Національна академія наук України

Інститут фізіології рослин і генетики

Коць Сергій Ярославович

Удк 581.1:581.138.1:581.133.1:633.31

Фізіологічні основи високоефективного

Функціонування симбіотичних систем

люцерни в агроценозах

03.00.12 – фізіологія рослин

Автореферат дисертації на здобуття наукового ступеня

доктора біологічних наук

Київ – 2001

Дисертацією є рукопис

Робота виконана в Інституті фізіології рослин і генетики НАН України

Науковий консультант: доктор біологічних наук, професор, академік УААН

Патика Володимир Пилипович

Інститут агроекології та біотехнології УААН, директор інституту

Офіційні опоненти: доктор біологічних наук, професор

Головко Ераст Анатолійович

Національний ботанічний сад ім. М.М. Гришка

НАН України, завідувач відділу

доктор біологічних наук, професор

Антипчук Адель Федорівна

Інститут мікробіології і вірусології

ім. Д.К. Заболотного НАН України,

провідний науковий співробітник

доктор біологічних наук, професор

Терек Ольга Іштванівна

Львівський національний університет ім. Івана Франка, завідувач кафедри

Провідна установа: Київський національний університет імені Тараса Шевченка.

Захист дисертації відбудеться " 15 " листопада 2001 р. о 10 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.212.01 при Інституті фізіології рослин і генетики НАН України за адресою: 03022, Київ-22, вул. Васильківська 31/17.

З дисертацією можна ознайомитись в бібліотеці Інституту фізіології рослин і генетики НАН України, Київ, вул. Васильківська 31/17.

Автореферат розісланий " 12 " жовтня 2001 р.

Вчений секретар

cпеціалізованої вченої ради Мордерер Є.Ю.

Загальна характеристика роботи

Актуальність теми. Інтенсифікація землеробства до останнього часу пов?язувалась із застосуванням високих доз мінеральних добрив і, насамперед, азотних. Завдяки цьому досягалося значного підвищення врожайності сільськогосподарських культур. Проте збільшення виробництва мінерального азоту вимагає високих матеріальних і енергетичних витрат і є небезпечним для навколишнього середовища. Коефіцієнт використання рослинами мінерального азоту невеликий і становить не більше 40–60 % із загальної кількості внесеного в ґрунт. Решта трансформується у газоподібні сполуки, вивітрюється в атмосферу або вимивається із ґрунту і забруднює водоймища. Втрати азоту з ґрунту лише за рахунок денітрифікації становлять у середньому від 15 до 30 % внесених добрив.

Для поліпшення продуктивності сільськогосподарського виробництва України, відтворення родючості ґрунтів необхідно щорічно вносити до 2,2 млн т азоту, що становитиме близько 50–60 кг цього елемента на 1 га ріллі [Тараріко та ін., 1997].

Біологічна фіксація молекулярного азоту є однією з найскладніших фундаментальних проблем біології і надзвичайно актуальною для сільськогосподарської біології, тому що вона безпосередньо пов?язана з урожайністю важливих сільськогосподарських культур – бобових рослин. Процес зв?язування молекулярного азоту – це унікальне явище природи і разом з фотосинтезом обумовлює існування життя на Землі. Фіксація молекулярного азоту мікроорганізмами, найважливішими з яких є бактерії роду Rhizobium (у симбіозі з бобовими рослинами засвоюють від 40 до 500 кг/га атмосферного азоту), забезпечує живлення рослин зв?язаним азотом і підтримання його запасів у ґрунті [Вавилов, Посипанов, 1983; Патика та ін., 1993; Азаров, 1995; Кожемяков, 1997]. Серед бобових культур провідна роль у засвоєнні атмосферного азоту і скороченні дефіциту рослинного білка належить люцерні. За сприятливих умов симбіотичні системи люцерна–Rhizobium meliloti протягом вегетації засвоюють 250–350 кг/га і більше атмосферного азоту. При цьому надбавка урожаю зеленої маси та насіння досягає 25–35 %, а збір білка збільшується на 30–50 % [Мішустін, Черепков, 1983; Берестецький та ін., 1987; Старченков, Коць, 1992].

Поряд з покращанням якості рослинної продукції біологічний азот сприяє підвищенню родючості ґрунтів, проявляючи при цьому пролонговану дію: протягом 3–5 років після вирощування бобових культур 10–20 % азоту їхніх пожнивних і післяукісних залишків ще використовується рослинами. Біологічна азотфіксація посівами бобових – своєрідний приклад беззалишкової технології: коефіцієнт використання біологічно зв?язаного азоту в бобово-ризобіальних системах наближається до 100 % [Мішустін, Черепков, 1983; Орлов, 1985; Старченков, Коць, 1992].

Не зважаючи на значну кількість досліджень, присвячених вивченню різних аспектів біологічної азотфіксації бобовими (в основному горохом, люпином, соєю), наявна інформація з цього питання розрізнена і висвітлює лише окремі аспекти даної проблеми. Що стосується люцерни, то треба зазначити, що недостатньо дослідженими є умови створення високоефективних симбіотичних систем люцерна–Rhizobium, утворених різними сортами даної культури і штамами бульбочкових бактерій. Практично не вивчені фізіологічні і біохімічні особливості формування і функціонування різних за ефективністю симбіотичних систем люцерни. На сьогодні залишаються нез?ясованими і екологічні аспекти використання симбіотичних систем в агроценозах. Тому розкриття механізму відновлення молекулярного азоту, принципів дії і можливостей регулювання ферментативних систем, пов?язаних з цим процесом, є необхідним при вирішенні питань, спрямованих на покращання умов і підвищення ефективності біологічної фіксації молекулярного азоту.

Лімітуючим фактором розширення посівних площ під люцерну є недостача насіння. Тому дуже важливою проблемою при вирощуванні люцерни є отримання його високих врожаїв. У літературі досить широко описані дослідження вегетативної продуктивності цієї культури. Проте її насіннєву продуктивність досліджували лише за окремими критеріями, не враховуючи потужного азотфіксувального потенціалу культури. Вважаємо, що важливими етапами у дослідженні цього показника є розробка заходів, спрямованих на створення симбіотичних систем з підвищеною азотфіксувальною здатністю.

Мета і задачі досліджень. Метою досліджень було з?ясувати фізіологічні особливості та екологічні аспекти формування і високоефективного функціонування в агроценозах симбіотичних систем Medicago–Rhizobium meliloti, а також розробити наукові основи підсилення активності процесу симбіотичної фіксації атмосферного азоту і інтенсивності фотосинтезу за рахунок інтродукованих штамів бульбочкових бактерій та їх природних рас. Для досягнення поставленої мети необхідно було вивчити:

-

-

-

-

-

-

-

-

-

Наукова новизна одержаних результатів.

? Науково обґрунтовано роль симбіотичної азотфіксації в підвищенні продуктивності багаторічних трав за рахунок біологічного азоту.

? Вперше показано, що застосування нових штамів Rhizobium meliloti, отриманих генно-інженерними методами, відчутно сприяє перебігу найважливіших фізіологічних процесів – азотфіксації, фотосинтезу і дихання, а також істотному підвищенню (на 20–25 %) продуктивності люцерни і збільшенню в урожаї вмісту білка, вільних та зв’язаних амінокислот.

? Науково обґрунтована і експериментально доведена позитивна роль застосування нових штамів бульбочкових бактерій у формуванні ґенеративних органів люцерни, яка полягає в інтенсифікації утворення в них лімітуючих синтез білка амінокислот – метіоніну, лізину, гістидину, тирозину та ін.

? Показано, що в умовах дефіциту зв’язаного азоту в ґрунті інтенсивність симбіотичної азотфіксації люцерни визначає рівень фотосинтезу у рослин.

? Розширено уявлення про значення мінерального азоту в функціонуванні симбіотичних систем багаторічних бобових трав. Вперше встановлено особливості впливу різних форм мінеральних азотних добрив на формування симбіотичних систем, елементів продуктивності рослин люцерни та рівень їх урожайності.

? Вперше виявлено неадекватну реакцію симбіотичних систем люцерна–Rhizobium meliloti, створених з використанням штамів із різною стійкістю до вмісту мінерального азоту, на концентрацію цього елементу в живильному середовищі. Встановлено, що фізіологічною особливістю систем, утворених за участю стійких до мінерального азоту штамів, є висока нітратредуктазна активність рослини-хазяїна.

? Встановлено, що регулятори росту цитокінінової природи інтенсифікують процеси газообміну СО2, стимулюють азотфіксувальну функцію рослин люцерни, сприяють формуванню ґенеративних органів, утворенню плодів, а також підсилюють адаптивні властивості до посухи.

? Вивчено вплив нових регуляторів росту рослин триману-1 і ПТМБ на азотфіксувальну активність симбіотичних систем люцерни. Визначено способи ефективного застосування цих речовин на посівах багаторічних бобових трав.

? Розроблено критерії оцінки і відбору високоефективних штамів Rhizobium meliloti на різних етапах формування симбіозу з люцерною.

Практичне значення одержаних результатів. Результати досліджень основних закономірностей формування високоефективних симбіотичних систем люцерна–бульбочкові бактерії дозволили рекомендувати ефективні заходи активізації процесів симбіотичної азотфіксації, інтенсивності фотосинтезу, збільшення надходження біологічного азоту в рослини та підвищення їх продуктивності, зокрема і насіннєвої, за рахунок максимального використання симбіотрофного азоту. Численний експериментальний матеріал з оптимізації мінерального азотного живлення люцерни з урахуванням азотфіксувальної активності як тесту екологічної і економічної доцільності застосування добрив є основою принципово нових науково обґрунтованих рекомендацій для створення високоврожайних травостоїв, які характеризуються екологічною чистотою продукції при невеликих енергетичних витратах рослини-хазяїна.

Вивчення симбіотичних взаємовідносин різних сортів люцерни з новими штамами бульбочкових бактерій дозволило підібрати високоефективні комплементарні пари цих симбіонтів, які рекомендовані для використання у сільськогосподарському виробництві.

Нові високоефективні штами Rhizobium meliloti, які характеризуються високими симбіотичними властивостями, захищені авторськими свідоцтвами на винаходи і патентами України (А.с. № 1760743, 1992 р.; патент № 13298, 1997 р.; заявка на винахід № 2000042255/Э–2222, 2000 р.) та використовуються для виробництва бактеріальних добрив під люцерну.

Особистий внесок здобувача. Робота виконана автором особисто, а також у співавторстві із співробітниками відділу симбіотичної азотфіксації Інституту фізіології рослин і генетики НАН України, завідувачем якого є дисертант.

Дослідження впливу повільнодіючих азотних добрив на азотфіксувальну активність і продуктивність люцерни проведені спільно з к.х.н. І.Г. Пономарьовою; впливу вуглеамонійних солей і комплексних азотних добрив, виготовлених на їх основі, на симбіотичні системи люцерна–бульбочкові бактерії – із співробітниками Науково-інженерного центру "АКСО" Інституту біоорганічної хімії та нафтохімії НАН України.

Здобувач особисто розробив робочі гіпотези, спланував та провів експериментальні дослідження, здійснив аналіз, інтерпретацію і узагальнення одержаних результатів. У проведенні досліджень і їх узагальненні частка автора складає 80 %.

Зв?язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертаційна робота виконувалась у відповідності з міжнародною програмою "Інтербіоазот–2000"; в рамках бюджетних тем відділу симбіотичної азотфіксації ІФРГ НАН України: "Вивчити умови створення високоефективних бобово-ризобіальних систем і розробити прийоми підвищення продуктивності фітосимбіонта за рахунок симбіотрофного азоту" (01.86.0.006642), "Вивчити механізми фізіолого-генетичих процесів фіксації азоту з метою формування високопродуктивних азотфіксуючих систем бобових рослин" (01.9.10.019962), "Дослідження процесів взаємодії бульбочкових бактерій з бобовими рослинами з метою максимальної реалізації азотфіксуючого потенціалу симбіонтів" (0199U000193), науково-технічної програми "Використання вуглеамонійних солей в сільському господарстві", затвердженої постановою Кабінету Міністрів України №1549 від 28 вересня 1998 року, та проекту Фонду фундаментальних досліджень України "Вивчити фізіолого-генетичні механізми формування високопродуктивних азотфіксуючих систем бобових рослин" (5.3/268).

Апробація результатів дисертації. Основні наукові результати були представлені на V симпозіумі з біологічної фіксації азоту "Азотфіксація" (Познань, Польща, 1990), Республіканській конференції "Біологічна фіксація молекулярного азоту і азотний метаболізм бобових рослин" (Тернопіль, 1991), ІV Науковій конференції "Мікроорганізми в сільському господарстві" (Пущино, 1992), V Конференції молодих вчених "Актуальні проблеми фізіології рослин і генетики" (Київ, 1992), VІІІ Східноєвропейському симпозіумі з біологічної фіксації азоту "Азотфіксація–92" (Саратов, 1992), ІІ з?їзді Українського товариства фізіологів рослин (Київ, 1993), І установчому з?їзді Українського мікробіологічного товариства (Одеса, 1993), VІІІ Міжнародному симпозіумі С.І.Е.С. "Добрива і довкілля" (Саламанка, Іспанія, 1994), ІХ Бахівському колоквіумі з азотфіксації (Москва, 1995), Х Міжнародному конгресі з фіксації азоту (С.-Петербург, 1995), Міжнародній конференції "Якість сільськогосподарського продовольства–95" (Норвіч, Англія, 1995), ІІ Європейській конференції із зернобобових (Копенгаген, Данія, 1995), Міжнародній нараді "Актуальні питання фізіології рослин в аспекті екологічних проблем України" (Чернівці, 1995), Міжнародній конференції молодих вчених та спеціалістів "Наслідки наукових пошуків молодих вчених-аграрників в умовах реформування АПК" (Чабани, 1996), VІ конференції молодих вчених "Актуальні проблеми фізіології рослин і генетики" (Київ, 1996), Х FESPP Конгресі (Флоренція, Італія, 1996), Республіканській конференції "Енерго- і ресурсозберігаючі екологічно безпечні агрохімікати та їх вплив на процес біологічної фіксації молекулярного азоту" (Київ, 1997), ІІІ Європейській конфе-ренції з фіксації азоту (Нідерланди, 1998), ХІ Міжнародній науковій конференції "Вивчення онтогенезу рослин природних та культурних флор у ботанічних закладах та дендропарках Євразії" (Біла Церква, 1999), Міжнародній науковій конференції "Регуляція росту, розвитку і продуктивності рослин" (Мінськ, 1999), ІІ з?їзді Українського мікробіологічного товариства (Чернігів, 2000).

За цикл наукових праць "Фізіологічні особливості взаємодії симбіотрофного і автотрофного азотного живлення люцерни" дисертанту в 1994 році присуджено Медаль Академії наук України з премією для молодих вчених. За цикл робіт "Фізіолого-біохімічні особливості симбіотичних взаємовідносин бобових рослин і нових штамів бульбочкових бактерій" дисертанту в 1998 році присуджено премію ім. М.Г. Холодного НАН України.

Публікації. Наукові результати з теми дисертації опубліковано в 46 друкованих роботах, з яких 25 статей, опубліковано у провідних наукових виданнях, у тому числі 7 – без співавторів. Одержано 1 авторське свідоцтво, 1 патент України та 2 пріоритетні довідки на винаходи.

Об'єм та структура роботи. Дисертація, викладена на 323 сторінках машинописного тексту, складається із вступу, 8 розділів, висновків, списку використаної літератури та додатків, що містять копії актів виробничих випробувань нового штаму та регулятора росту триману-1. Робота містить 89 таблиць і 14 рисунків. Бібліографічний список складає 481 літературне джерело.

Матеріали та методи

Об'єкти та методи досліджень. Об?єктами досліджень були люцерна посівна (Medicago sativa L.) сорту Ярославна і люцерна мінлива (Medicago varia Mart.) сортів Зайкевича та Полтавчанка.

Для бактеризації насіння використовували ряд штамів бульбочкових бактерій Rhizobium meliloti: виробничі штами 425а (стандарт) і 441, та нові штами М3, М4, М6, М7, М12, М48, М82, М4-7, М6-2, отримані генетико-селекційними методами у відділі симбіотичної азотфіксації Інституту фізіології рослин і генетики НАН України під керівництвом д.б.н. М.М. Нічик. При створенні штамів М3, М4, М6, М7, М12, М48, М82 використовували міжродову кон?югацію E. coli JC 5466 (pRD1) і Rhizobium meliloti з наступною селекцією за ознакою “азотфіксувальна активність”. У ряді дослідів рослини інокулювали також штамами 435а, 404б, 412б, переданими нам із колекції Всеросійського науково-дослідного інституту сільськогосподарської мікробіології (Санкт-Петербург). Ці штами отримані методами аналітичної селекції.

Вегетаційні досліди проводили на майданчику Інституту фізіології рослин і генетики НАН України. Рослини люцерни вирощували в 11- та 16-кілограмових посудинах Вагнера в піщаній та ґрунтовій культурах на поживному середовищі Гельрігеля без азоту і з 0,2, 0,25, 0,5, 1,0 та 1,5 нормами азоту [Ca(NO3)2]. Одна норма азоту становить 708 мг Ca(NO3)2·4H2O на 1 кг субстрату. Перед посівом насіння протягом 20 хв стерилізували 70%-м етиловим спиртом і інокулювали згідно схем дослідів різними штамами Rhizobium meliloti. У посудинах вирощували по 6–8 рослин при 60%-ній вологості і природному освітленні. Повторність дослідів 8–15-кратна. У вегетаційних дослідах здебільшого використовували добірний річковий пісок, промитий водопровідною водою, або світло - сірий опідзолений, легкосуглинковий ґрунт.

Крім кальцієвої селітри [Ca(NO3)2] вивчали дію вуглеамонійних солей (ВАС – суміш карбонату і бікарбонату амонію), аміачної селітри [NH4NO3] та повільнодіючих азотних добрив – сульфату амонію [(NH4)2SO4], і нітроамофосу (НАФ), капсульованих водною емульсією поліуретансемикарбазиду та оксамідкарбамідного гранульованого добрива, на ріст та розвиток рослин, азотфіксувальну активність і продуктивність люцерни.

При дослідженні впливу різних стимуляторів росту на формування симбіотичного апарату та насіннєву продуктивність люцерни двічі протягом вегетації в фазах початку бутонізації і початку цвітіння рослини люцерни обприскували 6–бензиламінопурином (БАП, 0,03 г/л води), кінетином (0,03 г/л), гібереловою кислотою (А3, 0,035 г/л), в-індолілоцтовою кислотою (ІОК, 0,02 г/л), б-нафтилоцтовою кислотою (НОК, 0,02 г/л), або у фазі бутонізації препаратом продуктів термофільного метанового бродіння (ПТМБ) відходів спиртодріжджевого виробництва (1 г/л) та триману-1 (0,01 або 0,03 г/л) з розрахунку 15 мл розчину на посудину.

При дослідженні впливу регуляторів росту на інтенсивність газообміну СО2 і азотфіксувальну активність двічі протягом вегетації у фазах стеблування і бутонізації в 1995 р. та бутонізації і початку цвітіння в 1996 р. рослини обприскували стимуляторами росту БАП (0,03 г/л) і триман-1 (0,03 г/л). Відбір рослин для проведення досліджень проводили на третю добу після другої обробки БАП у фазі бутонізації та на 15 добу – у фазі масового цвітіння (1995 р.) і на 7 добу після першого обприскування регуляторами росту у фазі початку цвітіння та на 12 добу після другого застосування у фазі масового цвітіння–утворення плодів (1996 р.).

У серії дослідів ми вивчали вплив синтетичних аналогів цитокініну і ауксину на азотфіксувальну активність та продуктивність люцерни за умов різного водозабезпечення. Досліди проводили з рослинами люцерни сорту Ярославна першого року вегетації. У фазі прихованої бутонізації (1998 рік – 45-денні рослини і 1999 рік – 38-денні рослини) рослини обприскували водними розчинами БАП, 2,4-дихлорфеноксиоцтової кислоти (2,4-Д) та їх полімерних форм: полістимуліну К (ПС-К, БАП, іммобілізований на полімері) і полі-стимуліну А-6 (ПС-А-6, 2,4-Д, іммобілізована на полімері) в концентрації 10-4М за діючою речовиною. У контрольних варіантах люцерну вирощували за 60 % повної вологоємкості (ПВ) піску. Модельну посуху на рівні 40 % ПВ підтримували протягом 30 днів, після чого полив у варіантах досліду проводили на рівні 60 % ПВ.

Польові досліди проводили на опідзоленому чорноземі агродільниці Тернопільського державного педагогічного університету (ТДПУ) в зоні Західного Поділля. Вміст гумусу – 3,05 %, азоту – 11,4, фосфору – 10,4, калію – 8,1 мг/100 г ґрунту. Кислотність (рН сол.) – 6,1, гідролітична – 1,9 мг-екв. на 100 г ґрунту. Норма висіву насіння 12 кг/га, ширина міжрядь – 30 см.

У дослідному господарстві Львівського державного аграрного універси-тету (ЛДАУ) люцерну вирощували на темно-сірому опідзоленому середньосу-глинковому ґрунті, рН сол. 6,2–6,4. Вміст гумусу 2,1–2,4 %, фосфору – 11–14, калію – 11–13, легкогідролізованого азоту – 6–9 мг/100 г ґрунту. Люцерну висівали із розрахунку 15 кг/га по фону Р60К60, ширина міжрядь 30 см.

Польові досліди закладали також у дослідному господарстві Інституту землеробства (ІЗ) УААН (смт. Чабани) у зоні Північного Лісостепу. Ґрунти дослідних ділянок світло-сірі лісові легкосуглинкові, рН сол. 5,7 , вміст гумусу – 1,8 %, фосфору – 9–10, калію – 8–9, легкогідролізованого азоту – 8–10 мг/100 г ґрунту. Люцерну висівали із розрахунку 6 кг/га, ширина міжрядь 60 см.

Серію польових дослідів ми провели в науково-виробничому відділі (НВВ) ІФРГ НАН України в смт. Глеваха. Ґрунт світло-сірий, опідзолений, легкосуглинковий, рН сол. 5,5–5,8. Вміст гумусу – 1,6–1,8 %, фосфору – 9–10, калію – 7–8, легкогідролізованого азоту – 10–12 мг/100 г ґрунту. Люцерну висівали із розрахунку 6–15 кг/га, ширина міжрядь – 30–60 см.

У всіх дослідах агротехніка загальноприйнята для безпокривних посівів. Аміачну селітру вносили під передпосівну культивацію в дозах 30, 60 і 90 кг/га діючої речовини (д. р.). Фосфорні (суперфосфат, Р60) і калійні (KCl, K60) добрива вносили під оранку. Повторність дослідів – 4–5 разова, облікова площа ділянок 5–60 м2. Розміщення дослідних ділянок – рендомізоване.

Для обліку зеленої маси укіс люцерни проводили у фазі бутонізації–початку цвітіння.

У польових умовах обприскування рослин люцерни розчинами регуляторів росту ПТМБ (1 г/л) та триману-1 (0,03 г/л) проводили у фазі бутонізації, або двічі у фазах початку бутонізації та початку цвітіння регуляторами росту БАП і триману-1 (0,03 г/л) з розрахунку 350–500 л розчину на га.

Активність процесу азотфіксації визначали ацетиленовим методом [Харді, 1968; Крикунець, 1993] на газовому хроматографі “Chromatograf-504” (Польща). Кількість етилену, що утворився з ацетилену під дією нітрогенази інкубованого зразка, виражали у молярних одиницях (нмоль, мкмоль).

Активність нітратредуктази в листках, стеблах і корінні люцерни визначали in vivo [Єрмаков, 1972].

Інтенсивність видимого фотосинтезу і темнового дихання рослин люцерни вимірювали за допомогою інфрачервоного газоаналізатора марки ОА-5501, ввімкненого за диференційною схемою, при природному освітленні вранці в сонячні дні. Посудину з рослинами поміщали в камеру з оргскла (31?31Ч150 см) [Голик, 1988]. Швидкість проходження повітря через камеру з рослинами становила 8 л/хв, температура – (25±2)0С. Після закінчення вимірювань фотосинтезу рослини зрізали і визначали дихання субстрату з коренями. Темнове дихання окремих органів вимірювали в термостабілізованих камерах [Голик, 1984] при 250С через 15–30 хв після внесення проби в камеру. Частку дихання від фотосинтезу визначали як відношення дихання рослин до істинного фотосинтезу (суму видимого фотосинтезу і темнового дихання рослини).

У ряді дослідів інтенсивність фотосинтезу визначали за допомогою оптико-акустичного аналізатора ГІАМ-5М. Для дослідження застосовували камери з органічного скла об?ємом 30 л, в які вміщували по одній посудині з рослинами і продували атмосферним повітрям зі швидкістю 10 л/хв. Із повітря, що пройшло через камеру, 1 л/хв відбирали на газоаналізатор. Рослини освітлювали лампами розжарювання КГ-2000 з водяним фільтром. Густина променевого потоку на рівні субстрату була 200 Вт/м2 ФАР. Температуру в камері підтримували на рівні 25 0С.

Визначення вмісту загального азоту в рослинному матеріалі проводили методом К?єльдаля [Плешков, 1985]. При перерахунку на сирий протеїн використовували коефіцієнт 6,25.

Зв?язані амінокислоти визначали в солянокислих гідролізатах висушених листків [Рядчиков, 1978] на амінокислотному аналізаторі Biotronik LC 6001.

Вільні амінокислоти визначали в зафіксованому спиртом рослинному матеріалі [Тимошенко та ін., 1980] на аналізаторі АААТ 339.

Вміст нітратів у рослинному матеріалі (листки, стебла, коріння) визначали іонселективним методом [Дорст, 1972].

Статистична обробка експериментальних даних виконана за Доспєховим [Доспехов, 1985].

Результати досліджень та їх обговорення

Особливості формування і функціонування симбіотичного апарату та вегетативна продуктивність люцерни при різному співвідношенні біологічного і мінерального азоту

Інтенсивність фіксації молекулярного азоту симбіотичними системами люцерна–Rhizobium meliloti на фоні різного забезпечення мінеральним азотом. Результати проведених нами багаторічних вегетаційних та польових досліджень свідчать про інгібуючу дію мінерального азоту на розвиток та функціонування симбіотичних систем люцерна–Rhizobium meliloti, значне зниження процесу азотфіксації та частки біологічного азоту у загальному азоті біомаси цієї культури. Внесення мінерального азоту знижує рівень фіксації його молекулярної форми пропорційно застосованій дозі добрив. Симбіотичний апарат формується лише після використання запасів зв'язаного азоту до певного рівня в субстраті. Внесення стартової дози азоту 30 кг/га в польових умовах затримує утворення бульбочок і знижує їх нітрогеназну активність, оскільки наявна кількість мінерального азоту в орному шарі ґрунту забезпечує задовільний розвиток рослин до початку утворення і активного функціонування бульбочок.

Встановлено, що поєднання симбіотрофного і автотрофного азотного живлення люцерни залежить не лише від дози мінерального азоту, але й від здатності штамів бульбочкових бактерій, використаних для інокуляції, активно функціонувати у присутності мінерального азоту.

Штам М4, отриманий нами генно-інженерними методами, є більш стійким до мінерального азоту ґрунту. Мінеральний азот сприяє кращому утворенню бульбочок, підвищує їх азотфіксувальну активність (табл. 1).

Таблиця 1.

Азотфіксувальна активність бульбочок люцерни сорту Зайкевича (мкмоль С2Н4/(рослину·год)) при різному забезпеченні мінеральним азотом і інокуляції різними штамами Rhizobium meliloti (вегетаційний дослід)

Норма азоту за Гельрігелем | Штам | Фаза розвитку рослин та день після сходів

Стеблування,

30-й | Бутонізація,

53-й | Початок цвітіння,

60-й

0 | 425а | 1,71±0,38 | 4,16±0,21 | 9,80±0,34

М4 | 1,57±0,25 | 2,52±0,20 | 7,47±0,42

0,25 | 425а | 0,73±0,05 | 1,20±0,18 | 4,56±0,07

М4 | 0,65±0,12 | 1,98±0,17 | 9,00±0,80

0,5 | 425а | 0 | 0,07±0,01 | 0,65±0,05

М4 | 0,10±0,00 | 1,19±0,09 | 3,58±0,27

1,0 | 425а | 0 | 0 | 0,25±0,02

М4 | 0 | 0,07±0,00 | 1,84±0,18

Симбіотичні системи люцерни, утворені стійкими до мінерального азоту штамами Rhizobium meliloti, здатні в однаковій мірі паралельно використовувати і автотрофний і симбіотрофний азот при підвищеному вмісті мінерального азоту в субстраті.

Врожайність вегетативної маси люцерни залежно від різних умов живлення біологічним і мінеральним азотом. У результаті проведених досліджень з'ясовано, що штами бульбочкових бактерій Rhizobium meliloti в поєднанні з різними дозами мінерального азоту не лише по-різному діють на формування і функціонування симбіотичного апарату, але й істотно впливають на абсолютну швидкість росту і відносний ріст органів різних сортів люцерни. Штам бульбочкових бактерій М4 сприяв отриманню високого урожаю фітомаси люцерни в поєднанні з внесенням мінерального азоту в дозі 30 кг/га. При інокуляції цим штамом рослини уже в фазі стеблування мали більшу масу коріння, стебел, листків і високу частку листків у загальній масі пагона, а в період між фазами стеблування–початку цвітіння вони характеризувалися вищим абсолютним і відносним ростом маси коріння, листків і пагонів.

Встановлено, що високий урожай зеленої маси та сіна люцерни можна отримати при спонтанній інокуляції місцевими расами бульбочкових бактерій та бактеризації високоефективними штамами без внесення мінеральних азотних добрив. Люцерна другого року вегетації формує потужну кореневу систему з добрим симбіотичним апаратом і забезпечує себе азотом завдяки симбіотичній азотфіксації.

Реакція симбіотичних систем люцерна–Rhizobium meliloti на живлення різними формами мінерального азоту. Показано, що вуглеамонійні солі (ВАС) у дозах 0,25 і 0,5 норми суттєво збільшували кількість і масу кореневих бульбочок (рис. 1). Зокрема у фазу стеблування у варіанті з вне-сенням ВАС у дозі 0,25 норми азоту бульбочок утворилось в 1,3–2,0 рази більше, а за масою вони перевищували бульбочки з рослин, вирощених на NH4NO3, в 1,4–2,0 рази. У варіанті з 0,5 норми азоту ВАС при інокуляції штамом 425а у фазі бутонізації бульбочок було в 1,5–2,2 рази більше порівняно до варіанта з 0,5 норми азоту NH4NO3, а їх маса відповідно перевищувала масу бульбочок цього варіанта в 1,3–1,7 рази. Азотфіксувальна активність кореневих бульбочок люцерни при внесенні ВАС у дозі 0,25 норми азоту протягом вегетації до фази початку цвітіння була вищою порівняно з аналогічним варіантом на фоні NH4NO3, а до початку фази бутонізації порівняно з Ca(NO3)2. Так, у фазі стеблування рослини, вирощені на 0,25 норми азоту ВАС, за азотфіксувальною активністю перевищували рослини, що росли на NH4NO3, в 1,6–4,0 рази, на Ca(NO3)2 в 2,8–4,1 рази. Вірогідну прибавку урожаю зеленої маси протягом усіх трьох років досліджень отримали при внесенні 0,25 норми азоту ВАС. Прибавки урожаю залежно від року досліджень становили 10–19,5 %.

Вплив повільнодіючих азотних добрив на азотфіксувальну активність і продуктивність люцерни. У процесі дослідження впливу повільнодіючих азотних добрив – сульфату амонію і нітроамофосу, капсульованих водною емульсією поліуретансемикарбазиду, та оксамідкарбамідного гранульованого добрива на ріст, розвиток, азотфіксувальну активність і продуктивність люцерни встановлено, що при використанні азоту в повільнорозчинній формі утворюється потужніший симбіотичний апарат та підвищується азотфіксувальна активність кореневих бульбочок, порівняно із застосуванням адекватних за вмістом кількостей кальцієвої селітри (рис. 2). Азотфіксувальна активність у рослин першого року вегетації у фазах бутонізації і цвітіння збільшилась на 21–91 %, другого – 11–65 % порівняно з контрольними рослинами на Сa(NO3)2. Найбільшою азотфіксувальною активністю в перший рік вегетації характеризувались рослини у варіанті з оксамідкарбамідним добривом, на другий рік вегетації – нітроамофосом, капсульованим водною емульсією поліуретансемикарбазиду. Перевагою повільнодіючих азотних добрив є поступове вивільнення з їхнього складу азоту. У зв’язку з цим збільшується період використання азотних добрив рослинами, а його концентрація в ґрунті є невеликою, тому не пригнічує формування та функціонування симбіотичного апарату у люцерни. Азотні добрива з регульованою віддачею азоту дозволяють знизити втрати поживних речовин і зменшити негативний вплив на довкілля.

Роль біологічного азоту в підвищенні насіннєвої продуктивності люцерни.

Залежність насіннєвої продуктивності люцерни від інокуляції різними штамами Rhizobium meliloti. Як показав аналіз літературних даних, насіннєву продуктивність люцерни досліджували лише за окремими критеріями, а автори здебільшого не враховували потужного азотфіксувального потенціалу культури [Черенков, 1999]. Як свідчать результати наших багаторічних досліджень, насіннєву продуктивність можна підвищити за рахунок інтенсифікації симбіотрофного живлення рослин азотом. Передпосівна бактеризація насіння люцерни високоефективними штамами бульбочкових бактерій позитивно впливає на формування генеративних органів у рослин завдяки інтенсифікації утворення в них лімітуючих синтез білка амінокислот – метіоніну, лізину, гістидину, тирозину та ін.

У вегетаційних умовах при інокуляції сорту Ярославна найбільш ефективним порівняно із штамом-стандартом 425а був штам М6, – приріст врожаю насіння в перший рік вегетації, становив 20,5 %, на другий рік – 30,9 %. Найбільшу прибавку насіння люцерни сорту Зайкевича – 24,8 % отримали при інокуляції новим штамом М12. Рослини цього варіанта у фазі бутонізації за азотфіксувальною активністю у 2,1 рази перевищували інокульовані штамом 425а.

Таблиця 2.

Вплив різних штамів Rhizobium meliloti на насіннєву продуктивність люцерни (ц/га) сорту Ярославна другого року вегетації (польовий дослід, ЛДАУ)

Штам | Урожай насіння, ц/га | Прибавка до

контролю | штаму 425а

ц/га | % | ц/га | %

Без інокуляції (контроль) | 1,12±0,06––––

425а | 1,24±0,05 | 0,12 | 10,7––

435а | 1,31±0,04* | 0,19 | 16,9 | 0,07 | 5,6

412б | 1,49±0,05* | 0,37 | 33,0 | 0,25 | 20,2

М4 | 1,36±0,07* | 0,24 | 21,4 | 0,12 | 9,7

М6 | 1,55±0,04* | 0,43 | 38,4 | 0,31 | 25,0

М7 | 1,17±0,06 | 0,05 | 4,5 | -0,07 | -5,6

НІР05 0,17

* Різниця достовірна

За польових умов найбільш ефективними були штами Rhizobium meliloti М6, М12 та 412б (табл. 2). При їх використанні для інокуляції прибавка врожаю насіння люцерни сорту Ярославна другого року вегетації становила від 20 до 25 % порівняно із штамом-стандартом 425а та від 33 до 38,4 % порівняно із місцевими расами бульбочкових бактерій.

Зв?язок між насіннєвою продуктивністю та інтенсифікацією процесу біологічної азотфіксації. Отримані результати свідчать, що насіннєву продуктивність люцерни можна суттєво підвищити за рахунок максимального використання біологічного азоту, фіксованого симбіотичними системами люцерна–Rhizobium meliloti. Оптимальні умови для функціонування симбіозу і забезпечення максимальної насіннєвої продуктивності рослин першого року вегетації залежно від сорту люцерни і штаму бульбочкових бактерій створювались у вегетаційних дослідах при внесенні 0,25–0,5 норми мінерального азоту. Ефективність штамів М4 і М82, отриманих генетико-селекційними методами, була вищою на фоні 0,5 і 1 норми екзогенного азоту. Прибавка урожаю насіння становила від 6,5 до 52,3 % залежно від штаму бульбочкових бактерій і року досліджень. У польових умовах достовірне зростання врожаю насіння від внесення N30 на другий рік вегетації отримали лише на світло-сірому опідзоленому легкосуглинковому ґрунті.

З’ясовано, що ефективним засобом підвищення врожаю насіння люцерни є позакореневе підживлення у фазі бутонізації або бутонізації–початку цвітіння 10%-ним розчином ВАС або нових комплексних азотних добрив ВІДАКСу-н і ВІДАКСу-і. Прибавка урожаю насіння від обприскування становила 10,6–24,6 %.

Залежність інтенсивності процесів фотосинтезу і дихання від умов живлення мінеральним азотом та інокуляції різними штамами Rhizobium meliloti і їх зв?язок з азотфіксувальною активністю

Особливості газообміну СО2 у люцерни при інокуляції штамами Rhizobium meliloti на фоні різного забезпечення мінеральним азотом. На початку наших досліджень відомості щодо впливу різних за ефективністю штамів Rhizobium meliloti, в тому числі і тих, що характеризуються підвищеною ефективністю в багатих азотом ґрунтах, на інтенсивність газообміну СО2 у люцерни були відсутні. Для дослідження цих питань ми провели серію вегетаційних дослідів з люцерною сорту Зайкевича.

Одержані результати свідчать, що симбіотичні системи люцерна–Rhizobium meliloti, утворені штамами 425а і М4, на різних нормах мінерального азоту суттєво відрізняються між собою не лише за азотфіксувальною активністю, але й за інтенсивністю фотосинтезу та дихання. Рослини, інокульовані штамом 425а, вирощені без внесення мінерального азоту або при малих його дозах (0,1–0,2 норми), мали вищу інтенсивність фотосинтезу і більше нагромаджували сухої речовини порівняно з рослинами, інокульованими штамом М4, який проявив підвищену ефективність у присутності 0,5–1 норми азоту. У варіанті з 0,5 норми азоту рослини, інокульовані штамом М4, уже на перших фазах вегетації формували добрий листовий апарат і характеризувалися високою інтенсивністю фотосинтезу, яка в розрахунку на одиницю маси сухої речовини була на 48,1 % більшою, ніж у рослин, інокульованих штамом-стандартом 425а. За стійкістю до мінерального азоту бульбочки люцерни, утворені штамом М4, подібні до стеблових бульбочок тропічних рослин та кореневих бульбочок африканських бобових рослин, які є стійкішими до внесення мінерального азоту.

Вплив різних форм мінерального азоту на інтенсивність фотосинтезу та дихання. Різні форми азотних добрив – аміачна селітра і вуглеамонійні солі суттєво впливають на інтенсивність газообміну СО2 у люцерни. Симбіотичні системи люцерна–Rhizobium meliloti у варіанті із внесенням стартових доз ВАС (0,25–0,5 норми) на перших етапах розвитку рослин до фази прихованої бутонізації мали вищу інтенсивність фотосинтезу, нижчу частку дихання від фотосинтезу та переважно невисоку інтенсивність дихання (в розрахунку на 1 г сухої речовини за 1 год), ніж при використанні аміачної селітри (табл. 3).

Таблиця 3.

Вплив різних форм мінеральних азотних добрив на інтенсивність фотосинтезу (мг СО2/год) та нагромадження сухої речовини (мг) у рослин люцерни сорту Ярославна, інокульованих штамом Rhizobium meliloti 425а

(вегетаційний дослід, 0,25 норми азоту)

Фаза розвитку

та день після сходів |

Варіант | Фотосинтез |

Маса

сухої

речовини

видимий | істинний, на

одну рослину

на одну

рослину | на 1 г сухої речовини

Стеблування, 18-й | NH4 NO3 | 0,3 ± 0,1 | 10,5 ± 0,3 | 0,6 ± 0,1 | 41

ВАС | 1,2 ± 0,3 | 20,3 ± 3,1 | 1,6 ± 0,3 | 73

Стеблування, 24-й | NH4 NO3 | 1,1 ± 0,2 | 17,2 ± 2,1 | 1,4 ± 0,1 | 92

ВАС | 1,8 ± 0,2 | 22,3 ± 2,3 | 2,3 ± 0,2 | 131

Стеблування, 32-й | NH4 NO3 | 2,2 ± 0,0 | 14,5 ± 0,1 | 3,2 ± 0,1 | 296

ВАС | 3,5 ± 0,3 | 14,9 ± 0,5 | 4,7 ± 0,4 | 443

Прихована бутонізація, 39-й | NH4 NO3 | 3,9 ± 0,1 | 11,4 ± 1,0 | 5,6 ± 0,1 | 657

ВАС | 6,4 ± 0,1 | 17,8 ± 2,6 | 8,1 ± 0,1 | 733

Початок

цвітіння, 55-й | NH4 NO3 | 8,9 ± 0,2 | 11,1 ± 0,7 | 11,6 ± 0,4 | 1625

ВАС | 6,9 ± 0,4 | 9,0 ± 0,9 | 10,0 ±0,3 | 1749

На пізніших фазах розвитку (бутонізація–початок цвітіння) вищою інтенсивністю фотосинтезу та азотфіксації характеризувались уже симбіотичні системи люцерни, сформовані в присутності 0,25 норми азоту аміачної селітри. Підвищення інтенсивності фотосинтезу в першій половині вегетації до фази бутонізації при внесенні стартових доз ВАС відбувається за рахунок підвищення вмісту хлорофілу в рослинах та концентрації СО2 і аміаку в ґрунті. СО2 крім того, що підсилює розмноження чистих культур ризобій, стимулює також утворення бульбочок на корінні бобових, підвищує активність азотфіксації і позитивно впливає на фізіолого-біохімічні процеси у рослин, збільшуючи продуктивність останніх [Мішустін, Шильникова, 1968; Гуляєв, 1986].

Активність основних ферментів азотного метаболізму у люцерни при різному співвідношенні біологічного та мінерального азоту

При вивченні азотфіксувальних мікроорганізмів і їх симбіозу з бобовими рослинами дуже важливим у теоретичному і в практичному плані є питання про співвідношення ключових ферментів асиміляції азоту рослинами – нітрогенази і нітратредуктази. Від своєчасного переключення живлення клітини з азотфіксації на використання нітрату і навпаки практично залежить азотне живлення вільно-існуючих і симбіотичних азотфіксаторів і відповідно їх внесок в азотний баланс ґрунту і урожай бобових рослин [Львов, 1989; Боте, 1991; Старченков, 1996].

Співвідношення нітратредуктазної і нітрогеназної активності у люцерни залежно від інокуляції різними штамами Rhizobium meliloti на фоні зростаючих доз азоту. Проведені нами дослідження показали, що найбільш інтенсивне поглинання і асиміляція нітратів проходять у фазах стеблування і бутонізації (40–55-денні рослини). Штами бульбочкових бактерій 425а, М4 та М48 суттєво відрізнялися за нітрогеназною активністю (НГА) і значно впливали на рівень нітратредуктазної активності (НРА) в різних органах люцерни. НГА при інокуляції рослин штамом 425а була вищою без внесення мінерального азоту, а штамом М4 – у присутності 0,25–1 норми екзогенного азоту в ґрунті. Рослини, інокульовані штамом-стандартом 425а, при живленні лише атмосферним азотом (варіант без внесення мінерального азоту) і внесенні 0,25 норми азоту в більшості випадків мали вищу нітратредуктазну активність в листках і стеблах порівняно з рослинами при інокуляції штамами М4 та М48 (табл. 4).

Фізіологічною особливістю симбіотичних систем люцерна–Rhizobium meliloti, утворених стійким до мінерального азоту штамом М4 на фоні 0,5 і 1 норми екзогенного азоту, є більш високий рівень НРА в стеблах, ніж у систем, утворених штамом 425а.

Таблиця 4.

Вплив різних норм мінерального азоту та штамів бульбочкових бактерій на

нітратредуктазну активність (мкг NO2-/г сирої речовини за 30 хв) у листках та

стеблах люцерни (вегетаційний дослід)

Норма азоту

за Гельрігелем | Штам | Об?єкт дослідження | Фаза розвитку та день після сходів

Стеблування, 40-й | Прихована бутонізація, 46-й | Бутонізація, 52-й

0,25