Харківський національний університет

ім. В.Н.Каразіна

КАВОК НАТАЛІЯ СЕРГІЇВНА

УДК 577.175.44+577.125

Вікові особливості метаболізму ліпідів печінки щурів

на ранньому етапі дії тиреоїдних гормонів

03.00.04 – біохімія

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

Харків – 2001

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана в Харківському національному університеті ім. В.Н.Карабіна Міністерства освіти і науки України.

Науковий керівник: доктор біологічних наук

Бабенко Наталія Олексіївна,

Харківський національний університет ім. В.Н.Каразіна,

завідувач відділу фізіології онтогенезу НДІ біології.

Офіційні опоненти: доктор біологічних наук, професор

Каліман Павло Авксентійович,

Харківський національний університет ім. В.Н.Каразіна,

завідувач кафедри біохімії;

доктор біологічних наук

Бондаренко Тетяна Петрівна,

Інститут проблем кріобіології і кріомедицини НАН України, завідувач відділу кріобіохімії та фармакології

нейрогуморальних систем.

Провідна установа: Інститут геронтології АМН України

(лабораторія регуляції метаболізму,

сектор біології старіння), м. Київ.

Захист відбудеться “17” квітня 2002 р. о 15 15 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 64.051.17 Харківського національного університету

ім. В.Н.Каразіна за адресою: 61077, м. Харків, пл. Свободи, 4, ауд. ІІІ-15.

З дисертацією можна ознайомитись у Центральній науковій бібліотеці Харківського національного університету ім. В.Н.Каразіна за адресою: 61077, м. Харків, пл. Свободи, 4.

Автореферат розісланий “05” березня 2002 р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради

кандидат біологічних наук Падалко В.І.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Уявлення про функціональну роль ліпідів як структурних компонентів біомембран суттєво змінилося за відносно короткий проміжок часу (останні 10-15 років). На цей час більшість дослідників розглядають ліпіди як попередники біоактивних молекул, що утворюються при стимуляції рецепторів клітинної поверхні та функціонують в якості вторинних месенджерів [Liscovitch, Cantley, 1994; Divecha, Irvine, 1995; Topham, Prescott, 1999].

Відомо, що гормони щитовидної залози мають виражений ліпотропний ефект і регулюють різні ланки ліпідного обміну [Hulbert, 2000]. Однак дані щодо участі ліпідних вторинних месенджерів у реалізації ефектів тиреоїдних гормонів на клітини – мішені практично відсутні.

Дія тиреоїдних гормонів переважно опосередкована ядерними рецепторами [Чин, Йен, 2000]. Однак на цей час виявлений цілий ряд негеномних ефектів йодотиронинів, які знайдені на рівні плазматичної мембрани та різних субклітинних структур. До них належать: посилення транспорту іонів (Ca2+, Na+), глюкози, модуляція активності деяких протеїнкіназ, регуляція полімеризації актина [Davis, Davis, 1996]. Є докази наявності специфічних сайтів, які зв'язують тироксин і трийодотиронін на поверхні плазматичних мембран клітин-мішеней [Кахарова, 1991]. Вважають, що мембранна рецепція відіграє важливу роль у транспортуванні та обміні тиреоїдних гормонів, а також у реалізації їх швидких ефектів [Lin et al, 1999; Дейвис, Дейвис, 2000].

Незважаючи на те, що деякі ефекти тироксину на обмін ліпідів виявляються при безпосередній дії на клітини печінки та на субклітинні структури, до цього часу є лише непрямі докази активації при цьому у клітинах фосфоліпаз С (ФЛС) і Д (ФЛД), а також участі в реалізації дії тиреоїдних гормонів ліпідних вторинних месенджерів, таких як діацилгліцерол (ДАГ) і фосфатидна кислота (ФК) [Бабенко и др., 1991; Бабенко, Кавок, 1995; Красильникова, Бабенко , 1996]. Це питання практично не вивчене у віковому аспекті. Разом з тим відомо, що зміна чутливості клітин до регуляторного впливу в старості може бути пов'язана з перебудовами ліпідного складу мембран [Кульчицький та ін., 2001] та зі зрушеннями на початкових етапах сигнальної трансдукції, зокрема, з порушенням процесу генерації вторинних посередників [Serra et al, 1996].

З'ясування питання відносно участі тиреоїдних гормонів у регуляції утворення ліпідних месенджерів ДАГ і ФК в клітинах печінки дасть змогу виявити нові сторони в молекулярному механізмі дії йодотиронінів, а також сприятиме більш глибокому розумінню причин, які призводять до змін у характері клітинної відповіді на гормональний сигнал при старінні.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертаційна робота виконувалась у рамках комплексних НДР держбюджетних тем відділу фізіології онтогенезу НДІ біології Харківського національного університету ім. В.Н.Каразіна: “Дослідження закономірностей проходження гормонального сигналу до тканин-цілей при моделюванні несприятливих факторів довкілля” (шифр 11-16-97, № ДР 0197U008189), “Вікові особливості розвитку порушень функції залоз внутрішньої секреції і реалізації гормонального сигналу в тканинах-цілях” (шифр 11-16-00, № ДР 0100U003318), яка входила до координаційного плану №16 Міністерства освіти і науки України.

Мета і задачі дослідження. Робота присвячена з'ясуванню вікових особливостей метаболізму гліцероліпідів печінки на ранніх етапах дії тиреоїдних гормонів. У відповідності з метою були поставлені такі задачі:

1. Вивчити динаміку ліпідних перетворень у клітинах печінки на ранньому етапі дії тиреоїдних гормонів на організм тварин різного віку.

2. Вивчити динаміку, шляхи та джерела утворення ДАГ при активації клітин печінки щурів тиреоїдними гормонами.

3. Виявити закономірності вікових змін у регуляції тиреоїдними гормонами утворення ДАГ у клітинах печінки.

Об'єкт дослідження. Молекулярні механізми дії тиреоїдних гормонів.

Предмет дослідження. Динаміка та характер перебудов ліпідів печінки щурів різного віку на ранніх етапах дії тиреоїдних гормонів.

Наукова новизна отриманих результатів. Уперше показано, що короткочасна дія L-тироксину на організм щурів супроводжується значними перебудовами вмісту ліпідів печінки, причому, характер індукованих гормоном змін ліпідного спектру клітин печінки залежить від віку тварин.

Встановлено, що під впливом L-тироксину в клітинах печінки 3-місячних щурів відбувається накопичення ліпідних вторинних месенджерів –ДАГ. Процес накопичення ДАГ має двофазний характер, а фосфоліпідними попередниками ДАГ, утвореного при дії L-тироксину на клітини, можуть бути фосфатидилетаноламін (ФЕА) і фосфатидилхолін (ФХ). Ефект гормону на акумуляцію ліпідних вторинних месенджерів є швидким, короткотерміновим, специфічним і дозозалежним. Встановлено, що в процес залучена ФЛД. Відсутність подібного ефекту L-тироксину в клітинах печінки старих, 24-місячних щурів, відображує, ймовірно, вікові порушення у механізмах передачі сигналу і є однією з причин зниження чутливості клітин до дії тиреоїдних гормонів в старості.

Теоретичне і практичне значення отриманих результатів. Робота має значення для фундаментальних досліджень ролі ліпідів у реалізації дії регуляторних сигналів.

Отримані дані про утворення під впливом тироксину ліпідних вторинних посередників-ДАГ дозволяють глибше зрозуміти молекулярний механізм короткочасних ефектів гормонів щитовидної залози в клітинах-мішенях.

Виявлені у роботі вікові особливості реакції клітин печінки на короткотермінові впливи тиреоїдних гормонів розвивають уявлення про важливу роль початкових етапів сигнальної трансдукції у формуванні адекватної клітинної відповіді. Враховуючи, що тиреоїдні гормони активують метаболізм сигнальних ліпідів в клітинах печінки та здатні швидко модулювати дію певних агоністів (наприклад, агоністів a1-адренорецепторів) [Daza et al, 1998] або інтерферону-гамма [Lin et al., 1999], отримані в роботі дані важливо враховувати при застосуванні тиреоїдних гормонів у клініці при їх сумісному призначенні з іншими гормонами та біоактивними сполуками.

Особистий внесок здобувача. Вибір теми дисертаційної роботи, встановлення мети та задач, вибір об'єкту та методів дослідження проведено спільно з науковим керівником. Автор самостійно провів аналіз наукової літератури за даною проблемою. Експериментальні дослідження проведені автором самостійно на базі НДІ біології ХНУ, а також у співпраці з співробітниками Харківського державного медичного університету та Інституту цитології і генетики СВ РАН (м. Новосибірськ, Росія). Інтерпретація отриманих даних проведена спільно з науковим керівником.

Апробація результатів. Основні положення дисертаційної роботи доповідалися на симпозіумі “Биологические механизмы старения” (Харків, 1994), міжнародному симпозіумі “Біологічні механізми старіння” (Харків, 1996), конференції молодих учених біологічного факультету і науково-дослідного інституту біології (Харків, 1996), 2-му Європейському конгресі з біогеронтології “From molecules to humans” (Saint Petersburg, Russia, 2000).

Публікації. За темою дисертації опубліковано 13 робіт (5 статей і 8 тез).

Обсяг та структура дисертації. Матеріали викладено на 138 сторінках друкованого тексту і містять: вступ, огляд літератури, опис матеріалів і методів досліджень, заключення, висновки, список використаних джерел.

Матеріали дисертації проілюстровано 17 рисунками і 16 таблицями. Список літератури складається з 275 джерел.

МАТЕРІАЛИ ТА МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ

В експериментах використовували 3- і 24-місячних щурів-самців інтактних та яким було введено тироксин (200 мкг/100 г ваги) за 15, 30, 60, 120 хвилин до забою; контролем у цьому випадку були тварини, яким вводили у відповідній кількості фізіологічний розчин. Пригнічення функції щитовидної залози в окремих експериментах визивали внутрішньо-черевинним введенням 1 мг 1-метил-2-меркаптоімідазолу (мерказолілу) на 100 г ваги тварині (протягом 16 днів). При вивченні дії тироксину в умовах in vitro вміст гормону в середовищі інкубації становив від 0,1 нМ до 1,0 мкМ , контрольні проби інкубували в присутності розчинника тироксину – NaOH у відповідних концентраціях.

Печінку наркотизованих діетиловим ефіром тварин перфузували 0,9%-вим розчином NaCl, суспензію тканини отримували продавленням печінки через перфоровану платівку з діаметром отворів 0,3 мм. В експериментах з перфузованою печінкою за основу була взята модель, запропонована Hummerich and Soboll (1989). Гепатоцити виділяли за методом Hoek et al., (1987) та Канаевой и др. (1975). Нативність клітин оцінювали за допомогою трипанового синього. Кількість життєдіяльних клітин становила 90-95% від їх загальної кількості.

Включення мітки до ліпідів печінки щурів здійснювали шляхом внутрішньо-черевинного введення [14С]СН3СООNa згідно зі схемою, яка була розроблена Кейтсом (1975). Преінкубацію суспензії тканини печінки [14С]олеїновою кислотою протягом 90 хвилин проводили, як описано нижче, в умовах, використаних для мічення ліпідів гепатоцитів. У окремих експериментах [U-14С]глюкозу, [14С]олеїнову кислоту або гліцеролтри–(9,10(n)-[3Н]олеат) додавали до середовища інкубації суспензії тканини печінки безпосередньо перед внесенням тироксину в кількості 2 мкКі/мл, 0,2 мкКі/мл, 0,1 мкКі/мл, відповідно.

Свіжовиділені гепатоцити мітили шляхом інкубації клітин (107 клітин у 1 мл) протягом 90 хвилин або 3 годин у середовищі Ігла, рН 7,5, яке містило [14C] олеїнову кислоту (1 мкКі/мл), 25 мМ Hepes, 200 мМ глутамін, пеніцилін (61 мг/л), стрептоміцин (100 мг/л), 10% ембріональну бичачу сироватку, при 37 0С в атмосфері О2(95%) – СО2(5%). В окремих випадках використовували [3H]пальмітинову або [14C]лінолеву кислоти (5 мкКі/мл). При введенні мітки до складу ліпідів гепатоцитів в умовах тривалої інкубації (24 години) до середовища інкубації, яке містило [14С]пальмітинову кислоту (6,0 мкКі/мл) або [14С]олеїнову кислоту (2,5 мкКі/мл) додатково вносили дексаметазон (4 мг/мл), інсулін (20 од/л), гентаміцин (13 мг/мл). Концентрація гепатоцитів у цьому випадку складала 3 х 106 клітин на 1 мл. Інкубацію проводили при 37 0С в атмосфері повітря (95%) – СО2(5%).

Після включення мітки гепатоцити витримували в середовищі без ембріональної сироватки протягом 1 год., потім клітини відмивали буфером Кребс-Хенселейта, рН 7,4, який містив 20 мМ Hepes, 2 мМ CaCl2, 0,2%-вий альбумін сироватки бика і розводили перед початком експерименту в тому ж буфері до концентрації 3х106 клітин на 1 мл.

Про активацію фосфоліпази Д у клітинах печінки судили по утворенню фосфатидилетанолу, за реакцією трансфосфатидилювання етанолу [Billah, Anthes, 1990; Kumada et al., 1993]. До складу інкубаційної суміші входили відповідно до умов експерименту такі компоненти: 300 мМ етанол, 1 мМ неоміцин, 300мкМ пропранолол, 50мкМ Н7, 20 мкМ ТМВ-8, які вносили за 15 хвилин перед додаванням L-тироксину або його розчинника. Концентрація L-тироксину в інкубаційній суміші становила від 0,1 нМ до 1,0 мкМ. Реакцію зупиняли додаванням охолодженого метанолу.

Ліпіди з клітин і суспензії тканини печінки екстрагували за методом Bligh, Dyer (1959). Розділення ліпідів на фракції проводили методом тонкошарової хроматографії в шарі силікагелю Woelm в системах розчинників: гексан-диетиловий ефір-оцтова кислота (73:25:2, за об'ємом) для діацилгліцеролів, триацилгліцеролу, жирних кислот, холестеролу, фосфоліпідів; хлороформ-метанол-оцтова кислота-вода (25:15:4:2, за об'ємом) для фосфатидилхоліну, сфінгомієліну, фосфатидилінозиту, фосфатидилетаноламіну; етилацетат-ізооктан-оцтова кислота-вода (130:20:30:100, за об'ємом) для фосфатидилетанолу. Ліпіди проявляли в парах йоду. Радіоактивність мічених ліпідів визначали в сцинтиляторі ЖС-8 за допомогою лічильника радіоактивності БЕТА. Кількісний вміст ліпідів визначали за методом March, Weinstein (1966).

Активність протеїнкінази С (ПКС) вимірювали після часткового очищення ферменту хроматографією на DEAE целюлозі і визначали за перенесенням 32Р з [?-32Р] АТР на гістон H1 у присутності фосфатидилсерину та іонів Са2+ (0,2 мМ) (Kikawa et al., 1982; Сидоркина и др. 1988). Активність ферменту виражали в пмоль фосфату, перенесеного з [?-32Р ] АТР на гістон НІ за 1 хвилину. Вміст білка визначали за методами Bradford (1976) або Lowry et al. (1951). Обробку експериментальних даних виконували за допомогою методів варіаційної статистики [Урбах, 1964].

У роботі використовували [?-32Р] АТР, питома активність >1000 Кі/ммоль; натрій оцтовокислий – 114С (10–50 мКі/ммоль) (ВПО “Изотоп”); тритон Х-100, сахарозу, EGTA, Hepes, трипановий синій (“Sevra”, Німеччина); 8-(диетиламіно)октил 3,4,5-триметоксибензоат (ТМВ-8); EDTA, фенілметилсульфонілфторид (PNSF) (“Fluka”, Швейцарія); неоміцин, пропранолол, 1-(5-ізокуінолінсульфоніл)-2-метилпиперазин (H7) (“Sigma”, США); АТР (динатрієва сіль); L-тироксин (“Reanal”, Угорщина); фосфоцелюлозний папір Р-81, DEAE-целюлозу DE-52 (“Whatman”, Великобританія); силікагель (“Woelm”, Німеччина); [14С]олеїнову кислоту (58 мКі/ммоль); [3Н]пальмітинову кислоту (54 Кі/ммоль), [14С]лінолеву кислоту (59 мКі/ммоль), гліцеролтри(9,10(n)-[3Н]олеат) (1Кі/ммоль), [14С]пальмітинову кислоту (60 мКі/ммоль) (“Amersham”, Великобританія); [U-14С]глюкозу (0,1–1 мКі/ммоль) (“Hemapol”, Чехия).

ОСНОВНІ РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ ТА ЇХ ОБГОВОРЕННЯ

Вікові особливості метаболізму ліпідів печінки щурів на ранньому

етапі дії на організм тиреоїдних гормонів.

З використанням методу попереднього мічення ліпідів печінки [14С] ацетатом натрію було показано, що введення в організм 3-місячних щурів екзогенного тироксину стимулює обмін ліпідів печінки, що супроводжується коливаннями вмісту загальних ліпідів та співвідношення їх окремих фракцій. Встановлено, що накопичення загальних 14С-ліпідів при дії гормону по 15-й хвилині експерименту відбувається за рахунок підвищення рівня 14С-фосфоліпідів, 14С-триацилгліцеролів і 14С-холестеролу. Аналіз окремих фосфоліпідних фракцій виявив, що під дією гормону відбувається різке зростання як абсолютного, так і відносного вмісту 14С-сфінгомієліну та 14С-фосфатидилінозиту (рис. 1). Підвищення рівня досліджених фосфоліпідних фракцій є короткочасним, за винятком більш подовженого накопичення 14С-сфінгомієліну, яке спостерігається як по 15 хвилині, так і по 30 хвилині дії тироксину на організм 3-місячних щурів. Ефект гормону на утворення загальних фосфоліпідів і триацилгліцеролів із різних мічених попередників відтворюється також за умов його дії in vitro. Посилення синтезу фосфоліпідів і триацилгліцеролів спостерігається у перші 15 хвилин дії тироксину на суспензію тканини печінки та ізольовані гепатоцити 3-місячних щурів (табл. 1, табл. 2). Враховуючи ці дані, а також результати попередніх досліджень [Бабенко, Кавок, 1995; Красильникова, Бабенко, 1996], можна припустити, що посилення синтезу гліцероліпідів є однією з причин підвищення рівня цих сполук у печінці через 15 хвилин після одноразової ін'єкції тваринам тироксину.

Той факт, що під дією гормону відбувається швидке одночасне збільшення вмісту загальних 14С-фосфоліпідів, 14С-триацилгліцеролів і 14С-холестеролу – основних компонентів ліпопротеїнів - дозволяє зробити припущення про підсилення за даних експериментальних умов процесів утворення та/або захвату печінкою із крові ліпопротеїнів. Не виключається, що швидке зростання вмісту 14С-холестеролу є результатом активації його синтезу під впливом тироксину із тих 14С-попередників, що містяться у печінці. Збільшення вмісту 14С-фосфоліпідів, 14С-триацилгліцеролів і 14С-холестеролу є короткочасним процесом, і в подальшому (по 30-тій хвилині експерименту) виявляється різке падіння рівня даних ліпідних фракцій, що супроводжується відповідним зниженням вмісту загальних 14С-ліпідів в печінці піддослідних тварин. Такі координовані зміни вмісту даних ліпідних фракцій можуть відбуватися, ймовірно, внаслідок викиду пула готових ліпопротеїнів печінки до крові, що згідно з роботою Калімана та ін. (1997) може бути одним із показників перемикання метаболізму на утилізацію ліпідів.

При більш тривалій дії тиреоїдних гормонів на організм 3-місячних щурів (60 і 120 хвилин) найбільш різкі зміни спостерігаються у вмісті 14С-холестеролу, 14С-триацилгліцеролу і 14С-жирних кислот. Підвищення рівня жирних кислот на тлі падіння вмісту триацилгліцеролу свідчить про активацію ліполізу за даних експериментальних умов, що узгоджується з результатами досліджень впливу тиреоїдних гормонів на ліполітичні процеси в печінці і жировій тканині [Пашкова и др., 1980]. Накопичення вільних жирних кислот у печінці, в свою чергу, може служити сигналом до активації біосинтезу холестеролу [Salam et al, 1989].

Рис. 1. Вплив тироксину на вміст індивідуальних 14С-фосфоліпідів у печінці щурів 3-місячного віку (М±m, n=12-15). Примітки: * – вірогідно відносно до контролю (р<0,05); СФМ – сфінгомієлін; ФХ – фосфатидилхолін; ФІ – фосфатидилінозит; ФЕА – фосфатидилетаноламін.

Таблиця 1

Вплив тироксину (10 нМ) на утворення [14С]гліцероліпідів із [14С]попередників

в гепатоцитах і суспензії тканини печінки щурів 3-місячного віку (М ± m, n=6-10)

[14С]попередник Ліпід Контроль Дослід

[14С]пальмітинова кислотаa ФЛ 257.0 ± 13.0 421.2 ± 19.1*

ТАГ 4.551 ± 0.426 6.283 ± 1.931

[14С] олеїнова кислотаб ФЛ 151.8 ± 14.9 302.2 ± 16.8*

ТАГ 37.5 ± 4.3 51.1 ± 3.9*

[14С]глюкозаб ФЛ 83.6 ± 6.3 136.0 ± 17.0*

Примітки: Час інкубації з L-тироксином 15 хвилин. а – гепатоцити у концентрації 3ґ106 кл/мл преінкубували з [14С]пальмітиновою кислотою 24 год., дані виражені в імп/хв на 103 кл.; б – суспензія тканини печінки, [14С] мічений попередник вносили до середовища інкубації одночасно з додаванням L-тироксину, дані виражені в імп/хв. на мг білка. * - вірогідно по відношенню до контролю (р<0,05).

Таблиця 2

Вплив тироксину (10 нМ) на вміст гліцероліпідів у печінці

щурів різного віку (10-2імп/хв на г тканини) (М±m, n=6)

Ліпід Вік щурів, міс.

3 24

контроль дослід контроль дослід

14С-ФЛ 242±31 389±20* 277±19 245±59

14С-ТАГ 199±9 256±9* 389±30** 384±46

Примітки: Час преінкубації суспензії тканини печінки з [14С]олеїновою кислотою – 90 хвилин; час інкубації проб з тироксином – 15 хвилин. * – вірогідно відносно до контролю (р<0,05); ** – вірогідно у порівнянні з 3-місячним віком (р<0,05).

Введення тироксину в організм 24-місячних тварин також активує метаболізм ліпідів печінки, що супроводжується змінами рівня загальних 14С-ліпідів та їх окремих фракцій. Однак по 15 хвилині дії гормону в умовах in vivo (рис. 2), а також in vitro (див. табл. 2) не відбувається вірогідних змін рівня загальних фосфоліпідів та їх окремих фракцій за винятком зниження вмісту фосфатидилінозиту. Підвищення рівня 14С-фосфоліпідів у печінці 24-місячних щурів відбувається повільно, лише по 30-й хвилині експерименту (див. рис.2), при цьому на відміну від молодих, 3-місячних щурів, не спостерігається вірогідного збільшення вмісту 14С-холестеролу та 14С-триацилгліцеролу.

Координоване падіння рівня 14С-фосфоліпідів,14С-холестеролу та 14С-триацилгліцеролу в печінці 24-місячних щурів відбувається за даних експериментальних умов значно пізніше, ніж у молодих тварин і, ймовірно, теж пов'язане з активацією секреції ліпопротеїнів до крові.

Рис. 2. Вплив тироксину на вміст індивідуальних 14С-фосфоліпідів у печінці 24-місячних щурів (М±m, n=12-15). Примітки: * – вірогідно відносно до контролю (р<0,05); СФМ – сфінгомієлін; ФХ – фосфатидилхолін; ФІ – фосфатидилінозит; ФЕА – фосфатидилетаноламін.

На відміну від 3-місячних щурів, тироксин не приводив до підвищення рівня 14С-жирних кислот і 14С-холестеролу в печінці 24-місячних щурів протягом всього часу експерименту.

Отримані дані, таким чином, свідчать про суттєві вікові відміни в короткотерміновій регуляції метаболізму ліпідів печінки тиреоїдними гормонами. Активуючий ефект тироксину на обмін ліпідів печінки 24-місячних щурів спостерігається при більш тривалій дії гормону на організм, причому характер ліпідних перебудов у старих тварин суттєво відрізняється від тих, що відбуваються у відповідь на дію гормону в печінці 3-місячних щурів.

Оскільки встановлено, що модифікації початкових етапів клітинної активації, пов'язаних з генерацією вторинних месенджерів можуть бути причиною вікових змін у відповіді клітин на дію гормонального сигналу [Serra et al., 1996], доцільно припустити, що перебудови у механізмах сигнальної трансдукції призводять до вікових змін характеру метаболічної відповіді на дію тироксину.

Механізм швидкої активації метаболізму ліпідів під дією тиреоїдних гормонів.

На цей час встановлено, що активація метаболізму гліцероліпідів є не тільки підготовчим етапом у формуванні клітинної відповіді на вплив агоністу, але і супроводжує сам процес трансмембранної передачі сигналу [Tronchere et al., 1994; Exton, 1997] .

Наступним етапом роботи стало з'ясування механізму швидкої активації метаболізму ліпідів тиреоїдними гормонами. Для цього вивчали вплив тироксину на утворення ліпідних вторинних посередників – ДАГ у клітинах печінки щурів 3- і 24-місячного віку. Підвищення рівня ДАГ в клітинах у відповідь на дію агоніста є важливим етапом процесу сигнальної трансдукції [Billah, Anthes, 1990]. Ці сполуки є ліпідними вторинними месенджерами, для яких у клітинах знайдено численні молекулярні цілі, у тому числі різні субтипи ПКС [Wakelam, 1998].

На різних експериментальних моделях, зокрема на ізольованих гепатоцитах і суспензії тканини печінки (табл. 3, табл. 4, рис. 3, рис. 4) було встановлено, що L-тироксин викликає швидке накопичення ДАГ, яке спостерігається в перші хвилини дії гормону. В той же час D-тироксин не впливає на вміст ДАГ у суспензії тканини та ізольованих гепатоцитах 3-місячних щурів.

Таблиця 3

Вплив неоміцину, пропранололу і ТМВ-8 на індукцію L-тироксином

утворення 14С -1,2-діацилгліцеролів в гепатоцитах 3-місячних щурів

(% від загальних 14С-ліпідів) (М ± m, n=10-12)

Умови експерименту Контроль Дослід

Без добавлень 1,19 ± 0,06 2,02 ± 0,14*

Неоміцин 1,08 ± 0,11 1,43 ± 0,09*

Пропранолол 1,97 ± 0,21 1,77 ± 0,15

ТМВ-8 0,910 ± 0,04 1,09 ± 0,015*

Примітка. * - вірогідно відносно до контролю (р<0,05).

Відомо, що активація фосфатидилінозит-специфічної фосфоліпази С є найбільш ранньою подією, яка відбувається в клітинах у процесі сигнальної трансдукції [Berridge, 1993]. Різні гормони, нейротрансміттери і ростові фактори дуже швидко (протягом перших секунд і хвилин впливу на клітини), але короткочасно, стимулюють активність фосфоліпази С, що супроводжується накопиченням ДАГ, переважно поліненасиченого за своїм жирнокислотним складом. Однак в більшості випадків індуковане агоністом накопичення ДАГ у клітинах відбувається в результаті активації декількох сигнальних шляхів [Liscovitch, 1992; Tronchere et al., 1994; Divecha, Irvine, 1995].

Таблиця 4

Вплив L-тироксину (10 нМ) на вміст фосфатидилетанолу і діацилгліцеролів

в гепатоцитах щурів 3- і 24-місячного віку (імп/хв на 107 кл) (М ± m, n = 10-12)

Ліпід Умови експери-менту Вік щурів (міс)

3 24

Контроль Дослід Контроль Дослід

Фосфа-тидил-етанол Без добавлень 2170 ± 362 5000 ± 638* 968 ± 92 788 ± 96

Н7 1847 ± 296 2915 ± 447* 972 ± 152 940 ± 152

ДАГ Без добавлень 10797 ± 715 16515 ± 1077* 12879 ± 1755 12790 ± 1172

Н7 7359 ± 746 9051 ± 1290 11717 ± 2285 10651 ± 2053

Примітка. * - вірогідно відносно до контролю (р < 0,05).

Рис. 3. Дозозалежна дія і специфічність ефекту тироксину на утворення 1,2-діацилгліцеролу в гепатоцитах 3-місячних щурів, n=6-10. Примітки: * – вірогідно відносно до контролю (р<0,05); гепатоцити преінкубували з [14С]олеїновою кислотою протягом 90 хвилин.

Рис. 4. Дія тироксину на процес утворення 1,2-діацилгліцерола і вміст фосфоліпідів у печінці щурів (% від контролю). Примітки: ліпіди печінки мітили [14С]ацетатом Na, концентрація L-тироксину в інкубаційному середовищі становила (10 нМ), контроль містив NaOH (100 нМ). Вік щурів 3 міс. (-·-), 24 міс. (-o-).

Нами показано, що інгібітор поліфосфоінозитид cпецифічної ФЛС - неоміцин – знижує, але не блокує ефект тироксину на утворення ДАГ (див. табл. 3). Це може свідчити про активацію гормоном інших, незалежних від гідролізу поліфосфоінозитидів шляхів генерації ДАГ. Для з'ясування питання про шляхи утворення ДАГ при короткочасній дії тироксину на клітини печінки до інкубаційного середовища вносили [3Н]триацилгліцерол або як попередники біосинтезу гліцероліпідів de novo – [14C]глюкозу або [14C]олеїнову кислоту. В цих умовах тироксин не приводив до накопичення 3Н- або 14C-діацилгліцеролів.

Відомо, що утворення ДАГ у гормон-стимульованих клітинах може відбуватися не тільки в результаті гідролізу інозитліпідів, а також при деградації фосфатидилетаноламіну або фосфатидилхоліну [Kiss, Anderson, 1994; Exton, 1997]. Нами встановлено, що процес генерації ДАГ у клітинах печінки є двофазним процесом (див. рис. 4), причому перша фаза накопичення ДАГ супроводжується короткочасним зниженням рівня фосфатидилетаноламіну, тоді як другий пік утворення ДАГ пов'язаний з падінням вмісту фосфатидилхоліну. Тироксин не викликає вірогідних змін рівня відповідних фракцій ліпідів печінки 24-місячних щурів.

Згідно з даними літератури активація ФЛД є імовірним механізмом генерації ДАГ у клітинах під впливом фізіологічних стимулів. Процес відбувається через стадію гідролізу фосфатидної кислоти під дією фосфатидатфосфатази. Інгібітор фосфатидатфосфатази – пропранолол блокує індукований тироксином процес утворення ДАГ у гепатоцитах 3-місячних щурів (див. табл. 3). Отримані результати свідчать, що джерелом ДАГ є фосфатидна кислота. Прямим доказом активації ФЛД під дією L-T4 є накопичення у клітинах фосфатидилетанолу (ФЕТ) – специфічного продукту реакції трансфосфатидилювання етанолу, яку каталізує ФЛД [Billah, Anthes, 1990]. Ця сполука метаболізується більш повільно у порівнянні з ФК, тому швидкість її утворення дозволяє оцінити інтенсивність процесу гідролізу фосфоліпідів за участю ФЛД. Тироксин стимулює накопичення фосфатидилетанолу в суспензії тканини печінки і гепатоцитах 3-місячних щурів і не впливає на рівень цієї сполуки в клітинах печінки 24-місячних щурів (див. табл. 4).

Відомо, що в механізмі активації ФЛД у різних типах клітин під впливом численних агоністів бере участь ПКС [Gustavsson et al., 1994] . Було показано [Кавок и др., 2000], що під впливом L-тироксину, але не його менш активного в метаболічному відношенні D-аналогу, в клітинах печінки 3-місячних щурів відбувається перерозподіл ПКС між цитозолем та мембранами. Нами встановлено, що зростає також загальна активність ферменту у відповідь на дію L-тироксину з 2629 ± 65 (контроль) до 10200 ± 686 пмоль/хв на 1 мг білка (дослід). Активність ферменту не змінюється під впливом D-тироксину і складає 1802±185 пмоль/хв на 1 мг білка. Отже, не виключається, що Пкс опосередкує дію тироксину на активність ФЛД. Оскільки інгібітор ПКС – сполука Н7 знижує, проте не блокує стимулюючу дію L-тироксину на утворення фосфатидилетанолу і ДАГ в гепатоцитах 3-місячних щурів (див. табл. 4), можна припустити, що активація ФЛД здійснюється не лише ПКС-залежним шляхом, але також за участі інших механізмів. Тироксин не викликає вірогідних змін рівня фосфатидилетанолу і ДАГ у гепатоцитах 24-місячних щурів як у відсутності, так і в присутності Н7 (див. табл. 4).

З огляду на важливу роль Са2+ в регуляції активності ФЛД гепатоцитів [Gustavsson, et al, 1994] , а також враховуючи Са2+-мобілізуючу дію тиреоїдних гормонів [Hummerich, Soboll, 1989; Segal et al, 1989] можна передбачити, що в клітинах печінки утворення ДАГ під впливом тироксину теж є Са2+ - залежним процесом. Для з'ясування ролі Са2+ у механізмі активації ФЛД під дією тироксину був застосований хелатор внутрішньоклітинного Са2+ - ТМВ-8. Експерименти свідчать, що ця сполука викликає пригнічення стимулюючої дії гормону на процес утворення ДАГ в гепатоцитах 3-місячних щурів (див. табл. 3). Таким чином, в механізмі регуляції цього процесу підвищення рівня внутрішньоклітинного Са2+ є необхідним етапом.

Встановлено, що падіння рівня ФХ у клітинах печінки 3-місячних щурів, яке пов'язане з активацією L-тироксином ФЛД у подальшому змінюється підвищенням вмісту цього ліпіду (контроль – 65,4±2,7, дослід 74,6±3,4% від рівня загальних фосфоліпідів, рконтроль-дослід <0,05). При цьму спостерігається зменшення кількості ДАГ: 75,1±10,3% від контролю по 5-й хвилині експерименту. Таким чином, гормон контролює не тільки процес утворення ДАГ, але й термінацію цього процесу. Оскільки відомо, що ПКС залучена до механізму регуляції синтезу ФХ [Kiss, 1999], не виключається, що активація під дією L-тироксину ресинтезу ФХ є ПКС залежним процесом.

ВИСНОВКИ

1. L-тироксин викликає швидке, накопичення ДАГ у клітинах печінки 3-місячних щурів, яке спостерігається в перші хвилини дії гормону, і не впливає на рівень цих сполук у клітинах печінки 24-місячних тварин. Ефект тироксину на утворення ДАГ є короткочасним, дозозалежним і високоспецифічним.

2. Накопичення ДАГ під дією гормону носить характер двофазного процесу і супроводжується перебудовами у вмісті окремих фосфоліпідних фракцій клітин печінки 3-місячних щурів. Перший пік накопичення ДАГ супроводжується падінням рівня ФЕА, тоді як другий – ФХ.

3. Специфічний інгібітор ФЛС – неоміцин не відміняє ефект L-тироксину на утворення ДАГ, тоді як пропранолол – інгібітор фосфатидатфосфатази – повністю блокує його, що служить доказом утворення ДАГ у процесі дефосфорилювання ФК.

4. Накопичення фосфатидилетанолу в присутності 300 мМ етанолу свідчить про активацію тироксином ФЛД за умов короткочасного впливу гормону на гепатоцити 3-місячних щурів. Тироксин не впливає на утворення цієї сполуки в гепатоцитах 24-місячних щурів.

5. Ефект L-тироксину на утворення фосфатидилетанолу у клітинах печінки знижувався під дією інгібітора ПКС – сполуки Н7, що свідчить про залучення ПКС до регуляції тироксином активності ФЛД.

6. У присутності хелатора внутрішньоклітинного кальцію – ТМВ-8 стимулюючий ефект тироксину на утворення ДАГ у гепатоцитах щурів 3-місячного віку пригнічується, що свідчить про важливу роль іонів кальцію в короткотерміновій регуляції цього процесу тироксином.

7. Зниження рівня ФХ і збільшення вмісту ДАГ у перші хвилини впливу L-тироксину супроводжується в подальшому зменшенням ДАГ на тлі підвищення кількості ФХ, що може свідчити про термінацію процесу активації ФЛД і ресинтез ФХ.

8. Короткочасний вплив тироксину на організм тварин стимулює обмін ліпідів печінки молодих і старих тварин, однак якісні характеристики та динаміка процесу у 3- та 24-місячних щурів суттєво відрізняються. Швидке накопичення фосфоліпідів у печінці 3-місячних щурів під впливом тироксину відбувається при одночасному підвищенні рівня холестеролу і триацилгліцеролу. В печінці 24-місячних щурів зростання вмісту фосфоліпідів відбувається більш повільно, на тлі падіння рівня ДАГ та жирних кислот. На відміну від двофазного підвищення рівня холестеролу в печінці 3-місячних щурів у старих тварин накопичення ліпіду не спостерігається. Серед вивчених фракцій фосфоліпідів найбільш різких змін на ранньому етапі дії тироксину на організм зазнають СФМ и ФІ печінки 3-місячних та ФХ – 24-місячних щурів.

ПЕРЕЛІК ОПУБЛІКОВАНИХ ПРАЦЬ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

1. Kavok N. The role of thyroid hormones in the regulation of protein kinase C activity of rat liver // School of Fundamental Medicine Journal.-1997.-Vol. 3, № 1.- P. 24-26.

2. Кавок Н.С., Красильникова О.А., Бабенко Н.А. Роль тиреоидных гормонов в регуляции обмена полифосфоинозитидов и фосфатидилхолина в печени крыс // Вісник Харківського університету.- 2000.- №456,ч 2.-С.99-101.

3. Кавок Н.С., Красильникова О.А., Сидоркина О.М., Бабенко Н.А. Быстрый эффект тироксина на процесс накопления диацилглицерина и активацию протеинкиназы С в клетках печени // Биохимия.- 2000.- Т.65, №11.- С.1577-1583.

4. Кавок Н.С.Возрастные особенности регуляции тиреоидными гормонами ацилирования фосфолипидов в печени крыс // Вісник Харківського університету.- 2001.- № 506.-С.270-272.

5. Kavok N.S. Krasilnikova O.A., Babenko N.A. Thyroxine signal transduction in liver cells involves phospholipase C and phospholipase D activation. Genomic independent action

of thyroid hormone //BMC Cell Biology.-2001. - Vol. 2. – P. 5. Available HTTP: //www.biomedcentral.com/1471-2121/2/5.

6. Бабенко Н.А., Кавок Н.С., Красильникова О.А., Гафт М.Х. Возрастные особенности влияния L- и D-тироксина на образование диацилглицеринов в печени белых крыс // Биологические механизмы старения. Симпозиум: Тез. докл. 12-14 мая 1994 г. – Харьков, 1994. – C. 14.

7. Кавок Н.С. Влияние тиреоидных гормонов на обмен сфингомиелина и фосфатидилхолина печени крыс // Біологічні механізми старіння. Міжнародний симпозіум. Тез. доп. – Харків, 1996. – C.58.

8. Кавок Н.С. Участие тиреоидных гормонов в регуляции активности фосфолипазы Д в клетках печени // Матеріали наукової конференції молодих вчених біологічного факультету та науково-дослідного інституту біології. – Харків: ХДУ, 1996. – С.24.

9. Кавок Н.С. Вікові особливості впливу тироксину в умовах in vitro на обмін ліпідів печінки білих щурів // VII Український біохімічний з?їзд. Тез. доп. 4.1 – Київ, 1997. – С.96-97.

10. Бабенко Н.А., Кавок Н.С., Красільнікова О.А., Натарова Ю.А. Особливості регуляції обміну ліпідів та функціональної активності печінки в старості // Тези доповідей XV з?їзду Українського фізіологічного товариства – Фізіологічний журнал – 1998. – Т.44, №3. – С.307.

11. Babenko N.A., Kavok N.S., Natarova U.A., Filenko V.A. Age-peculiarities of sphingolipids metabolism regulation / IV European Congress of Gerontology. Abstracts July 7-11, 1999. Berlin, Germany- Р11/223.

12. Бабенко Н.А., Кавок Н.С., Красільнікова О.А. Вікові особливості реалізації гормонального сигналу в тканинах-цілях // IV Международный симпозиум. Биологические механизмы старения. Тез.докл. – 24-27 мая 2000 г. – Харьков, 2000. – С.101.

13. Babenko N.A., Kavok N.S., Krasilnikova O.A. Age peculiarities of the thyroid hormone signal tranduction in the liver cells. // 2nd European Congress on biogerontology. From molecules to humans. Abstracts. August 25-28, 2000. Saint Petersburg, Russia-Advances in Gerontology-2000.-Vol.5.-P.33-34.

АНОТАЦІЯ

Кавок Н.С. “Вікові особливості метаболізму ліпідів печінки щурів на ранньому етапі дії тиреоїдних гормонів”. – Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 03.00.04. – біохімія. - Харківський національний університет ім. В.Н.Каразіна, Харків, 2001.

Вивчали вікові особливості та механізми короткотермінової регуляції тиреоїдними гормонами метаболізму ліпідів печінки щурів. Встановлено, що тироксин протягом перших хвилин дії стимулює в клітинах печінки 3-місячних щурів процес деградації фосфоліпідів, який супроводжується швидким та короткочасним накопиченням у клітинах ліпідних вторинних месенджерів – діацилгліцеролів. Показано, що утворення цих сполук пов`язано з активацією фосфоліпази Д. Регуляція ферменту під впливом тироксину здійснюється по механізму, до якого залучені ПКС і Са2+. Отримані результати свідчать про існування взаємозв'язку між порушенням утворення ліпідних медіаторів сигнальної трансдукції і змінами у характері метаболічної відповіді клітин печінки на гормональний сигнал у старості.

Ключові слова: печінка, тироксин, діацилгіцероли, фосфоліпаза Д, протеїнкіназа С.

АННОТАЦИЯ

Кавок Н.С. "Возрастные особенности метаболизма липидов печени крыс на раннем этапе воздействия тиреоидных гормонов". – Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.04. – биохимия. – Харьковский национальный университет им. В.Н. Каразина, Харьков, 2001 г.

В работе изучали краткосрочное действие тиреоидных гормонов на обмен липидов печени крыс разного возраста.

Установлено, что введение экзогенного тироксина в организм 3- и 24-месячных крыс вызывает быстрые изменения в содержании индивидуальных липидов печени у животных обеих возрастных групп, однако качественные характеристики ответа и динамика процесса у молодых и старых животных существенно различаются. Накопление фосфолипидов и триацилглицерола в печени 3-месячных крыс обнаруживается уже к 15-й минуте воздействия гормона на организм, тогда как повышение уровня фосфолипидов в клетках печени 24-месячных крыс выявляется после более длительного, чем у молодых животных, лаг-периода, причем метаболический ответ имеет качественно иные характеристики.

Стимулирующий эффект тироксина на метаболизм липидов печени 3-месячных крыс воспроизводится также при действии гормона в условиях in vitro. Под влиянием гормона происходит быстрое (к 15-й минуте эксперимента) накопление фосфолипидов, образованных из различных меченых предшественников, а также усиливается включение жирных кислот в триацилглицерол. В клетках печени 24-месячных крыс в данных экспериментальных условиях тироксин не вызывает достоверных изменений в содержании липидов и их отдельных фракций.

Выявлены существенные возрастные различия в регуляции метаболизма сфингомиелина и холестерола при кратковременном воздействии тироксина на организм. Быстрое повышение уровня сфингомиелина в печени 3-месячных крыс сопровождается увеличением содержания холестерола (15 минута эксперимента), тогда как накопление холестерола при более продолжительном действии гормона (60 и 120 минут) происходит на фоне значительного подъема уровня жирных кислот, которое, по-видимому, является результатом активации липолитических процессов. У старых животных подобные изменения не выявлены. Показано, что фазе накопления глицеролипидов в клетках печени молодых животных при действии тироксина в условиях in vitro предшествует этап деградации фосфолипидов с образованием липидных вторичных посредников – диацилглицеролов. Данный эффект развивается в течение первых минут воздействия гормона и является кратковременным, дозозависимым и высокоспецифичным.

Ингибитор полифосфоинозитид специфичной фосфолипазы С-неомицин снижает, однако не отменяет, действие тироксина на образование диацилглицеролов в гепатоцитах 3-месячных крыс, что доказывает вовлечение независимых от обмена полифосфоинозитидов путей генерации диацилглицерола под влиянием тироксина. Установлено, что источниками данных соединений в гормонактивированных клетках являются фосфатидилэтаноламин и фосфатидилхолин.

Ингибитор фосфатидатфосфатазы – пропранолол блокирует стимулирующий эффект гормона на образование диацилглицеролов, это доказывает, что их накопление происходит в ходе дефосфорилирования фосфатидной кислоты. Показано, что накопление диацилглицерола в клетках печени молодых животных опосредовано активацией фосфолипазы Д. Об активации фермента судили по образованию фосфатидилэтанола в реакции трансфосфатидилирования этанола, которую катализирует фосфолипаза Д. Обнаружено, что тироксин стимулирует накопление данного соединения в гепатоцитах 3-месячных крыс и не влияет на его уровентв гепатоцитах 24-месячных крыс. Эффект гормона на образование фосфатидилэтанола в клетках печени молодых животных является дозозависимым и специфичным.

Установлено, что тироксин регулирует активность фосфолипазы Д по механизму, в который вовлечены протеинкиназа С и Са2+. Показано, что под влиянием L- , но не

D-тироксина происходит увеличение активности протеинкиназы С клеток печени. Подавление активности фермента ингибитором Н7 снижает также эффект тироксина на образование фосфатидилэтанола в гепатоцитах 3-месячных крыс. Ингибитор не влияет на уровень данного соединения в гепатоцитах 24-месячных животных как в присутствии, так и в отсутствии гормона. Хелатор внутриклеточного Са2+ соединение ТМВ-8 значительно подавляет стимулирующее действие тироксина на образование диацилглицерола. По-видимому, для полной активации фосфолипазы Д под влиянием L-тироксина необходимо синергичное взаимодействие протеинкиназа С-зависимых и Са2+-зависимых регуляторных механизмов. Нарушение в старости этапа образования диацилглицеролов при кратковременном воздействии тироксина на клетки печени может являться одной из