ЛЬВІВСЬКА ДЕРЖАВНА АКАДЕМІЯ ВЕТЕРИНАРНОЇ МЕДИЦИНИ

імені С.З. ГЖИЦЬКОГО

КРОТКИХ МИХАЙЛО ОЛЕКСАНДРОВИЧ

УДК 636.22/28.082

ОКИСНО-ВІДНОВНІ ПРОЦЕСИ В ТКАНИНАХ ЯЄЧНИКА, МАТКИ ТА НАДНИРКОВОЇ ЗАЛОЗИ КОРІВ І ТЕЛИЦЬ ЗАЛЕЖНО ВІД СТАНУ РЕПРОДУКТИВНОЇ СИСТЕМИ

03.00.13—фізіологія людини і тварин

Автореферат дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата ветеринарних наук

Львів 2001

Дисертацією є рукопис.

Роботу виконано на кафедрі фізіології і біохімії сільськогосподарських тварин Одеського державного аграрного університету Міністерства аграрної політики України

Науковий керівник: доктор біологічних наук, професор Смолянінов Борис Вікторович, Одеський державний аграрний університет, завідувач кафедри фізіології і біохімії сільськогосподарських тварин.

Офіційні опоненти:

-доктор ветеринарних наук, с.н.с. Стояновський Володимир Григорович, Львівська державна академія ветеринарної медицини імені С.З. Гжицького, професор кафедри фармакології і патологічної фізіології;

- кандидат біологічних наук Шаран Микола Михайлович, Інститут біології тварин УААН, завідувач лабораторії біотехнології і відтворення.

Провідна установа:

Дніпропетровський державний аграрний університет, кафедра нормальної і патологічної фізіології тварин, Міністерство аграрної політики України.

Захист відбудеться 25.12.2001р. о 14 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 35.826.01 у Львівській державній академії ветеринарної медицини імені С.З. Гжицького за адресою: 79010, м. Львів, вул. Пекарська, 50, аудиторія №1.

З дисертацією можна ознайомитися у бібліотеці Львівської державної академії ветеринарної медицини імені С.З. Гжицького за адресою: 79010,

м. Львів-10, вул. Пекарська, 50.

Автореферат розісланий 24.11.2001р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради,

кандидат біологічних наук,

доцент Головач П.І.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. На сучасному етапі розвитку тваринництва вирішального значення набуває підвищення відтворної здатності тварин. Цієї мети можна досягти шляхом впровадження та розвитку інтенсивних методів відтворення, насамперед, трансплантації ембріонів та клонування.

Опанування цими новими методами потребує всебічного вивчення фізіологічних процесів, що відбуваються в ендокринній та статевій системах самиць тварин протягом статевого циклу, вагітності та за умов патології, пов’язаної з безпліддям. Цінними в цьому відношенні є зміни в біоенергетичних процесах у тканинах ендокринних залоз та матки.

Виходячи з даних (McIntosh J. et al., 1973; Телевич О.З., 1976; Смолянінов Б.В., 1984; Бучко А.М., 1988; Любомська О.В., 1996), отриманих в результаті вивчення біологічного окислення в тканинах статевих органів, можна впевнено судити про залежність цих процесів від стану репродуктивної системи.

Основні етапи стероїдогенезу в яєчниках та надниркових залозах однакові (Бейрд Т.Д., 1987). Надниркова залоза впливає на метаболізм в інших органах через інкрецію як стероїдних гормонів, так і катехоламінів, що викликають зміни у морфології цих органів, рівні тканинних обмінних процесів в них, а також приймає участь в механізмі генерації стресу (Муртузов Г.М., Мамедов І.Б., 1994; Стояновський В.Г., 2000). Таким чином, порівняння процесів окисного фосфорилювання та активності дихальних ферментів в статевих органах та надниркових залозах має велике значення у вивченні взаємодії ендокринної та статевої систем.

Окремими технологічними етапами інтенсивних методів підвищення репродуктивної здатності сільськогосподарських тварин є викликання суперовуляції, синхронізація охоти та поліпшення приживлення ембріонів. З цією метою традиційно використовується ціла низка природних та синтетичних гормональних препаратів—аналогів гіпоталамічного гонадотропін-рілізінг-гормону, гонадотропних гормонів та простагландину F2б (Смолянінов Б.В., 1980; Бучко А.М., 1986; Шаран М.М.,1993; Любомська О.В., Смолянінов Б.В., 1996; Juengel J.L. et al., 2000). Останнім часом у складі середовищ отримання та зберігання ембріонів поза організмом матері використовуються сироватка крові плодів, сироватка крові самиць тварин, яка отримана під час овуляції та фолікулярна рідина (Butzow T.L. et al., 1999; Гузеватий О.Е. з співавт., 2000; Жернокльов Г.В., 2001). Проте, механізм дії цих рідин на запліднення та розвиток ембріону, зокрема—на біоенергетичні процеси в гаметах та інших клітинах статевих органів залишається здебільшого невідомим. Виходячи з усього вищезазначеного, встановлення залежності між ефективністю дії гормональних препаратів і біологічних рідин та їх впливом на інтенсивність процесів біологічного окислення в ендокринних та статевих органах in vitro могло б значно зменшити витрати коштів та часу при пошуку оптимальних схем викликання суперовуляції, синхронізації охоти, культивування ембріонів in vitro та лікування різних форм функціональної патології яєчника. До того ж, даних про прямий вплив гормонів на біологічне окислення в мітохондріях тканин гонад в літературі майже немає, тому великий науковий та практичний інтерес виникає до порівняння впливу природних та штучних джерел гуморальних факторів на неушкоджені клітини та вільні мітохондрії ендометрію, жовтого тіла і надниркової залози.

Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дана робота є частиною теми “Вивчити інтенсивність енергетичного обміну в зв’язку з регуляторною дією окремих гормонів і рівнем продуктивності тварин”, дослідження згідно якої проводяться на кафедрі фізіології та біохімії сільськогосподарських тварин Одеського державного аграрного університету. Номер державної реєстрації—0101V000752.

Мета і задачі дослідження. Метою дослідження було встановити рівень енергетичних процесів в органах репродуктивної системи та надниркових залозах корів і телиць впродовж статевого циклу та під впливом препаратів, що володіють гонадотропною активністю.

У завдання роботи входило дослідити:—

залежність інтенсивності окисного фосфорилювання, активності АТР-ази, сукцинатоксидази, цитохромоксидази, NADH-оксидази, креатинкінази та вмісту аскорбінової кислоти в гомогенатах і мітохондріях ендометрію, жовтого тіла та надниркової залози, гомогенатах жовтого тіла і суспензії клітин гранульози фолікула залежно від стадії статевого циклу;—

вплив тільності та деяких форм функціональної патології яєчника (гіпофункції, персистенції жовтого тіла, фолікулярної та лютеїнової кісти) на окисне фосфорилювання, активність дихальних ферментів і АТР-ази та вміст аскорбінової кислоти в тканинах ендометрію, яєчника та надниркової залози;—

зміни інтенсивності тканинного дихання під впливом біологічних рідин (рідини з передовуляторного фолікула, амніотичної рідини, сироватки крові корів в період овуляції) у тканинах статевих органів та надниркових залоз у порівнянні з гонадотропін-рілізінг гормоном і простагландином F2б.

Об’єктом дослідження був енергетичний метаболізм в органах статевої та ендокринної систем корів та телиць.

Предметом дослідження були ферментативні реакції, що характеризують інтенсивність процесів біологічного окислення в статевих органах та надниркових залозах залежно від функціонального стану яєчника.

Методи дослідження: у дослідженні використовувалися морфометричні та фізіолого-біохімічні методи.

Наукова новизна одержаних результатів. Уперше отримано дані, які характеризують закономірності змін інтенсивності біологічних окисних процесів в мітохондріях тканин ендометрію, жовтого тіла та надниркової залози, а також у клітинах гранульози корів і телиць залежно від стадії статевого циклу, а також під час вагітності, персистенції жовтого тіла, гіпофункції яєчника, лютеїнової та фолікулярної кіст яєчника. Виявлено залежність між окислювальним фосфорилюванням у мітохондріях і гомогенатах органів ендокринної та репродуктивної систем. Виявлено також певні закономірності впливу біологічних рідин, що містять гонадотропіни, статеві стероїди, простагландини, фактори росту в фізіологічних концентраціях та співвідношеннях, а саме рідини преовуляторного фолікула, амніотичної рідини та сироватки крові овулюючих корів, на інтенсивність тканинного дихання в гомогенатах і мітохондріях досліджуваних тканин. Досліджено залежність впливу біологічних рідин на окисне фосфорилювання в тканинах від стадії статевого циклу, тільності, функціональної патології яєчника.

Практичне значення одержаних результатів. Отримані експериментальні дані щодо взаємозв’язку функціонального стану гонад та активності тканинного дихання в них можуть бути застосовані для прогнозування відтворної здатності тварин і корекції неповноцінних статевих циклів. Вивчення впливу фолікулярної, амніотичної рідини і сироватки крові овулюючих корів на метаболічні процеси в тканинах яєчника доцільно використати з метою отримання та культивування in vitro ембріонів. Отримані дані щодо гормональної регуляції біоенергетичних процесів в ізольованих тканинах статевих органів можуть бути використані для тестування гормональних препаратів.

Особистий внесок дисертанта. Роботи з організації дослідів, розроблення схеми досліджень та проведення всього обсягу експериментальних досліджень виконані здобувачем самостійно. Робоча програма досліджень розроблена спільно з науковим керівником.

Апробація результатів дисертації. Результати досліджень і основні положення дисертації висвітлені в доповідях на міжнародній конференції з фізіології і біохімії тварин, присвяченій 100-річчю від дня народження проф. С.З.Гжицького (Львів, 27-29 січня 2000 р.); міжнародній науковій конференції “С.З. Гжицький і сучасна аграрна наука”, присвяченій 100-річчю від дня народження Степана Гжицького (Львів, 4—6 травня 2000р.); науковій конференції професорсько-викладацького складу, наукових співробітників та аспірантів Одеського державного сільськогосподарського інституту (Одеса, березень 2000р.); науковій конференції професорсько-викладацького складу, наукових співробітників та аспірантів Одеського державного сільськогосподарського інституту (Одеса, березень 2001р.).

Публікації. За основними результатами, представленими в дисертації, опубліковано 6 статей.

Структура й обсяг дисертації. Дисертаційну роботу викладено на 156 сторінках друкованого тексту, вона ілюстрована 31 таблицею і складається зі вступу, 4 розділів та списку літератури з 239 найменувань.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Матеріали і методи досліджень. Експериментальна частина роботи виконана впродовж 1998-2001рр. в лабораторії кафедри фізіології і біохімії сільськогосподарських тварин Одеського державного аграрного університету. Для досліджень було використано 124 корови і статевозрілі телиці червоної степової породи на різних стадіях статевого циклу та з деякими формами функціональної патології яєчника, а також корови у перші 45 днів тільності. Матеріал для дослідження (яєчники, матку, надниркові залози) відбирали після забою тварин на Одеському м’ясокомбінаті. Стадію статевого циклу, період тільності та форму функціональної патології визначали в ході морфологічного дослідження матки та яєчників. З великих фолікулів виділяли фолікулярну рідину, з якої отримували клітини гранульози. З цією метою фолікулярну рідину центрифугували 10 хвилин при 3000g, надосадкову рідину виливали, осадок ресуспендували фолікулярною рідиною. Концентрацію гранульозних клітин підраховували в камері Горяєва. З гомогенатів (Г) ендометрію, жовтого тіла та надниркової залози шляхом диференційного центрифугування отримували мітохондрійну фракцію (МХ). Інтенсивність поглинання кисню та активність сукцинатоксидази, цитохромоксидази, NADH-оксидази та креатинкінази визначали полярографічним методом (Кондрашова М.Н., Ананeнко А.А., 1973) на полярографі ЛП-7 (Чехія). В Г і МХ ендометрію, жовтого тіла, надниркової залози та Г строми яєчника методом полярографії визначали активність сукцинатоксидази, NADH-оксидази, цитохромоксидази та креатинкінази (Рахимов М.И., Алматов К.Т., 1977), а в суспензії клітин гранульози—активність сукцинатоксидази. Активність ферментів виражали в мкатомах кисню, який був поглинутий 1мг білка за хвилину при 260С (мкатомО2/мг білка/хв) для Г і МХ та у мкатомах кисню, який був поглинутий на 1000 клітин за хвилину при 260С для суспензії гранульози (мкатомО2/1000кл./хв). Активність загальної Mg-залежної АТР-ази в Г і МХ тканин визначали за методом, описаним О.Ф. Терещенко з співавт., 1972.

Концентрацію аскорбінової кислоти в тканинах ендометрію, строми яєчника, жовтого тіла, надниркової залози визначали за методом Roe (Савченко О.Н., 1967).

Вплив гонадотропін-рілізінг гормону (ГНРГ) та простагландину F2б на жовте тіло вивчали у Г і МХ жовтих тіл при всіх досліджуваних формах лютеїнізації. Вплив гонадотропін-рілізінг гормону та простагландину F2-alpha на функціональний стан ендометрію вивчали in vitro в Г і МХ цієї тканини корів, забитих в стадію овуляції. Для вивчення впливу простагландину використовували препарат “Естрофан” (Чехія), а для вивчення дії гонадотропін-рілізінг гормону— синтетичний агоніст ГнРГ—“Сурфагон” (Росія). В першій серії дослідів вивчали вплив гонадотропін-рілізінг гормону та простагландину F2б на інтенсивність сукцинатоксидазної та NADH-оксидазної реакції в ендометрії та жовтому тілі корів і телиць. З метою дослідження впливу стандартизованих препаратів на сукцинатоксидазну активність їх додавали у стані дихання V4 досліджуваного Г або МХ, а при вивченні NADH-оксидазної активності—відразу після реєстрації максимальної інтенсивності поглинання кисню після додавання NADH. В другій серії дослідів вивчали вплив простагландину F2б на активність Mg-залежної АТР-ази в жовтих тілах корів та телиць при різних формах лютеїнізації.

З метою вивчення впливу іонів кальцію на інтенсивність сукцинатоксидазної реакції в ендометрії розчин CaCl2 додавали перед внесенням сукцинату до інкубаційного середовища і під час полярографічного дослідження. Активність сукцинатоксидази визначали методом полярографії без додавання у середовище ADP. Аналогічним методом досліджували вплив іонів Са2+ на інтенсивність NADH-оксидазної реакції. Отримані дані порівнювали зі значеннями активності сукцинатоксидази та NADH-оксидази в середовищі без додавання кальцію.

З метою дослідження впливу фолікулярної, амніотичної рідин та естральної сироватки крові корів на інтенсивність тканинних енергетичних процесів в репродуктивних органах та надниркових залозах корів і телиць ці рідини додавали in vitro до полярографічної комірки.

Концентрацію естрадіолу та прогестерону в біологічних рідинах досліджували радіоімунним методом в багатопрофільній діагностичній лабораторії Одеського пологового будинку №5.

РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ

1.Зміни інтенсивності окисного фосфорилювання, активностей дихальних ферментів та концентрації аскорбінової кислоти в гонадах і надниркових залозах корів і телиць на протязі статевого циклу

Результати проведених нами морфометричних досліджень свідчать про те, що в корів, на відміну від телиць, наявна функціональна асиметрія яєчників. В більшості корів правий яєчник більший за лівий (8,3±0,7 проти 7,8±0,3г у фолікулярну стадію циклу), в той час як у телиць обидва яєчники розвинуті приблизно однаково (5,5±1,6 і 5,25±2,1г у фолікулярну стадію циклу). Найбільша середня кількість фолікулів діаметром 0,8 см та більше виявлена в яєчниках корів у лютеальну стадію статевого циклу (0,42±0,01шт. у лівому та 1,8±0,27шт. у правому яєчниках), а в телиць—під час овуляції (0,58±0,04шт. та 0,63±0,13шт. відповідно).

Отже, результати морфометричних досліджень свідчать про те, що функціональна асиметрія яєчників не є вродженою, а формується під час фізіологічного дозрівання. Підвищення кількості великих фолікулів в яєчнику корів під час лютеїнової стадії циклу свідчить про те, що на цій стадії гальмується овуляція, але відбувається інтенсивний фолікулогенез (друга та третя його хвилі), що призводить до накопичення фолікулів.

Установлено, що в Г і МХ ендометрію, жовтого тіла, строми яєчника та надниркової залози активність сукцинатоксидази та NADH-оксидази вища в групах тварин з функціонуючим жовтим тілом. Ця активність, порівняно з фолікулярною стадією статевого циклу, особливо зростала під час тільності (табл.1).

Таблиця 1

Інтенсивність поглинання О2 ендометрієм корів на окремих стадіях статевого циклу при окисленні сукцинату (мкатом О2 / мг білка / хв). M±m, n=4—8

Стадія циклу, стан яєчника | V3 | V4 | ДК | МХ | Г | МХ | Г | МХ | Г | Фолікулярна | 17,05± 0,57 | 9,34± 0,23 | 6,96± 0,27 | 4,93± 0,17 | 2,45 | 1,9 | Овуляція | 35,45± 1,12*** | 14,07± 0,45*** | 12,10±0,37*** | 5,35± 0,082,93 | 2,63 | Лютеальна | 42,69± 1,24*** | 12,94± 0,42*** | 13,50± 0,34***5,86± 0,15** | 3,16 | 2,7 | Тільність до 45 днів | 49,09± 1,46***26,52± 0,84*** | 16,04± 0,57*** | 9,04± 0,28*** | 3,06 | 2,94 | Тільність більше 45 днів | 44,56± 1,39*** | 24,07±0, 66*** | 14,42± 0,46***8,10±0,25*** | 3,09 | 2,97 | Лютеїнова кіста | 44,31± 1,45*** | 25,17± 0,76*** | 14,24± 0,38*** | 8,42± 0,21*** | 3,11 | 2,99 | Фолікулярна кіста | 42,17± 1,26*** | 18,08± 0,52*** | 13,47± 0,32*** | 6,65± 0,17*** | 3,13 | 2,72 | Гіпофункція | 32,07± 0,59*** | 8,65± 0,24 | 12,63± 0,31*** | 4,26± 0,18* | 2,54 | 2,03 | Персистентне жовте тіло тільності | 53,03± 1,82*** | 17,76± 0,44*** | 22,02± 0,69*** | 7,59±0,29*** | 2,41 | 2,34 |

Ці групи тварин, за виключенням корів із персистентним жовтим тілом, характеризувалися також збільшенням дихального контролю

Примітка. У цій та наступній таблиці ступінь вірогідностір?0,05*; р?0,01**; р?0,001***

сукцинатоксидазної реакції в ендометрії порівняно з фолікулярною стадією статевого циклу. Про збільшення інтенсивності метаболічних процесів у

тканинах даних груп тварин свідчить також підвищення активності цитохромоксидази та АТР-ази. Зміни активності цитохромоксидази, виявлені в стромі яєчника, були протилежні до змін активності фермента у тканині жовтого тіла. Отримані дані свідчать про те, що найвища цитохромоксидазна активність спостерігалася в цій тканині у зародковий період тільності (31,78±0,88 мкатом О2/мг білка/хв), при лютеїновій (28,26±0,82 мкатом О2/мг білка/хв) і фолікулярній (28,53±0,78 мкатом О2/мг білка/хв) кістах яєчника, персистенції жовтого тіла (28,07±0,48 мкатом О2/мг білка/хв) та гіпофункції яєчника (27,21±0,58 мкатом О2/мг білка/хв). У телиць активність цитохромоксидази в стромі яєчника була найвищою у лютеальну стадію статевого циклу (27,61±0,89 мкатом О2/мг білка/хв).

Нами встановлено високу інтенсивність тканинного дихання в матці та клітинах гранульози в тварин з активно функціонуючим жовтим тілом, яка узгоджується з даними L.H. Anderson et al., 1996. Ці дані свідчать про те, що введений нестатевозрілим телицям гестаген викликає зростання лютеїнізуючого гормону (ЛГ), збільшення маси матки і розміру фолікулів. В гранульозних клітинах доведено ключову роль прогестерону в регуляції стероїдогенезу (Chaffin C.L. et al., 2000). Найвищу активність сукцинатоксидази встановлено в клітинах гранульози корів під час лютеальної фази статевого циклу порівняно з фолікулярною фазою (45,12± 1,34 проти 34,30± 1,13 мкатом О2/мг білка/хв). Подібні циклічні зміни сукцинатоксидазної активності спостерігалися і в гранульозі великих фолікулів телиць. Тільність супроводжувалася подальшим зниженням сукцинатоксидазної активності в гранульозі (28,83±0,88)мкатом О2/мг білка/хв. Найнижча сукцинатоксидазна активність у порівнянні з фолікулярною фазою циклу (9,30±0,24 мкатом О2/мг білка/хв) спостерігалася в гранульозі великих фолікулів під час персистенції жовтого тіла.

Найвищу активність NADH-оксидази в гранульозній тканині зареєстровано в корів під час лютеальної фази статевого циклу (58,54±1,44 проти 34,30± 1,13 мкатом О2/мг білка/хв у фолікулярну фазу статевого циклу). Під час тільності, особливо в перші 45 днів, інтенсивність окислення NADH також була високою (30,52±0,95 мкатом О2/мг білка/хв). У фолікулярну фазу статевого циклу, особливо в телиць, і за умов персистенції жовтого тіла NADH-оксидазна активність в гранульозі була низькою порівняно з іншими групами досліджуваних тварин (6,94±1,29 мкатом О2/мг білка/хв).

В тканині надниркової залози корів також можна простежити залежність активності цитохромоксидази від функціональної активності жовтого тіла, проте в телиць такої залежності виявити не вдається. дослідженні активності цитохромоксидази та NADH-оксидази в наднирковій залозі корів і телиць протягом статевого циклу, початку тільності та за умов деяких форм функціональної патології яєчника встановлено, що фолікулярна стадія статевого циклу та овуляція характеризувалися відносно невисокою швидкістю окислення цитохрому с в МХ (22,35 ± 0,97 та 25,24±0,82 мкатом О2/мг білка/хв відповідно). Лютеальна стадія статевого циклу (29,96± 1,88 мкатом О2/мг білка/хв), тільність, особливо перші 45 днів (32,11 ± 0,73 мкатом О2/мг білка/хв), гіпофункція яєчника (30,53±1,39 мкатом О2/мг білка/хв), персистенція жовтого тіла (33,19±1,47 мкатом О2/мг білка/хв) і лютеїнова кіста (34,46±1,47 мкатом О2/мг білка/хв), супроводжувалися в корів помітним зростанням цитохромоксидазної активності МХ з тканин надниркової залози. Дещо менш значне зниження активності цитохромоксидази спостерігалося в тканині надниркової залози корів з фолікулярною кістою яєчника. В телиць, на відміну від корів, окислення цитохрому с в МХ та Г надниркової залози найінтенсивніше протікало під час фолікулярної стадії статевого циклу (26,15 ± 0,72 мкатом О2/мг білка/хв). В момент овуляції спостерігалося зниження цитохромоксидазної активності надниркової залози, яке тривало також під час лютеальної стадії циклу. Найнижчу активність цитохромоксидази в тканині надниркової залози телиць зафіксовано за умов гіпофункції яєчника (21,53±1,49 мкатом О2/мг білка/хв).

Зміни інтенсивності окислення NADH в наднирковій залозі у різні стадії статевого циклу в корів були незначними. Найнижча активність NADH-оксидази в наднирковій залозі телиць встановлена в фолікулярну фазу статевого циклу (24,15± 1,32 мкатом О2/мг білка/хв). Під час овуляції та лютеальної стадії циклу NADH-оксидазна активність зростала до 25,86±1,97 і 24,82±1,04 мкатом О2/мг білка/хв відповідно, а за умов гіпофункції яєчника—до 33,08±0,92 мкатом О2/мг білка/хв. Ці результати узгоджуються з даними Z.Szymanski, 1998, які вказують на те, що синтез гестагенів й андрогенів в клітинах кори надниркової залози залежить від концентрації ЛГ в культуральному середовищі. Вони також можуть свідчити про залежність інтенсивності тканинного дихання в наднирковій залозі від вмісту в крові ЛГ, а не прогестерону, і обумовлена функцією гіпофізу, яка стимульована прогестероном жовтого тіла або плаценти.

Встановлено, що найнижчою активністю сукцинатоксидазної реакції характеризувалися МХ циклічного жовтого тіла корів (11,28±0,37 мкатом О2/мг білка/хв). Валовий рівень окислення сукцинату в циклічному жовтому тілі телиць був майже удвічі вищим, ніж у корів (21,81±0,67 проти 11,28±0,37 мкатом О2/мг білка/хв). На початку тільності (до 45 днів) інтенсивність сукцинатоксидазної реакції в мітохондріях жовтого тіла зростала більше, ніж утричі (37,37±0,86 проти 11,28±0,37 мкатом О2/мг білка/хв). МХ лютеїнової кісти характеризувалися відносно невисокою інтенсивністю сукцинатоксидазної реакції (28,18±1,17 мкатом О2/мг білка/хв). Найвищим рівнем окислення сукцинату (35,26-±1,21 мкатом О2/мг білка/хв) характеризувалися МХ персистентного жовтого тіла. Подібні закономірності, з деякими відмінностями, спостерігалися і для креатинкіназної реакції в жовтому тілі. Найнижчою активністю креатинкінази характеризувалися МХ циклічного жовтого тіла телиць (22,34±0,74 мкатом О2/мг білка/хв). Найвища активність креатинкінази встановлена в МХ персистентного жовтого тіла та жовтого тіла тільності віком більше 45 днів (23,11±0,70 мкатом О2/мг білка/хв).

При дослідженні концентрації аскорбінової кислоти в тканинах статевої системи та наднирковій залозі встановлено, що вона є найвищою на початку тільності, під час лютеальної стадії статевого циклу та лютеїнової кісти, низька у фолікулярну фазу циклу, під час персистенції жовтого тіла та особливо при гіпофункції яєчника (табл.2). Серед досліджуваних тканин найвищою концентрацією аскорбінової кислоти характеризувалися жовте тіло та надниркова залоза, найнижчою—фолікулярна рідина.

Таблиця 2

Концентрація аскорбінової кислоти (мкг / %) в окремих тканинах корів та телиць протягом статевого циклу. M±m, n=4—8

Стадія циклу, стан яєчника | Ендомет рій | Строма яєчника | Жовте тіло | Надниркова залоза | Фолікулярна рідина | Корови. Фолікулярна | 26,7±0,47 | 38,2±0,58 | 82,7±0,19 | 10,3±0,21 | Овуляція | 27,0±0,86 | 41,7±1,23 | 92,3±2,81* | 11,3±0,33 | Лютеальна | 27,3±0,32 | 41,1±0,72* | 110,7±1,86 | 96,5±3,14** | 12,6±0,22*** | Тільність до 45 днів | 32,4±0,64*** | 50,6±1,67*** | 131,8±2,43 | 172,1±4,20*** | 18,3±3,7 | Тільність більше 45 днів | 24,3±0,41** | 46,5±1,50** | 125,3±1,87 | 160,8±3,43*** | 17,8±0,52*** | Лютеї нова кіста | 25,5±0,67 | 48,4±1,49** | 127,6±3,92 | 108,2±3,27** | Фолікулярна кіста | 28,9±0,82 | 40,7±1,28 | 143,4±4,30*** | Персистентне жовте тіло | 29,3±0,76* | 32,5±1,04** | 52,4±1,51 | 96,1±2,79** | 15,4±0,47*** | Гіпофункція яєчника | 18,9±0,61*** | 32,0±0,80** | 82,2±2,23 | Телиці. Фолікулярна | 22,3±0,53 | 37,5±0,48 | 81,0±2,27 | 12,8±0,41 | Овуляція | 23,8±0,49 | 40,2±1,25 | 104,6±2,91** | 14,7±0,38* | Лютеальна | 24,2±0,73 | 43,3±0,97** | 100,4±2,30 | 120,3±1,78*** | 16,2±0,35***

Гіпофункція яєчника | 16,1±0,44*** | 26,8±0,82*** | 62,8±1,24**

2. Вплив добавок фолікулярної, амніотичної рідини, естральної сироватки та деяких гормональних препаратів на окисне фосфорилювання в гомогенатах тканин матки та яєчника

Проведені дослідження показали, що додавання фолікулярної, амніотичної рідини та естральної сироватки in vitro до гомогенатів ендометрію та окремих тканин яєчника проявляло певний вплив на активність дихальних ферментів. Так, фолікулярна рідина неоднаково впливає на активність сукцинатоксидази, NADH-оксидази та цитохромоксидази в досліджуваних тканинах. Зокрема, встановлено, що в ендометрії, лютеальній тканині та стромі яєчника корів фолікулярна рідина найактивніше прискорює окислення сукцинату у перші 45 днів тільності (на 74, 64 та 124% відповідно) та при персистенції жовтого тіла (на 227, 278 і 135% відповідно), а в телиць—у лютеальну стадію циклу (рис.1).

Амніотична рідина порівняно з фолікулярною у всіх досліджуваних тканинах чинить менш виразний вплив на активність сукцинатоксидази, але більш виразний—на активність NADH-оксидази. Закономірності змін впливу амніотичної рідини на ці реакції залежно від стану яєчника подібні таким для фолікулярної рідини.

Рис. 1. Вплив фолікулярної, амніотичної рідин та естральної сироватки на інтенсивність сукцинатоксидазної реакції в гомогенатах ендометрію корів. Примітка: Ф-фолікулярна стадія, О-овуляція, Л-лютеальна стадія, Т-тільність, Г-гіпофункція яєчника, П-персистенція жовтого тіла.

Отримані дані, які наведені на рис. 1, засвідчують, що найінтенсивніше підвищення сукцинатоксидазної активності під впливом естральної сироватки спостерігається в ендометрії циклуючих корів. Це підвищення було найбільш виразним у фолікулярну стадію статевого циклу. Оскільки концентрація статевих стероїдів у використаній нами сироватці невисока, а концентрація гонадотропних гормонів в корів за 12—24 години після з’явлення ознак тічки сягає максимуму, то слід вважати відповідальними за ефект естральної сироватки на тканинне дихання в досліджуваних тканинах саме гонадотропні гормони.

Фолікулярна рідина чинить найактивніший стимулюючий вплив на окислення сукцинату в МХ та Г ендометрію в перші 45 днів тільності та при персистенції жовтого тіла, а в телиць—у лютеальну стадію статевого циклу. Як відомо (Piva M., Flieger O., Rider V., 1996), такі фактори фолікулярної рідини, як bFGF, IGF-I, PDGF, TGF-beta, проявляють свою специфічну активність, зокрема на ендометрій, лише в присутності прогестерону, що є основним гормональним компонентом фолікулярної рідини. Ці дані свідчать про те, що різний за інтенсивністю вплив фолікулярної рідини в різних групах тварин на сукцинатоксидазну активність в досліджуваних тканинах не можна пояснити різною концентрацією стероїдних гормонів в крові цих тварин, а скоріше свідчить про дійсні зміни чутливості тканин до гормонів фолікулярної рідини. Оскільки вміст естрадіолу в фолікулярній та амніотичній рідинах майже однаковий, а вміст прогестерону в амніотичній рідині набагато нижчий за такий в рідині фолікула та за рівень естрадіолу в самій амніотичній рідині, то вплив фолікулярної рідини на тканинне дихання слід розглядати саме як вплив прогестерону, а основною складовою амніотичної рідини, що впливає на тканинне дихання, треба вважати естрогени.

При дослідженні впливу біологічних рідин на активність АТР-ази в лютеїновій тканині встановлено, що реакція прискорювалася при додаванні фолікулярної рідини та естральної сироватки найактивніше за все (на 76 і 83% відповідно) в циклічному жовтому тілі та в жовтому тілі тільності (на 51 і 67% відповідно). Естрофан, на відміну від біологічних рідин, при додаванні до інкубаційного середовища гальмував АТР-азну реакцію (рис. 2).

Рис.2. АТР-азна активність гомогенатів жовтого тіла корів і вплив на неї фолікулярної рідини, естральної сироватки та естрофану.

Примітка: Ц-статевий цикл, Т-тільність, П-персистенція жовтого тіла, К-лютеїнова кіста.

Виходячи з цих даних, можна зробити висновок, що в стероїдпродукуючих тканинах яєчника, надниркової залози та в ендометрії активність впливу естральної сироватки на тканинне дихання знаходяться у зворотній залежності від функціональної активності жовтого тіла.

Вплив естрофану та сурфагону на активність сукцинатоксидази та NADH-оксидази в жовтому тілі значно більший під час статевого циклу та тільності, менш виразний—в персистентному жовтому тілі та тканині лютеїнової кісти (рис. 3).

Рис. 3. Вплив естрофану (ЕФ) та сурфагону (СГ) на інтенсивність сукцинатоксидазної реакції в жовтому тілі корів та телиць.

Примітка: Ц -статевий цикл, Т-тільність, П-персистенція, К-лютеїнова кіста.

Стимулюючий вплив сурфагону на активність сукцинатоксидази та NADH-оксидази в жовтому тілі in vitro свідчить про наявність позагіпофізарного механізму дії ГнРГ на енергетичний метаболізм в яєчнику поряд з механізмом, опосередкованим гонадотропними гормонами гіпофізу, а прискорення сурфагоном сукцинатоксидазної та NADH-оксидазної реакцій в ізольованій тканині ендометрію—про можливість не лише позагіпофізарного, а й позаоваріального впливу ГнРГ на статеву систему самиць.

ВИСНОВКИ

1. Рівень тканинних дихальних процесів в стромі яєчника, гранульозній тканині, жовтому тілі та ендометрії корів і телиць змінюється залежно від фізіологічного стану репродуктивної системи (стадії статевого циклу, періоду тільності, функціональної патології яєчника).

2. Інтенсивність сукцинатоксидазної, NADH-оксидазної, цитохром-оксидазної та АТР-азної активності, а також концентрація аскорбінової кислоти в тканинах яєчника та ендометрію знаходяться в прямій залежності від функціональної активності жовтого тіла, яка є високою у лютеальну стадію статевого циклу, на початку тільності, особливо у перші 45 її днів, та при лютеїновій кісті.

3. В ізольованих мітохондріях ендометрію, жовтого тіла та надниркової залози активність сукцинатоксидази, креатинкінази, NADH-оксидази та цитохромоксидази вища порівняно з гомогенатами цих тканин, а зміни активностей цих ферментів під час статевого циклу, тільності та функціональної патології яєчника в мітохондріях більш виразні порівняно з гомогенатами.

4. Інтенсивність тканинного дихання в клітинах гранульози вища за наявності в середовищі суспендування фолікулярної рідини, яка є одночасно продуктом життєдіяльності фолікулярного епітелію та природним середовищем для нього.

5. Вплив фолікулярної рідини, що містить високі фізіологічні концентрації прогестерону, естрогенів, інгібину та інших факторів росту, на окисно-відновні процеси в тканинах статевої системи та надниркових залоз корів і телиць найбільш інтенсивний в момент овуляції та під час існування жовтого тіла.

6. Вплив амніотичної рідини від корів, забитих на третьому-четвертому місяці тільності, яка містить концентрації естрогенів, подібні таким в фолікулярній рідині та набагато нижчі концентрації прогестерону, чинить на окисно-відновні процеси в гонадах та надниркових залозах ефект, менш виразний порівняно з фолікулярною рідиною, однак вплив амніотичної рідини на тканинне дихання в ендометрії більш виразний порівняно зі впливом на ці процеси фолікулярної рідини.

7. Вплив сироватки крові корів, що відібрана під час овуляції та містить пікові фізіологічні концентрації гонадотропних гормонів гіпофізу, на активність дихальних ферментів в яєчнику, матці та наднирковій залозі має зворотну залежність від наявності та фізіологічної активності жовтого тіла і плаценти.

8. Аналоги гіпоталамічного гонадотропін-рілізінг гормону in vitro чинять стимулюючий позагіпофізарний вплив на окисно-відновні процеси в тканинах яєчника та ендометрії. Найбільш виразний цей ефект за умов статевого циклу та тільності.

9. Естрофан (аналог простагландину F2б ) в жовтому тілі стимулює окислення сукцинату і NADH, гальмуючи водночас АТР-азну реакцію. Найактивніше гальмування АТР-ази естрофаном при відносно активній їм стимуляції сукцинатоксидази та NADH-оксидази спостерігається в персистентному жовтому тілі та жовтому тілі тільності.

ПРАКТИЧНІ РЕКОМЕНДАЦІЇ

1. З метою тестування активності гормональних препаратів на фармацевтичних і біотехнологічних підприємствах України, як вдалу модель у дослідженнях, рекомендується використовувати гомогенати тканин гонад і ендометрію, тим часом, як мітохондрії цих тканин можна пропонувати як модель для досліджень з вивчення рівня тканинного дихання та прогнозування фізіологічної активності гонад і ендометрію залежно від фізіологічного стану організму худоби.

2. Для покращання життєдіяльності та метаболічної активності гранульозної тканини яєчника з метою подальшого використання її для культивування in vitro ооцитів і ембріонів великої рогатої худоби на ранніх етапах їх розвитку рекомендується використовувати модифікований нами метод отримання гранульозних клітин.

3. Одержані нами дані щодо рівня біоенергетичних процесів упродовж статевого циклу в корів і телиць за умов фізіологічного стану та при застосуванні гормональних препаратів і біологічних рідин рекомендується використовувати у навчальному процесі з курсу фізіології і біохімії для студентів вищих учбових закладів ветеринарного і біологічного профілю.

СПИСОК ПРАЦЬ, ОПУБЛІКОВАНИХ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

1. Кротких М.О., Смолянінов Б.В. Порівняльне вивчення біологічного окислення та фосфорилювання в гомогенатах і мітохондріях ендометрію і жовтого тіла корів та телиць протягом фолікулярної, лютеальної стадій статевого циклу та тільності // Науково-технічний бюлетень Інституту землеробства і біології тварин.—Львів, 1999.—Вип. 1(3).—С.35—41;

2. Кротких М.О., Смолянінов Б.В. Інтенсивність тканинного дихання ендометрію та жовтого тіла великої рогатої худоби за умов тільності, фолікулярної та лютеальної стадій статевого циклу // Науковий вісник Львівської державної академії ветеринарної медицини ім. С.З. Гжицького.—Львів, 2000. – Т2 Ч.2.—С. 163—167;

3. Кротких М.О., Смолянінов Б.В. Вплив фолікулярної рідини та фази статевого циклу на тканинне дихання в гранульозній тканині оваріального фолікула корів та статевозрілих телиць //Науковий вісник Львівської державної академії ветеринарної медицини ім. С.З. Гжицького.—Львів, 2000. – Т2, №1.—С. 79—82.

4. Кротких М.О. Вивчення окислювального фосфорилювання та активностей дихальних ферментів в гомогенатах і важких мітохондріях ендометрію і жовтого тіла корів та телиць протягом фолікулярної, лютеальної стадій статевого циклу та тільності // Аграрний вісник Причорномор’я. Збірник наукових праць.—Одеса, 2000.—Вип. 4(9).—С.32—38.

5. Кротких М.О., Смолянінов Б.В. Вплив амніотичної рідини на активність біологічного окислення в ендометрії корів та телиць за умов статевого циклу, тільності та функціональної патології яєчника // Аграрний вісник Причорномор’я. Збірник наукових праць.—Одеса, 2001.—Вип. 4(14).—С.59—63.

6. Смолянінов Б.В., Кротких М.О., Черневич О.І. Біоенергетична сторона впливу синтетичного аналога простагландину F2-alpha на тканину нормальних, персистентних жовтих тіл та лютеїнової кісти // Аграрний вісник Причорномор’я. Збірник наукових праць.—Одеса, 2001.—Вип. 4(14).—С.95—100.

Кротких М.О. Окисно-відновні процеси в тканинах яєчника, матки та надниркової залози корів і телиць залежно від стану репродуктивної системи – рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата ветеринарних наук за спеціальністю 03.00.13—фізіологія людини і тварин.

Львівська державна академія ветеринарної медицини ім. С.З. Гжицького. Львів, 2001.

За допомогою полярографічного методу вивчали інтенсивність тканинного дихання в тканинах яєчника, надниркової залози та ендометрію корів і статевозрілих телиць.

Інтенсивність сукцинатоксидазної, NADH-оксидазної, цитохром-оксидазної та АТР-азної реакцій в тканинах статевих органів і надниркової залози корів і статевозрілих телиць знаходяться в прямій залежності від функціональної активності жовтого тіла. При гіпофункції яєчника тканинне дихання в наднирковій залозі також підсилюється.

Стимуляція фолікулярною та амніотичною рідинами тканинного дихання в досліджуваних тканинах має пряму залежність від функціональної активності жовтого тіла або плаценти. Сироватка крові овулюючих корів більш активно стимулює тканинне дихання при відсутності жовтого тіла.

Аналоги гонадотропін-рілізінг гормону in vitro стимулюють окисно-відновні процеси в тканинах яєчника та ендометрії. Простагландин F2б в жовтому тілі стимулює тканинне дихання та гальмує АТР-азну реакцію.

Ключові слова: корови, телиці, статевий цикл, тільність, мітохондрії, тканинне дихання, яєчник, ендометрій, надниркова залоза.

Кротких М.А. Окислительно-восстановительные процессы в тканях яичника, матки и надпочечника коров и тёлок в зависимости от состояния репродуктивной систем – рукопись

Диссертация на соискание учёной степени кандидата ветеринарных наук по специальности 03.00.13—физиология человека и животных

Львовская государственная академия ветеринарной медицины им. С.З. Гжицкого. Львов, 2001.

С помощью полярографического метода изучали интенсивность процессов тканевого дыхания в строме яичника, гранулёзной ткани, жёлтом теле, надпочечнике и эндометрии коров и тёлок.

Интенсивность сукцинатоксидазной, NADH-оксидазной, цитохрмоксидазной и АТР-азной реакций в строме яичника, гранулёзной ткани, жёлтом теле и эндометрии коров и тёлок находится в зависимости от физиологического состояния репродуктивной системы (стадии полового цикла, периода стельности, функциональной патологии яичника). Активность сукцинатоксидазы, NADH-оксидазы, цитохромоксидазы и АТР-азы, а также концентрация аскорбиновой кислоты в тканях яичника и эндометрия находятся в прямой зависимости от функциональной активности жёлтого тела, которая высока в лютеальную стадию полового цикла, в начале стельности, особенно в первые её 45 дней, и при наличии лютеиновой кисты яичника.

В ткани надпочечника, в отличие от тканей яичника и матки, корреляция тканевых энергетических процессов с состоянием репродуктивной системы менее выражена, однако в ней также прослеживается зависимость активности тканевого дыхания от наличия и стероидогенетической активности жёлтого тела. Эта зависимость прямая у здоровых животных и обратная—при гипофункции яичника.

В изолированных митохондриях эндометрия, жёлтого тела и надпочечника активность сукцинатоксидазы, креатинкиназы, NADH-оксидазы и цитохромоксидазы более высокая по сравнению с гомогенатами из этих тканей. Изменения активности этих ферментов во время полового цикла, стельности и функциональной патологии яичника в митохондриях более выражены, чем в гомогенатах.

Интенсивность тканевого дыхания в клетках гранулёзы выше при наличии в среде суспензирования фолликулярной жидкости, которая является одновременно продуктом жизнедеятельности фолликулярного эпителия и естественной средой для него. Влияние фолликулярной жидкости, содержащей высокие концентрации прогестерона, эстрогенов, ингибина и факторов роста, на окислительно-восстановительные процессы в тканях половых органов и надпочечников наиболее интенсивно в момент овуляции и при наличии жёлтого тела. Влияние амниотической жидкости от коров, забитых на третьем-четвёртом месяце стельности, которая содержит концентрации эстрогенов, подобные таковым в фолликулярной жикости и намного более низкие концентрации прогестерона, оказывает на окислительно-восстановительные процессы в гонадах и надпочечниках эффект, менее выраженный по сравнению с фолликулярной жидкостью. Однако влияние амниотической жидкости на тканевое дыхание в эндометрии более выражено по сравнению с влиянием на эти процессы фолликулярной жидкости. Влияние сыворотки крови, отобранной у коров во время овуляции и содержащей пиковые физиологические концентрации гонадотропных гормонов гипофиза, на активность дыхательных ферментов в яичнике, матке и надпочечнике имеет обратную зависимость от наличия и физиологической активности жёлтого тела и плаценты.

Аналоги гипоталамического гонадотропин-рилизинг гормона in vitro оказывают стимулирующее влияние на окислительно-восстановительные процессы в тканях яичника и эндометрии. Наиболее выражен этот эффект в условиях полового цикла и стельности.

Эстрофан (аналог простагландина F2б) в желтом теле стимулирует окисление сукцината и NADH, тормозя одновременно АТР-азную реакцию. Самое активное торможение АТР-азы эстрофаном при относительно активной им стимуляции сукцинатоксидазы и NADH-оксидазы наблюдается в персистентном желтом теле и желтом теле стельности.

Влияние естественных добавок, содержащих половые, гонадотропные гормоны, и синтетических добавок, содержащих ГнРГ и простагландин F2б оказывают более активное стимулирующее или тормозное влияние на активность дыхательных ферментов и АТР-азы в гомогенатах тканей яичника в сравнении с влиянием на митохондрии из этих тканей.

Ключевые слова: коровы, тёлки, половой цикл, стельность, митохондрии, тканевое дыхание, яичник, эндометрий, надпочечник.

Krotkykh M.A. Processes of oxidation and restoration in ovarian, uterine and adrenal tissues of cows and heifers and their dependence on the reproductive system state – manuscript

Thesis to obtain the scientific degree of