Скористайтеся пошуком, наприклад Реферат        Грубий пошук Точний пошук
Вхід в абонемент





ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ

ІНСТИТУТ біоОРГАНІЧНОЇ ХІМІЇ ТА НАФТОХІМІЇ

КРИВОРОТЕНКО ДМИТРО ВАЛЕНТИНОВИЧ

УДК 577.336+57.08.088.5+542.95

(Тіо)(піридо-4)монометинціаніни для флуоресцентної детекції нуклеїнових кислот та білків

02.00.10 – біоорганічна хімія

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата хімічних наук

КИЇВ - 2001

Дисертацією є рукопис.

Роботу виконано у відділі структури і функцій нуклеїнових кислот Інституту молекулярної біології і генетики НАН України, м. Київ.

Науковий керівник: | кандидат хімічних наук, старший науковий співробітник Ярмолюк Сергій Миколайович,

Інститут молекулярної біології і генетики НАН України,

старший науковий співробітник відділу структури і функцій

нуклеїнових кислот

Офіційні опоненти: | доктор хімічних наук, професор

Толмачов Олексій Іванович,

Інститут органічної хімії НАН України,

завідувач відділу будови та кольору органічних сполук

доктор біологічних наук, професор

Кібірєв Володимир Костянтинович,

Інститут біоорганічної хімії та нафтохімії НАН України,

завідувач відділу хімії білка

Провідна установа: | Київський національний університет імені Тараса Шевченка, хімічний факультет

Захист дисертації відбудеться 25 травня 2001 р. о 10 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.220.01 в Інституті біоорганічної хімії та нафтохімії НАН України, 02094, Київ, вул. Мурманська 1.

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Інституту біоорганічної хімії та нафтохімії НАН України, 02094, Київ, вул. Мурманська 1.

Автореферат розісланий 23 квітня 2001 року.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради Д.М.Федоряк

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність роботи. Все більш широке застосування молекулярно-біологічних технологій та генної інженерії вимагає швидких і зручних методів детекції нуклеїнових кислот (НК) та білків. Детекція за традиційними процедурами обов’язково потребує виділення біополімерів за допомогою гель-електрофорезу чи високоефективної рідинної або гібридизаційної афінної хроматографії, що позначається на швидкості та вартості аналізу.

Використання для детекції НК флуоресцентних ціанінових барвників, спектральні характеристики яких змінюються при зв’язуванні з нуклеїновими кислотами, дозволяє проводити аналіз в гомогенних системах, коли немає необхідності виділяти незв’язаний залишок зонда. Необхідно зауважити, що на відміну від широковживаного флуоресцентного барвника бромистого етидію та радіоактивних міток, ціанінові барвники є безпечними для використання в лабораторній практиці.

Незважаючи на значну кількість існуючих флуоресцентних зондів для визначення НК на основі ціанінових барвників, лише декілька представників цього класу сполук використовуються в якості зондів для детекції білків. Треба відмітити, що ці барвники є поліметинціанінами, тоді як монометинціанінові барвники для флуоресцентної детекції білків раніше не пропоновувались.

Одним з перспективних шляхів створення нових флуоресцентних зондів для визначення НК і білків є введення в структуру барвників ефекторних груп. Практично не змінюючи хромофор барвника, ці групи здатні впливати на взаємодію барвника з біополімерами. Потрібно зазначити, що систематичних досліджень впливу природи ефекторних груп на спектрально-люмінісцентні властивості комплексів ціаніновий барвник-НК не проводилось.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Роботу виконано у відповідності з планом науково-дослідних робіт ІМБіГ НАН України: державною бюджетною темою “Синтез та вивчення механізму взаємодії ціанінових флуоресцентних зондів з нуклеїновими кислотами” №2.2.4.16 за 1997-99 р. (№ держ. реєстрації: 0197U004292). Дослідження проводилися також згідно угоди про матеріальну підтримку між Інститутом молекулярної біології і генетики НАН України, м. Київ та Ліверморською національною лабораторією Каліфорнійського університету, м. Лівермор, Каліфорнія, США № В507077, програма ІРР Міністерства Енергетики США.

Мета роботи полягала в розробці нових синтетичних підходів до отримання нових флуоресцентних барвників шляхом введення ефекторних груп до структури ціаніну, а також у вивченні впливу ефекторних груп на спектрально-люмінесцентні властивості модифікованих барвників у присутності білків та НК.

Для досягнення поставленої мети необхідно було вирішити такі завдання:

·

  • розробити хімічні підходи для синтезу нових монометинових ціанінових барвників з амінними, спиртовими та ароматичними ефекторними групами

·

  • вивчити реакцію між 2-(2,6-диметил-піран-4-іліденметил)-3-метил-бензотіазолій перхлоратом (Cyan 39) та первинними амінами

·

  • дослідити спектрально-люмінесцентні властивості отриманих барвників та вивчити вплив ефекторних груп на взаємодію барвників з ДНК, РНК та білками

Наукова новизна досліджень. Розроблено ефективні підходи для одержання монометинових ціанінових барвників з ефекторними групами. Вивчено реакцію між пірилоціаніном та первинними амінами з різними замісниками. Вперше запропоновано карбонілдіімідазол (КДІ) для приєднання ефекторних груп до ціанінового фрагмента. Синтезовано 37 нових барвників. Будову та інидивідуальність отриманих сполук доведено за допомогою елементного аналізу, тонкошарової хроматографії, ПМР- та мас-спектроскопії, електронної спектроскопії.

Показано, що наявність в молекулі ціаніну спиртових ефекторних груп підвищує інтенсивність флуоресценції комплексів барвника з ДНК. Доведено, що багатоциклічні ароматичні ефекторні групи в складі ціанінів підвищують їх схильність до агрегації, що зменшує інтенсивність флуоресценції барвника у вільному стані. Знайдено, що структурний фрагмент арилоцтової кислоти в складі монометинціаніну значно підсилює зв’язування барвника з білком.

Практичне значення одержаних результатів. Розуміння впливу ефекторних груп на взаємодію ціанінових барвників з біополімерами є важливим для направленого синтезу флуоресцентних зондів з заданими властивостями. Запропоновано для практичного використання високочутливі флуоресцентні зонди для визначення ДНК (D-19), РНК (D-8) та БСА (Р-5).

Особистий внесок здобувача. Основний об’єм експериментальної роботи, обробка та аналіз отриманих результатів, формулювання висновків дисертаційної роботи виконані здобувачем. Частину спектральних досліджень проведено у співпраці з Ковальською В.Б., Лосицьким М.Ю., Баландою А.О. Постановка задачі та обговорення результатів проведені з науковим керівником.

Апробація результатів дисертації. Матеріали роботи доповідались на 8 Європейській конференції зі спектроскопії біологічних молекул (Holland, Enschede 1999), ХV Науковій конференції з біоорганічної хімії та нафтохімії (Київ 2000), Першій всеукраїнській конференції студентів та аспірантів (Київ 2000), міжнародній конференції “Хімія азотовмісних гетероциклів” (ХАГ 2000) та на міжнародній конференції “Біотехнологія та навколишнє середовище” (Croatia, Zagreb 2001)

Публікації. Основний зміст роботи відображено у 5 статтях в наукових фахових журналах та 4 тезах доповідей на наукових конференціях.

Об’єм та структура роботи. Дисертація складається з вступу, огляду літератури, експериментальної частини, обговорення результатів, висновків та списку використаних літературних джерел (117 найменувань). Дисертація викладена на 132 сторінках друкованого тексту і містить 15 таблиць, 10 схем та 31 рисунок.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

У першому розділі розглянуто основні механізми взаємодії малих молекул (антибіотики, флуоресцентні барвники) з двоспіральною ДНК. Наведено дані щодо впливу функціональних замісників на взаємодію малих молекул з біополімерами. Зазначено, що присутність спиртових, амінних та ароматичних груп в складі акридинів, антрациклінів, піролкарбоксамідів та інших ароматичних сполук значно посилює зв’язування цих молекул з ДНК. Проте систематичних досліджень впливу функціональних груп на властивості комплексів малих молекул з НК та білками раніше не проводилось.

“Ефекторна група” – це ковалентно приєднаний до хромофора функціональний замісник, який практично не змінює спектральні властивості хромофора барвника, але посилює взаємодію барвника з біополімером. На сьогодні існує обмежена кількість методів функціоналізації ціанінових барвників. Всі вони є досить складними. Тому, на наш погляд, існує проблема пошуку більш простих і зручних методів модифікації ціанінових барвників функціональними замісниками.

Нещодавно для детекції НК було запропоновано високофлуоресцентний хромофор Cyan 40 (Рис. 1) та вивчено можливий механізм його взаємодії з ДНК. Введення ефекторних груп до піридинієвого ядра Cyan 40 є перспективним шляхом для створення на його основі нових флуоресцентних зондів.

У другому розділі наведено методики синтезу ціанінових барвників та фізико-хімічних досліджень. Описано методи приготування розчинів нуклеїнових кислот, білків та барвників для спектральних досліджень; визначення констант зв’язування барвників з ДНК; електрофорезу та візуалізації НК в агарозному гелі.

У третьому розділі подано результати експериментальних досліджень та їх обговорення.

Синтез похідних (тіо)(піридо-4) монометинціаніну

Для введення до молекули Cyan 40 (Рис. 1) ефекторних груп нами запропонована реакція 2-(2,6-диметил-піран-4-іліденметил)-3-метил-бензотіазолій перхлорату (Cyan 39) з амінами (Рис. 2).

З пірилоціанінами ця реакція раніше проводилась лише з метиламіном як амінокомпонентою. Ми дослідили її перебіг з первинними амінами, що мають різноманітні функціональні замісники. Первинні аміни, до складу яких входять спиртові та діалкіламіно групи, а також 6-аміногексанова кислота, добре реагують з Cyan 39 і з високим виходом утворюють барвники D-3, D-5, D-6, D-7, D-9, D-20, D-24 та D-27, і їхні функціональні замісники не заважають проходженню цієї реакції. Якщо в складі амінокомпоненти присутні одночасно первинна та вторинна аміногрупи, пірилоціанін реагує переважно з первинною аміногрупою (D-11). Аналогічно в реакції з фенілгідразином реагує лише первинна аміногрупа з утворенням барвника D-14. При одночасній присутності первинної аміногрупи та аміногрупи в складі гетероциклу (D-1, D-8) реакція проходить тільки з первинною аміногрупою. Вихід барвників, що були одержані з використанням даної реакції, знаходився в межах 85-96%.

Для синтезу піридоціанінів з аміногрупою ми вивчили реакцію Cyan 39 з діамінами та виявивили певні закономірності її перебігу. Для запобігання утворенню димерного ціаніну реакцію проводили з подвійним надлишком аміну. У випадку етилендіаміну та 1,3-діамінопропану отримані індивідуальні піридоціаніни D-12 (вихід 85%) та D-13 (вихід 87%), тоді як для 1,4-діамінобутану та 1,6-діаміногексану навіть при потрійному надлишку діаміну утворюються суміші мономерного та димерного ціанінів. З одержаних експериментальних даних можна зробити висновок, що Cyan 39 має меншу реакційну здатність в реакціях з первинними амінами порівняно з солями пірилію. Внаслідок зменшеної реакційної здатності Cyan 39 є зручною вихідною речовиною для синтезу різноманітних похідних Cyan 40 без використання захисних груп для захисту функціональних замісників в амінокомпонентах.

Перспективним підходом ковалентного зв’язування ефекторних груп з флуорофором барвника є використання карбоксильної групи. Для кон’югації карбоксильних похідних ціанінів з біополімерами раніше застовувався дициклогексилкарбодіімід (ДЦГК). Ми використали цей підхід для конденсації карбоксильного похідного тіазолового оранжевого (ТО) барвника Сyan 6 з амінокислотами. Сукцинімідний ефір барвника Сyan 6 був отриманий в розчині ДМФА з використанням ДЦГК та без попереднього виділення введений в реакцію з гідрохлоридами ефірів амінокислот в присутності піридину (Рис. ). Амінокислотні похідні Сyan 6 виділялись оберненофазовою хроматографією з використанням градієнту концентрації 0.1 М трифторацетатного буферу та діоксану. Отримані продукти охарактеризовані спектрально-люмінісцентними та мас-спектроскопічним методами.

Конденсації з використанням активованих ефірів потребують складної процедури проведення реакції та виділення її продуктів. Для синтезу ціанінів з ефекторними групами ми вперше запропонували досить поширений в пептидній хімії реагент – карбонілдіімідазол (КДІ). Цей реагент за декілька хвилин утворює активований карбоксамід з одночасним утворенням двоокису вуглецю та імідазолу, від якого легко позбутися. Імідазолільне похідне барвника без попереднього виділення легко реагує з аміном. Нами розроблена загальна методика проведення цієї реакції з виходами 68-92% та синтезовано п’ять нових барвників (Рис. 4).

При застосуванні КДІ як конденсуючого реагента індольний атом азоту та спиртові групи амінокомпонент вводились в реакцію без захисних груп (барвники D-16 та D-19). Поряд з цим застосування КДІ дозволяє в реакції D-7 з пара-фенілендіаміном без використання захисних груп отримати моноціанінове похідне з вільною аміногрупою D-23. Барвник D-23 був застосований для подальшої модифікації ефекторними групами. Нами показано, що активація карбоксильної групи ціаніну за допомогою КДІ дозволяє отримувати карбоксамідні похідні аліфатичних та ароматичних амінів з добрими виходами та, у багатьох випадках, без використання захисних груп. Аміноакридин дуже важко піддається N-ацилюванню, тому для синтезу барвника D-17 було використано більш активний конденсуючий реагент ДЦГК в присутності нуклеофільного каталізатора 1-гідроксибензотріазолу.

Нами запропоновано підхід для введення ефекторних груп в ціаніновий барвник, що полягає в ацилюванні аміногрупи ціаніну карбоновими кислотами. Обробкою розчину D-23 в абсолютному ДМФА в присутності піридину одним еквівалентом хлорангідриду карбонової кислоти ми отримували барвники (Р-1, Р-3, Р-10, Р-11) з виходами 81-88%. У випадку кислот, хлорангідриди яких важко доступні, спочатку отримувалися за допомогою КДІ їх імідазолільні похідні в розчині абсолютного ДМФА. Потім імідазоліди кислот без попереднього виділення конденсували з D-23 та отримували барвники (Р-2, Р-4 - Р-9) з виходами 76-84% (Рис. 5).

Дослідження впливу ефекторних груп в складі ціанінових барвників на властивості комплексів ціанінів з НК

Нещодавно було запропоновано модель напівінтеркаляції монометинових ціанінових барвників в дволанцюгову ДНК. Згідно з цією моделлю (тіо)(піридо-4) монометинціанінові барвники взаємодіють з ДНК так, що більш основний піридинієвий гетероцикл фіксується в борозенці, а менш основний бензтіазоловий гетероцикл "класично" інтеркалює між парами основ (рис. 6). Було експериментально показано, що введення замісників у бензтіазолове ядро заважає інтеркаляції барвника, що, як наслідок, зменшує інтенсивність його випромінювання. В той же час введення об’ємних замісників до піридинієвого гетероциклу, що знаходиться в борозенці, не створює стеричних перешкод для інтеркаляції бензтіазолу. Тому для створення нових флуоресцентних зондів з ефекторними групами ми модифікували саме піридинієве ядро (тіо)(піридо-4) монометинціаніну.

За допомогою описаних вище підходів до модифікації піридинієвого ядра (тіо)(піридо-4)монометинціаніну ми синтезували ряд нових флуоресцентних барвників. Характеристики їхніх спектрів поглинання та флуоресценції в ДМФА та водному буфері подані в Табл. 1.

Таблиця 1

Характеристики спектрів поглинання та флуоресценції ціанінових барвників групи D у розчині та в присутності ДНК і РНК

Барвник | погл буфер,нм | фл, нм | I0, в.о. | флДНК, нм | IДНК, в.о. | флРНК, нм | IРНК, в.о.

D-1 | 438 | 488 | 0.41 | 488 | 35.0 | 490 | 30.0

D-2 | 444 | 486 | 0.46 | 488 | 31.9 | 490 | 40.0

D-3 | 443 | 488 | 0.38 | 495 | 32.5 | 495 | 51.4

D-4 | 440 | 485 | 0.34 | 485 | 57.0 | 488 | 40.5

D-5 | 443 | 486 | 0.40 | 493 | 26.0 | 494 | 78.0

D-6 | 442 | 488 | 0.34 | 488 | 61.1 | 487 | 53.3

D-7 | 438 | 480 | 0.43 | 485 | 34.0 | 483 | 38.0

D-8 | 443 | 485 | 0.44 | 488 | 47.0 | 488 | 112.0

D-9 | 442 | 485 | 0.21 | 488 | 54.5 | 488 | 50.8

D-10 | 442 | 478 | 0.39 | 482 | 26.8 | 483 | 29.8

D-11 | 443 | 486 | 0.28 | 490 | 42.0 | 490 | 55.0

D-12 | 444 | 480 | 0.31 | 490 | 13.5 | 488 | 40.1

D-13 | 441 | 477 | 0.32 | 486 | 20.9 | 484 | 47.9

D-14 | 450 | 483 | 0.37 | 492 | 7.2 | 490 | 9.1

D-16 | 444 | 488 | 0.59 | 480 | 48.2 | 480 | 46.l

D-17 | 362, 446 | 483 | 0.07 | 483 | 13.3 | 485 | 9.7

D-18 | 442 | 485 | 0.42 | 485 | 36.4 | 482 | 99.0

D-19 | 442 | 482 | 0.45 | 483 | 89.0 | 485 | 61.0

D-20 | 440 | 483 | 0.28 | 485 | 45.3 | 485 | 42.4

D-21 | 441 | 483 | 0.33 | 483 | 49.0 | 485 | 39.0

D-23 | 442 | 483 | 0.35 | 480 | 65.0 | 482 | 57.0

D-24 | 444 | 482 | 0.50 | 489 | 27.5 | 488 | 56.3

D-25 | 443 | 481 | 0.51 | 485 | 28.1 | 485 | 23.8

D-26 | 440 | 481 | 0.56 | 484 | 28.0 | 484 | 29.0

D-27 | 444 | 481 | 0.49 | 489 | 24.9 | 488 | 62.1

Cyan40 | 435 | 480 | 0.30 | 480 | 51.1 | 482 | 80.8

де погл буфер - довжина хвилі максимуму поглинання у буфері, фл - довжина хвилі максимуму випромінювання барвника у буфері, I0 - інтенсивність випромінювання вільного барвника, флДНК(РНК) - довжина хвилі максимуму випромінювання в присутності ДНК, РНК, IДНК(РНК) - інтенсивність випромінювання барвника в присутності ДНК, РНК, в.о. - відносні одиниці.

Як видно з наведених характеристик, спектрально-люмінесцентні властивості вільних барвників з ефекторними групами незначно відрізняються від властивостей базового немодифікованого барвника Cyan 40. Максимуми поглинання барвників в апротонному ДМФА розташовані в інтервалі 440-448 нм і при переході до водного буферу незначно (2-10 нм) зсуваються в короткохвильовий бік. Максимуми флуоресценції вільних ціанінів (фл) знаходяться в інтервалі 478-488 нм, значення стоксових зсувів (?S) лежать в межах 42-50 нм, барвники мають низькоінтенсивну власну флуоресценцію (І0 = 0,07-0,59). Нами показано, що введення ефекторних груп до структури барвника Cyan 40 незначно підвищує інтенсивність випромінювання практично всіх ціанінів порівняно з вихідним барвником, за винятком D-9 та D-17 (Табл. 1). Присутність акридинового фрагменту в структурі D_посилює здатність барвника до утворення агрегатів, що в свою чергу зменшує інтенсивність мономерного випромінювання барвника.

Отже, присутність ефекторних груп в складі ціанінів практично не впливає на спектральні властивості хромофору цих барвників.

Для дослідження впливу ефекторних груп на люмінесцентні властивості комплексів барвників з НК було вивчено спектри поглинання та флуоресценції ціанінів в присутності ДНК та РНК (Табл. ). Максимуми поглинання піридинієвих барвників в комплексах з ДНК та РНК розташовані в інтервалі 435-452 нм (дані не наведено), а максимуми випромінювання ( флДНК(РНК)) – в межах 483-495 нм. Комплекси барвників з ДНК та РНК мають середні стоксові зсуви 35-54 нм.

Присутність гідроксильної групи в молекулах ціанінів D-6 та D_підвищує інтенсивність випромінювання їхніх комплексів з ДНК (ІДНК) та понижує інтенсивність флуоресценції комплексів з РНК (ІРНК) порівняно з базовим Cyan . Прагнучи ще більше підвищити ІДНК, ми синтезували барвник D_з трьома спиртовими групами. Дійсно, інтенсивність випромінювання цього барвника в комплексі з ДНК (89.0 в.о.) значно перевищує відповідні величини для барвників D-6, D_та D_, що містять тільки одну гідроксильну групу (61.1, 54.5 та 45.3 в.о. відповідно), та для Cyan 40. Таким чином, ми вперше показали, що присутність в складі барвника спиртових ефекторних груп приводить до покращення флуоресцентних властивостей комплексу барвник-ДНК. При цьому збільшення кількості спиртових груп в ефекторній групі підвищує інтенсивність випромінювання комплексу.

Для барвників, що містять аліфатичні аміногрупи (D-3, D-5, D-11, D-12, D-13, D-18, D-24, D-27), ІРНК суттєво перевищує ІДНК (ІРНК знаходиться в межах 40.1-99.0 в.о., тоді як ІДНК – в інтервалі від 13.5 до 42.0 в.о.). Виняток становить лише барвник з лізиновою ефекторною групою D-4, для якого ІРНК (40.5 в.о.) є меншим за ІДНК (57.0 в.о.). Але всі ці барвники мають менші значення ІРНК, ніж вихідний Cyan , за винятком D-18 (ІРНК = 99.0 в.о.). Таким чином, для барвників, що містять амінні ефекторні групи, інтенсивність флуоресценції в присутності РНК помітно вища, ніж в присутності ДНК.

Для серії барвників D-16, D-17, Р-1 - Р-8, Р-10 та Р-11, що містять ароматичні ефекторні групи, приєднані до хромофору лінкером довжиною 7-15 атомів, спостерігається зменшення ІДНК(РНК) порівняно з Cyan 40. Для деяких барвників (Р-1, Р-3, Р-4, Р-5 та Р-7) спостерігається надзвичайно мале значення ІДНК(РНК) (1.34-11.0 в.о.). Отже, введення ароматичних ефекторних груп (феніл, нафталін, індол, кумарини, хінолін) до структури барвника погіршує властивості ціанінів як флуоресцентних зондів для детекції нуклеїнових кислот порівняно з вихідним Cyan 40. Виняток становить барвник D-8 з індольним фрагментом, для якого ІРНК (112.0 в.о.) значно перевищує відповідну величину для Cyan 40 (80.8 в.о.). В той же час інтенсивність випромінювання D-8 в комплексах з РНК більш ніж вдвічі перевищує його ІДНК (47.0 в.о.). Завдяки таким властивостям барвник D-8 може бути використаний для флуоресцентної детекції РНК.

Застосування барвників для візуалізації НК в гель-електрофорезі

Досліджена можливість використання ціанінів D-3, D-4, D-6, D-8, D-9, D-16, D-17, D-18 та D-19 для візуалізації нуклеїнових кислот в агарозному гелі. Фарбування НК проводили за двома процедурами. За першою – проводилось електрофоретичне розділення ДНК , розщепленої рестриктазою HindIII, після чого гелі фарбували в буфері, який містив ціанінові барвники або EtBr (бромистий етидій). За другою – електрофорез нуклеїнових кислот проводили в забарвленому гелі. Барвник додавали безпосередньо в агарозний гель при його приготуванні. Застосовані для фарбування ціаніни утворювали з НК високофлуоресцентні комплекси, що випромінювали свічення різних відтінків зеленого кольору.

Чутливість детекції НК ціаніновими барвниками не залежала від процедури фарбування. Барвники однаково ефективно забарвлювали кільцеву плазмідну дволанцюгову (дл) ДНК, лінійну длДНК, а також РНК.

Для збудження флуоресценції ціанінових барвників ми використали стандартний лабораторний ультрафіолетовий трансілюмінатор. На рис. 7 наведено фотографію агарозної платівки, пофарбованої ціаніном D-19, який мав найбільшу інтенсивність випромінювання з-поміж усіх досліджених барвників. За умов проведення експерименту чутливість визначення НК ціаніновими барвниками та широко поширеним EtBr була однаковою. Однак перевагами ціанінових барвників є нижчий рівень “фонового забарвлення” агарозної платівки та більш чітко забарвлені смуги порівняно з ЕtBr (Рис. 7), а також відсутність у ціанінів токсичних властивостей. Крім того, інтенсивність флуоресценції ціанінів при збудженні в видимій області в кілька разів більша, ніж при збудженні ультрафіолетовим випромінюванням. Тому при використанні в експерименті лазерного випромінювання з довжиною хвилі близько 440 нм інтенсивність флуоресцеції повинна значно зрости. Підсумовуючи, ми вважаємо, що ціаніновий барвник D-19 є перспективним для візуалізації нуклеїнових кислот в агарозному гелі.

Спектрально-люмінесцентні властивості барвників у присутності білків

Принцип ефекторних груп нами застосований для конструювання флуоресцентних зондів для детекції білків. В якості модельного білка ми використали БСА (альбумін сироватки бика). Альбуміни виконують в організмі в основному транспортну функцію, тому представники цього класу протеїнів легко зв’язуються з малими молекулами.

В складі білків присутні ароматичні амінокислоти (Phe, Tyr, Trp, His), тому наявність ароматичної ефекторної групи може сприяти “налипанню” молекул барника на залишки ароматичних амінокислот. Тому для отримання білкових флуоресцентних зондів вважаємо перспективним синтез сполук з індольною та іншими ароматичними ефекторними групами. На основі цього підходу були синтезовані ціанінові барвники для детекції білків (Рис.5). Спектрально-люмінесцентні властивості барвників групи Р в присутності БСА наведено в Табл. 2.

Максимуми поглинання барвників розташовані в межах 427-458 нм. На відміну від барвників групи D, ціаніни групи Р мають високу схильність до утворення агрегатів у водних розчинах, що призводить до суттєвих змін у спектрах поглинання та випромінювання. Для них спостерігається поява додаткової короткохвильової смуги (426-429 нм), що відповідає поглинанню Н-агрегатів, і значне розширення смуг поглинання. У спектрах флуоресценції барвників (окрім Р-2) агрегати проявляються у вигляді низько інтенсивної смуги з максимумом випромінювання, який зсунутий приблизно на 100 нм в довгохвильову ділянку спектра (560-580 нм) відносно максимуму випромінювання мономерної форми барвника. Інтенсивність випромінювання барвників на довжині хвилі максимумів випромінювання (І0) становить 0,05-0,72 в.о. (Табл. 2).

Таблиця 2

Спектральні характеристики барвників групи Р в вільному стані та в присутності 0.1 мг/мл БСА

Барвник | поглбуфер, нм | 0фл , нм | БСАфл, нм | І БСА, в.о. | І0, в.о. | І0*, в.о.

P-1 | 429, 452* | 579 | 483 | 1.20 | 0.72 | 0.12

P-2 | 440 | 486 | 482 | 1.57 | 0.47 | 0.47

P-3 | 441 | ~560 | 481 | 0.08 | 0.05 | 0.02

P-4 | 430 | 581 | 487 | 11.70 | 0.40 | 0.12

P-5 | 427, 448* | 575 | 484 | 18.40 | 0.29 | 0.16

P-6 | 437 | 575 | 482 | 1.18 | 0.36 | 0.20

P-7 | 426, 458* | 581 | 587 | 0.60 | 0.60 | 0,12

P-8 | 438 | 575 | 483 | 0.80 | 0.12 | 0,09

P-10 | 432 | 580 | 482 | 1.55 | 0.18 | 0,15

P-11 | 427 | 571 | 486 | 8.50 | 0,38 | 0,17

де І0* - інтенсивність випромінювання на довжині хвилі флуоресценції мономерного барвника.

Взаємодія з білком призводить до руйнування агрегаційних структур. В присутності БСА спостерігається випромінювання мономерної форми барвника. Для всіх ціанінів, окрім Р_, в присутності БСА максимуми флуоресценції розташовані в області 481-487 нм. Інтенсивність І0* випромінювання вільного барвника на цій ділянці спектра (0,02-0,47 в.о.) є помітно меншою, ніж І0. Таким чином, значна відстань між максимумами флуоресценції дозволяє легко відділити випромінювання вільного барвника від випромінювання його комплексу з білком (Рис. 8).

Збільшення інтенсивності флуоресценції ?QБСА ми визначаємо як відношення інтенсивності випромінювання барвника в присутності білка ІБСА до інтенсивності випромінювання вільного барвника І0*, виміряної на довжині хвилі максимуму флуоресценції комплексу барвника з білком (?QБСА = ІБСА/І0* ). Для барвників Р-4, Р-5 та P-11 при концентрації БСА 0.1 мг/мл підвищення інтенсивності випромінювання ?Q*БСА становить 97, 115 та 50 разів відповідно. При концентрації БСА 1 мг/мл ?Q*БСА дорівнює 600 для Р-4 та 750 для Р-5.

Отже, здатність запропонованих нами барвників утворювати агрегати у вільному стані, сильний довгохвильовий зсув смуг та зменшення інтенсивності випромінювання цих агрегатів по відношенню до смуг випромінювання мономерів барвників покращує чутливість визначення білків.

Барвники Р-4, Р-5 та Р-11, що проявили значне підвищення інтенсивності випромінювання в присутності БСА, мають ефекторні групи, які є похідними арилоцтових кислот. Ми вважаємо, що спорідненість барвників Р-4, Р-5 та Р-11 до БСА спричинена саме присутністю арилоцтової ефекторної групи, яка зв’язується із певним сайтом білка, що сформований на рівні третинної структури.

Дослідження специфічності взаємодії, рівня чутливості та впливу домішок на чутливість детекції протеїнів за допомогою барвника Р-5

Серед усіх синтезованих нами барвників ціанін Р-5 має найбільш перспективні властивості для застосування в якості флуоресцентного зонда для визначення БСА. Тому для цього барвника було проведено ряд додаткових досліджень, спрямованих на визначення специфічності барвника, рівня його чутливості та впливу домішок інших біополімерів на чутливість детекції.

Титрування барвника Р-5 (концентрація 10-6 М) БСА продемонструвало, що залежність збільшення інтенсивності флуоресценції від концентрації БСА є лінійною в діапазоні від 5 до 400 мкг/мл білка. Отже, за допомогою барвника P-5 можливо проводити кількісне визначення білка в цьому діапазоні концентрацій. Ми встановили, що присутність домішок НК лише в дуже великих концентраціях може впливати на чутливість визначення БСА за допомогою досліджених барвників. Присутність амінокислот в широкому діапазоні концентрацій не впливає на інтенсивність флуоресценції розчину барвника Р-5 і таким чином не заважає кількісному визначенню БСА.

З метою визначення специфічності зв’язування барвників Р-4 та Р-5 з білками ми провели дослідження спектрально-люмінесцентних властивостей барвників у присутності шести різних білків. Як вже було згадано вище, в присутності 0.1мг/мл БСА барвники Р-4 і Р-5 підвищують інтенсивності випромінювання приблизно на два порядки, тоді як у присутності ЛСА збільшення інтенсивності флуоресценції є незначним (в 11.50 і в 13.20 разів відповідно) (Табл. 3). При додаванні інших протеїнів до розчинів барвників підвищення інтенсивності випромінювання практично не спостерігалось. Отже, ціаніни Р-4 та Р-5 проявляють значну спорідненість до альбумінів, особливо до БСА.

Таблиця 3

Інтенсивність флуоресценції (I) та її зміна (?Q*) для барвників в присутності білків |

I та ?Q* барвників в присутності 0.1 мг/мл білка

БСА | ЛСА | Трипсін | лізоцим | Гемоглобін | Цитохром С

I, в.о. | ?Q* | I, в.о. | ?Q* | I, в.о. | ?Q* | I, в.о. | ?Q* | I, в.о. | ?Q* | I, в.о. | ?Q*

Р-4 | 11.7 | 97.50 | 1.38 | 11.50 | 0.13 | 1.10 | 0.15 | 1.30 | 0.10 | 0.83 | 0.11 | 0.90

Р-5 | 18.4 | 131.0 | 1.86 | 13.20 | 0.16 | 1.10 | 0.17 | 1.20 | 0.13 | 0.90 | 0.14 | 1.0

де Q* — збільшення інтенсивності випромінювання на довжині хвилі флуоресценції мономерного барвника

Відомо, що денатурація та зміна рН середовища призводять до змін третинної структури білка. Для того, щоб дослідити взаємодію барвника Р-5 з альбумінами, ми порівняли значення ДQ* цього барвника в присутності нативних та термічно денатурованих білків. При переході від нативного до денатурованого білка значення ДQ* в присутності БСА зменшується від 131.0 до 34.8, а в присутності ЛСА зростає від 13.2 до 33.9 (при цьому для обох денатурованих білків значення ДQ* практично однакове). Тому можна припустити, що зв’язування з глобулою БСА відбувається шляхом специфічної взаємодії з сайтом, сформованим на рівні третинної структури білка. При денатурації цей сайт руйнується і ми спостерігаємо зменшення ДQ*. Навпаки, з глобулою ЛСА барвник Р-5 взаємодіє неспецифічно, зв’язуючись з негативно зарядженою ділянкою поверхні через електростатичні, гідрофобні та Ван дер Ваальсові взаємодії. При денатурації білка поліпептидний ланцюг розгортається і кількість “посадкових” місць для барвника збільшується, внаслідок чого зростає величина ДQ*. Вивчення впливу рН середовища на флуоресцентні властивості барвника Р-5 в присутності БСА продемонструвало, що в лужному середовищі інтенсивність випромінювання його комплексів зростає, а в кислому, навпаки, зменшується. Оскільки третинна структура білка залежить від pH середовища, то подібні зміни флуоресцентних характеристик барвника можуть бути пояснені специфічною взаємодією молекули барвника з фрагментом третинної структури БСА.

ВИСНОВКИ

1. Запропоновано три нових підходи для синтезу (тіо)(піридо-4)монометинціанів з ефекторними групами. Вивчено реакцію монометинового пірилоціаніну Cyan 39 з первинними амінами, які мають різні замісники. Синтезовано та охарактеризовано 37 нових барвників.

2. Доведено, що наявність в складі молекули ціаніну спиртових ефекторних груп підвищує інтенсивність флуоресценції комплексів барвника з ДНК. Встановлено, що амінні ефекторні групи в складі барвників практично не впливають на їхні флуоресцентні властивості як у вільному стані, так і в присутності ДНК, РНК та білків.

3. Показано, що наявність багатоциклічних ароматичних ефекторних груп в складі барвників підвищує їх здатність до агрегації, що зменшує інтенсивність флуоресценції барвника у вільному стані та сприяє підвищенню чутливості детекції білка в розчині.

4. Показано, що барвники Р-4 та Р-5 специфічно підвищують інтенсивність випромінювання в присутності БСА на три порядки, що пов‘язано з наявністю в складі ефекторної групи структурного фрагменту арилоцтової кислоти.

5. Запропоновано для практичного використання флуоресцентні барвники для визначення ДНК (D-19) та РНК (D-8).

Список наукових праць, опублікованих за темою дисертації

1. Yarmoluk S. M., Kryvorotenko D.V., Gerasymchuk Yu.S. Interaction of cyanine dyes with nucleic acids. 6. Synthesis and spectroscopic properties of thiazole orange- amino acids conjugates // Біополімери і клітина. - 1999. - 15, №3. - C.247-251.

2. Криворотенко Д.В., Ковальська В.Б., Ярмолюк С.М. Взаємодія ціанінових барвників з нуклеїновими кислотами. 10. Синтез та спектральні властивості нових бензтіазоло-4-(2,6-диметилпіридинієвих) монометинових ціанінових барвників // Біополімери і клітина. - 2000. - 16, №2. - С.145 - 152.

3. Криворотенко Д.В, Ковальська В.Б., Ярмолюк С.М. Взаємодія ціанінових барвників з нуклеїновими кислотами. 16. Нові флуоресцентні бензтіазоло-4-(2,6-диметилпіридинієві) монометинові ціанінові барвники // Біополімери і клітина. - 2000. - 16, №4. - С.320 - 326.

4. Yarmoluk S.М., Kryvorotenko D.V, Kovalska V.B. Interaction of cyanine dyes with nucleic acids. XX. New methods of preparation of fluorescent probes based on benzothiazol-4-[2,6-dimethylpyridinium]cyanine dyes. Dyes and Pigments 2001; 48: 165-172.

5. Д.В. Криворотенко, М.Ю. Лосицький, А.О. Баланда, С.М. Ярмолюк. Білки та ціанінові барвники. IV. Бензтіазоло-4-[2,6-диметилпіридинієві] монометинові ціанінові барвники для гомогенної детекції білків // Вісник Національного університету “Львівська політехніка”. – 2000. – № 414, Хімія, технологія речовин та їх застосування. – С.127-135.

6. Kryvorotenko D.V. Kovalska V.B., Yarmoluk S.M. Synthesis and spectral properties of novel benzothiazolo -4-[2,6- dimehtylpyridine] monomehtyne cyanine dyes as possible fluorescent probes for nucleic acids detection // 8th Europ. Conf. Spectroscop. Biolog. Molec.(29 Aug. -2 Sept. 1999, Enschede, Netherlands): post-deadline papers - Enschede, 1999. - P. 13-14.

7. Криворотенко Д.В. Баланда А.О. Лосицький М.Ю. Ярмолюк С.М. Синтез та спектроскопічні дослідження бензтіазоло-4-[2,6-диметилпіридинієвих] монометинових ціанінових барвників для детекції білків в розчині // Перша всеукраїнська конференція студентів та аспірантів “Сучасні проблеми хімії” (Київ, 2000): тези доп. – Київ 2000. – С.84.

8. Криворотенко Д.В. Баланда А.О. Лосицький М.Ю. Бензтіазоло-4-[2,6-диметилпіридинієві] монометинові ціанінові барвники як флуоресцентні зонди для детекції білків в розчині // Міжнародна конференція “Хімія азотовмісних гетероциклів” (Харків, 2000): тези доп. - Харків 2000. - С.229.

9. Kryvorotenko D.V. Yarmoluk S.M. Balanda A.O. Losytskyy M.Yu. New fluorescent cyanine dyes for homogeneous detection of bovine serum albumin in solutions // Biotechnology and Environment. (19 – 22 Feb. 2001, Zagreb, Croatia): - Zagreb 2001. – P.55.

Криворотенко Д.В. (Тіо)(піридо-4)монометинціаніни для флуоресцентної детекції нуклеїнових кислот та білків. - Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата хімічних наук за спеціальністю 02.00.10- біоорганічна хімія. - Інститут біоорганічної хімії та нафтохімії НАН України, Київ, 2001.

Дисертація присвячена вивченню впливу ефекторних груп в складі (тіо)(піридо-4)монометинціанів на взаємодію з біополімерами. З метою розробки нових флуоресцентних ціанінових барвників для детекції біополімерів запропоновано три нових підходи для синтезу (тіо)(піридо-4)монометинціанів з різноманітними функціональними групами. Одержано 35 нових похідних 2,6-диметил-4-(3-метил-3Н-бензотіазол-2-іліденметил)-1-алкіл-піридиній перхлорату. Досліджено спектрально-люмінесцентні властивості синтезованих барвників та їх комплексів з ДНК, РНК та білками. Вивчено вплив природи функціональних груп на флуоресцентні властивості цих барвників та їх комплексів з біополімерами Запропоновано перспективні для практичного використання флуоресцентні барвники для визначення ДНК (D-19), РНК (D-8) та БСА (Р-5).

Ключові слова: (Тіо)(піридо-4)монометинціаніни, флуоресценція, детекція біополімерів.

Криворотенко Д.В. (Тио)(пиридо-4)монометинцианины для флуоресцентной детекции нуклеиновых кислот и белков. - Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата химических наук по специальности 02.00.10- биоорганическая химия. - Институт биоорганической химии и нефтехимии НАН Украины, Киев, 2001.

Диссертация посвящена изучению влияния эффекторных групп в составе (тио)(пиридо-4)монометинцианинов на взаимодействие с биополимерами. Эффекторной группой считается функциональный заместитель в составе молекулы красителя, практически не влияющий на хромофор. При этом наличие эффекторной группы способно влиять на взаимодействие красителя с биополимерами.

С целью разработки новых флуоресцентных цианиновых красителей для детекции биополимеров предложено три новых подхода к синтезу (тио)(пиридо-4)монометинцианинов с различными эффекторными группами. Для введения эффекторных групп в молекулу красителя предложили реакцию 2-(2,6-диметил-пиран-4-илиденметил)-3-метил-бензотиазолий перхлората (Cyan 39) с первичными алифатическими аминами. Для ковалентного связывания эффекторных групп с флуорофором красителя применена карбоксильная группа. Для активации карбоксильной группы цианина был использован карбонилдиимидазол. Также была предложена модификация эффекторными группами ацилированием карбоновыми кислотами цианинового красителя с аминогруппой. Получено 35 производных 2,6-диметил-4-(3-метил-3Н-бензотиазол-2-илиденметил)-1-алкил-пиридиний перхлората. Строение и индивидуальность полученных соединений были доказаны с помощью элементного анализа, ПМР- и электронной спектроскопии.

Изучены спектрально-люминесцентные свойства синтезированных красителей и их комплексов с биополимерами. Показано, что спиртовые группы в составе красителя Cyan 40 повышают стабильность комплексов с ДНК, что приводит к возрастанию интенсивности флуоресценции по сравнению с Cyan 40. При этом увеличение количества спиртовых групп в эффекторной группе приводит к повышению интенсивности флуоресценции комплекса. Присутствие многоциклических ароматических эффекторных групп в составе красителей повышает их способность к агрегации, что уменьшает интенсивность флуоресценции красителей в свободном состоянии и увеличивает чувствительность определения биополимера в растворе.

Исследование возможности использования цианина D-19 для визуализации НК в агарозном геле показало, что чувствительность определения НК этим красителем такая же, как и у широко распространённого бромистого этидия. Однако преимуществами цианиновых красителей являются более низкий уровень фоновой окраски агарозной пластины, более четко окрашенные полосы и отсутствие у цианинов токсических свойств по сравнению с бромистым этидием. Цианиновый краситель D-19 предложен нами для визуализации нуклеиновых кислот в гель электрофорезе.

Для конструирования флуоресцентных зондов для определения белков был использован принцип эффекторных групп. Красители Р-4, Р-5 и Р-11, которые проявили значительное повышение интенсивности излучения в присутствии БСА, имеют в своем составе эффекторные группы – производные арилуксусных кислот. В частности, краситель P-5, содержащий фрагмент 3-индолилуксусной кислоты проявил в присутствии 1 мг/мл БСА повышение интенсивности флуоресценции на три порядка. Показано, что сродство красителей Р-4, Р-5 и Р-11 к БСА объясняется присутствием арилуксусной эффекторной группы, которая связываеться со сформированным на уровне третичной структуры определённым сайтом белка.

Ключевые слова: (тио)(пиридо-4)монометинцианины, флуоресценция, детекция биополимеров.

Kryvorotenko D.V. (Thio)(pyrido-4)monomethyncyanines for fluorescent detection of nucleic acids and proteins. -Manuscript.

Thesis for a candidate’s degree in Chemical Sciences on speciality 02.00.10- bioorganic chemistry - The Institute of Bioorganic Chemistry and Petrochemistry of National Academy of Science of Ukraine, Kyiv, 2001.

The thesis is dedicated to the studies of the influence of “affinity-modifying groups” presented into the structure of (thio)(pyrido-4) monomethyncyanines on the interaction of the dyes with biopolymers. For the designing of novel fluorescent cyanine dyes for biopolymers detection were proposed three approaches of the synthesis of (thio)(pyrido-4)


Сторінки: 1 2