Київський національний університет імені Тараса Шевченка

УДК 581.141:142:547.96

Ковальчук Наталія Віталіївна

ФІЗІОЛОГІЧНА РОЛЬ ЛЕКТИНІВ У ПРОЦЕСАХ ДОЗРІВАННЯ І ПРОРОСТАННЯ НАСІННЯ КВАСОЛІ

03. 00. 12 - фізіологія рослин

Автореферат дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

Київ - 2001

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана у відділі фітогормонології Інституту ботаніки ім. М.Г. Холодного НАН України

Науковий керівник:

доктор біологічних наук, професор

Мусатенко Людмила Іванівна,

Інститут ботаніки ім. М.Г. Холодного НАН України,

завідувач відділу фітогормонології

Офіційні опоненти:

доктор біологічних наук, ст. наук. співробітник

Яворська Вікторія Казимирівна,

Інститут фізіології рослин і генетики НАН України, м. Київ

завідувач відділу росту і розвитку рослин

кандидат біологічних наук

Мельникова Наталія Миколаївна,

Інститут мікробіології та вірусології ім. Д.К.Заболотного

НАН України, м. Київ

науковий співробітник відділу мікробіологічних процесів на твердих поверхнях

Провідна установа:

Львівський національний університет імені Івана Франка

Захист дисертації відбудеться 18.06.2001 р. о 14 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.001.24 Київського національного університету імені Тараса Шевченка за адресою:

03022, Київ, проспект академіка Глушкова, 2, біологічний факультет, ауд. 215.

Поштова адреса: 01033, Київ-33, вул. Володимирська, 64.

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Київського національного університету імені Тараса Шевченка: 01033, Київ-33, вул. Володимирська, 58.

Автореферат розісланий 17.05.2001 р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради____________ Брайон О.В.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність проблеми. Лектини (від лат. legere - вибирати) - білки зі специфічними біологічними властивостями, які зворотно й вибірково зв`язують вуглеводи, не викликаючи їх хімічного перетворення, привертають увагу вчених не одне десятиліття (Rigas, Osgood, 1955; Roth, 1978; Луцик и др., 1981; Chrispeels, Raikhel, 1991). Зв`язування лектинів із вуглеводними компонентами поверхні призводить до аглютинації клітин або рослинних протопластів, мітогенної стимуляції лімфоцитів, зміни іонної проникності мембран, лізису зооспор грибів, стимуляції проростання пилку, токсичності по відношенню до клітин ссавців та інших подій. Проте, єдиної думки щодо фізіологічної ролі лектинів у рослинах на даний час не знайдено. Останні дослідження з лектинами зародків пшениці розкривають їх антистресову та захисну роль (Шакирова, Безрукова, Шаяхметов, 1995). При цьому показано, що антистресова роль лектинів може бути опосередкована фітогормонами, зокрема, абсцизовою кислотою. Так, встановлена стимулююча дія цього фітогормона на синтез лектинової мРНК (Mansfield and Raikhel, 1990). У дослідах з калусною культурою квасолі (Borrebaeck and Linsefors, 1985) показано, що на безгормональному середовищі не відбувається синтезу лектинів, а при дії кінетину та 2,4-Д вміст лектину зростає. Найбільша кількість лектинвмісних видів належить до родини бобових, з насіння яких виділені найвідоміші фітолектини - фітогемаглютинін (ФГА) і конканавалін А відповідно з Phaseolus vulgaris L. і з Canavalia ensiformis L. ФГА - один з перших очищених та охарактеризованих аглютинінів, локалізований у білкових тілах, складає близько 10% сумарного білку сім`ядолей і розпадається протягом росту проростка, подібно до інших запасних білків (Bollini, Chrispeels, 1978). Проте, наявність ФГА у вегетативних органах протягом усього онтогенезу рослини (Borrebaeck, 1984) та гіпотези про можливу участь в регуляції клітинного поділу (Rietveld et al., 2000), у розвитку білкових тіл протягом дозрівання (Walton, 1980; Booij et al., 1996) та у захисті проростаючого насіння (Peumans, Van Damme, 1995) свідчать про набагато ширшу, ніж запасну, фізіологічну роль лектинів насіння. У роботі була зроблена спроба дослідити кінетику накопичення лектину в процесі дозрівання і проростання насіння квасолі та його зв`язок зі змінами у комплексі фітогормонів, що має велике значення для розуміння як гормональної регуляції синтезу окремих білків, так і функціональної ролі лектинів.

Зв`язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертаційна робота виконувалась у рамках двох бюджетних тем “Гормональна регуляція процесів росту і розвитку нижчих і вищих рослин та грибів” (реєстраційний № 0198U007929) і “Адаптивна роль природних регуляторів росту рослин” (реєстраційний № 0194U013762) відділу фітогормонології Інституту ботаніки ім. М.Г. Холодного НАН України.

Мета і задачі дослідження. Мета роботи - вивчення динаміки накопичення та основних властивостей лектину, виділеного з функціонально різних частин зародку при дозріванні та проростанні насіння квасолі, а також з`ясування можливої регуляції вмісту та активності даного глікопротеїду різними типами фітогормонів.

Для досягнення поставленої мети вирішувались наступні задачі:

1.

2.

3.

4.

Об`єкт дослідження – це процеси дозрівання і проростання насіння.

Предмет дослідження – біла спаржева квасоля (Phaseolus vulgaris L.) сорту “Білозерна”.

Методи дослідження – визначення вмісту та активності лектинів методами електрофорезу, денситометрії, гемаглютинації.

Наукова новизна одержаних результатів. Вперше проведено поетапне дослідження зміни вмісту та активності лектину у функціонально різних частинах зародку протягом дозрівання і проростання насіння квасолі. Отримано нові дані щодо накопичення даного білку в зародкових осях протягом дозрівання насіння. Доведено можливість виділення лектину у навколишнє середовище на початкових етапах проростання, де він може відігравати функціональну роль у захисті проростаючого насіння. Проведено аналіз вуглеводної специфічності, субодиничного складу, активності виділеного лектину. На основі отриманих результатів висунуто припущення про функціональну роль лектинів у формуванні стану спокою та в захисті проростаючого насіння. Встановлено залежність кількості та активності аглютиніну від фази онтогенезу насінини, що пов`язано, в першу чергу, із змінами ендогенного вмісту АБК і ГК3 (гіберелова кислота). Виявлено вплив екзогенної обробки фітогормонами різних типів на лектинову активність у зародкових осях та сім`ядолях.

Теоретична та практична цінність одержаних результатів. Отримані в роботі дані істотно доповнюють сучасні уявлення про функціональну роль лектинів насіння. Результати досліджень свідчать про існування механізмів фітогормональної регуляції вмісту та активності даних білків. Встановлені закономірності динаміки аглютинінів у функціонально різних частинах зародку протягом дозрівання і проростання насіння мають загальнотеоретичне значення для оцінки ролі окремих білкових сполук у процесі онтогенезу рослинного організму.

Особистий внесок здобувача. Автором дисертації було самостійно виконано аналіз літературних даних, розроблена методологія, проведено експериментальні дослідження та їх статистичну обробку та проаналізовано отримані результати.

Апробація роботи. Результати досліджень, що включені до дисертації, доповідалися на 2-й практичній конференції з раціонального природокористування (Севастополь, 1996); на IV міжнародній конференції з медичної ботаніки (Київ, 1997); на Європейському конгресі з молекулярної і клітинної біології (Брайтон, Англія, 1997); на міжнародній конференції “Онтогенез рослин в природному та трансформованому середовищі” (Львів, 1998); на VII молодіжній конференції ботаніків у Санкт-Петербурзі (2000); на ХІI конгресі Федерації Європейських Товариств Фізіологів Рослин (FESPP) (Будапешт, Угорщина, 2000); на 12-й міжнародній конференції “Вивчення онтогенезу рослин природних та культурних флор у ботанічних закладах і дендропарках Євразії” (Полтава, 2000).

Публікації. Результати дисертації опубліковані в 10 наукових працях, з яких 4 статті у наукових журналах.

Структура та об`єм роботи. Дисертація складається зі списку скорочень, вступу, семи розділів основної частини, узагальнення результатів досліджень, висновків та списку використаних джерел (містить 247 найменувань). Дисертаційна робота викладена на 135 сторінках машинопису, містить 5 таблиць та 23 рисунки.

МАТЕРІАЛИ ТА МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ

У дослідженнях використовували зріле сухе (схожість більше 80%), а також недозріле – в процесі ембріогенезу, насіння білої спаржевої квасолі (Phaseolus vulgaris L.) сорту “Білозерна”, вирощеної у польових умовах (на експериментальній базі Інституту ботаніки ім. М.Г. Холодного НАН України, селище “Феофанія”).

Лектини екстрагували 0,1 М К-фосфатним буфером (рН 7,0). Охолоджений екстракт центрифугували 20 хвилин при 27 000 об/хв. при 4 0С. Отриманий супернатант діалізували ніч проти 50 мМ Na-фосфатного буфера (рН 7,2) та використовували для подальших досліджень (Borrebaeck, Mattiasson, 1983).

Електрофорез білків проводили по модифікованому методу Лемлі (Laemmli, 1970) з використанням градієнтного ПААГ (10 – 22%) у присутності ДДС-Na. Молекулярні маси білків визначали за відомими маркерами. Визначення концентрації білку проводили за методом Бредфорд у мікромодифікації (Read, Northcote, 1981).

Для визначення лектинової активності застосовували метод гемаглютинації за Луциком (Луцик та ін., 1981). Лектинову активність визначали як мінімальну концентрацію білку, при якій спостерігається аглютинація і виражали в обернених одиницях (мг/мл)-1 (Выскребенцева, Борисова, 1996).

Дослідження вуглеводної специфічності починали з визначення цукру, який зв`язує даний лектин. Використовували наступні вуглеводи: арабінозу, галактозу, глюкозу, лактозу, мальтозу, сахарозу, ксилозу, рамнозу, фруктозу, дульцит, інозит, маніт, сорбіт, N-ацетил-D-галактозамін. Для кількісної характеристики вуглеводної специфічності визначали мінімальну пригнічуючу концентрацію вуглеводу (Луцик та ін., 1981).

Для вивчення регуляторного впливу різних фітогормонів на активність лектинів насіння квасолі після 3-годинного набухання у дистильованій воді переносили на розчини фітогормонів і пророщували в термостаті при температурі 27 0С протягом 27 годин.

Одержані дані були статистично оброблені; достовірність різниці між варіантами оцінювали за критерієм Ст`юдента, використовуючи 5% рівень значущості.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Динаміка вмісту та активності лектинів при дозріванні насіння квасолі. Визначаючи етапи досліджень насіння протягом дозрівання: на 30-й, 40-й та 50-й день після зацвітання (д.п.з.), виходили з послідовності етапів розвитку насінини. А саме, припинення новоутворення клітин у сім`ядолях та продовження росту органів зародкової осі (30 д.п.з.), припинення поділів у гіпокотилі і завершення періоду росту зародку (40 д.п.з.), та в кінці ембріогенезу насінини (50 д.п.з.), який характеризується відсутністю клітинного росту в органах зародку, накопиченням у ньому запасних речовин, зневодненням і переходом до стану спокою (Мусатенко, 1985).

Електрофоретичний та денситометричний аналіз легкорозчинних білків, виділених на різних етапах дозрівання із зародкових осей і сім`ядолей, дозволив виявити зростання вмісту поліпептидів в процесі запасання поживних речовин, а також розширення їх спектру за рахунок появи "нових" білкових молекул. Такі новоутворені білки, можливо, відіграють важливу роль у завершенні формування насіння та переходу насінини до стану спокою. У виділеній фракції легкорозчинних білків було виявлено два поліпептиди, які за електрофоретичною рухливістю та молекулярною масою відповідали двом субодиницям очищеного ФГА (фірма “Serva”) (рис. 1) – легкій Л (лімфоцит-активна) з молекулярною масою 34 кДа і важкій Е (еритроцит-активна) 36 кДа.

Відносну кількість лектину, ідентифікованого таким чином як ФГА, та його субодиниць наведено в таблиці 1. Було виявлено, що даний білок посідає одне з основних місць у поліпептидному спектрі насіння квасолі досліджуваного сорту. Так, у сім`ядолях він кількісно поступався лише трьом поліпептидам, які являють собою, очевидно, основний запасний білок квасолі віцилін, оскільки область їх локалізації відповідає молекулярним масам його субодиниць - 52, 49 і 46 кДа (Bollini, Chrispeels, 1978), а у зародкових осях у кінці дозрівання (на 50-й д.п.з. та в сухому насінні) субодиниці ФГА характеризуються максимальною кількістю, порівняно з іншими поліпептидами. На завершальних етапах ембріогенезу насінини його кількість у зародкових осях зростає більше як у 3 рази на 50-й д.п.з., а в сухому насінні більше як у 4 рази, порівняно з початком дозрівання. Таке збільшення вмісту лектину свідчить про накопичення даного білку в процесі дозрівання саме у цій частині зародку.

Протилежна картина відмічена у сім`ядолях, де кількість ФГА суттєво зменшується на завершальних етапах дозрівання. Якщо на 30-й д.п.з. вміст лектину у сім`ядолях перевищує вміст у зародкових осях майже у 3,5 раза, то на 50-й д.п.з., його кількість уже менша, ніж у зародкових осях. Проте, на 40-й д.п.з. спостерігається максимум ФГА у сім`ядолях.

Виходячи з отриманих результатів, можна зробити висновок, що ФГА накопичується саме у зародкових осях, а не в сім`ядолях, як типові запасні білки. Порівняння динаміки накопичення класичного запасного білку віциліну і лектину в сім`ядолях (рис. 2) свідчить про чітку відмінність між ними. Так, кількість віциліну зростає в сім`ядолях впродовж дозрівання насіння з максимумом його вмісту на 50-й д.п.з. Щодо ФГА, то, на відміну від запасних білків, його кількість в кінці ембріогенезу насінини зменшується, що, можливо, відбиває різну фізіологічну функцію даних насіннєвих білків.

При дослідженні субодиничного складу ФГА виявлено значні відмінності не лише між різними етапами дозрівання, а й між різними частинами насінини. Зокрема, у зародкових осях на 30-й д.п.з. вміст легкої субодиниці Л був вищим за кількість субодиниці Е на 13,8%, а на 40-й д.п.з., навпаки, був нижчий на 3,8 % (табл. 1, рис. 3). До кінця дозрівання спостерігалось подальше зростання вмісту субодиниці Е та зменшення на її фоні субодиниці Л. У сім’ядолях протягом дозрівання динаміка вмісту субодиниці Е має параболічний характер, тоді як вміст субодиниці Л поступово падає. Кількісна відмінність між субодиницями була незначною (близько 3-5%) як на початку, так і в кінці дозрівання. Проте, на 40-й д.п.з., під час інтенсивних ростових процесів, різко зростав вміст субодиниці Е і був вищий на 31%, порівняно з субодиницею Л. Наведені дані свідчать про можливу зміну ізолектинового складу ФГА протягом дозрівання насіння, тобто про їх кількісний і якісний перерозподіл. Так, у зародкових осях вміст Е-вмісних ізолектинів (Е4, Е3Л1, Е2Л2, Е1Л3) зростає в процесі дозрівання, а у сім`ядолях, навпаки, при переході до стану спокою збільшується кількість Л-вмісних ізолектинів (Л4, Л3Е1, Л2Е2, Л1Е3). Важливо відмітити, що динаміка лектинової активності корелювала з кількістю субодиниці Е, тоді як вміст субодиниці Л не впливав на динаміку активності лектину. Очевидно, саме Е-вмісні ізолектини відповідають за аглютинацію еритроцитів.

У ході експерименту на всіх трьох стадіях дозрівання виявлено значну лектинову активність у зародкових осях, де вона зростає в ході онтогенезу насінини більше, ніж у 4 рази (рис. 3). Так, на 30-й д.п.з. лектинова активність становила 3,92 (мг/мл)-1, на 40-й д.п.з. уже 7,7; а на 50-й д.п.з. 16 (мг/мл)-1.

У сім`ядолях, навпаки, лектинова активність знижувалася протягом дозрівання. Так, якщо на 30-й д.п.з. вона становила 22,9 (мг/мл)-1, то на 50-й д.п.з. її рівень знизився до 12,4 (мг/мл)-1. Проте, на 40-й д.п.з. спостерігалось різке зростання активності, що може свідчити про можливу роль ФГА саме на етапі зупинки ростових процесів у сім`ядолях.

Враховуючи літературні дані про існування в молекулі ФГА крім двох вуглеводзв`язуючих, ще двох центрів, здатних специфічно взаємодіяти з неполярними лігандами, зокрема цитокінінової природи (зеатин, дигідрозеатин, кінетин, ізопентеніладенін) (Roberts, Goldstein, 1981), а також високий вміст лектину в насінні квасолі, особливо у зародкових осях, можна припустити можливість зв`язування значної кількості присутніх цитокінінів, що призводить до зниження проліферативної активності в тканинах зародку. Таким чином, очевидно, лектини здатні знижувати ефективні концентрації цитокінінів у насінні, виступаючи важливою ланкою в процесі формування стану спокою.

Крім того, останні дослідження з фітолектинами розкривають їх захисну та антистресову роль і вказують на накопичення лектинів при дії стресових факторів різної природи, в тому числі осмотичного стресу (Безрукова, 1997; Комарова, Молодюк, 1999). Як відомо, на завершальних етапах дозрівання насінина через зневоднення втрачає до 70% води і перебуває в стані водного стресу. Можливо, значне накопичення лектину в зрілому насінні відбувається внаслідок стрес-індукованого синтезу.

При дослідженні вуглеводної специфічності ФГА на різних стадіях дозрівання з використанням 14 видів вуглеводів було виявлено здатність N-ацетил-D-галактозаміну та D-галактози пригнічувати лектинову активність (рис. 4). Протягом дозрівання вуглеводна специфічність лектину не змінювалась і була однаковою як для зародкових осей, так і для сім`ядолей. Відомо, що чистий ФГА має аналогічну вуглеводзв`язуючу активність (Brewin, Kardailsky, 1997), а також здатний специфічно взаємодіяти з вуглеводною частиною тваринного глікопротеїду тиреоглобуліну (Borrebaeck, 1984). Провівши ряд послідовних розведень даних вуглеводів, було визначено мінімальну пригнічуючу концентрацію, яка складала 0,125 М/л для N-ацетил-D-галактозаміну і 0,25 М/л для D-галактози. Це може свідчити про більшу спорідненість до N-ацетил-D-галактозаміну, порівняно з D-галактозою. Що ж стосується інших використаних вуглеводів, то жоден з них не пригнічував аглютинуючу активність, тобто не був специфічним до даного лектину.

Вміст і активність лектинів у проростаючому насінні квасолі. Період проростання був поділений на етапи, виходячи з кривої проростання насіння квасолі, а також із структурно-функціональних закономірностей росту насінини (Мусатенко та ін., 1982; Мартин, Нестерова, 1989). Перший період триває 5-6 годин і пов`язаний з інтенсивним поглинанням води, збільшенням розміру і маси зародкової осі. Другий період (близько 13 год.) характеризується активними метаболічними процесами і майже незмінними розмірами і вагою зародку. Третій період (біля 25 год.) триває до появи перших поділів у кореневій меристемі, пов`язаний з метаболічним поглинанням води і швидким ростом зародкової осі і завершується накльовуванням. Першими починають ділитися клітини меристеми кореня (25-27 год.), за ними стеблової меристеми (36 – 40 год.), далі активується меристема листків (біля 48 год.) і останніми починають ділитися клітини стебла (72 год.).

При електрофоретичному дослідженні спектру легкорозчинних білків сім`ядолей і зародкових осей проростаючого насіння було виявлено, що вміст ФГА та його субодиниць змінювався протягом 48 годин проростання (рис. 5, табл. 2). Так, протягом перших 6 годин вміст лектину у зародкових осях зменшився у півтора рази, а у сім`ядолях в 1,1 раза. Подальше зниження кількості білку продовжувалося до 30 години у зародкових осях і до 24 години у сім`ядолях. Проте, на 24 годину у сім`ядолях спостерігається інтенсивне накопичення лектину. Якщо на початку проростання кількість лектину у сім`ядолях була нижчою, порівняно із зародковими осями майже у півтора рази, то на 24 годину його кількість уже перевищувала вміст у зародкових осях більше як вдвічі. Незначне підвищення спостерігалося також у зародкових осях на 30 годину проростання, хоча воно було недовготривалим і уже на 48 годину динаміка вмісту лектину йде на спад як у зародкових осях, так і в сім`ядолях.

Дослідження лектинової активності різних частин зародку проростаючого насіння квасолі виявило (рис. 5) різке зниження активності на ранніх стадіях проростання. А саме, протягом перших трьох годин після замочування у сім`ядолях активність лектину зменшилася на 20%, а на 6 годину складала всього 1/5 його активності в сухому насінні.

Аналогічним чином при вивченні ранніх етапів проростання насіння пшениці було показано, що більша частина лектину втрачалася в першу годину набухання (Stinissen et al., 1981). Літературні дані свідчать про можливість вимивання рослинних білків з насінини при інтенсивній гідратації на початку проростання через нестабільні та пошкоджені мембранні структури. Так, Фонтейном (1977) на прикладі насіння сої показано виділення лектину з гідратованого насіння протягом 48 годин проростання. Провівши подібні дослідження, ми виявили, що, дійсно, протягом перших 24 годин лектин інтенсивно виходить у навколишнє середовище, внаслідок чого, очевидно, і відбувається відмічене нами різке зниження його вмісту на початкових етапах проростання.

Крім того, ФГА, вуглеводна специфічність якого при проростанні була аналогічною до встановленої при дозріванні насіння (рис. 4) – незмінною протягом чотирьох діб і однаковою для різних частин зародку, зв`язуючи залишки N-ацетил-D-галактозаміну, здатний гальмувати ріст хвороботворних бактерій, наприклад, Pseudomonas syringae pv. pisi, збудника бактеріального опіку гороху, що цілком підтверджує висунуту раніше гіпотезу про участь лектинів у захисті проростаючого насіння.

Зменшення лектинової активності у зародкових осях продовжується до 12 години проростання, після чого спостерігаються незначні підвищення з піками на 24, 36 та 48 годину. Як відомо, саме в ці періоди починаються перші поділи в меристемах - спочатку в кореневій, на 36 годину - в стебловій і на 48 - в меристемі листків (Мусатенко та ін., 1982), що може свідчити про роль ФГА під час інтенсивної проліферації клітин. Підтвердженням такого припущення можуть бути дані, отримані на культурі тканин з проростків квасолі, які показали накопичення лектину протягом логарифмічної фази росту культури і різке зниження вмісту при переході до стаціонарного стану (Borrebaeck, 1984). Крім того, в регуляції клітинних поділів ФГА може приймати опосередковану участь як цитокінін-зв`язуючий білок.

Вплив екзогенних фітогормонів на вміст ФГА в зародкових осях та сім`ядолях проростаючого насіння. Протягом проростання, на нашу думку, найбільш цікавим з точки зору динаміки вмісту ФГА є початковий період, коли лектинова активність різко падає, а також час початку невеликого зростання кількості ФГА (на 24 годину в зародкових осях і на 30 годину у сім`ядолях). Після трьох годин замочування у воді насіння переносили на розчин відповідного фітогормона, а контроль залишали у тих же умовах. Дослідним шляхом були підібрані такі фізіологічні концентрації фітогормонів, які не виявляли помітного впливу на ріст проростків. Використовували такі концентрації фітогормонів: АБК - 0,5 мг/л; ІОК (індолілоцтова кислота) - 0,2 мг/л; кінетин - 0,3 мг/л; ГК3 - 0,05 мг/л.

Отримані результати, представлені на рис. 6 і 7, показують, що вплив фітогормонів на лектинову активність значно відрізнявся у зародкових осях і сім`ядолях. Так, АБК, ІОК і кінетин мали подібний характер впливу і викликали зниження лектинової активності у зародкових осях уже через 3 години обробки (рис. 6). На 9 год. дії екзогенних регуляторів спостерігалося незначне, порівняно з контролем, підвищення активності лектину. Через 21 годину, коли в нормальних умовах лектинова активність зростала, порівняно з попереднім етапом проростання, під впливом АБК, ІОК та кінетин вона продовжувала знижуватись. Загалом же спостерігалось швидке (через 3 год обробки) і стабільне (протягом усього досліду - 27 год. обробки) зниження лектинової активності у зародкових осях, порівняно з контролем, яке не залежало від тривалості впливу АБК, ІОК і кінетин. Під дією екзогенної ГК3 зміни лектинової активності у зародкових осях мали зовсім інший характер. Так, на 3 год. обробки кількість лектину зросла на 15% і залежала від тривалості впливу даного фітогормона - на 27 годину лектинова активність збільшилась більше, ніж у 10 разів, порівняно з контролем.

Зовсім інша картина спостерігалася для сім`ядолей (рис. 7). Під дією ГК3, яка викликала швидке і помітне зростання лектинової активності у зародкових осях, у сім`ядолях кількість лектину або майже не змінювалась, або дещо зростала протягом обробки, але була набагато нижча, порівняно з контролем. Інші фітогормони мали подібний характер впливу, який проявлявся у зростанні лектинової активності майже втричі уже через 3 години обробки. Подальше зростання кількості лектину залежало від тривалості впливу екзогенних фітогормонів і на 27 годину перевищувало контроль більше, ніж у 10 разів для АБК та ІОК і більше, ніж у 5 разів - для кінетину.

Отже, встановлено протилежний вплив екзогенних фітогормонів на лектинову активність у зародкових осях і сім`ядолях. Так, АБК, ІОК і кінетин викликали сильний стимулюючий ефект у сім`ядолях, тоді як у зародкових осях під їх впливом активність лектину знижувалась, за винятком 9 год обробки, коли спостерігалося незначне її підвищення, порівняно з контролем. Слід відмітити, що майже незмінна лектинова активність у зародкових осях протягом досліджуваного періоду може свідчити про відсутність синтезу лектину у них під впливом АБК, ІОК та кінетину при одночасному зростанні лектинової активності у сім`ядолях.

Цікаво, що ГК3 випадає із загальної картини і має специфічний вплив, який проявляється у накопиченні лектину у зародкових осях при майже незмінній кількості ФГА у сім`ядолях. Це може свідчити про активний синтез ФГА у зародкових осях під впливом екзогенної ГК3.

Крім того, така відмінність дії ГК3 і інших фітогормонів може свідчити про різні механізми їх впливу на активність і кількість лектинів. Подібність дії АБК, ІОК і кінетину можна пояснити, виходячи з даних Безрукової (1997), яка досліджувала зміни ендогенної АБК під впливом екзогенних фітогормонів. Було показано, що екзогенні АБК, бензиламінопурин (БАП) та ІОК викликають значне підвищення вмісту ендогенної АБК. А, як свідчать літературні дані, таке підвищення викликає інтенсивний синтез лектинів (Cammue et al., 1989; Хайруллин и др., 1993; Шакирова и др., 1995). Інша картина спостерігалася для ГК3, під впливом якої рівень АБК у проростках пшениці практично не змінювався. Таким чином, можна припустити безпосередню участь ГК3 у регуляції синтезу лектину, тоді як ІОК і БАП впливають опосередковано через зміну кількості АБК. Крім того, необхідно відмітити вибірковість дії фітогормонів, які стимулюють синтез лектину в одній частині зародку і пригнічують в іншій. Так, можна припустити, що АБК пригнічує синтез ФГА у зародкових осях квасолі і активує у сім`ядолях. Тоді як ГК3, навпаки, стимулює накопичення лектину у зародкових осях, а у сім`ядолях суттєво не впливає на його кількість.

ВИСНОВКИ

1.

2.

3.

4.

5.

6.

7.

СПИСОК ОПУБЛІКОВАНИХ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ РОБІТ

1.Погоріла Н.Ф., Меншова В.О., Брайон О.В. Воєводіна О.В., Погоріла З.О., Бродовська Н.В. Лектини – біологічно активні речовини ехінацеї пурпурної // Фармацевтичний ж.- 1997.- №4.- с.80-83.

2.Ковальчук Н.В., Мусатенко Л.І. Лектини при дозріванні насіння // Доповіді НАНУ.- 2000.- №7.- с.169-173.

3.Ковальчук Н.В. Фізіологічна роль фітолектинів // Укр. бот. журнал.- 2000.-Т.57, №4.- с.442-445.

4.Pogorila N.F., Slavny P.S., Brayon O.B., Pogorila Z.O., Zhuk T.M., Brodovska N.V. Ecophysiological monitoring by means of lectins of grees plants // Тези доп. конф. з раціонального природокористування.- Севастополь (Україна).-1996.-с. 193-194.

5.Brodovska N., Pogorila N., Musatenko L. Lectins of Echynacea purpurea: allocation by organs and carbohydrate - binding specificity // European Congress for Molecular Cell Biology.- Brigton (England).-1997.-p.34.

6.Бродовська Н.В., Погоріла Н.Ф. Фітогемаглютиніни ехінацеї пурпурної // Тези доп. ІV конфер. з медичної ботаніки.-Київ.- 1997.-с.379-380.

7.Ковальчук Н.В., Мусатенко Л.І., Троян В.М. Лектини квасолі при дозріванні насіння // Матеріали конф. “Онтогенез рослин в природному та трансформованому середовищі”.-Львів.-1998.-с.157-158.

8.Ковальчук Н.В. Динамика лектинов при созревании семян фасоли Тезисы VII молод. конф. ботаников в Санкт- Петербурге.- 2000.-с.121.

9.Ковальчук Н.В., Мусатенко Л.І. Лектини при дозріванні насіння квасолі // Материалы 12 междунар. науч. конф. “Изучение онтогенеза растений природных и культурных флор в ботанических учреждениях и дендропарках Евразии”.- Полтава.- 2000.-с.151-153.

10.Kovalchuk N.V., Musatenko L.I. Lectins in bean during seed maturation // 12th Congress of the Federation of European Societies of Plant Physiology.- Budapest (Hungary).- 2000.-p.42.

АНОТАЦІЇ

Ковальчук Н.В. Фізіологічна роль лектинів у процесах дозрівання і проростання насіння квасолі (Phaseolus vulgaris L.). – Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 03.00.12 – фізіологія рослин. – Київський національний університет імені Тараса Шевченка, Київ, 2001.

Дисертація присвячена дослідженню фізіологічної ролі насіннєвих лектинів на прикладі лектину квасолі – фітогемаглютиніну (ФГА). Проаналізовано динаміку накопичення ФГА протягом дозрівання і проростання у функціонально різних частинах насінини, а також можливі механізми її регуляції різними типами фітогормонів. Проведені дослідження заперечують запасну природу ФГА та свідчать про його набагато ширшу фізіологічну роль. Вперше показано накопичення лектину при дозріванні насінини в зародкових осях, а не в сім`ядолях, на відміну від типових запасних білків, зокрема, віциліну. Високий вміст у зародкових осях ФГА та наявність в його молекулі центрів зв`язування неполярних лігандів цитокінінової природи, що веде до зниження ефективних концентрацій цитокінінів, може свідчити про важливе значення лектину у процесах формування стану спокою насінини. Показана захисна роль ФГА при проростанні насіння, яка базується на здатності лектину виділятися у навколишнє середовище та, внаслідок специфічної взаємодії зі складовими клітинних стінок хвороботворних бактерій, викликати затримку їх росту.

При дослідженні ендогенного вмісту різних типів фітогормонів, а також їх екзогенного впливу на лектинову активність, було виявлено можливість існування двох альтернативних шляхів гормональної регуляції накопичення лектинів у різних органах насінини, обумовлених АБК та ГК3.

Ключові слова: лектини, фітогемаглютинін, дозрівання, проростання, фітогормони, насіння, зародкові осі, сім`ядолі.

Ковальчук Н.В. Физиологическая роль лектинов в процессах созревания и прорастания семян фасоли (Phaseolus vulgaris L.). – Рукопись.

Диссертация на соискание научной степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.12 – физиология растений. – Киевский национальный университет имени Тараса Шевченко, Киев, 2001.

Диссертация посвящена изучению динамики содержания лектина фасоли и его физиологической роли в процессах созревания и прорастания семян, а также регуляторного влияния разных типов фитогормонов на лектиновую активность. По электрофоретической подвижности, молекулярной массе, субъединичному составу и углеводной специфичности, выделенный из семян фасоли сорта Белозерная лектин, аналогичен фитогемагглютинину (ФГА), соотношенте двух субъединиц которого (34 и 36 кДа) определяют различия изолектинового состава зародышевых осей и семядолей при созревании и прорастании семени. Впервые проведенные исследования накопления ФГА в функционально разных частях зародыша отрицают запасную роль данного белка, о чем свидетельствует снижение в семядолях на завершающих стадиях созревания содержания лектина, в отличие от классического запасного белка вицилина. Напротив, в зародышевых осях накопление ФГА происходило всего периода созревания, что может свидетельствовать о его функциональной роли в процессе формирования состояния покоя.

На начальных этапах прорастания количество ФГА резко уменьшалось, как в семядолях, так и в зародышевых осях, что может быть связано с выделением лектина в окружающую среду. Учитывая углеводную специфичность ФГА, способного связывать остатки N-ацетилD-галактозамина и галактозы, а также его антибактериальную активность, сделано предположение о функциональной роли лектина в защите прорастающего семени.

Впервые показаны различия регуляторного действия различных фитогормонов на лектиновую активность, что свидетельствует о существовании нескольких альтернативных путей её регуляциии в различных частях зародыша, опосредованных АБК и ГК3. В частности, исследование экзогенного влияния различных типов фитогормонов на лектиновую активность показало сходное действие АБК, ИУК и кинетина, которое приводило к увеличению эндогенного содержания АБК и проявлялось в снижении лектиновой активности в зародышевых осях и увеличении в семядолях. Экзогенная ГК3 не вызывала накопления АБК в семени и приводила к увеличению лектиновой активности в зародышевых осях и снижению в семядолях.

Ключевые слова: лектины, фитогемагглютинин, созревание, прорастание, семена, фитогормоны, зародышевая ось, семядоли.

Kovalchuk N.V. Physiological role of lectins in the processes of maturation and germination of bean seeds (Pheseolus vulgaris L.).- Manuscript.

The thesis for the Ph.D. degree obtaining on a speciality 03.00.12 – plant physiology.- Kyiv National Taras Shevchenko University, Kyiv, 2001.

The thesis for deals with the determination of seed lectin physiological role using as an example bean lectin - phytohemagglutinin (PHA). The dinamics of PHA accumulation during maturing and germination in functionally different parts of the seed as well as posible mehanisms of its regulation by various types phytohormones have been analysed. The results obtained refute a reserve nature of PHA and give evidence of its greater physiological role. It has been shown that lectin isolated at diffferent stages of seed maturing and germination has 2 subunits with molecule mass of 34 and 36 kDa respectively and specifically bind N-acetil D-galactosamin. As compared with typically reserve proteins such as vicilin lectin has for the first time been shown to accumulate in embryonic axes but not in cotyledons during maturing. This high content of PHA in embryonic axes and presence of binding centers for non-polar ligands of the cytokinin nature in PHA molecules may indicate the importanse of lectin in the development of seed dormancy through a reduction of cytokinin effective concentrations.

A protective role of PHA based during the germination on the lectin ability to exude into the environment and, as a result of specific interaction with components of cell walls in diseasc-producing bacteria, to cause inhibition of their growth has been shown.

During the investigation of an exogenous on the lectin activity as well as endogenous content of various phytohormones there has been found a possibility of existence of two alternative ways of the hormonal regulation on varius seeds organs mediated by ABA and GBA.

Key words: lectin, phytohemagglutinin, maturation, germination, phytohormones, seed, embryonic axes, cotyledon.