НАЦIОНАЛЬНА АКАДЕМIЯ НАУK УКРАЇНИ
НАЦIОНАЛЬНА АКАДЕМIЯ НАУK УКРАЇНИ
IНСТИТУТ МIКРОБIОЛОГIЇ І ВIРУСОЛОГIЇ iм. Д.К. ЗАБОЛОТНОГО
ЖОЛОБАК Надiя Михайлiвна
УДК 578.23+578.24.001.4
IНТЕРФЕРОНОГЕННА ТА АНТИВІРУСНА ДIЯ
МОЛЕКУЛЯРНИХ КОМПЛЕКСIВ ОДНОЛАНЦЮГОВА РНК — ТИЛОРОН
03.00.06 — вiрусологiя
А в т о р е ф е р а т
дисертації на здобуття наукового ступеня
кандидата бiологiчних наук
К И Ї В — 2 0 0 1
Дисертацією є рукопис.
Робота виконана у відділі проблем інтерферону та імуномодуляторів Iнституту мікробіології і вірусології ім.Д.К.Заболотного Національної академії наук України.
Науковий керівник: доктор біологічних наук, професор
Співак Микола Якович,
Інститут мікробіології і вірусології ім. Д.К. Заболотного НАН України, завідувач відділу проблем інтерферону та імуномодуляторів.
Офіційні опоненти:
доктор біологічних наук, професор Менджул Михайло Іванович, Інститут мікробіології і вірусології ім. Д.К. Заболотного НАН України, завідувач відділу вірусів водоростей;
доктор біологічних наук, старший науковий співробітник, Швед Анатолій Давидович, Інститут молекулярної біології та генетики НАН України, завідувач відділу молекулярної вірусології.
Провідна установа: Національний медичний університет ім.О.О.Богомольця, кафедра мікробіології, вірусології та імунології, Міністерство охорони здоров’я України, м. Київ.
Захист дисертації відбудеться “ 23 ” травня 2001р. о 1000 год. на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.233.01 в Інституті мікробілогії і вірусології ім.Д.К.Заболотного НАН України за адресою: 03143, м.Київ, вул.Заболотного, 154.
З дисертацією можна ознайомитися у бібліотеці Iнституту мікробіології та вірусології ім.Д.К.Заболотного НАН України за адресою: 03143, м.Київ, вул.Заболотного, 154.
Автореферат розісланий “20 ” квітня 2001 р.
Вчений секретар
спеціалізованої вченої ради,
канд.біол.наук Пуріш Л.М.
ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ
Актуальність теми. Розробка ефективних засобів профілактики та лікування вірусних інфекцій і на сьогодні залишається надзвичайно актуальною.
Багаторічний досвід клінічного використання препаратів інтерферонів (ІФН), котрі є представниками численного сімейства цитокінів i являють собою групу білків, яким притаманна противірусна, імуномодулююча та антипроліферативна дія, дозволив встановити їх значну ефективність для профілактики та лікування вірусних, бактеріальних і деяких онкологічних захворювань (Grossberg et al,1987; Ершов с соавт, 1998). Однак при цьому вказаним препаратам притаманні і досить суттєві недоліки та обмеження. Так, тривале введення препаратів ІФН в великих дозах викликало формування в організмі антиінтерферонових антитіл, що зводить нанівець ефект лікування (Porres et al, 1989, Bendtzen et al, 1994), а при передозуванні препаратів ІФН в клінічній практиці спостерігаються деякі небажані побічні ефекти (Bottomley, Toy, 1984; Ершов, 1998). Крім того, довготривалі курси лікування препаратами ІФН до цього часу залишаються надзвичайно дорогими.
В той же час знайдено цілий ряд різноманітних речовин-індукторів, які здатні мобілізувати клітинні можливості до продукції ІФН, тобто викликають в організмі продукцію власного ІФН і, таким чином, зникає необхідність введення екзогенного ІФН (Ершов, 1996). Індукторами ІФН І типу (ІФН-/) є віруси, природні дволанцюгові РНК (длРНК) різного походження та синтетичні дволанцюгові рибополінуклеотиди. Крім цього, здатність до індукції ІФН-/ притаманна також цілому ряду низькомолекулярних синтетичних сполук. Але і тут існує цілий ряд обмежень. Віруси, внаслідок інфекційності, не можуть використовуватися в медицині, як індуктори ІФН. Препарати інтерфероногенних длРНК і синтетичних дволанцюгових рибополінуклеотидів є відносно нестабільними при зберіганні і відзначаються досить високою вартістю. Низькомолекулярні синтетичні сполуки - індуктори ІФН, як правило, досить токсичні в інтерфероногенних концентраціях. Незважаючи на велику кількість досліджень в цій галузі (Дидковский с соавт, 1999), ні один з вивчених до цього часу інтерфероногенів не відповідає головним критеріям, що висуваються до них практикою, а саме: отримання досить значних і довготривалих рівнів концентрації ІФН в організмі (і в культурах клітин) при мінімальному рівні токсичності індуктора (Чижов с соавт, 1988).
Поглиблене вивчення відомих та створення і оцінка принципово нових індукторів ІФН, розробка оптимальних шляхів їх використання, а також вивчення шляхів антивірусного впливу досліджуваних речовин є актуальним напрямком сучасної вірусології, оскільки відкриває нові шляхи до встановлення механізму дії цитокінової системи інфікованого організму.
Виходячи з вищевказаного, вивчення речовин з антивірусною дією — препаратів молекулярних комплексів одноланцюгова РНК-тилорон — з точки зору як їх здатності індукувати інтерферон, так і можливості безпосередньо пригнічувати репродукцію вірусів, є перспективним напрямком сучасної медико-біологічної науки.
Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Робота відповідає плану науково-дослідних робіт Інституту мікробіології і вірусології ім. Д.К. Заболотного НАН України, виконувалась у відповідності з тематикою відділу проблем інтерферону та імуномодуляторів Інституту мікробіології і вірусології ім. Д.К. Заболотного НАН України, а також в межах наукової програми ДКНТ України 1993-1995 р.р. “Здоров’я людини”.
Мета і задачі дослідження. Мета роботи — встановити біологічні властивості принципово нових індукторів ІФН І типу (ІФН-/) на основі молекулярних комплексів одноланцюгова РНК — тилорон в умовах in vivo та in vitro, а також провести оцінку перспективності застосування згаданих комплексів як антивірусних препаратів. Для досягнення поставленої в роботі мети вирішувались такі задачі:
1.Дослідити інтерфероногенну дію молекулярних комплексів дріжджова РНК — тилорон в умовах in vivo та in vitro.
2.Вивчити цитотоксичну дію комплексів і оцінити перспективність їх застосування, як індукторів ІФН.
3.Вивчити противірусну дію комплексів дріжджова РНК — тилорон в дослідах in vitro в стандартних умовах.
4.Визначити вклад iндукованого комплексом дріжджова РНК — тилорон iнтерферону в антивірусний ефект препаратів молекулярних комплексів.
Наукова новизна одержаних результатів. Вперше продемонстрована здатність одноланцюгової дріжджової РНК в комплексі з тилороном до індукції ІФН як в організмі дослідних тварин, так і в культурах клітин людини та тварин. Детально вивчені кількісні та часові параметри цього процесу. Показано, що iндукований як in vivo, так i in vitro інтерферон належить до І типу (ІФН-/).
Виявлена здатність одноланцюгових гомополірибонуклеотидів poly (C), poly (U) при комплексоутворенні з тилороном викликати індукцію інтерферону в чутливих клітинах в умовах in vitro.
Визначені показники цитотоксичності комплексу дріжджова РНК - тилорон. Проведена оцінка перспективності застосування препарату комплексу як індуктора ІФН.
Встановлені технологічні характеристики препарату, шляхи збільшення продукції ІФН in vitro за допомогою праймінгу при застосуванні вказаного індуктору.
Встановлено, що препарат комплексу має значну противірусну дію. Виявлені значення хіміотерапевтичного індексу препарату, що дає змогу розглядати його, як перспективний противірусний агент. Детально досліджені можливості профілактичного та лікувального використання препарату. Вивчено вклад препарату комплексу і інтерферону, що індукується у відповідь на його введення, в явище пригнічення репродукції досліджуваних вірусів.
Практичне значення одержаних результатів. Розроблено і експериментально підтверджено принцип використання молекулярних комплексів дріжджової РНК з тилороном як перспективних індукторів ІФН І типу. Комплекси можуть бути застосовані при крупномасштабному виробництві ІФН-/ як достатньо активні та високотехнологічні індуктори.
Виявлені і підтверджені в дослідах інтерфероногенна та антивірусна ефективність обгрунтовують необхідність наступних етапів оцінки препаратів молекулярних комплексів дріжджової РНК — тилорон, які при задовільних результатах можуть бути основою для розробки і клінічного впровадження сімейства принципово нових противірусних препаратів широкого спектру дії.
Особистий внесок здобувача. Дослідження виконано з ініціативи автора та за її безпосередньою участю. Основний експериментальний матеріал одержано автором особисто. Дослідження проводилось у відділі проблем інтерферону та імуномодуляторів Інституту мікробілогії і вірусології НАН України.
В проведенні даних досліджень автор відштовхувалась від продемонстрованої в роботах пров.н.с. відділу проблем інтерферону та імуномодуляторів ІМВ НАН України, д.б.н. О.В.Карпова здатності одноланцюгових полірибонуклеотидів в комплексі з тилороном утворювати стабільні двоспіральні ділянки, які є головною умовою інтерфероніндукуючої дії РНК.
В оцінці активності інтерфероногенезу МНК крові людини та токсичної дії препаратів приймала участь докт. мед. наук С.Л.Рибалко (Київський науково-дослідний інститут епідеміології та інфекційних хвороб ім. Л.В. Громашевського МОЗ України). Консультативна допомога у вивченні антивірусної активності надана канд. біол. наук. Л.Д.Кривохатською (Київський науково-дослідний інститут отоларингології ім. О.С.Коломійченко МОЗ України).
Дослідження щодо отримання препаратів молекулярних комплексів з максимальною інтерфероногенною активністю, встановлення індексу ефективності інтерфероногенезу, вивчення можливості використання способу праймінгу для підвищення продукції інтерферону, визначення тривалості збереження інтерфероногенної активності в препаратах комплексу проведені автором самостійно.
Автором самостійно досліджено вплив молекулярних комплексів одноланцюгова РНК — тилорон на цитотоксичність рефeренс-вірусів, вивчена профілактична та терапевтична ефективність препаратів комплексів, віддиференційовано вклад препарату комплексу і інтерферону, що індукується у відповідь на його введення, в явище пригнічення репродукції досліджених вірусів.
Апробація результатів дисертації. Матеріали дисертації доповідались та публікувались на Всесоюзному симпозіумі за міжнародною участю “Імунодефіцити та алергія”, Москва, 1986; на виїздному пленумі проблемних комісій Наукової ради з мікробіології “Медична мікробіологія” та “Теоретична і прикладна інфекційна імунологія”, присвячених сучасним аспектам клінічного використання інтерферонов і інших імуномодуляторів, Київ, 1990; на І Установчому (VIII) з’їзді українського мікробіологічного товариства, Україна, Одеса, 1993; на Мжнародному Конгресі молодих вчених, Україна, Івано-Франківськ, 1995; на ІІ (IХ) з’їзді українського мікробіологічного товариства, Україна, Чернігів, 2000.
При виконанні досліджень у 1995 роцi за конкурсом автору присуджена стипендiя ДКНТ для молодих учених, у 1999 році робота “Інтерфероногенні, антивірусні та імуномодулюючі властивості нових індукторів інтерферону І типу” відзначена премією для молодих учених НАН України.
Публікації. Матерiали дисертацiйної роботи вiдображенi у 6 статтях в наукових фахових журналах та в 2 патентах України.
Обсяг і структура дисертації. Загальний обсяг роботи становить 142 сторінки машинописного тексту і складається із вступу, двох підрозділів огляду літератури, матеріалів та методів досліджень, експериментальної частини, яка включає виклад у шести розділах результатів роботи та їх обговорення з використанням 9 рисунків та 18 таблиць, висновків, списку літератури, який охоплює 232 найменування, з них 145 іноземні.
ОСНОВНИЙ ЗМIСТ
РОЗДІЛ 1. ОГЛЯД ЛІТЕРАТУРИ
У двох підрозділах викладено відомості про індуктори інтерферону І типу. Висвітлено сучасний рівень знань про шляхи встановлення противірусного стану в інфікованих клітинах. Детально розглянуто дані літератури про вплив інтерфероногенів при інфекціях вірусної етіології.
МАТЕРIАЛИ ТА МЕТОДИ ДОСЛIДЖЕНЬ
В роботі вивчали молекулярні комплекси (МК), до складу яких входив тилорон гідрохлорид (“Sigma”, США). Як другий компонент МК використовували гомополінуклеотиди poly (С), poly (U) (“Sigma”, США), чи комерційний препарат дріжджової РНК (рибосомальна фракція РНК дріжджів Saccarоmices cerevisiae) (НПО “Біохімреактив“, Олайна, Латвія). Цей препарат додатково очищали потрійною фенольною депротеїнізацією з подальшим осадженням етанолом згідно стандартної методики (Белозерский, 1970).
Як препарати порівняння використовували ларифан (лікувальна форма препарату дсРНК бактеріофагу f2) виробництва Інституту мікробіології ім. Августа Кірхенштейна, Латвія та poly(I)-poly(C) (“Calbiochem”, США). Як стандарт використовували офіцинальний препарат інтерферону людини — лаферон (IМБ НАН України), для інтерферону мишей — лабораторний стандартний препарат.
В вірусологічних дослідженнях використовували вiрус везикулярного стоматиту (ВВС), штам Iндiана, отриманий з музею НДI епiдемiологiї i мiкробiологiї iм.Н.Ф. Гамалеї (Москва), вірус енцефаломіокардиту мишей (ВЕМК), вірус венесуельського енцефаломієліту коней (ВВЕК, штам 230), отримані з музею Інституту ветеринарної медицини УААН.
Вивчення інтерферонідукуючої дії досліджуваних комплексів проводили на бiлих безпородних мишах масою 18 - 20 г.
Вивчення біологічних ефектів МК в умовах in vitro проводили на клітинах перевивної лiнії мишачих фiбробластiв — L929, що були люб’язно наданi к.б.н. Кривохатською Л.Д. (Iнститут отоларингологiї МОЗ України), культури клітин тестикул поросяти (ПТП), нирок ембріону свині (СНЕВ), отриманих з музею Інституту ветеринарної медицини УААН, які вирощували за стандартною методикою, та мононуклеарних клітин (МНК) крові людини І(0), що отримували з еритроцитарної маси (Кузнецов и др. 1978).
IФН in vivo iндукували, використовуючи рiзнi шляхи, різні дози введення МК, різне співвідношення його компонентів та визначали в сироватці крові рівень індукованого інтерферону (Ершов и др., 1987).
Для індукції інтерферону в умовах in vitro на моношар клітин чи в суспензію МНК крові людини І(0) вносили досліджувані інтерфероногени. В культуральному середовищі визначали рівень продукованого інтерферону (Ершов и др., 1988, Кузнецов и др., 1989).
Рівні індукованого iнтерферону визначали шляхом мiкротитрування в перевивнiй культурi чутливих клiтин (Анджапаридзе, 1978). За титр інтерферону приймали максимальне розведення препарату, що викликало захист від цитопатичної дії (ЦПД) вірусу. Як позитивний контроль використовували препарат інтерферону людини — лаферон (IМБ НАН України), для інтерферону мишей — лабораторний стандарт.
Динамічні показники продукції інтерферону під дією досліджуваних препаратів вивчали як in vivo, так і in vitro.
Цитотоксичнiсть МК вивчали in vitro на клiтинах культуральних лiнiй L929, ПТП, СНЕВ та на мононуклеарних клітинах кровi людини І(0) групи. Розрахунок ТЦД50 проводили за методом Ріда і Менча (Беленький, 1963). Параметри токсичності МК визначали за отриманими в досліді значеннями максимально витримуваної концентрації (МВК) та мінімально активної концентрації (МАК) (Вотяков, 1986).
Вплив МК на антивірусну резистентність культур клітин вивчали за допомогою мікрометоду скринінгу антивірусних сполук (Вотяков и др., 1986). Антивірусна дія МК досліджувалась за такими критеріями: 1)захист клітин від цитопатичної дії вірусів і 2)визначення рівнів інгібіції розмноження вірусу. Вивчалась ефективність препаратів за профілактичною (внесення в клітинні культури за 6 год до інфікування) та терапевтичною (внесення в клітинні культури через 1 год після їх інфікування) схемами.
Визначення вкладу препаратів МК чи інтерферону, що індукується під їх впливом, в явище антивірусної дії проводили шляхом паралельного внесення їх в культуру клітин за 1 год до інфікування досліджуваним вірусом. Через 24 год визначали титр вірусу. Інтерферон попередньо індукували в інтактній культурі клітин дозою препарату, яку використовували для вивчення антивірусної дії.
Результати дослiджень обробляли статистично за методом Бейлі (1962), використовуючи t-критерій Стьюдента для оцінки суттєвої відмінності показників. За статистично достовірні вважали відмінності, коли ймовірність випадковості у відмінності між показниками не перевищувала 0,05. Графiчно поданi результати обробленi за допомогою програми Excell 4.0.
РОЗДІЛ 3. IНТЕРФЕРОНОГЕННI ВЛАСТИВОСТI КОМПЛЕКСIВ ОДНОЛАНЦЮГОВА РНК — ТИЛОРОН
Перший етап дослідження інтерфероногенних властивостей речовин, що вивчалися в даній роботі, полягав в проведенні оцінки їх здатності індукувати ІФН в умовах in vivo.
Інтерфероногенну дію молекулярних комплексів дріжджової РНК з тилороном проводили, беручи до уваги ту обставину, що один з компонентів цього комплексу, а саме тилорон, в умовах in vivo може виступати сам по собі як інтерфероноген в організмі мишей.
Враховуючи літературні дані, а також спираючись на попередні досліди, первинне вивчення інтерфероногенної активності проводили за таких умов: співвідношення компонентів МК — 1/10 (тилорон/фосфат РНК); доза МК, що вводилася — 1, 46 мг/кг маси тварин; спосіб введення — внутрішньом’язевий. Пряму оцінку інтерфероногенної активності МК проводили як у відношенні до відомих індукторів, так і до складових МК, які випробовували поодинці. Результати цих дослідів наведені в Табл.1.
Таблиця 1
Титри IФН в сироватках кровi мишей пiсля введення МК та стандартних iндукторiв
Індуктор, що вводився1 | Доза (мг/кг ваги) | Середні титри ІФН X (log2) n
Контроль | 0 | 0
МК2 | 1,46 | 9,65 0,67
Ларифан | 1,00 | 4,54 0,23
Poly(I)-poly(C) | 0,66 | 7,65 0,33
Тилорон | 50,00 | 8,32 0,58
Тилорон3 | 0,13 | 1,32 0,03
РНК дріжджова3 | 1,33 | 0
Примітки:
1. Введення iндукторiв внутрiшньом'язеве; титри iнтерферону визначали через 24 години пiсля введення iндуктору.
2. Спiввiдношення тилорон/РНК (фосфат) — 1/10; доза вiдповiда рекомендованiй для отримання iндукторного ефекту.
3. Доза вiдповiда такiй у складi МК.
МК здiйсню найбiльший вплив на iнтерфероногенез в органiзмi мишей, порiвняно з усiма дослiдженими iндукторами. Важливо, що доза МК, яка вводилася тваринам (вiдносно її нуклеїнового компоненту) практично вiдповiдала дозам iндукторiв рибонуклеїнової природи, в яких вони виявляють оптимальну дiю, а тилорон входить до складу МК в дозi, яка менша за рекомендовану майже в 500 разiв.
Вивчена динамiка накопичення IФН в сироватках кровi мишей, яким одноразово вводили МК. Так, введення МК викликало появу в сироватках кровi мишей IФН в значних титрах. При цьому згаданi титри зберiгалися досить довго (пролонгований ефект). (Рис 1.).
Рис 1. Динаміка накопичення ІФН в сироватці крові мишей після одноразового внутрішньом’язевого введення МК
Примітка. Доза МК та співвідношення його компонентів аналогічне вказаним в Табл.1.
За пролонгованiстю iндукторної дiї препарати МК вигiдно вiдрiзняються вiд вiдомих полiрибонуклеотидних iндукторiв (максимум продукцii IФН — 1-2 доби, час дiї — 3-4 доби) i спiвпадають з дiєю самого тилорону (2-3 доби i 3-4 доби вiдповiдно) (Садыков и др., 1978). Титри сироваткового iнтерферону, отриманi в результатi введення МК, порiвняльнi iз титрами iнтерферону, отриманими в результатi iндукцii вiдомими iндукторами iнтерферону, такими, як poly(I)-poly(C), ларифан. Перевагою МК, поряд iз високими титрами iнтерферону, вiдсутнiстю токсичностi у використовуваних дозах, є тривалiсть циркуляцiї iнтерферону у сироватцi крові експериментальних тварин.
ІФН, що iндукується в органiзмi мишей у вiдповiдь на введення МК, в силу його кислото- та термостiйкостi віднесено до IФН I типу (/-iнтерферони).
Виявлена висока ефективнiсть МК в органiзмi експериментальних тварин зумовила дослiдження його iнтерфероногенних властивостей в умовах in vitro.
Порівняльне дослідження інтерфероногенної активності молекулярного комплексу дріжджової РНК з тилороном (МК), яке проводили як по відношенню до відомих індукторів, так і до складових МК, які випробовували поодинці (Табл.2) показало, що такі комплекси здатні індукувати ІФН в культурі фібробластів мишей на рівні титрів відомих індукторів ІФН і до того ж в дозі, вдвічі нижчій від доз останніх. Для культури клітин L929 за результатами попередніх дослідів ефективне співвідношення компонентів МК — 1/10 (тилорон/фосфат РНК); доза МК, що вносилася — 25 мкг/мл.
Таблиця 2
Продукція ІФН культурою клітин L929 та мононуклеарів крові людини І(0) під дією МК та стандартних індукторів1
Індуктор, | Доза | Середні титри ІФН X(log2) n
що вносили | (мкг/106 клітин) | L929 | мононуклеари крові людини І(0)
Контроль | 0 | 0 | 0
МК2 | 25,0 | 6,67 0,33 | 4,520,31
Ларифан | 50,0 | 4,67 0,31 | 6,930,34
Poly(I)-poly(C) | 50,0 | 6,69 0,28 | 6,660,24
Тилорон3 | 2,2 | 0 | 1,120,03
РНК дріжджова3 | 22,3 | 2,01 0,07 | 2,20 0,09
Примітки:
1. Титри ІФН визначали через 24 години після введення індуктору, n=6.
2. Співвідношення тилорон/ РНК (фосфат) - 1/10.
3. Доза відповідає такій в складі МК.
Виявлене нами явище індукції ІФН in vitro за допомогою МК є цікавим з огляду на те, що дріжджова РНК сама по собі є дуже слабким індуктором ІФН, а тилорон індукторної дії в умовах in vitro практично не проявляє (Чижов и др., 1987).
В результатi внесення МК в культуру клiтин L929 з часом вiдбувається значне накопичення IФН в поживному середовищi. При цьому максимум iнтерфероногенезу припада на шосту годину пiсля контакту МК з клiтинами. За динамiчними параметрами дiя препаратiв МК в культурi клiтин L929 повнiстю спiвпадає з дiєю iндукторiв полiрибонуклеотидної природи (максимум продукцiї IФН — 5-6 годин) (Садыков и др., 1978, Torrence et al., 1984). ІФН, що індукується у відповідь на внесення МК в культуру клітин належить до IФН I типу (/-IФН).
Вперше вивчено здатність молекулярних комплексiв тилорону з одноланцюговими полірибонуклеотидами poly(U) та poly(C) до iндукцiї in vitro iнтерферонiв I типу (/-iнтерферони). Ефективне співвідношення компонентів аналогічне розробленому для препаратів дріжджової РНК з тилороном — 1/10 (тилорон/фосфат РНК); доза, що вносилася — 25 мкг/106 клітин. Титри індукованих інтерферонів в культурі ПТП за використання одноланцюгових полірибонуклеотидів poly(U) та poly(C) склали 5,980,35 та 5,380,28 log2 n відповідно.
У всіх досліджених культурах клітин L929, ПТП, СНЕВ, МНК крові людини І(0) групи оптимальна інтерфероногенна доза МК була в межах 25 мкг/106 клітин. Виявлений ефект індукції інтерферону в різних культурах клітин дозволяє розглядати МК, як інтерфероноген прямої дії. Високі титри інтерферону, індукованого в культуральному середовищі, відкривають перспективи використання МК в біотехнологічному виробництві.
В зв’язку з цим було досліджено можливості збільшення продукції ІФН під дією МК в культурі клітин за допомогою праймінгу. Для цього культуру клітин ПТП попередньо обробляли на протязі чотирьох годин гомологічним інтерфероном в кінцевій концентрації 12,5 МО/мл. Потім в культуральне середовище вносили МК чи індуктори порівняння. Рівень продукції ІФН при умові праймінгу в культурі клітин ПТП відображений в Табл. 3.
Таблиця 3
Продукція ІФН культурою клітин ПТП під дією МК та стандартних індукторів
Індуктор, що вносили | Доза
(мкг/106клітин) | Середні титри ІФН X(log2) n | Середні титри ІФН X(log2) n
без праймінгу | з праймінгом
Контроль | 0 | 0 | 0
МК | 25,0 | 5,120,23 | 8,620,37
Ларифан | 50,0 | 6,630,31 | 9,530,24
Poly(I)-poly(C) | 50,0 | 6,540,13 | 9,660,33
Примітка. Умови дослідів аналогічні вказаним в Табл. 2.
В результаті праймінгу виявлене збільшення на 50% продукції ІФН в культурі клітин в під дією МК, взятого в дозах вдвічі нижчих, ніж дози відомих індукторів інтефероногенезу полінуклеотидної природи.
Вивчено здатність готового МК зберігати свою інтерфероніндукуючу ефективність на протязі семи років. Молекулярний комплекс дріжджової РНК з тилороном при зберіганні в умовах, розроблених для речовин такого типу, на протязі 3-х років практично не змінює своєї здатності до індукції інтерферону in vitro, що дозволяє оцінювати МК інтерфероноген з тривалим строком зберігання.
Таким чином, висока інтерфероногенна здатність in vivo та in vitro вiдкриває можливiсть використання молекулярних комплексів дріжджова РНК - тилорон, як iндукторiв IФН при виробництвi IФН, чи, можливо, і терапевтичних засобів.
РОЗДІЛ 4. ТОКСИЧНIСТЬ МОЛЕКУЛЯРНИХ КОМПЛЕКСIВ ДРIЖДЖОВА РНК - ТИЛОРОН
Вивчена залежність токсичності від дози препаратів інтерфероногенів (діапазон експериментальних доз — від 2,5 до 5000 мкг/мл), а також від тривалості контакту клітин з препаратом (24 — 48 год.). При цьому враховували як пряму цитотоксичну дію препаратів, так і специфічну відповідь окремих культур клітин, які використовували в роботі: клітинних культур L929 та ПТП, СНЕВ, МНК крові людини І(0).
Виходячи з отриманих даних відносно залежності життєздатності клітин від дози МК, значення максимально витримуваних концентрацій (МВК) та показники тканинної цитотоксичної дози, що викликає 50% загибель клітин (ТЦД50) МК у порівнянні із відомими індукторами полінуклеотидної природи представлені в Tабл.4.
Таблиця 4
Величини порогової токсичної дози МК та відомих інтерфероногенів для культур клітин L929, ПТП, СНЕВ і МНК крові людини І(0)
Препарат, | Культура клітин
концентрація
(мкг/106 клітин) | L929 | ПТП | СНЕВ | МНК крові людини
МВК | ТЦД50 | МВК | ТЦД50 | МВК | ТЦД50 | МВК | ТЦД50
poly(I)-poly(C) | 600 | 1250,5 | 400 | 911,7 | 350 | 826,3 | 500 | 1055,6
МК | 500 | 1017,4 | 250 | 621,2 | 250 | 598,8 | 500 | 964,6
ридостін | 400 | 810,0 | 250 | 454,8 | 250 | 462,2 | 450 | 720,0
ларифан | 400 | 805,4 | 250 | 492,5 | 250 | 450,3 | 400 | 766,2
тилорон | 30 | 75,0 | 25 | 50,0 | 25 | 50,0 | 30 | 75,0
Знайдена нами різниця в токсичній дії МК на клітинні культури, що вивчалися, зумовлена як їх походженням, так і особливостями, пов’язаними з конкретними умовами культивування.
Параметри токсичності препаратів МК корелюють з такими для інтерфероногенів полінуклеотидної природи. На підставі отриманих значень МВК, ТЦД50, величини оптимальної інтерфероногенної дози, широкого спектру культур клітин, в яких спостерігалась інтерфероногенна дія МК, препарат молекулярних комплексів дріжджова РНК — тилорон можна розглядати як перспективний індуктор ІФН І типу в промисловому виробництві для потреб медицини та ветеринарії.
РОЗДІЛ 5. АНТИВІРУСНА ДIЯ КОМПЛЕКСIВ ДРIЖДЖОВОЇ РНК З ТИЛОРОНОМ
Пряма кількісна оцінка противірусної дії досліджуваних індукторів ІФН є суттєвою характеристикою останніх, як потенційних хіміотерапевтичних засобів.
Визначення цитопатичної дії вірусів за умов інфікування клітин (10 ТЦД50/0,1мл) показало, що вже на 24 год спостереження порівняно з контрольними неінфікованими культурами гине від 32,3% (система СНЕВ/ВВЕК) до 36,9% (система ПТП/ВЕМК) клітин. В той же час, при внесенні в поживне середовище МК одночасно із зараженням клітин вірусами, виявлялось помітне підсилення життєздатності інфікованих клітин: в дозі 2,5 мкг/мл МК достовірно збільшував життєздатність клітин в системах ПТП/ВЕМК та L929/ВBC. Підвищення концентрації МК до 100 мкг/мл викликало більш значне (на 23 - 30% у відношенні до контролю вірусу) збільшення життєздатності клітин, після чого подальше підвищення дози препарату приводило до певного зниження їх життєздатності.
Ефективний вплив МК на життєздатність вірус-інфікованих клітин виявлявся на 48 год спостереження. Так, при загибелі клітин на рівні 61,6 - 62%, що спостерігалась у контролі, МК в найбільш дієвій концентрації (100 мкг/мл) у випадках всіх систем вірус-клітина, що досліджувались, знижував цей показник до 22,3 - 22,9%.
Ступінь захисту клітин від цитодеструктивної дії вірусів дозволив більш адекватно оцінити противірусний ефект досліджуваних речовин.
МК виявив досить значний захисний ефект у всіх досліджених системах: СНЕВ/ВВЕК, ПТП/ВЕМК і L929/ВВС, який досягає більш ніж 60% при концентрації препарату 100 мкг/мл. Оскільки концентрації МК 250 - 500 мкг/мл наближаються до величин цитотоксичних доз (ТЦД50) для даних культур клітин спостерігається зменшення ефекту захисту клітин при внесенні препарату. Інгібуюча доза (ІД50) МК у всіх досліджених культурах склала 25 мкг/мл.
Хіміотерапевтичний індекс МК, вирахований за співвідношенням отриманих значень МВК до ІД50 складає 10, що є підставою для розгляду МК (ХТІ>8), як перспективних біологічно активних речовин — перспективних противірусних препаратів.
Профілактична дія МК проявлялась в значному пригніченні репродукції вірусів в досліджених культурах клітин. Інфекційні титри у всіх досліджених модельних системах знижувались на величини в діапазоні від 2,94 lg ТЦД50 (система ПТП/ВЕМК) до 3,01 lg ТЦД50 (система СНЕВ/ВВЭК), подібно до інтерфероногенів природнього походження — ларифану та ридостіну (зниження титрів від 2,93 lg ТЦД50 в системі ПТП/ВЕМК до 3,04 lg ТЦД50 в системі L929/ВВС). При цьому достовірних відмінностей в дії всіх сполук, в залежності від природи модельних систем, не спостерігалось. Синтетичний інтерфероноген poly(I)-poly(C) в даних умовах проявляв дещо більшу, ніж інші, вірусінгібуючу активність (зниження титрів від 2,99 lg ТЦД50 в системі ПТП/ВЕМК до 3,22 lg ТЦД50 в системі L929/ВВС).
А
Б
В
Рис 2. Захисна дія МК в різних системах вірус - клітина.
Примітка. А - CНЕВ/ВВЕК; Б - ПТП/ВЕМК; В - L929/ВВС; - 24 год, - 48 год.
Сумарний противірусний еффект складових МК виявився значно меншим, ніж антивірусний эффект, комплексного препарату. Це явище, яке спостерiгалося ранiшe при iндукцiї IФН в культурах клiтин пiд дiєю МК — синергiдний ефект компонентiв при комплексоутвореннi, може пояснюватися тією обставиною, що саме структура комплексу дрiжджова РНК — тилорон вiдповiдальна за здiйснення ефективної iндукцiї iнтерферону, i, як наслiдок, встановлення в подальшому стану клiтинної противiрусної резистентностi.
Таблиця 5
Вплив МК, його компонентів і стандартних індукторів
на репродукцію вірусів в культурах клітин (терапевтична дія)1
Вірус |
Препарат | Концентрація препарату
(мкг/106 клітин) | Титр вірусу
(Мlg ТЦД50)2 |
P | Зниження титру вірусу (Мlg ТЦД50)
ВВЕК | МК | 25 | 3,69 | 0,001 | 3,17
тилорон | 2,5 | 5,86 | 0,001 | 1,00
дріжджова РНК | 22,5 | 6,84 | 0,05 | 0,02
poly(I)-poly(C) | 25 | 4,03 | 0,001 | 2,83
ларифан | 25 | 4,16 | 0,001 | 2,70
ридостін | 25 | 4,15 | 0,001 | 2,71
контроль вірусу | - | 6,86 | - | -
ВЕМК | МК | 25 | 3,64 | 0,001 | 3,17
тилорон | 2,5 | 5,75 | 0,001 | 1,06
дріжджова РНК | 22,5 | 6,79 | 0,05 | 0,02
poly(I)-poly(C) | 25 | 4,11 | 0,001 | 2,70
ларифан | 25 | 4,13 | 0,001 | 2,68
ридостін | 25 | 4,14 | 0,001 | 2,67
контроль вірусу | - | 6,81 | - | -
ВВС | МК | 25 | 2,70 | 0,001 | 3,22
тилорон | 2,5 | 4,89 | 0,001 | 0,03
дріжджова РНК | 22,5 | 5,91 | 0,05 | 0,01
poly(I)-poly(C) | 25 | 2,97 | 0,001 | 2,95
ларифан | 25 | 3,16 | 0,001 | 2,76
ридостін | 25 | 3,16 | 0,001 | 2,76
контроль вірусу | - | 5,92 | - | -
Примітки:
1. Концентрація МК дорівнює ІД50, концентрація складових МК - дріжджової РНК і тилорону, дорівнює їх вмісту в дозі ІД50 МК;
2. Значення середніх арифметичних титрів в обернених логарифмах, n = 4.
Застосування стандартних iндукторiв IФН за терапевтичною схемою (Табл.5.), також викликало пригнiчення вiрусної репродукцiї, хоча i з дещо меншою, в порiвняннi з профiлактичним застосуванням, ефективнiстю. Так, зниження iнфекцiйних титрiв вiрусiв пiд дiєю ларифану та ридостiну склало вiд 2,68 до 2,76 lg ТЦД50, що в середньому на 10% менше аналогiчного ефекту, який спостерiгався в попередньму випадку. Як i ранiше, серед стандартних iндукторiв найбiльш ефективним виявився poly(I)-poly(C) — зниження титру вiрусiв на 2,70 - 2,95 lg ТЦД50.
Під дією МК спостерігалось значне (від 3,17 до 3,22 lg ТЦД50) зниження титру вірусів у всіх системах, що досліджувалися. Зниження титру вірусу під дією МК в цьому випадку переважає даний ефект під дією poly(I)-poly(C) та ларифану і ридостіну.
Виходячи з того, що при оцінці дії потенційних противірусних препаратів в умовах in vitro прийнято вважати, що зниження інфекційного титру вірусу таким препаратом у відношенні до контролю не менш, ніж на 1,78 lg, свідчить про його перспективність для подальшого випробування in vivo (Вотяков с соавт., 1986), в цілому слід відмітити, що МК, повністю відповідаючи даній вимозі, може розглядатися, як потенційний противірусний агент.
Оскільки для досліджених культур клітин характерна не тільки чітка ЦПД розглянутих вірусів, але і висока чутливість до дії інтерферону, а препарати молекулярних комплексів дріжджова РНК — тилорон виявили себе як ефективні інтерфероногени, то було визначено вклад у виявлене явище антивірусної дії як власне препаратів МК, так і індукованого ними інтерферону (Табл.6).
Таблиця 6
Вплив МК та індукованого ним інтерферону на репродукцію ВВС в культурі клітин ПТП
Препарат | Титр вірусу (Мlg ТЦД50)3 | P4
МК1 | 1,78 | 0,001
ІФН2 | 3,73 | 0,001
Контроль культури | 4,69 | 0,05
Контроль вірусу | 4,75 | -
Примітки.
1. Кількість МК відповідає оптимальній інтерфероногенній дозі — 25 мкг/106 клітин.
2. Кількість інтерферону, продукованого клітинами ПТП через 24 год після внесення МК в дозі 25 мкг/106 клітин.
3. Значення середніх титрів в обернених логарифмах, n=6.
4. Достовірність визначали у відношенні до контролю вірусу.
Виявлено, що попередній контакт з клітинами ПТП препаратів молекулярних комплексів дріжджової РНК з тилороном на протязі 1 год та наступне інфікування їх ВВС (0,1 ТЦД50/клітину) знижує титри вірусу на 2,97 lg ТЦД50, тоді як така ж обробка клітин інтерфероном — на 1,02 lg ТЦД50. Таким чином, антивірусна ефективність молекулярного комплексу обумовлюється в основному дією самого комплексу, яка майже втричі перевищує дію індукованого ним інтерферону.
РОЗДІЛ 7. УЗАГАЛЬНЕННЯ РЕЗУЛЬТАТІВ ДОСЛІДЖЕННЯ
В даному розділі викладено узагальнення основних експериментальних результатів дослідження.
висновки
1. Виявлена здатнiсть молекулярних комплексів тилорону з дріжджовою РНК до iндукцiї iнтерферонiв I типу (/-iнтерферони) в організмі експериментальних тварин.
2. Встановлено, що дріжджова РНК, а також одноланцюгові полірибонуклеотиди poly(U) та poly(C), при комплексоутворенні з тилороном викликають продукцію інтерферонів І типу в умовах in vitro на рiвнi вiдомих iндукторiв в стандартних дозах. Це характеризує такі комплекси як високотехнологічні, перспективні індуктори інтерферону.
3. Визначені параметри токсичності препаратів молекулярних комплексiв дріжджова РНК - тилорон. В діапазоні доз від 2,5 до 250 мкг/мл вони є повністю нетоксичними.
4. Показано, що стадія праймінгу збільшує кількість індукованого інтерферону за допомогою молекулярного комплексу дріжджова РНК — тилорон в культуральному середовищі на 50 %.
5. Препарати молекулярних комплексів зберігають свою інтерфероногенну здатність на протязі 3-х років з моменту виготовлення, що обгрунтовує доцільність їх використання при крупномасштабному виробництві препаратів інтерферонів І типу.
6. Препарати комплексу дріжджова РНК - тилорон захищають від цитопатичної дії вірусів клітини різних культуральних ліній. Значення хіміотерапевтичного індексу препарату свідчать про безпечність застосування комплексів як індукторів інтерферону в умовах in vitro.
7. Молекулярні комплекси дріжджової РНК — тилорон виявляють як профілактичну, так і терапевтичну дію на ряді експериментальних моделей вірус-клітина. Антивірусна дія молекулярного комплексу спричиняється як дією самого комплексу, так і дією індукованого ним інтерферону в співвідношенні приблизно 1:3. Це дає можливість розглядати вказані комплекси як перспективні противірусні сполуки, що вимагає подальшого вивчення їх дії в умовах in vivo.
Список наукових робіт, опублікованих за темою дисертації
1. Карпов А.В., Жолобак Н.М. Изучение интерфероногенных свойств комплексов дрожжевая РНК — тилорон в культуре клеток // Антибиотики и химиотерапия. — 1995. — T.40, №5. — C.20-23.
2. Карпов А.В., Жолобак Н.М. Продукция интерферонов I типа в организме под действием молекулярных комплексов дрожжевая РНК - тилорон // Вопр.вирусологии. — 1996. — Т.41, №1. — С.13-16.
3. Карпов О.В., Жолобак Н.М. інтерфероногенні властивості комплексів дріжджова РНК-тилорон // Доп. НАН України. — 1996. — №3. — С.128-131.
4. Жолобак Н.М., Карпов А.В., Рыбалко С.Л., Антоненко С.В., Барбашева Е.В. Сравнительная характеристика цитотоксичности интерферон-индуцирующего комплекса дрожжевая РНК-тилорон // Антибиотики и химиотерапия. — 1999. — Т.44, №4. — С.21-24.
5. Тимошок Н.А., Жолобак Н.М., Вольская О.Г., Карпов А.В., Спивак Н.Я. Интерфероногенная активность индукторов интерферона первого типа различного происхождения. // Вісник проблем біології і медицини. — 1999. — №6. — С.70-74.
6. Жолобак Н.М., Яковенко Л.Ф., Карпов О.В. Ефективність молекулярних комплексів дріжджова РНК — тилорон при експериментальній стафілококовій інфекції. // Бюлетень Інституту сільськогосподарської мікробіології УААН. — Чернігів, 2000. — №7. — С.62-63.
7. Пат. UA 9689А, А61К37/66. Індуктор інтерферону першого типу в організмі людини та тварин / Карпов О.В., Жолобак Н.М.— Опубл. 30.09.96. Бюл.№3.
8. Пат. UA 9690А, А61К37/66. Індуктор інтерферону першого типу в культурах клітин / Карпов О.В., Жолобак Н.М., Іваненко В.І.— Опубл. 30.09.96. Бюл.№3.
АНОТАЦIЯ
Жолобак Н.М. Інтерфероногенна та антивірусна дія молекулярних комплексів одноланцюгова РНК — тилорон. — Рукопис.
Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 03.00.06 — вірусологія. — Інститут мікробіології і вірусології ім.Д.К.Заболотного НАН України, Київ, 2001.
Дисертація присвячена вивченню препаратів з антивірусною дією з точки зору як їх здатності індукувати утворення інтерферону, так і можливості безпосередньо пригнічувати репродукцію вірусів. Предметом дослідження були молекулярні комплекси одноланцюгової РНК з тилороном.
Показана інтерфероногенна дія молекулярних комплексів гомополінуклетидів poly (С), poly (U), дріжджової РНК з тилороном в умовах in vivo та in vitro. Детально вивчені кількісні та часові параметри цього процесу. Показано, що iндукований як in vivo, так i in vitro інтерферон належить до І типу (ІФН-/). Визначені параметри токсичності препаратів молекулярних комплексів дріжджова РНК — тилорон гідрохлорид. Вказані препарати повністю нетоксичні в діапазоні доз від 2,5 до 250 мкг/мл. Разроблені способи збільшення продукції інтерферону шляхом праймінгу. Встановлено, що на протязі 3-х років препарат не змінює здатність до індукції інтерферону in vitro. Молекулярні комплекси мають чітку антивірусну дію: пригнічують репродукцію вірусів в культурі клітин при профілактичному та терапевтичному використанні. ХТІ досліжених препаратів складає 10. Антивірусна дія вивчених препаратів зумовлена в основному дією власне МК, і тільки в незначній мірі — індукованим ним інтерфероном. Все це дозволяє розглядати молекулярний комплекс дріжджова РНК — тилорон як перспективний противірусний препарат.
Ключові слова: інтерферон І типу, iндукція, poly (С), poly (U), дріжджова РНК, тилорон гідрохлорид, праймінг, токсичність, антивірусна дія.
АННОТАЦИЯ
Жолобак Н.М. Интерфероногенное и антивирусное действие молекулярных комплексов одноцепочная РНК — тилорон. — Рукопись.
Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.06 — вирусология. — Институт микробиологии и вирусологии им.Д.К.Заболотного НАН Украины, Киев, 2001.
Диссертация посвящена изучению препаратов с антивирусным действием с точки зрения как их способности индуцировать образование интерферона, так и возможности непосредственно ингибировать репродукцию вирусов. Предметом исследования были молекулярные комплексы одноцепочечная РНК — тилорон.
Показано, что молекулярные комплексы тилорона с дрожжевой РНК индуцируют образование интерферонов I типа (/-интерфероны) в организме экспериментальных животных. Определены дозовые зависимости интерфероногенеза, а также кинетика циркуляции интерферона в сыворотке крови мышей, в частности выявлен пролонгированный эффект интерфероногенного действия молекулярного комплекса дрожжевой РНК — тилорон.
Обнаружено, что молекулярные комплексы: poly (С) — тилорон, poly (U) — тилорон, дрожжевая РНК — тилорон в условиях in vitro обладают интерфероногенным действием на уровне индукторов интерферона полинуклеотидной природы, индуцированный интерферон принадлежит к интерферонам І типа (ИФН-/), а способностью продуцировать его обладают исследованные перевиваемые культуры клеток
