Інститут експериментальної і клінічної

ветеринарної медицини

УААН

Куцак Римма Святославівна

УДК:619:579:578:6365

Удосконалення регламенту вакцинопрофілактики

хвороби Марека курей

16.00.03. – ветеринарна мікробіологія та вірусологія

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата ветеринарних наук

Харків – 2001

Дисертацією є рукопис

Робота виконана в лабораторії вивчення хвороб птиці Інституту експериментальної і клінічної ветеринарної медицини УААН.

Науковий керівник

доктор ветеринарних наук, професор, член-кореспондент УААН Герман В'ячеслав Валентинович, Інститут експериментальної і клінічної ветеринарної медицини УААН, завідувач лабораторії вивчення хвороб птиці.

Офіційні опоненти

доктор ветеринарних наук, професор Панікар Ігор Іванович, Сумський державний аграрний університет, Міністерства аграрної політики України, завідувач кафедри вірусології і ветеринарно-санітарної експертизи;

кандидат ветеринарних наук, старший науковий співробітник Авдосьєва Ірина Корнилівна, Державний науково-дослідний контрольний інститут ветеринарних препаратів і кормових добавок, Міністерства аграрної політики України, завідувач лабораторії контролю біопрепаратів.

Провідна установа

Одеський державний сільськогосподарський інститут, Міністерства аграрної політики України, кафедра вірусології та мікробіології, м. Одеса.

Захист відбудеться “_1_” березня 2001р. о __10__ годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 64.359.01 при Інституті експеримен-тальної і клінічної ветеринарної медицини УААН за адресою :

61023, м. Харків, вул. Пушкінська, 83.

З дисертацією можна ознайомитися у бібліотеці Інституту експериментальної і клінічної ветеринарної медицини УААН за адресою : 61023, м. Харків, вул. Пушкінська, 83.

Автореферат розісланий “_26_” січня_2001р.

Вчений секретар спеціалізованої вченої ради,

доктор ветеринарних наук,

професор Конаржевський К.Є.

Загальна характеристика роботи

Актуальність теми. Значні економічні збитки від хвороби Марека (ХМ) курей викликають необхідність постійного контролю цього захворювання і удосконалення профілактики.

Провідним заходом боротьби з хворобою Марека є вакцинопрофілактика.

Незважаючи на використання широкого спектру сучасних вакцин, жодна з них не гарантує епізоотичного благополуччя стад курей з цього захворювання, оскільки не витісняє повністю польовий вірус та не запобігає виділенню його в зовнішнє середовище (Young P.L., Smith G.A., 1995).

Знання про біологічні властивості вірусу герпеса курей, збудника хвороби Марека, дозволяють констатувати, що розвиток хвороби і набуття специфічного імунітету залежить від різноманітних факторів, які необхідно враховувати для досягнення максимального захисту птиці від хвороби Марека.

Результати досліджень багатьох вчених свідчать про те, що наявність у курчат материнських антитіл, гомологічних до вакцинного штаму, поява в птахогосподарствах високовірулентних штамів вірусу хвороби Марека (ВХМ), помилки у технологічному процесі застосування вакцини, стрес-фактори, імуносупресивні хвороби та інш. знижують ефективність вакцинації і викликають підвищену загибель імунізованих проти ХМ курей (Коровин Р.Н., 1989; Герман В.В. та інш., 1991; Сергєєв В.О., 1993; Лукина В.О. та інш., 1996; Авдосьєва І.К. та інш., 2000; Chang J.D. та інш., 1985; De Boer G.F. та інш., 1986; Powell P.C. та інш., 1986; Otaki Y. та інш., 1988; Drouin P., 1997; Witter R.L. та інш., 1989, 1997, 1998).

В зв'язку з несприятливими економічними умовами і реформуванням сільськогосподарського виробництва в Україні не існує системного підходу до застосування вакцин проти ХМ з урахуванням конкретних технологічних процесів у птахівничих господарствах. Таке становище створює проблемну ситуацію, яка вимагає удосконалення регламенту вакцинопрофілактики на основі вивчення показників імунного статусу птахів і епізоотичного стану господарства з хвороби Марека.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Робота була виконана в лабораторії вивчення хвороб птиці ІЕКВМ у відповідності до аспірантського плану за темою : “Удосконалення регламенту вакцинопрофі-лактики хвороби Марека курей”, а також за планом науково-дослідних робіт, номер державної реєстрації 0197У000760/3.07.03 “Удосконалити методи діагностики та імуногенні засоби специфічної профілактики проти хвороби Марека курей”.

Мета і задачі дослідження. Метою роботи було удосконалення серологічної діагностики хвороби Марека курей, розробка регламенту вакцинопрофілактики і критеріїв контролю її ефективності.

Для досягнення наміченої мети були поставлені наступні задачі :

- вивчити можливості використання методів серологічної діагностики (РНГА, РДП) для оцінки ефективності вакцинації курчат проти хвороби Марека і отримання інформації щодо епізоотичного стану господарств;

- виконати серологічний моніторинг хвороби Марека курей в птахівничих підприємствах України;

- порівняти ефективність різних способів введення вакцини проти ХМ за показниками серологічних досліджень;

- вивчити вплив вакцинації в залежності від кратності і терміну імунізації вакцинами із гомологічних та гетерологічних штамів.

Об'єкт дослідження – епізоотичний процес при хворобі Марека, динаміка формування специфічного імунітету проти вірусу ХМ.

Предмет дослідження – птиця, вакцина, еритроцитарний антиген, вакцинопрофілактика хвороби Марека і контроль її ефективності.

Методи дослідження. Для дослідження поствакцинального імунітету і експрес-діагностики ХМ використовували серологічні методи досліджень (РНГА, РДП).

За допомогою епізоотологічних досліджень вивчали епізоотичний стан птахівничих господарств з ХМ та інших інфекццій.

За показниками патологоанатомічних методів досліджень оцінювали ефективність вакцинації проти ХМ курей.

Вірусологічні та гістоморфологічні методи використовували для постановки диференціального діагнозу.

З метою підтвердження стерильності матеріалів, що застосовували в дослідах, використовували бактеріологічний метод досліджень.

Методами біологічної статистики визначали вірогідність отриманих результатів.

Наукова новизна одержаних результатів. Вперше в Україні проведений серологічний моніторинг хвороби Марека курей з використанням реакції непрямої гемаглютинації (РНГА). Вперше запропонований експрес-метод серологічної діагностики і оцінки ефективності вакцинації проти хвороби Марека на основі застосування РНГА. При низьких рівнях групового імунітету у курчат 35-45-добового віку, запропонована внутрішньом'язова ревакцинація 50-55-денного молодняка курей, яка дає змогу підвищити збереженість поголів'я птиці на 2,3-4,5% в порівнянні з одноразовою імунізацією.

Практичне значення одержаних результатів. Результати виконаних досліджень покладені в основу “Настанови з лабораторної діагностики хвороби Марека курей”, яка затверджена Головним державним інспектором ветеринарної медицини України 7 березня 2000 року за №17-14/81.

У відповідності до наказу Держдепартаменту ветеринарної медицини

України від 4.11.99р. за №40 розроблена “Інструкція з профілактики і боротьби з хворобою Марека птахів”, яка передана на затвердження.

Особистий внесок здобувача Особисто виконано весь об'єм виробничих спостережень і експериментальних досліджень, узагальнення первинних даних, їх статистична обробка і аналіз, а також оформлення рукопису.

Апробація результатів дисертації. Основні результати досліджень доповідались і були обговорені на засіданнях вченої ради ІЕКВМ в 1994 – 1998 рр., на міжнародній науково-практичній конференції “Розвиток ветеринарної науки в Україні – здобутки і проблеми” (Харків, вересень 1997).

Публікації. Матеріали дисертації опубліковані у 4 друкованих працях, в тому числі три - у фахових наукових виданнях, де викладено основний зміст наукових досліджень.

Структура і обсяг дисертації. Дисертаційна робота викладена на 127 сторінках машинописного тексту, який містить вступ, огляд літератури, власні дослідження, обговорення результатів проведених досліджень, висновки, список використаних літературних джерел і додатки. Роботу ілюструють 24 таблиці, 22 графіка і діаграми та 4 додатки. Список використаної літератури налічує 172 джерела, в тому числі 111 іноземних.

Основний зміст

Матеріали і методи.Дослідження виконані в лабораторії вивчення хвороб птиці Інституту експериментальної і клінічної ветеринарної медицини, а також в птахівничих господарствах східного і південного регіонів України в період з 1994 до 1999 року.

В експериментах використовували вакцини проти хвороби Марека курей виробництва Нідерландів, Німеччини, Росії та України із вірусу герпеса індиків та вірусу герпеса курей, а також 3000 проб сироватки крові птиці, інкубаційні яйця і курячі ембріони віком 10-18 діб (1500 штук), 16 півнів та 850 курчат віком від 1 до 90 днів. Виробничі дослідження були проведені на 142 тисячах голів курей кросів Бєларусь-9 і Тетра-SL.

Специфічні сироватки крові для РНГА і РДП отримували від дорослих курей, відібраних із стад неблагополучних з ХМ.

Для отримання гіперімунних сироваток крові імунізували курчат 60-80 денного віку та дорослих півнів. Цикл імунізацій складався з 2-кратних інтраперитонеальних ін'єкцій вірус-вакцини Marek Nobilis зі штаму РВ-1 вірусу герпеса індиків (ВГІ) у зростаючій дозі від 1 до 2 см3 з інтервалом у 2 тижні (Коровін Р.Н. та інш., 1984).

Імунізацію птиці проти хвороби Марека проводили в дозі 1000 ФУО такими способами: 18-добовим ембріонам вприскували вакцину в повітряну камеру за методикою ІЕКВМ (Герман В.В., Жувак К.І., 1991); добовим курчатам вакцину вводили внутрішньом'язово в стегно, під шкіру – на шиї,

інтраназально – закапували на слизову оболонку носа.

Вивчаючи вплив на ефективність вакцинації проти ХМ кратності, термінів, доз та способів імунізації курчат, застосовували різні схеми щеплення (табл. 1). Всі три групи імунізували внутрішньом'язово в добовому віці в дозі 1000 ФУО, потім першу групу ревакцинували у віці 28 діб, другу групу - у віці 35 діб і третю - у віці 50-55 діб. Крім цього, кожна група під час ревакцинації була розділена на чотири підгрупи, в яких використовували дві різні дози вакцини (1000 і 2000 ФУО) і два різних способи введення вакцини (внутрішньом'язовий і підшкірний). Контрольні групи застосовували для оцінки результатів реімунізації у різні строки.

Таблиця 1

Схеми ревакцинації курчат проти ХМ

Дослідні групи Підгрупи Вакцинація в добовому віці Ревакцинація у віці, дні Доза, ФУО Спосіб введення вакцини

1 a b c d контроль + + + + + 28 28 28 28 - 1000 1000 2000 2000 - вн. м'язово підшкірно вн. м'язово підшкірно -

2 a b c d контроль + + + + - 35 35 35 35 - 1000 1000 2000 2000 - вн. м'язово підшкірно вн. м'язово підшкірно -

3 a b c d контроль + + + + - 55 55 55 55 - 1000 1000 2000 2000 - вн. м'язово підшкірно вн. м'язово підшкірно -

Ефективність ревакцинації оцінювали за допомогою індексу сероконверсії, який обчислювали шляхом ділення середньогеометричного титру антитіл, отриманого після другої вакцинації, на його величину після першої. Індекс конверсії, що знаходиться в діапазоні 1,3-3,9, свідчить про формування надійного імунітету (Авдосьєва І.К. та ін., 2000).

З метою вивчення впливу материнських антитіл на ефективність імунізації

проти ХМ вакцинами із різних штамів, використовували перехресну схему вакцинації (табл. 2).

Батьківське стадо курей та їх нащадків імунізували в добовому віці вакцинами із штамів CVI 988 віруса герпеса курей (ВГК) і РВ-1 ВГІ за різними варіантами. Біопрепарат вводили внутрішньом'язово в дозі 1000 ФУО.

Імунологічний моніторинг птахівничих господарств з ХМ виконували за допомогою експрес-методу РНГА із еритроцитарним антигеном ІЕКВМ.

Таблиця 2

Перехресна схема вакцинації курчат проти ХМ

Групи Вакцини із штамів

РВ-1 ВГІ CVI 988 ВГК

Курчата з материнськими антитілами до: ВГІ 1 + -

2 - +

ВГК 3 + -

4 - +

Крім цього, вивчали програми вакцинопрофілактики ХМ та використані при цьому вакцини, виконання загальних ветеринарно-санітарних і спеціальних заходів з охорони господарств від заносу інфекції і захисту від інших хвороб, умов годівлі та утримання.

Ефективність вакцинопрофілактики ХМ оцінювали враховуючи такі показники : клінічний стан, кількість загиблої птиці, аналіз причин загибелі і вибраковки за даними комплексних досліджень (патологоанатомічних, вірусологічних, серологічних, гістологічних, бактеріологічних та інш.).

Для проведення серологічних досліджень були виготовлені експериментальні серії еритроцитарного антигену на основі вакцинного штаму РВ-1 вірусу герпеса індиків. Специфічність діагностикуму контролювали за негативними результатами РНГА з сироватками крові специфічними до інших збудників (хвороби Ньюкасла, інфекційного ларинготрахеїту, хвороби Гамборо, інфекційного бронхіту, синдрому зниження несучості, інфекційного енцефаломієліту).

Постановку реакції непрямої гемаглютинації виконували мікрометодом.

Результати реакції враховували після осідання еритроцитів у контролі у вигляді крапки чи маленького ґудзика.

Позитивна реакція характеризувалась появою осаду еритроцитів у вигляді парасольки на дні лунки з рівними чи зубчастими краями.

Визначення рівня материнських антитіл у жовтку інкубаційних яєць проводили тим же методом, але жовтки попередньо розводили фізіологічним розчином у співвідношенні 1:2.

Рівень групового імунітету обчислювали по кількості проб крові із захисним титром антитіл 1:8 і вище у відсотках від числа досліджених сироваток крові.

В реакції дифузної преципітації (РДП) виявляли преципітуючі антитіла до вірусу хвороби Марека в сироватках крові дослідної птиці, а також

ідентифікували вірус хвороби Марека у вірусоутримуючих суспензіях із внутрішніх органів, тканин і фолікулів пір'я піддослідних курчат і курей.

Динаміку специфічних антитіл в сироватці крові вивчали в РНГА з еритроцитарним антигеном ІЕКВМ та в РДП у різноманітні строки після вакцинації – через 2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,14,15,17,20,21,25,30,34 тижнів.

Вірус виділяли із внутрішніх органів та фолікулів пір'я птиці на первинно-трипсинізованій культурі фібробластів курячих ембріонів (ФЕК). Первинно-трипсинізовану культуру фібробластів отримували за методом Голубєва Д.Б. і Сопіліна А.А. (1976).

Вірусоутримуючий матеріал для досліджень готували за загальноприйнятою методикою (Антонов Б.І., 1987).

Для вирощування культури клітин використовували комерційні середовища Ігла і середовища 199 у співвідношеннях 1:1 з добавкою 10% і стерильної сироватки крові великої рогатої худоби.

Неінфікована культура клітин була контролем і інкубувалась в тих же умовах.

Щоденно протягом 6-7 днів культуру ФЕК оцінювали під мікроскопом. Цитопатогенна дія (ЦПД) вірусу ХМ на моношарі ФЕК характеризувалась змінами у вигляді фокусів, які складались із скупчень округлих рефрактильних клітин-синцитіїв і мікроскопічно видимих бляшок – негативних плям. Специфічність ЦПД підтверджували шляхом дослідження окремих зразків матеріалу в РДП.

Вірус герпеса курей виділяли також із фолікулів пір'я птиці на курячих ембріонах. Ембріони десятиденної інкубації в кількості 10-15 штук заражали на хоріоналантоїсну оболонку в дозі 0,2 см3. Потім їх розміщували в термостаті з температурою 37,50 С і двічі на день овоскопували. Ембріони інкубували 7-8 діб. Загибель вважали специфічною через 72 години після зараження.

Ознакою інфікування ембріонів вірусом ХМ вважали їх загибель та утворення на хоріоналантоїсній оболонці сірувато-білих проліферативних плям-бляшок розміром до 1-3 мм в діаметрі, збільшення селезінки та печінки ембріона.

Специфічність змін підтверджували дослідженням матеріалу від заражених ембріонів в РДП.

Біологічну активність вакцинного вірусу визначали шляхом титрації на ФЕК. Титрацію проводили на моношарі клітин (24 год. інкубації) у матрацах об'ємом 50 см3. Кожне розведення в об'ємі 0,5 см3 вносили на моношар 4 флаконів та інкубували при + 370 С впродовж 5 днів. Титр вірусу обчислювали після попереднього забарвлення моношару культур клітин амідо-чорним з наступним підрахунком фокусоутворюючих одиниць (Dr. V. Palay, 1989).

З метою вивчення персистенції вірусу герпеса індиків у вакцинованих та

ревакцинованих курчат застосовували вакцину із штаму РВ-1 ТНV. У віці 10,25,35,45,65 і 75 днів курчат забивали по 3 голови з кожної групи і відбирали печінку, селезінку, кров для вірусовиділення і визначення концентрації вірусу.

Патологоанатомічному дослідженню було піддано більш ніж 300 трупів загиблих і тушок вимушено забитої птиці. При цьому, виявляли специфічні для ХМ патологоанатомічні зміни і диференціювали їх від лімфоїдного лейкозу за допомогою серологічного та гістоморфологічного методів.

Під час зовнішнього огляду відмічали стан скелетних м'язів. Після розтину до патологоанатомічних змін, характерних для ХМ, відносили такі :

- збільшення печінки і селезінки в 2-4 рази;

- різні за величиною пухлинні утворення в яєчниках, серці, залозному шлунку, шкірі, фабрициєвій сумці, легенях, нирках;

- яєчник у вигляді кольорової капусти, на серці різної величини опуклі білуваті утворення, нирки дуже збільшені горбкуваті, стінка залозного шлунку потовщена, сірувато-білого кольору з чітко контуруючими залозами;

- локальне або дифузне потовщення периферичних нервів;

- зміна кольору райдужної оболонки ока до сірого, неправильна форма зіниці (Красніков Г.А., 1982).

В результаті гістоморфологічних досліджень діагностували ХМ за такими критеріями :

- накопичення лімфоїдних клітин між фолікулами фабрициєвої сумки;

- пухлинні розрости різних внутрішніх органів з рідко розташованими поліморфними клітинами;

- виражена гіперемія і набряк, інтенсивна загибель клітин з явищами лізису і рексису ядер.

Результати дослідів були оброблені методами біологічної статистики за Лакіним Г.Ф. (1990).

результати досліджень

Порівняльна серологічна оцінка поствакцинального імунітету у молодняку курей, імунізованого проти ХМ.

З метою вивчення ролі гуморального імунітету у захисті вакцинованих проти ХМ курей були проведені дослідження в лабораторних і виробничих умовах. Для виявлення в сироватці крові курчат поствакцинальних антитіл використовували РНГА і РДП. Вивчаючи ефективність імунізації, здійснювали порівняльну характеристику вищезгаданих методів серологічної діагностики.

Дослід проводили на трьох групах курчат (по 2800 гол.). Першу і другу групи вакцинували в добовому віці, третя група була контрольна.

Збереженість курчат до 6 місячного віку 1 і 2 груп була значно вища, ніж у

невакцинованої птиці третьої групи, а відсоток загибелі курчат від ХМ був у контрольній групі в 4 рази більший. Ефективність імунізації була недостатньо високою і складала 76-78%.

Дані патологоанатомічного розтину трупів курей показали високу частоту враження печінки, селезінки і нирок (67-100%).

Серологічна оцінка поствакцинального імунітету (табл. 3) вказує на те, що на 20 добу після щеплення, в РНГА виявляли сліди антитіл до вірусу ХМ (0,1-0,8 log2) і титри не перевищували розведення сироватки крові курчат 1:2.

Таблиця 3

Виявлення специфічних антитіл до ВХМ в сироватках крові птиці в РНГА і РДП

Досліджувані показники Вік, дні Групи

1 2 3

Дані РНГА : кількість проб з титром антитіл 3 log2 і вище, % 20 0 0 0

30 0 0 0

40 60 60 0

60 60 50 0

80 0 0 0

Середньогео- метричний титр антитіл, Log2 Хg + m 20 0,1 0,4 0,8

30 0,8 1,1 0,9

40 3,0 + 0,29 2,3 + 0,12 0,2

60 2,8 + 0,18 2,1 + 0,17 0,4

80 1,6 + 0,12 1,8 + 0,10 0,2

Дані РДП : кількість позитивних проб від числа досліджених, % 20 0 0 0

30 0 0 0

40 10 10 0

60 0 10 0

80 0 0 0

Далі середньогеометричний титр підвищувався з віком курчат в період від 40 до 60 дня у групах вакцинованого молодняку і досягав 2,1-3,0 log2 та потім поступово знижувався. У невакцинованих курчат 3 групи титри антитіл знаходились на низькому рівні (0,2-0,4 log2), а різниця між середньогеометричними титрами специфічних антитіл у курчат 40-60-денного віку дослідних і контрольної груп була на високовірогідному рівні (Р<0,001).

Преципітуючі антитіла до ВГІ в РДП виявляли у курчат 1 групи на 40 день вирощування в розведенні 1:4, у курчат 2 групи – на 60 день в титрі 1:2, при цьому смуги преципітації з'являлись тільки у 10% досліджуваних зразків

сироватки крові птиці.

Таким чином, порівнюючи РНГА і РДП, як методи виявлення поствакцинальних антитіл, можна заключити, що РНГА є більш інформативним і чутливішим ніж РДП в 2 і більше разів (коли в РНГА специфічні антитіла до ВГІ виявляли в титрах 1:4 – 1:16, то в РДП – в титрах 1:2 – 1:4). Відсоток позитивних зразків сироватки крові курчат 20-60-денного віку в РНГА від числа досліджених, складав 77,1 (ефективність вакцинації за даними загибелі курей від ХМ була 76-78%), в той час як преципітини були знайдені тільки у 6% зразків сироватки крові курчат того ж віку (табл. 4).

Таблиця 4

Порівняльна оцінка ефективності серологічних методів по виявленню поствакцинальних антитіл до ВХМ

Метод Позитивних проб Негативних проб Відсоток виявлення специфічних антитіл

РНГА 64 19 77,1

РДП 3 46 6,1

Отже, нами був визначений позитивний взаємозв'язок між рівнем специфічних антитіл, що виявляються в РНГА, імунізованих курчат і ступенем захисту від ХМ.

Як свідчить Васильєва В.А. та інш. (1996), РНГА виявляє більш ніж у 90% випадків віруснейтралізуючі антитіла. З цього можна передбачити, що в поствакцинальному імунітеті провідну роль відіграють віруснейтралізуючі антитіла. Тому є обґрунтованим застосування реакції непрямої гемаглютинації для оцінки поствакцинального імунітету проти ВХМ, як вірогідного і чутливого експрес-методу серологічної діагностики.

У зв'язку з тим, що максимальні рівні поствакцинальних антитіл виявляли у курчат 40-60-денного віку, оцінку ефективності імунізації проти ХМ слід проводити із застосуванням РНГА у курчат віком 5-7 тижнів.

Серологічний моніторинг для визначення епізоотичного стану птахівничих господарств з ХМ у східному і південному регіонах України

Для аналізу епізоотичної ситуації з ХМ з 1994 до 1999 року був проведений імунологічний моніторинг різновікової птиці з використанням РНГА із еритроцитарним антигеном ІЕКВМ у семи птахівничих підприємствах східного і південного регіонів України (табл. 5).

Таблиця 5

Дані серологічного моніторингу і загибелі птиці від ХМ курей в птахівничих господарствах східного і південного регіонів України

Господарства Дослід-жувані показ-ники Вік птиці (днів) n=10

40-50 60 90 120 140-150 180 210-240

Люботинський КСП 1* 2** 3*** 0 10 1,7 + 0,30 0 0 1,5 + 0,28 0 0 1,3 + 0,18 36,4 10 2,1 + 0,25 52,1 60 5,5 + 030 60,5 30 5,7 + 0,24 42,1 30 6,3 + 0,23

Введенський ППР 1 2 3 0 20 2,2 + 0,09 - - - - - - - - - - - - 49,3 70 4,7 + 0,31 - - - “

Правекс-Пром” 1 2 3 0 - - - - - - - - - - - - - - 91,4 50 5,6 + 0,48 - - -

Перевальський ППР 1 2 3 0 20 2,1 + 0,10 - - - - - - - - - 29,3 70 5,3 + 0,48 - - - - - -

Старовірівська п/ф 1 2 3 0 60 2,5 + 0,12 - - - - - - - - - 14,4 50 4,2 + 0,35 - - - 17,5 40 4,8 + 0,45

Орловська п/ф 1 2 3 - 50 3,0 - - - - - - - - - - - - - - - - 30 3,7 + 0,47 “

Придніпр. ППС” (вакцина зі штаму РВ-1) 1 група 1 2 3 0 70 2,7 + 0,11 - - - - - - - - - 14,3 40 3,3 + 0,18 - - - 26,3 - - “

Придніпр. ППС” (вакцина зі штаму РВ-1) 2 група 1 2 3 - 0 1,2 + 0,17 - - - - - - - - - 41,0 50 4,4 + 0,42 - - - 43,9 - - “

Придніпр. ППС” (вакцина зі штаму РВ-1) 3 група 1 2 3 0 80 3,6 + 0,19 - - - - - - - - - 5,3 60 3,3 + 0,15 - - - 12,2 - - “

Придніпр. ППС” (вакцина зі штаму РВ-1) 4 група 1 2 3 0 0 0,3 - - - - - - - - - 66,7 50 4,6 + 0,42 - - - 39,6 - -

Примітки: 1* - пало від ХМ, % від загального падежу

2** - кількість проб сироваток крові (в %) з титром 3log2 та вище

3*** - середньогеометричний титр антитіл, log2 Хg + m.

До 40-50-денного віку середньогеометричні титри антитіл до ВХМ складали 1,7-2,7 log2. У птиці 140-240-денного віку виявляли значне зростання специфічних антитіл (3,3-6,3 log2) і спостерігали збільшення кількості загибелі курей від ХМ (14-91% від загального відходу) з характерними патологоанатомічними ознаками (збільшення печінки і селезінки в 2-4 рази,

потовщення стінок залозного шлунку і сідничного нерву, пухлинні утворення в яєчнику, легенях, селезінці).

Груповий імунітет у курчат 5-7-тижневого віку складав у різних господарствах від 10 до 80%. Причиною низького захисного рівня імунітету до ВХМ у курчат досліджених господарств слід вважати декілька чинників – це імунодепресивна дія вірусу хвороби Гамборо в результаті застосування вакцини (проти ХГ) із, так званих, “гарячих штамів”, порушення технології вирощування (посадка в одне приміщення різновікового молодняку різного генетичного і господарського походження (“Люботинський КСП, Введенський ППР”, “Правекс-Пром”), порушення умов зберігання нативної вакцини (Старовірівське підприємство), наявність материнських антитіл гомологічних до вакцинного вірусу (“Придніпровський ППС, Орловська птахофабрика, Перевальський ППР, Люботинський КСП), застосування не обґрунтованої в конкретних умовах схеми вакцинації проти ХМ (Перевальський ППР).

На основі серологічних досліджень РНГА було відмічене різке зростання титрів специфічних антитіл в зазначених підприємствах, починаючи із 120-140-денного віку птиці в 2-5 разів, порівняно з 40-50-денним віком, що зв'язано, на наш погляд, з персистенцією в стаді епізоотичного вірусу ХМ. На підтвердження цього у більшості господарств виявили значну різноманітність величин титрів антитіл (“строкатість”) в одній і тій же обстежуваній групі птиці (від 0 до 1:128). Піддавши ці дані математичній обробці з використанням критерію Х2, встановили, що рівень “строкатості” титрів антитіл у курей старшого віку (140-180-210 дн.) був на вірогідному рівні вище (Р<0,001) ніж у 40-50-денного молодняку. Цей факт підтверджує наявність у стаді польового вірусу ХМ.

В результаті порівняння частот розподілу величин титрів антитіл до ВХМ у курей однієї і тієї ж групи у віці 120-180 днів з такими ж показниками в 40-60 днів, зафіксували найвищі значення критерію Х2 у птахів Люботинського КСП і АО “Правекс-Пром”, що вірогідно на рівні Р<0,001.

На високому і середньовірогідному рівнях (Р<0,01-0,05) показники “строкатості” були на підприємствах Введенське, Старовірівське і Придніпровське, що дає право констатувати персистенцію епізоотичного вірусу ХМ у цих господарствах.

Результати порівняльного вивчення імуногенних властивостей різних

вакцин проти ХМ на Придніпровському птахівничому підприємстві показані в таблиці 6. Збереженість птиці за період експерименту (240 днів) складала 89,2 і 92,7% в контрольній і 2 групі (вакцина FC126) відповідно, що на 3,4-7,7% нижче ніж в 1 і 3 групах (вакцини із штамів CVI 988 і РВ-1).

В результаті спостережень виявили, що найефективнішою (87,1%) в цьому випадку була вакцина Rismavac Nobilis із штаму CVI 988 вірусу герпеса курей, найнижчу ефективність показала вакцина із штаму FC 126 вірусу герпеса індиків (34,4%).

Таблиця 6

Порівняльне вивчення ефективності різних вакцин проти ХМ на ППС “Придніпровський”

Вакцини Збереженість птиці у 240 денному віці, % Ефективність імунізації, % Середньогеометричні титри антитіл в РНГА (log2 Xg)

CVI 988 96,9 87,1 3,6

FC 126 92,7 34,4 1,2

PB – 1 96,1 76,1 2,8

Контроль 89,2 - 0,3

Отже, застосування для серологічної діагностики ХМ курей експрес-методу РНГА з еритроцитарним антигеном дозволило виявити персистенцію польового вірусу в усіх досліджених нами птахівничих підприємствах.

Використання в цих господарствах вакцин проти ХМ голландського виробництва із штамів РВ-1 ВГІ, CVI 988 ВГК, німецької із штаму ВГІ, російської полівалентної, української із штаму FC 126 ВГІ в силу різних причин (наявність материнських антитіл, зниження імунітету під впливом вірусу хвороби Гамборо, відсутність серологічного контролю імунного статусу курчат та інш.) виявилось в більшості випадків малоефективним, в наслідок чого спостерігали високий відсоток загибелі птиці від хвороби Марека.

Порівняльна оцінка способів введення вакцини проти хвороби Марека

За даними сероконтролю утримання материнських антитіл в жовтках яєць було на рівні 4,6 log2.

Імунізація ембріонів проти ХМ не вплинула негативно на виводимість курчат (83% - дослід, 82 % - контроль). Після вилуплення спостерігали за курчатами до 60-денного віку. Як свідчать дані таблиці 7, в результаті проведеного експерименту на основі серологічних досліджень встановили, що динаміка зростання титрів антитіл у курчат, вакцинованих в ембріональному періоді вище, ніж у молодняка, щепленого в добовому віці (3,0 log2 проти 1,6 log2, P<0.05).

Таблиця 7

Серологічні дослідження сироваток крові курчат, імунізованих проти ХМ різними способами

Групи Дані РНГА, у віці (днів)

48 60

log2 Хg + m кількість проб (в %) з титром 3log2 та вище (n=10) log2 Хg + m кількість проб (в %) з титром 3log2 та вище (n=10)

1 (in ovo + Фіант-2) 1,7 + 0,11 10 3,0 + 0,56 70

2 (in ovo) 1,1 + 0,22 0 2,2 + 0,20 50

3 (контроль) 0,2 0 0 0

4 (внутрішньо-м'язово) 0,4 0 1,6 + 0,18 20

5 (підшкірно) 0,3 0 1,5 + 0,11 0

6 (інтраназально) 0,3 0 1,4 + 0,25 10

Крім цього, відмічений позитивний вплив на формування імунітету у курчат препарату ФІАНТ-2 (груповий імунітет підвищився на 20 %). Разом з тим, не виявили суттєвої різниці титрів антитіл груп курчат, в яких застосовували різні способи введення вакцини в добовому віці (внутрішньом'язовий, підшкірний і інтраназальний, P<0.05).

Вплив реімунізації на ефективність вакцинації курчат проти хвороби Марека

З метою визначення кратності, строків, дози і способів вакцинації проти ХМ були проведені досліди в лабораторних і виробничих умовах.

Для постановки цих досліджень використовували повідомлення Stinlue P., Coman S. et al (1989) і дані Лукіної В.А. та співавторів (1996).

В лабораторних дослідах ревакцинували курчат у віці 28, 35 і 55 днів в дозах по 1000 і 2000 ФУО підшкірно і внутрішньом'язово. Спостереження за курчатами тривали до 90-денного віку.

В результаті ревакцинації 28 і 35-денних курчат, незалежно від дози і способу введення вакцини, титри антитіл до ВГІ були низькими (0,2-0,7 log2), тоді як у не ревакцинованих курчат рівень групового імунітету складав 10-20%.

Ревакцинація 55-денних курчат внутрішньом'язовим способом, незалежно від дози, показала на 21 день після другого щеплення підвищення рівню групового імунітету до 80-100% (при 3log2), що на 70-90% вище, ніж в контрольній групі. В контрольній групі курчат, яких імунізували один раз в добовому віці, титри антитіл до ВГІ були нижче на 1,2-1,8 log2 (P<0,05). Якість проведеної ревакцинації проти ХМ 55-денного молодняку курей

підтверджували також шляхом вираховування індексу сероконверсії, який складав 1,6-2,1.

Титри антитіл до ВГІ після ревакцинації 55-денних курчат були вище на 0,4-1,0 log2 (P<0.05) в результаті внутрішньом'язової ін'єкції, ніж підшкірної.

Лабораторні досліди не виявили різниці в динаміці зростання специфічних антитіл в результаті застосування різних доз вакцини.

Таким чином, серологічні дослідження довели, що найрезультативнішою є внутрішньом'язова ревакцинація в 55-денному віці курчат.

Результати випробування (табл. 8) показали, що у ревакцинованої птиці в порівнянні з контролем (щепленої тільки один раз в добовому віці), середньогеометричний титр специфічних антитіл був вищий на 1-1,8 log2, що вірогідно при Р<0,01, а рівень групового імунітету сягав за 80%.

Таблиця 8

Виробничі випробування ревакцинації курчат проти ХМ на КСП “Люботинський”

Групи Вік, дні 1 2 3 4

Крос курей Бєларусь - 9 Тетра - SL Бєларусь - 9 Тетра – SL

Вакцинація 1 + + + +

Спосіб введення вакцини 1 Внутрішньо-м'язово Внутрішньо-м'язово Внутрішньо-м'язово Внутрішньо-м'язово

Ревакцинація 50-55 + + - -

Спосіб введення вакцини 50-55 Внутрішньо-м'язово Внутрішньо-м'язово - -

Поголів'я 50 31070 24320 21480 15390

ХМ (в %)від загального падежу 100-240 6 4,2 41 25,2

Збереженість, % 50-240 91,6 92,5 87,4 90,2

Середньогеометричний титр специфічних ___антитіл, log2 Xg___ Кількість проб (в %) із титром 3log2 та вище (n=10) 45-50 2,1 + 0,31 40 1,1 + 0,25 0 2,0 + 0,21 30 1,9 + 0,16 30

80-85 2,8 + 0,43 70 3,4 + 0,28 80 1,8 + 0,14 10 1,8 + 0,39 10

За весь період спостережень у ревакцинованого поголів'я зустрічались спорадичні випадки падежу птиці з ознаками ХМ. Отже, ревакцинація в 50-55-денному віці курчат дала змогу зменшити загибель птахів від хвороби Марека у 5-7 разів і збільшити загальну збереженість в середньому на 2,3-4,5%.

На Придніпровському ППС (табл. 9) в результаті ревакцинації рівень групового імунітету досягав 90%. Загибель курей від ХМ у 8-місячному віці знизилась в 8,8 разів в порівнянні із неревакцинованою групою. При цьому збереженість загального поголів'я збільшилась на 2,8%.

Таблиця 9

Виробничі випробування ревакцинації курчат проти ХМ на ППС “Придніпровський”

Групи Вік, дні 1 2

Крос курей Бєларусь – 9 Бєларусь – 9

Вакцинація 1 + +

Спосіб введення вакцини 1 Внутрішньом'язово Внутрішньом'язово

Ревакцинація 50 + -

Спосіб введення вакцини 50 Внутрішньо-м'язово -

ХМ (в %) від загального падежу 120-240 3,9 34,4

Збереженість, % 50-240 92,2 89,4

Середньогеометричний титр специфічних антитіл, log2 X + m Кількість проб (в %) із титром 3log2 та вище 45 1,4 + 0,22 10 1,6 + 0,11 20

80 3,7 + 0,15 90 1,2 + 0,14 0

Економічна ефективність виробничого випробування ревакцинації 55-денних курчат проти ХМ на Люботинському КСП і Придніпровському ППС становила 8289 і 2142 гривень відповідно, що на кожну тисячу голів вирощених несучок у середньому становило 143 гривні.

Найвищий груповий імунітет проти вірусу хвороби Марека серед дослідних груп виявили у курчат в результаті перехресної вакцинації, який складав 70% проти 20-50% (в контролі) групового імунітету, імунізованих гомологічними вакцинними штамами батьків і їх нащадків.

Таким чином, вакцинація батьків і нащадків гетерологічними штамами значно знижує негативний вплив материнських антитіл на ефективність імунопрофілактики ХМ.

Отже, перехресна або “альтернативна” схема вакцинації проти ХМ, яку пропонує нідерландська фірма “Intervet”, підвищує ефективність імунізації і придатна для застосування в птахівничих підприємствах України.

Висновки

1. Простежена епізоотична ситуація в птахівничих господарствах східного і південного регіонів України з хвороби Марека курей, встановлено, що вона залишається складною. На основі проведених досліджень удосконалюється проблема захисту курей від хвороби Марека шляхом постійного серологічного контролю в реакції непрямої гемаглютинації і застосуванням ревакцинації молодняка при відповідних показаннях.

2. В результаті проведеного серологічного моніторингу з використанням реакції непрямої гемаглютинації було встановлено, що в більшості обстежених господарств з рівнем поствакцинального групового імунітету у курчат 35-50 денного віку 60% і менше, спостерігали ознаки прояви хвороби Марека у 14,3-91,4% загиблої птиці у віці 110-240 днів. В господарстві, де у курчат груповий імунітет був 70%, реєстрували до 5,3% загибелі курей від цього захворювання.

3. Вірогідно значуща різноманітність (за розрахунком критерію c2, Р>0,95-0,999) величин титрів специфічних антитіл (виявлених в РНГА) в сироватці крові курей однієї групи по відношенню до таких в поствакцинальний період, може слугувати основою для постановки діагнозу про циркуляцію в стаді польового вірусу хвороби Марека.

4. При серологічній оцінці поствакцинального імунітету до вірусу хвороби Марека реакція непрямої гемаглютинації є інформативним, високо специфічним методом і перевищує за чутливістю реакцію дифузної преципітації в 2 і більше разів.

5. Встановлений позитивний взаємозв'язок між рівнем антитіл до вірусу хвороби Марека в сироватці крові курей і ефективністю відповідної вакцинації можливо вивчати за допомогою реакції непрямої гемаглютинації.

6. Ревакцинація проти хвороби Марека 50-55 денних курчат підвищує рівень групового імунітету (до 90-100%) та збереженість курей в 240 денному віці на 2,3-4,5%. Ревакцинацію доцільно проводити, якщо рівні захисних антитіл, які визначені в реакції непрямої гемаглютинації, у 35-50-денного молодняка курей менше, ніж 70%.

7. Після внутрішньом'язової ревакцинації 55 денних курчат, титри специфічних антитіл вищі на 0,4-1,0 log2 (P<0,05), ніж після підшкірної.

8. Спосіб введення вакцини проти хвороби Марека (внутрішньом'язовий, підшкірний, інтраназальний) добовим курчатам не впливає на динаміку утворення специфічних антитіл. Інокуляція вакцини на стадії ембріогенезу (18-та доба інкубації) ефективніша, ніж імунізація в постембріональний період ( 2,2-3,0 log2 проти 1,4-1,6 log2, при P<0,01).

9. Застосування імуномодулятора Фіант-2 курчатам, які щеплені проти хвороби Марека на стадії ембріогенезу, підвищує рівень захисних титрів антитіл на 0,8 log2.

10. Схема перехресної вакцинації проти хвороби Марека курей (імунізація батьків і їх нащадків вакцинами із гетерологічних штамів – вірусу герпеса курей і вірусу герпеса індиків), дозволяє збільшити рівень групового імунітету курчат до 70%.

Список опублікованих робіт за темою дисертації

1. Куцак Р.С. Порівняльна оцінка ефективності щеплення проти хвороби Марека курей на стадії ембріогенезу та у постнатальний період // Ветеринарна медицина : міжвідом. темат. наук. зб., Харків, 1997. - № 73. – С. 45-47.

2. Куцак Р.С. Повторна імунізація курчат проти хвороби Марека // Таврійський науковий вісник : зб. наук. статей, Херсон : Айлант, 1999. - № 10. – С. 71-73.

3. Куцак Р.С. Оцінка поствакцинального імунітету курей, імунізованих проти хвороби Марека // Ветеринарна медицина : міжвідом. темат. наук. зб., Харків, 2000. - № 77. – С. 216-219.

4. Куцак Р.С. Оценка эффективности вакцинопрофилактики цыплят против болезни Марека по данным сероконтроля // Мат. міжнар. наук. – практ. конф.: “Розвиток ветеринарної науки в Україні : здобутки та проблеми”. – Харків, 1997. – С. 14-15.

Куцак Р.С. Удосконалення регламенту вакцинопрофілактики хвороби Марека курей. - Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата ветеринарних наук за спеціальністю 16.00.03. – ветеринарна мікробіологія та вірусологія. Інститут експериментальної і клінічної ветеринарної медицини, Харків, 2001.

В дисертації викладені матеріали з теоретичних і практичних питань боротьби з хворобою Марека курей шляхом удосконалення регламенту вакцинопрофілактики, опрацювання експрес-методу серологічної діагностики.

Запропонована ревакцинація 50-55 денних курчат проти хвороби Марека курей внутрішньом'язовим способом, що дає можливість підвищити збереженість поголів'я птиці на 2,3-4,5%. Доцільність ревакцинації визначається за допомогою серологічного контролю імунного статусу курчат в РНГА з еритроцитарним антигеном ІЕКВМ для діагностики хвороби Марека. Застосування РНГА для серологічної діагностики та оцінки напруженості імунітету до вірусу хвороби Марека виявило, що цей експрес метод є інформативним, специфічним і перевершує за чутливістю РДП в 2 і більше разів.

Ключові слова : вірус хвороби Марека, вакцинопрофілактика, серологічна діагностика, реакція непрямої гемаглютинації, ревакцинація, імунітет, антитіла, кури.

Куцак Р.С. Совершенствование регламента вакцинопрофилактики болезни Марека кур. – Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата ветеринарных наук по специальности 16.00.03. - ветеринарная микробиология