображені в спеціальному протоколі, який складається з паспортної частини і таблиці, у якій зафіксовано послідовність внесення специфічних сироваток у лунки мікрокамери. Отриманий матеріал переносився в базу даних, що містить додаткову інформацію про тварину (кличка, номер, діагноз і т.п.). Цифровий матеріал оброблявся статистично за допомогою програми “BoLA-тест”. Методами біометрії визначали критерій відповідності (?І), ступінь відносного ризику захворюваності (RR), етіологічної фракції (EF), атрибутивного ризику (?). Імуногенетичний аналіз результатів проводився на основі біометричних показників. Для одержання сироваток проводились імунізації великої рогатої худоби методом внутрішньошкірного введення суспензії лейкоцитів, (Spooner R.L., Leveziel H., Groslaude F. 1978; Caldwell J., Cumberland P.A. 1978.), а також серії масових та випробних абсорбцій з кластерним аналізом (Kobori J.A., Strauss K., Hood L. 1986). Для ідентифікації антигенів BoLA W1-W11 використовувались моноспецифічні сироватки.
РЕЗУЛЬТАТИ ВЛАСНИХ ДОСЛІДЖЕНЬ
Поширення захворюваності на лімфолейкоз у великої рогатої худоби
Аналіз захворюваності на ХЛЛ у великої рогатої худоби проводився у господарствах Харківської області. Результати обстеження тварин, проведені у 27 районах Харківської області, свідчать про підвищення захворюваності на хронічний лімфолейкоз. У всіх районах Харківської області виявлено осередки цього захворювання. Найбільш важке становище у Балакліївському, Близнюківському, Дергачівському, Лозівському, Печенізькому, Борівському, Вовчанському, Красноградському, Куп'янському, Первомайському районах: рівень господарств, у яких виявлено хронний лімфолейкоз, становить 80 – 100%. Захворюваність на ХЛЛ у Кегичівському, Коломацькому, Зачепилівському та Двурічанському районах було визначено у 40-60%
Аналіз результатів ветеринарного обстеження у Харківському районі показує, що кількість тварин з РИД(+)- аналізом та хворих на ХЛЛ підвищилась з 12,7% у. 1996р.. до 25,6% у 2000р. У приватному секторі також спостерігається зростання кількості РИД(+)- тварин (на 222 голови за 4 роки). Серед фермерських господарств Харківського району, вільних від вірусу лейкозу ВРХ, у 1998р. нараховувалось 7 господарств, які мали 9 ферм загальною кількістю 3530 голів. У 2000р.. залишилося 5 таких господарств, що включають 7 ферм із загальною кількістю 2180 голів. З трьох різновидів лейкозу найбільш поширеним є хронічний лімфолейкоз.
Поширення захворюваності на ХЛЛ у господарствах Харківської області обумовлює важливе значення та актуальність розробки селекційних заходів, спрямованих на використання природної резистентності великої рогатої худоби до ХЛЛ за допомогою маркерних BoLA-антигенів.
Виготовлення набору сироваток для типування великої рогатої худоби
У лабораторії генетики ІЖ УААН отримання колекції сироваток для проведення BoLА-типування проводилось у три основних етапи:
1.На основі готових моноспецифічних стандартів, перевірених та затверджених на міжнародній панелі сироваток-реагентів, виходячи з перевірочного типування контингенту, визначаємо тест-донорів: корів з відомим набором трансплантаційних антигенів (25-40 голів).
2.Клітини тест-донорів слугують еталоном для підтвердження отриманих імунних сироваток, у результаті чого відбираються найбільш активні зразки з первинно визначеною найбільш сильною специфічністю.
3.Ці отримані зразки проходять вторинну ідентифікацію на розширеній панелі тест-клітин з подальшим обчисленням коефіцієнтів кореляції між отриманими сироватками та моноспецифічними контрольними зразками (кластерний аналіз).
Джерелом імунних сироваток до антигенів системи ГКГС були родинні тварини (напівбрати-напівсестри, матері-нащадки), їх використовували з метою одержання найбільш тісної імунної відповіді.
Проведення абсорбцій “сирих” поліспецифічних антилейкоцитарних сироваток містить кілька етапів: підготовку стандартної панелі тварин для проведення всіх серологічних досліджень реагентів; виділення лейкоцитів з периферичної крові корів; послідовні аналізуючи абсорбції кожної сироватки лейкоцитами, що виділені з крові не менш, чим п'яти тварин; перевірку кожної сироватки на раніш заготовленій стандартній панелі з урахуванням, по можливості, як негативного контролю лейкоцитів донора (конфронтація). Перевірку сироваток на наявність-відсутність імунних антитіл проводили з використанням лімфоцитотоксичного тесту. Всього за три роки роботи методом класичних імунізацій у лабораторії було отримано 31 антилейкоцитарних поліспецифічних сироваток з титром антитіл у межах 1:4 та 1:64. З них одинадцять сироваток-реагентів є моноспецифічними, котрі брали участь у наукових дослідженнях протягом 1997-2000рр.
Вивчення антигенів BoLA-системи у здорових та хворих на хронічний лімфолейкоз тварин
Проведено дослідження розподілу антигенів та генів BoLА-системи у здорових та хворих на ХЛЛ тварин двох порід: чорно-рябої голштинської та червоно-рябої голштинської.
Табл. 1 Основні біометричні показники антигенів гістосумісності, що виявляються у зв'язку із захворюваністю на ХЛЛ у чорно-рябої
голштинської породи
Антигени W Частота антигену F Частота гена p Критерій відповідності чІ Ступінь ризику RR Етіологічна фракція EF Атрибутивний ризик д
1 2 3 4 5 6 7
W2 0,163 0,085 **8,700 0,267 –0,106 –0,203
W6 0,092 0,047 *4,656 2,470 0,062 0,088
W8 0,085 0,043 3,789 2,366 0,049 0,075
W21 0,201 0,106 0,841 1,345 0,049 0,062
W10 0,226 0,120 *5,967 2,139 0,091 0,158
W20 0,201 0,106 ***21,605 0,089 –0,206 –0,381
W31 0,173 0,091 0,166 1,155 0,015 0,025
W44 0,102 0,053 0,313 1,308 –0,011 0,022
W14 0,251 0,134 *5,126 2,051 0,036 0,142
W19 0,191 0,100 *4,740 2,127 0,039 0,118
W15 0,219 0,116 0,339 1,212 0,004 0,039
Примітка. Значення з символом * є вірогідними на рівні: *P <0,05; **P<0,01; *** P<0,001
На основі серологічних, гематологічних та гістологічних досліджень у популяції відокремлювали три групи:
1-група: здорові тварини з РИД(-)-аналізом;
2-група: вірусоносії з РИД(+)-аналізом;
3-група: хворі на ХЛЛ тварини (РИД+, ГЕМ+);
Групу стійких тварин складали корови віком від 5 років з РИД(-)-аналізом, які не хворіли на ХЛЛ протягом усіх лактацій. Вважали, що в цьому випадку тварини є несприйнятливими до ХЛЛ.
При порівнянні спектра лімфоцитарних антигенів гістосумісності серед сприйнятливих та резистентних тварин чорно-рябої голштинської худоби виявлено такі асоціативні зв'язки між захворюваністю на ХЛЛ та антигенами BoLA (табл.1):
W14 (RR=2,051; чІ=5,126; P<0,05; д=0,142),
W10 (RR=2,139; чІ=5,967; P<0,05; д=0,158),
W19 (RR=2,127; чІ=4,740; P<0,05; д=0,118),
W6 (RR=2,470; чІ= 4,656; P<0,05; д=0,088).?ри аналізі основних біометричних показників для червоно-рябої голштинської худоби було визначено, що за своїм впливом на сприйнятливість до ХЛЛ антигени розташувались у такому порядку (табл.2):
W6 (RR=3,309; чІ=8,122; P<0,01; EF=0,107; д=0,215);
W21 (RR=2,957; чІ=5,433; P<0,05; EF=0,056; д=0,153);
W10 (RR=2,931; чІ=5,856; P<0,05; EF=0,064; д=0,169);
W14 (RR=2,626; чІ=5,614; P<0,05; EF=0,114; д=0,191).
Табл. 2 Основні біометричні показники антигенів гістосумісності, що виявляються у зв'язку із захворюваністю на ХЛЛ у тварин червоно-рябої
голштинської породи
Антигени BоLA W Частота антигену f Частота гена p Критерій відповідності чІ Ступінь ризику RR Етіологічна фракція EF Атрибутивний риск д
1 2 3 4 5 6 7
W2 0,126 0,065 2,031 2,121 0,032 0,081
W6 0,225 0,120 **8,122 3,309 0,107 0,215
W8 0,318 0,174 1,841 0,611 –0,015 –0,196
W21 0,185 0,097 *5,433 2,957 0,056 0,153
W10 0,205 0,109 *5,856 2,931 0,064 0,169
W20 0,225 0,120 0,407 1,293 0,040 0,058
W31 0,252 0,135 *5,972 0,350 –0,131 –0,286
W44 0,179 0,094 0,310 1,293 0,001 0,041
W14 0,219 0,116 *5,617 2,626 0,114 0,191
W19 0,258 0,139 0,334 1,244 0,067 0,060
W15 0,192 0,101 3,236 2,233 0,048 0,127
Примітка. Символом * показані значення, що є вірогідними на рівні: *P <0,05; **P<0,01.
Порівняльний аналіз біометричних показників, які характеризують розподіл антигенів у популяції, проведено на основі оцінки ступеня вірогідності альтернатив, що спостерігаються. Такою альтернативою вважається наявність-відсутність антигену в стійких або сприйнятливих тварин. Оцінка вірогідності прояву антигена виробляється на підставі отриманих частот. Отже, випадковість чи дійсність розподілу антигенів, що спостерігається при альтернативній різноманітності характеризують за критерієм ?І: P<0,05- чІі3.8; для P<0,01 - ?Іі6.6; для P<0,001- ?Іі10,8.
Біологічний зміст відносного ризику (RR) полягає у розвитку захворювання у тварин, що мають даний антиген, по відношенню до тварин, що не мають його. При значенні RR<0,5 захисна роль антигена вважається значущою. Тому, чим менша величина відносного ризику, тим вище “захисна” роль даного антигену. У чорно-рябої голштинської худоби найвище значення відносного ризику належить антигену W6 (RR=2,470); далі йдуть W8 (RR=2,366); W10 (RR=2,139); W19 (RR=2,127); W14 (RR=2,051). Мінімальне значення цього показника у антигенів W2 (RR=0,267); W20(RR=0,089), що дозволяє прогнозувати резистентність до ХЛЛ .
У популяції червоно-рябої голштинської худоби за критерієм відносного ризику RR BoLА-антигени розташувались у порядку, що відповідає зростанню “захисної” ролі антигена:
W6 (RR = 3,309),W21 (RR= 2, 957),
W10 (RR = 2,931),W14 (RR = 2,626),
W15 (RR = 2,233),W8 (RR = 0,611).
W31 (RR = 0,350)
Атрибутивний ризик є зростаючою функцією, як відносного ризику, так і частоти фактора ризику в популяції, і тому біологічний зміст атрибутивного ризику полягає в тому, що його величина визначає який з антигенів, асоційованих із захворюванням, має найбільший генетичний зв'язок з ним. Високе значення атрибутивного ризику вказує на більш тісний зв'язок захворювання з “disease”-аллелем. Негативне значення атрибутивного ризику вказує на те, що частота антигену серед хворих тварин менше, ніж серед здорових.
Найвище значення атрибутивного ризику у чорно-рябої голштинської худоби мав антиген W10 (?=0,158), далі, в порядку зменшення - антигени W14 (?=0,142) та W6 (?=0,118). Група з шести антигенів має значення атрибутивного ризику у межах 0,022-0,088. Найбільш слабкий зв'язок між захворюванням та “disease”-аллелем визначено для антигенів W20 (d= -0,381), W2 (d= -0,203). У стаді червоно-рябих голштинів два антигени мають найбільше значення атрибутивного ризику: W6 (d=0,215) та W14 (d=0,191 відповідно). Антигени W31 і W8 виділяються негативним показником цієї величини (d= -0,286 та d= -0,196 відповідно).
Проведений аналіз показав, що серед спектра можна виділити кілька антигенів, що найбільш тісно пов'язані із захворюваністю на ХЛЛ. У випадку, коли із захворюванням асоціюється кілька антигенів пропонується використовувати поняття етіологічної фракції (EF). Величина EF показує ту частину хворих тварин, у яких сприйнятливість до захворювання пов'язана з наявністю певного антигена ГКГС. Чим частіше визначається антиген у сприйнятливих тварин при постійній частоті цього антигена в популяції, тим вагомішою є асоціація захворювання-антиген-захворювання. Тому, навіть рідкісний для популяції антиген може характеризуватись сильною асоціацією у тому випадку, якщо він часто виявляється серед сприйнятливих тварин.
Етіологічна фракція у популяції чорно-рябої голштинської худоби складала:
W10 (EF=0,091), W6 (EF=0,062), W20 (EF=-0,381),
W8 (EF=0,049), W21 (EF=0,049), W2 (EF=-0,106),
W19 (EF=0,039), W14 (EF=0,036), W44 (EF=-0,011).
У худоби червоно-рябої породи, найвище значення етіологічної фракції визначено для антигенів W14 (EF=0,114), W6(EF=0,107). Негативне значення виявлено для антигенів W31 (EF=-0,131), W8 (EF= -0,015).
На основі вищевикладеного можна зробити висновок, що у стаді чорно-рябої
голштинської худоби антиген W10 знаходиться в найбільш тісному зв'язку з “disease”- алелем, а антигени BoLA W6, W8 та W19 розташовані в порядку зменшення сили зв'язку. Сприятливе для резистентності статистичне значення мали антигени BoLA W20, W2.
У популяції червоно-рябої голштинської породи маркером сприйнятливості є антиген W6, а також, в порядку зменшення впливу, антигени BoLА W21, W10, W14. Маркером резистентності встановлено антиген W31.
Проведені дослідження підтверджують доцільність селекції худоби на резистентність до цього захворювання у осередках тривалого несприятливого стану у господарстві(рис. 1).
Обстеження груп тварин за лімфоцитарними антигенами BoLА-системи
Корови віком від 6р. Молоді тварини Бугаї-плідники Тварини РІД+ Тварини РІД+, ГЕМ+
Племінне стадо (на основі маркерних антигенів) Товарне стадо (на основі маркерних антигенів) Вибраковка (за діагнозом)
Рис.1 Селекційно-генетичні заходи за результатами BоLA-типування
тварин
Ці заходи мають наступні етапи:
- оцінка груп худоби за стійкістю до ХЛЛ, що проводиться за результатами тестування по антигенах BoLА-системи;
- оцінка плідників за стійкістю дочок до ХЛЛ на основі BoLА-типування;
- вибраковка (або виранжування) нащадків від нестійких до ХЛЛ корів;
- припинення племінного використання нестійких до ХЛЛ ліній, родин та гілок ВРХ.
Поширення BoLA-антигенів по групах мати-дочка
Стійкість тварин до хвороб у значній мірі залежить від методу підбору батьків. Ґрунтуючись на літературних джерелах, де наведено дані про високий рівень батьківського впливу на стійкість та сприйнятливість до ХЛЛ та високий коефіцієнт спадковості у системі батько-дочка, ми провели вивчення рівня материнського впливу на стійкість-сприйнятливість до ХЛЛ. Порівняння частот поширення антигенів та контролюючих їх генів по групах мати-дочка у різних альтернативних групах стійкі-сприйнятливі показало, що значення f та p характеризуються широким спектром. У дочок (за винятком третьої групи) відбулося накопичення “сприятливого” антигену W20, що впливає на підвищення резистентності корів до ХЛЛ. Елімінація “несприятливих” антигенів (W6, W10, W19) спостерігалася лише у четвертій групі, а в третій групі виявлено значне накопичення у дочок тих же антигенів. Результати порівняння їх між собою дозволили виявити прямий взаємозв'язок у спадковості антигена між матір'ю і дочкою тільки для W19. Для інших антигенів такої залежності не спостерігалося.
Розподіл антигенів BоLA-системи в популяції тварин
у залежності від віку
Досліджуючи розподіл антигенів BоLA-системи великої рогатої худоби у різних вікових групах тварин, ми визначили зміни в експресії антигенів, які спостеріга-
Табл. 3 Розподіл антигенів BоLA-системи серед корів різних вікових груп, здорових та хворих на лейкоз
Антигени BоLA W Здорові тварини Хворі тварини чІ 2,4 чІ 3,5
2-4рр 5-7рр. 2-4рр 5-7рр.
1 2 3 4 5 6 7
W2 0,091 0,043 0,158 0,154 0,526 0,191
W6 0,114 0,130 0,211 0,385 0,227 0,599
W8 0,477 0,348 0,421 0,308 0,100 0,441
W21 0,114 0,087 0,158 0,308 0,388 1,273
W10 0,091 0,130 0,316 0,000 2,752 3,346
W20 0,136 0,435 0,263 0,231 0,963 0,643
W31 0,341 0,304 0,105 0,154 2,427 0,715
W44 0,114 0,261 0,158 0,154 0,003 0,448
W14 0,114 0,087 0,368 0,385 *5,461 3,742
W19 0,182 0,348 0,368 0,231 1,215 0,078
W15 0,091 0,217 0,211 0,308 0,254 0,208
Примітка: символом * показані значення, які є вірогідними на рівні *P <0,05.
ються як в групах тварин із захворюваннями, так і в стаді взагалі. Проведено розподіл антигенів BоLA 1-го класу в популяції (табл. 3).
тварин голштинського червоно-рябої худоби у різних вікових групах, а також з урахуванням захворюваності на лейкоз. Аналіз показників у різних вікових групах тварин з урахуванням захворюваності на ХЛЛ привів до висновку, що зміни у експресії антигенів пов'язані як з віком, так і з сприйнятливістю до захворювання. Відмінності у частоті антигенів BоLA W8, W10, W15 визначено у різних вікових групах, тоді як різниця в експресії антигенів BоLA W14 (P<0,05), W6, W21 виявляється у зв'язку із сприйнятливістю до захворювання лейкозом. Маркерні антигені зберегли своє вплив в популяції.
Дослідження генетичних маркерів BoLА-системи великої рогатої худоби в зв'язку із захворюваннями, які супроводжуються лейкемоїдними реакціями
Виявлення позитивних асоціацій у багатьох дослідженнях між лейкозами, захворюваннями з лейкемоїдними симптомами та певними антигенами BoLА-системи, дозволяє вважати ці патології BoLА-залежними захворюваннями.
Проведено дослідження поголів'я голштинської чорно-рябої худоби з двох господарств Харківської та Бєлгородської області із приблизно однаковою частотою антигенів ГКГС (табл. 4)
Табл. 4 Спектр антигенів у популяції голштинської чорно-рябої худоби в зв'язку з резистентністю або сприйнятливістю до ХЛЛ та захворювань з лейкемоїдними реакціями
Антигени BоLA Частота антигену Лейкоз Мастит Ендометрит
W f чІ RR чІ RR чІ RR
W2 0,167 *3,816 0,365 1,440 0,636 0,469 0,713
W6 0,118 0,532 1,351 1,513 1,542 *7,830 2,927
W8 0,109 0,255 1,246 *5,469 2,196 2,143 1,904
W21 0,189 1,074 1,425 *6,913 0,328 0,074 1,119
W10 0,268 0,245 1,170 *5,030 1,806 0,030 0,936
W20 0,204 **10,473 0,132 *8,449 0,295 *6,105 0,194
W31 0,185 0,110 1,005 0,142 1,127 1,460 1,593
W44 0,103 0,072 0,876 1,277 0,578 0,293 1,313
W14 0,285 0,017 0,958 0,524 1,217 0,104 1,124
W19 0,161 1,698 1,583 *9,682 0,185 2,225 0,411
W15 0,273 0,780 0,738 *4,581 1,757 *4,072 1,980
Примітка. Символом * показані значення, які є вірогідними на рівні: *P <0,05; **P<0,01.
При аналізі різниці у частоті поширеності лімфоцитарних антигенів 1-го класу ГКГС, тварин розділили на три групи:
1 - позитивні за гематологією на лейкоз;
2 - хворі на мастит;
3 - хворі на ендометрит.
У першій групі тварин маркером стійкості до ХЛЛ на вірогідному рівні виявлені BoLА-антигени W20 (RR=0,132; ?І=10,473; P<0,01;), W2 (RR=0,365; чІ=3,816; P<0,05), ?кі сприяють несприйнятливості до ХЛЛ у даній вибірці тварин. У групі тварин хворих на мастит відзначається перевага BoLА W8 (RR=2,196; ?І=5,496; P<0,05), W10 (RR=1,806; чІ=5,030; P<0,05), W15 (RR=1,757; чІ=4,581; P<0,05) ?нтигенів. Серед тварин, які мали при обстеженні негативний діагноз на мастит, переважно визначаються BoLА W19(RR=0,185; ?І=9,682; P<0,01), W20 (RR=0,295; чІ=8,444; P<0,01), W21(RR=0,328; чІ=6,913; P<0,01) ?нтигени.
При обстеженні тварин хворих на ендометрит чітко просліджується перевага BoLА W6 (RR=2,927; ?І=7,830; P<0,01), W15 (RR=1,980; чІ=4,072; P<0,05) ?нтигенів. Стійкість, що вірогідно пов'язана з BoLА W20 (RR=0,194; ?І=6,105; P<0,05). ?аким чином, при обстеженні тварин по BoLА-системі з урахуванням трьох патологій, які супроводжуються лейкемоїдними реакціями, резистентність до всіх досліджених захворювань вірогідно підтверджується по BoLА W20 антигену.
Антигену, який обумовлює сприйнятливість відразу до усіх згаданих захворювань, у дослідженнях не знайдено. Слід відзначити, що антиген BoLА W15 обумовлює сприйнятливість тварин до маститу та ендометриту, цей антиген може бути показником схильності тварин до даних захворювань у цьому стаді.
Характеристика тварин за антигенами класу 1 BoLА-системи серед різних порід великої рогатої худоби
Ми вивчили генетичний поліморфізм за лімфоцитарними антигенами 1 класу BoLА системи в чотирьох породах п'яти господарств по п'яти областях України.
Всього досліджено 311 голів великої рогатої худоби. З них 133 голови української червоно-рябої породи з двох господарств: Чернігівська обл. - ГПЗ “Світ” та Вінницька обл. - ГПЗ “Україна”; 77 голів симентальської породи - ГПЗ “Червоний велетень” Харківської обл.; 51 голова української чорно-рябої породи з ГПЗ “ Велика бурімка” Черкаської обл.; 50 голів швіцької та голштинської породи ГПЗ “Михайлівка” Сумської обл. По всіх господарствах досліджувалися тварини без урахування захворюваності на лейкоз. Усі тварини пройшли типування за 11 лімфоцитарними антигенами 1-го класу ГКГС, що підтверджені на стандартній панелі сироваток-реагентів.
Серед тварин симентальської породи ГПЗ “Червоний велетень” Харківської обл. частота антигенів гістосумісності коливалась від 0,117 до 0,545. Взагалі, частота поширеного антигена W2 та W6, що зустрічається рідко, відрізняється майже у чотири рази. Висока частота у симентальської худоби W2 (f=0,545; p=0,326), W10 (f=0,403; p=0,227), W19 (f=0,325; p=0,178) антигенів. Кожен з цих антигенів зустрічається більш ніж у 30% обстежених тварин.
Відносно низька частота W31 (f=0,117; p=0,060), W6 (f=0,117; p=0,060), W44(f=0,130; p=0,067) антигенів, вони зустрічаються у 15-20% тварин. Інші 4 антигени характеризуються середньою для даної популяції частотою поширення. У червоно-рябої молочної породи фенотип BoLА W14, W2, W10, W44 був представлений найбільшою частотою антигена у межах f=0,258-0,311 та частотою гена p=0,138-0,170. Приблизно однаковою частотою характеризувались антигени BoLА W31, W20 (f=0,078-0,118; p=0,040-0,61). Слід зазначити, що загальна маса антигенів BoLА варіює у невеликих частотних межах (f=0,157-0,294; p=0,082-0,160).При аналізі частоти антигенів BoLА у тварин швіцької породи виявлено, що найбільше поширення одержали антигени BoLА W6, W31, W44, W15 з частотою антигена (f=0,300-0,420), та частотою гена (p=0,163-0,238). Рідко спостерігалися два антигени BoLА W2, W10 (f=0,040; p=0,020). Антиген BoLА W10, звичайно розповсюджений серед інших досліджених порід, у даному стаді взагалі відсутній. Імуногенетичне визначення антигенів спектра головного комплексу гістосумісності та вивчення розподілу антигенів серед різних порідних генеалогічних груп надає можливості розробити нові підходи у селекції тварин з генетичними детермінантами системи BoLА.
Створення банка даних та обробка експериментального матеріалу на базі персонального комп'ютера IBM PC
При аналізі великих масивів даних тварин, що находяться у різних господарствах, дослідник має певні труднощі з урахування зібраних матеріалів та швидкої їх статистичної обробки. Тому, щоб дані досліджень по BoLА-типуванню могли бути використаними при селекційній роботі, дуже важливо, щоб розроблена програма по збереженню і статистичній обробці даних була складена на базі інших готових програм, якими користуються зоотехніки-селекціонери. Всім цим вимогам відповідає розроблена нами програма по створенню банка даних і обробці експериментального матеріалу “BoLА-тест”, що входить у програмне забезпечення АРМЕКС (Автоматизоване робоче місце експериментатора-селекціонера). Функціональна модель формування вибірок забезпечує наступні можливості:
1.Вибірка тварин по господарствах;
2. Вибірка тварин по захворюваннях;
3. Вибірка позначених тварин;
4. Вибірка по господарству і захворюванню;
5. Вибірка по породі;
6. Вибірка по породі і захворюванню.
Передбачена можливість редагування BoLА-тестів в межах сформованої вибірки, пошук тварини, листання екрану.
ВИСНОВКИ
1.У популяції великої рогатої худоби голштинської чорно-рябої породи найбільше поширення мають антигени класу 1 BoLA-системи: W14, W10, W15, W20, W21. У популяції тварин червоно-рябої голштинської породи висока частота антигенів BoLА W8, W19, W31, W20, W6. У симентальської худоби-W2, W10, W19. У популяції української червоно-рябої молочної породи-W14, W44 ,W10 ,W2; української чорно-рябої молочні породи-W10, W14, W19. У тварин швіцької породи-W6, W31, W44.
Найбільше рідкими у популяції голштинської чорно-рябої худоби є антигени W8, W6, W44, у червоно-рябої голштинської худоби - антигени BoLА W2, W44, W21, W15; у симентальської худоби-W6, W31, у популяції української червоно-рябої молочної породи - W19, W6; української чорно-рябої молочної породи - W31, у тварин швіцької породи - W10, W2.
2.Вивчення BoLА-спектру дозволило знайти антигени, для яких розбіжність частот поширення у групах резистентних та сприйнятливих тварин виявлена на вірогідному рівні: W10, W19, W14, W6 (P<0,05); W2 (P<0,01); и W20 (P<0,001) для голштинської чорно-рябої худоби та W21, W10, W31, W14 (P<0,05); W6 (P<0,01) для голштинської червоно-рябої худоби.
3.На основі використання статистичних методів дослідження, антигени BoLA-системи у групах чорно-рябої голштинської худоби розподілені на “сприятливі” - W20, W2 та “несприятливі” - W10, W6, W19. “Сприятливим” антигеном у тварин червоно-рябої голштинської породи виявлено BoLА W31; “несприятливими” антигенами визначено W6, W14, W21.
4. У групі резистентних тварин спостерігається консолідація антигенів W20, W2 та W31 (“сприятливих”), які нейтралізують дію “несприятливих” антигенів, що може використовуватись у селекції цих порід на резистентність до ХЛЛ.
5.Наявність у фенотипі тварин голштинської чорно-рябої худоби антигену BoLА W20 позитивно впливає на стійкість до захворювань з лейкемоїдними симптомами (мастит, ендометрит).
6.Аналіз досліджень у різних вікових групах тварин червоно-рябої голштинської породи з урахуванням захворюваності на ХЛЛ показав, що відмінності у частоті поширення BоLA-антигенів W8, W10, W15 пов'язані з віковими змінами, а різниця у експресії антигенів BоLA W14, W6, W21 із сприйнятливістю до захворювання лейкозом.
7. Розроблена нами програма BoLА-тест, яка входить до пакету програм АРМЕКС, дозволяє створити базу даних тварин за результатами BoLА-типування та швидко проводити аналіз отриманих результатів з урахуванням зоотехнічних та ветеринарних показників.
РЕКОМЕНДАЦІЇ ВИРОБНИЦТВУ
1.Для підвищення ефективності селекційно-племінної роботи, спрямованої на створення стад великої рогатої худоби, стійкої до ХЛЛ (маститу, ендометриту), у конкретних господарствах при виконанні селекційних програм по розведенню використовувати корів та, за можливістю, бугаїв-плідників, які мають у своєму фенотипі лімфоцитарні антигени ГКГС W20, W2 - у групах чорно-рябої голштинської худоби та W31 - у тварин червоно-рябої голштинської породи.
2.Результати досліджень за BоLA-антигенами бугаїв-плідників, а також племінних тварин варто оформляти у виді машинних каталогів та направляти їх у держплемоб'єднання, селекційні центри, ради по породах і племінні заводи для використання у подальшому при удосконаленні існуючих та створенні нових порід, породних груп тварин у якості об'єктивного критерію контролю їх генетичної гетерогенності.
3.Матеріали експериментальних досліджень, викладені у поданій дисертації, доцільно включити в програму навчального курсу ветеринарних та зоотехнічних фахівців.
Список основних публікацій за темою дисертації
1.Івашура А.А. Роль BоLA-системи у генетичному контролі резистентності до хронічного лимфолейкозу місцевої популяції чорно-рябої худоби // Науково-технічний бюлетень - 1998 - №73 - Інституту тваринництва - Харків-1998. - С.30-32.
2.Россоха В.І., Івашура А.А., Орлова А.Р., Павленко С.П. Вплив материнського успадкування в зв'язку зі стійкістю-сприйнятливістю до хронічного лімфолейкозу (ХЛЛ) великої рогатої худоби. // Проблеми зооінженерії та ветеринарної медицини - 1998 - Випуск3 - Харківський зооветеринарний інститут - Харків.-1998 - С.48-49.
3.Россоха В.І., Тур Г.М., Ворошина Т.Л., Іванова Н.В., Фастівець Б.І., Довганюк О.П., Івашура А.А. Генетичні аспекти удосконалення селекційного процесу в популяціях сільськогосподарських тварин // Збірник наукових праць до 70-річчя з дня заснування Інституту тваринництва УААН-вип ХХХХ-Харків- 1999 - С.8-15
4.Россоха В. І., Івашура А. А. Характеристика тварин за антигенами класса1 BоLA-системі, середи різних порід великої рогатої худоби. // Науково-технічний бюлетень - 2000 - №78 - Інститут тваринництва - Харків-2000 - С.79-81.
5.Івашура А.А Дослідження генетичних маркерів BоLA-системи великої рогатої худоби в зв'язку з захворюваннями, що супроводжуються лейкемоїдними реакціями // Вісник Сумського Державного Аграрного Університету – Спеціальний випуск до міжнародної науково-практичної конференції “Перспективи розвитку скотарства у третьому тисячолітті” 2-5 жовтня – Суми – 2001 – С.80-83.
6.Івашура А.А., Россоха В.І., Слепченко А.Р. Резистентність до хронічного лимфолейкозу великої рогатої худоби у зв'язку з лимфоцитарними антигенами (BоLA) // Тези доповідей другої міжнародної науково-практичної конференції “Молекулярно-генетичні маркері тварин” 15-17 травня – Київ – 1996 – С.56-57.
7. Івашура А.А. Резистентність до хронічного лимфолейкозу великої рогатої худоби у зв'язку з лимфоцитарними антигенами (BоLA) // Тези доповідей другої міжнародної науково-практичної конференції “Проблеми сільськогосподарського виробництва на сучасному етапі та путі їх рішення ” – Бєлгород – 1998 – С.52-53.
Івашура А.А. Генетичний поліморфізм лімфоцитарних антигенів та можливість їх використання у селекції на резистентність до хронічного лімфолейкозу великої рогатої худоби. – Рукопис.
Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата сільскогосподарьских наук за спеціальністю 06.02.01 – розведення та селекція тварин. – Інститут тваринництва УААН, м. Харків, 2001.
У роботі викладені результати дослідження великої рогатої худоби за лімфоцитарними антигенами ГКГС у зв'язку із захворюваністю на хронічний лімфолейкоз. На основі статистичного аналізу розподілу BoLA- антигенів у резистентних та хворих на ХЛЛ тварин виявлено маркерні антигени. У голштинської чорно-рябої худоби “сприятливі” антигени - W20, W2; у червоно-рябої голштинської – W31. Резистентні тварини характеризувалися консолідацією “сприятливих” антигенів W20, W2 та W31, наявність W20 також позитивно впливала на резистентність до захворювань з лейкемоїдними симптомами. Проведено BoLA- тестування 6 порід великої рогатої худоби. Запропоновано систему селекційно-генетичних заходів з використанням BoLA- типування для створення стада тварин, резистентних до ХЛЛ.
Ключові слова: лімфоцитарні антигени, велика рогата худоба, хронічний лімфолейкоз, селекція, резистентність, захворюваність, сироватка, головний комплекс гістосумісності.
Ивашура А.А. Генетический полиморфизм лимфоцитарных антигенов и возможность их использования в селекции на резистентность к хроническому лимфолейкозу крупного рогатого скота. – Рукопись.
Диссертация на соискание ученой степени кандидата сельскохозяйственных наук по специальности 06.02.01 – разведение и селекция животных. – Институт животноводства УААН, г. Харьков, 2001.
Диссертационная работа посвящена использованию лимфоцитарных антигенов ГКГС в селекции сельскохозяйственных животных. В работе изложены результаты исследования корреляции антигенов главного комплекса гистосовместимости с ХЛЛ у крупного рогатого скота и изучение возможности их использования в практических целях при создании селекционно-генетических программ для оздоровления хозяйств. Изучение BoLA-спектра позволило обнаружить антигены, для которых расхождение частот распространения в группе резистентных и восприимчивых животных является достоверной: W10, W19, W14, W6 (P<0,05); W2 (P<0,01); и W20 (P<0,001) - для голштинского черно-пестрого скота и W21, W10, W31, W14 (P<0,05); W6 (P<0,01) - для голштинского красно-пестрого скота. На основе использования статистических методов исследования, антигены BoLA-системы в группах черно-пестрого голштинского скота распределены на "благоприятные" - W20, W2 и "неблагоприятные" - W10, W6, W19. "Благоприятным" антигеном у животных красно-пестрой голштинской породы выявлен антиген BoLА W31 и "неблагоприятными" - антигены W6, W14, W21. В группе резистентных животных наблюдается консолидация антигенов W20, W2 и W31 ("благоприятных"), которые перекрывают действие "неблагоприятных" антигенов, что может быть использовано в селекции этих пород на устойчивость к ХЛЛ. Наличие в фенотипе животных голштинского черно-пестрого скота антигена BoLА W20 положительно влияет на устойчивость к заболеваниям с выраженными лейкемоидными симптомами (мастит, эндометрит). Анализ исследований в различных возрастных группах животных красно-пестрой голштинской породы с учетом заболеваемости ХЛЛ показал, что отличия в частоте BоLA-антигенов W8, W10, W15 связаны с возрастными изменениями, а разница в экспрессии антигенов BоLA W14, W6, W21 - с восприимчивостью к заболеванию лейкозом. Исследования подтверждают целесообразность селекции скота на устойчивость к этому заболеванию в хозяйствах, где ХЛЛ выявляется у большей части поголовья. Селекционно-генетические мероприятия сводятся к следующему: оценка групп скота по устойчивости к ХЛЛ (проводится по результатам тестирования по антигенам BoLА-системы); оценка производителей по устойчивости дочерей к ХЛЛ (на основе результатов типирования по антигенам BoLА-системы); выбраковка (или выранжировка) потомства неустойчивых к ХЛЛ коров; прекращение племенного использования неустойчивых к ХЛЛ линий, семейств и ветвей крупного рогатого скота.
Ключевые слова: лимфоцитарные антигены, крупный рогатый скот, селекция, хронический лимфолейкоз, резистентность, заболеваемость, сыворотка, главный комплекс гистосовместимости.
Ivashura A.A. Genetic polymorphism of lymphocyte antigens and the possibility of using in selection on resistance to chronic lympoleukosis. – Manuscript.
Dissertation for degree Agricultural sciences candidate competition in specialty 06.02.01 –animal breeding and selection. –Institute of Animal Science of UAAS, Kharkov,2001.
The dissertation is devoted to investigations of cattle using the lymphocyte antigens and relationship between BoLA-antigens and sick rate of chronic lympholeukosis. Marker antigens were determined on the base of distribution analysis of BoLA -phenotype in resistant and sick animals. In Holstein Black-and-White breed the “favorable” antigens were W20, W2, in Holstein Red-and-White the same antigen was W31. Resistant animals were characterized by consolidation of several “favorable” antigens; W20, W2 and W31, presence of W20 have positive influence for resistance to diseases with
