НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ

ІНСТИТУТ ГІДРОБІОЛОГІЇ

Кривопиша Вікторія Вікторівна

УДК 597.554.3:591.481.1+577.42/48

ВПЛИВ СТРЕС-ФАКТОРІВ ВОДНОГО СЕРЕДОВИЩА

НА АДАПТИВНІ ФУНКЦІЇ НЕРВОВОЇ СИСТЕМИ КОРОПА

03.00.10. - іхтіологія

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

КИЇВ – 2001

Дисертацією є рукопис

Робота виконана в лабораторії екологічної біохімії Чернігівського державного педагогічного університету імені Т.Г. Шевченка

Науковий керівник: доктор біологічних наук, професор

ГРУБІНКО Василь Васильович

Тернопільський державний педагогічний

університет імені Володимира Гнатюка

проректор з навчальної роботи

Офіційні опоненти: доктор біологічних наук, професор

АРСАН Орест Михайлович,

Інститут гідробіології НАН України,

завідуючий відділом екотоксикології

кандидат біологічних наук,

ГАНДЗЮРА Володимир Петрович,

Київський національний університет ім. Тараса Шевченка,

доцент кафедри зоології

Провідна установа: Інститут біології південних морів ім. О.О. Ковалевського

НАН України, м. Севастопіль

Захист дисертації відбудеться “ 15 ” листопада 2001 р. о 10 год.

на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.213.01 при Інституті гідробіології НАН України за адресою: 04210 м. Київ-210, проспект Героїв Сталінграду, 12

З дисертацією можна ознайомитися в бібліотеці Інституту гідробіології НАН України, м. Київ, проспект Героїв Сталінграду, 12

Автореферат розісланий “ 27 ” серпня 2001 р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради

кандидат біологічних наук Гончаренко Н.І.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Зростання антропічного впливу на водне середовище загострило проблему виживання організмів в стресових умовах, які первинно створюються накопиченням токсичних речовин. Останні змінюють фізико-хімічні властивості водоймищ, порушують біологічну рівновагу і процеси самоочищення, що впливає на життєдіяльність водяних організмів. Серед значної кількості високотоксичних для водяних організмів речовин, найбільш поширеними є амонійний азот, важкі метали (Cu2+; Pb2+; Co2+), фенол та інші. Пошкодження водних екосистем унаслідок їх впливу здійснюється шляхом дії цих речовин на організм гідробіонтів, екологічна толерантність яких визначається їх фізіолого-біохімічним статусом. В регуляції метаболізму і функцій організму провідна роль належить головному мозку, який є компонентом гемато-енцефалічного бар`єру організму, що захищає останній від стресової дії факторів середовища.

Компенсаторні можливості нервової тканини, які формуються за дії стресових факторів, добре вивчені у ендотермних тварин. Щодо ектотермних організмів, то дане питання вимагає поглибленого розгляду і систематизації. Роботи Лук`яненка В.І. (1983), з питань загальної іхтіотоксикології, Висоцької Р.У. (1991) і Руоколайнен Т.Р. (1987), з питань токсичного впливу солей амонію та катіонів важких металів на активність лізосомальних ферментів в нирках і головному мозку коропа, Меєрсона Ф.З. (1981), з динаміки та фізіологічного значення активації гамааміномасляної кислоти у головному мозку риб, Сомкіної Н.В. (1968), з дослідження функціональної ролі амінокислот у мозку риб, Грубінка В.В. (1995), який вивчав адаптивні реакції риб до дії аміаку водного середовища, дають відомості про окремі ланки формування адаптацій до стрес-факторів у мозку риб в екстремальних станах. Наше дослідження передбачає комплексне вивчення процесів, які відбуваються у мозку коропа за дії на організм риб токсикантів, таких як фенол, амонійний азот, катіонів свинцю на фоні аміачної інтоксикації риб, а також дослідження корегуючої дії катіонів Mg2+, Mn2+ та Co2+.

Зв`язок роботи з науковими програмами. Дана робота є складовою частиною держбюджетних науково-дослідницьких робіт 5/97 “Дослідження механізмів адаптації прісноводних риб до токсикантів водного середовища, розробка на їх основі методів біохімічного моніторингу і модельних екосистем для очищення забруднених вод” та 16/98 “Оцінка комплексного впливу токсикантів та природних фізичних факторів на екосистему малої річки ( на прикладі річок Чернігівського Поліся), які виконувалися в межах координаційного плану за фаховим напрямком “Біологія” Міністерства освіти і науки України.

Мета і задачі дослідження. Метою роботи було вивчення впливу токсичних рівнів іонів свинцю, аміаку, фенолу та при зміні рН водного середовища на функціонування та стан метаболічного і енергетичного забезпечення мозку риб. Для досягнення мети вирішувались наступні завдання: вивчення сезонних адаптацій у мозку риб до періодичних абіотичних факторів: дослідження дії екстремальних факторів водного середовища на енергетичне забезпечення мозку риб (амінокислот, глюкози, кетонових тіл; стан енергогенеруючої системи, вміст аденілатів та функціонування адаптивних механізмів метаболізму енергетичних субстратів); вивчення адаптацій головного мозку коропа до дії аміаку та катіонів Mn2+, Co2+, Mg2+ на формування токсикотолерантності мозку коропа до аміаку; субстратні механізми детоксикації, роль глутамінової системи у підтриманні гомеостазу аміаку, функціонування системи обміну g-аміномасляної кислоти.

Наукова новизна одержаних результатів. Вперше на субстратно-метаболічному рівні дана комплексна характеристика процесів, які відбуваються у мозку коропа під впливом сезонних змін температури і інтенсивності живлення. Встановлено механізми зміщення рівноваги між енергоутворюючими і енергозатратними процесами під впливом токсикантів: аміаку, іонів свинцю, фенолу і політоксикозу, викликаного стічними водами. Показана роль гама-амінобутиратного шунту та глутамат-глутамінової системи у підтриманні енергетичного та метаболічного гомеостазу: формуванні пулу нейромедіаторів, детоксикації аміаку, забезпеченні функціонування адаптивних енергетичних гілок ГАМК-шунта (у зимові місяці активніше нейромедіаторна його гілка, весною - енергетична). Виявлено ефект підтримання гомеостазу у мозку коропа за рахунок синтезу кетонових тіл, при дії гіпотермії та під впливом токсикантів (аміаку, іонів свинцю, фенолу, політоксичній дії стічних вод).

Практичне значення одержаних результатів. На основі отриманих результатів виявлені ключові показники оцінки фізіологічного і метаболічного гомеостазу головного мозку коропа: вміст глюкози, вільних амінокислот, кетонових тіл, активність ферментів глутамат-глутамінової, ГАМК-ергічної систем, співвідношення швидкостей енергозатратних і енергоутворюючих процесів. Запропоновано використовувати їх як біоіндикатори для оцінки стану та розвитку інтоксикацій в організмі коропа, а також для моніторингу забруднень водного середовища.

Виявлено, що катіони магнію виконують протекторну роль при дії стресових факторів на риб, що дозволяє рекомендувати їх як токсикопротектори у рибництві.

Особистий внесок здобувача. В отриманні експериментальних даних автору належить провідна роль. Статистична обробка даних, їх обговорення та висновки виконані дисертантом особисто.

Апробація результатів дисертації.

Основні положення роботи доповідалися на:

1. VII Українському біохімічному з`їзді (Україна, Київ, 1997).

2. II з`їзді Гідроекологічного товариства України (Україна, Київ, 1997).

3. I Міжнародній науково-практичній конференції “Екологія і молодь” (Республіка Беларусь, Гомель, 1998).

4. I Всеукраїнській науковій конференції “Екологічний стрес і адаптація в біологічних системах” (Україна, Тернопіль, 1998).

5. Науковому семінарі “Сучасна екологія і проблеми сталого розвитку суспільства” (Україна, Львів,1999).

Публікації. По матеріалах дисертації опубліковано 8 робіт.

Структура і об`єм роботи. Дисертація складається із вступу, огляду літератури (2 розділи), експериментальної частини (6 розділів), підсумків і висновків. Робота викладена на 169 сторінках, містить 41 рисунок, 11 таблиць, 219 літературних джерел, з яких 83 - на іноземних мовах.

ЗМІСТ РОБОТИ

Матеріали і методи досліджень. Досліди проводились на коропах (Cyprinus carpio L.) дворічного віку.

Сезонну динаміку вмісту основних субстратів енергетичного обміну в тканинах мозку визначали протягом зимівлі з вересня до квітня. Риб відбирали з природної водойми (ставок Чернігівського рибкомбінату). Протягом всього періоду досліджень гідрохімічний режим води контролювався за допомогою приладу Horiba моделі U-7 (Японія). Вказані умови не викликали розвиток в організмі коропа гіпоксії, гіперкапнії, гіпотермії. За даними іхтіопатологічних спостережень, у риб збудників паразитарних хвороб не виявлено. Досліди з вивчення впливу різних стрес-факторів проводили в 200-літрових акваріумах з відстояною водопровідною водою. В усіх випадках здійснювали контроль і підтримували постійний гідрохімічний режим води. Величина рН складала 7,30±0,27; вміст кисню - 5,6±0,4 мг/л, температура витримувалась близькою до природної в залежності від сезону року.

Токсичні рівні (2 рибогосподарських ГДК) речовин у воді акваріумів створювали внесенням їх розрахункових кількостей: аміаку (0,1 мг/л - пороговий рівень) внесенням буферної суміші NH4OH: NH4Cl з рН 7,2; Pb2+ (0,2 мг/л) - ацетату свинцю; Cu2+ (0,2 мг/л) - сульфату міді; Zn2+ (2,0 мг/л) - сульфату цинку; Mg2+ (100,0 мг/л) - хлориду магнію з врахуванням природної твердості води; Mn2+ (2,41 г/л) - сульфату марганцю; фенолу (0,002 мг/л) - розчиненого свіжоперегнаного фенолу. Кислотний та лужний стрес створювали внесенням у воду HCl чи NaOH. Значення рН щодобово контролювали і корегували.

Аналіз амінокислотного складу здійснювали за Пасхіною Т.С. (1964) та Ali A.N. (1983). Вміст глюкози в хлорних екстрактах визначали за Зейфтером з о-Толуїдиновим реактивом (Асатіани В.С., 1957). Вміст кетонових тіл у мозку риб визначали за рекомендаціями Баєва В.І. і Булах Є.І. (1973) в нашій модифікації (Жиденко А.О. та ін., 1990).

Визначення вмісту макроергічних сполук у мозку риб здійснювали, методом тонкошарової хромотографії за рекомендаціями Маляревської О.Я. та Білик Т.І. (1985) у 8-% хлорних екстрактах.

Вміст лактату і пірувату визначали ферментним методом (Прохорова М.І., 1982). Вміст глутамату (ГЛУ), ГАМК досліджували методом хроматографії на папері (Пасхина Т.С., 1964); аміаку - мікродифузним методом (Балаховський С.Д. та ін., 1953; Selligson D. et al., 1951); глутаміну - за методом Сілакової І.А. та ін. (1962). Гомогенати тканини мозку у 0,32М сахарозі використовували для визначення активності ферментів. Глутамінсинтетазну (ГС) активність оцінювали фосфатним методом (Євстигнеєва З.Г. та ін., 1980; Труш Г.М., 1963); глутаміназну– за Магарламовим А.Г. та ін. (1979); глутаматдекарбоксилазну (ГДК) - за методикою Шатунової Н.Р. і Ситинського І.А., (1962); ГАМК-трансаміназну - згідно рекомендацій Фарадієва А.Н. (1991); ацетилхолінестеразну (АХЕ) - методом Еллмана в модифікації (Розенгарт Є.В., 1975).

Для визначення можливості утворення в організмі коропа глюкози з невуглеводних компонентів, досліджували незворотні реакції глюконеогенезу. Визначення активності глюкозо-6-фосфатази (Г-6-Фази) проводили за Львовою С.П. (1985), фруктозо-1,6-дифосфатази (Ф-1,6-ДФази) - за Орехович В.Н. (1964). З метою встановлення рівнів активності ферментів енергетичного обміну досліджували глюкозо-6-фосфатдегідрогеназну (Г-6-ФДГ), лактатдегідрогеназну (ЛДГ) активності у цитоплазматичній фракції, сукцинатдегідрогеназну (СДГ) - у мітохондріальній, малатдегідрогеназну (МДГ), глутаматдегідрогеназну (ГДГ) - в обох. Виділення мітохондрій здійснювали по загальноприйнятій методиці (Зініч В.Н., 1986), додатково очищували цетрифугуванням у градієнті густини сахарози 0,32-1,2М (Арутюнян А.В. ті ін., 1978) в горизонтальному роторі. Г-6-ФДГ, ГДГ, ЛДГ- та МДГ-азну активності визначали спектрофотометрично при 340 нм. (Biochemica information, 1975). Вміст білку в ферментних препаратах визначали за методом Лоурі і співавт. (1951).

Усі результати були оброблені статистично за Ойвіним І.А. (1960). Відмінності між порівнюваними групами вважали достовірними при Р<0,05.

РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ І ЇХ ОБГОВОРЕННЯ

Сезонні особливості вмісту основних субстратів та активності основних ферментів глутамат-глутамінової системи у мозку коропа. При вивченні співвідношення сезонних змін активності ферментів глутамат-глутамінової системи у мозку коропа можна відмітити, що осінню, за сприятливих умов , активність ГДК мінімальна, немає необхідності в охоронному гальмуванні і утворенні ГАМК-медіатора гальмування. Активність інших ферментів: ГДГ NAD(H) і NADP(H) і ГС достатньо високі, що свідчить про норму у фізіологічному стані риб. При зниженні температури води до 4оС (початок зимового періоду) у 6 разів збільшується активність ГДК, що призводить до утворення ГАМК і до охоронного гальмування у мозку. Це, в свою чергу, впливає на фізіологічні показники і поведінку риб, вони стають малорухомими. Детоксикація аміаку відбувається за рахунок ГС, а не ГДГ NADP(H). Збільшення активності ГДГ NAD(H) забезпечує ферменти циклу Кребса кетокислотами, що сприяє підтримці енергетичного гомеостазу мозку риб. Весняний період (час виходу риб із зимівлі), найбільш несприятливий і небезпечний, унаслідок виснаження енергетичних субстратів, що і відображається на активності ферментів - зниженням активності ГДГ NAD(H) і ГС.

Вплив екстремальних факторів водного середовища на вміст енергетичних субстратів у мозку риб. Ключовими показниками енергетичного метаболізму головного мозку коропа, які можна використати для оцінки стану та розвитку інтоксикацій в організмі риб є аденілатні макроерги (АТР, АDP, AMP), вуглеводи, амінокислоти, кетонові тіла.

Участь вільних амінокислот у формуванні адаптацій мозку коропа до різних типів екстремальних впливів базується на виконанні ними багаточисельних функцій. Головними з них можна вважати не тільки відому для вільних амінокислот участь в біосинтезі адаптивних білків, але і використання в енергетичному забезпеченні мозку, в окремих випадках більш інтенсивне, ніж окислення вуглеводів. Цистеїн, глутамін та аспарагін беруть участь у формуванні специфічних адаптивних реакцій. Динаміка ГАМК і глутамату підтверджує виконання ними нейромедіаторних функцій. Ряд амінокислот (глутамінова, аспарагінова, аланін), при стресі є компонентами метаболічних ланцюгів детоксикації аміаку. Для багатьох амінокислот очевидна участь в формуванні захисних буферних систем кислотно-лужного гомеостазу. Можлива участь окремих амінокислот (наприклад цистеїну) в перебудовах і стабілізації структурної та функціональної активності мембран клітин мозку. Високий метаболічний статус амінокислот у мозку риб може служити одним із засобів регуляції процесів життєдіяльності риб в стресових станах.

Енергетичний стан мозку риб, які знаходяться під впливом катіонів цинку, свинцю і міді, має спільні риси. Для цих умов характерне зниження рівня АТР, ДМАК, АТР/ADP, співвідношення діючих мас системи АТР і постійність вмісту ADP і неорганічного фосфору. Адаптивним механізмом, який підтримує енергетичний гомеостаз мозку експериментальних риб, може бути кетогенез. Нами раніше встановлена роль кетонових тіл в енергетичному забезпеченні мозку молоді коропа під впливом несприятливих умов зимового голодування (Жиденко А.О. та ін., 1994). В експериментах прослідковується загальна тенденція до збільшення концентрації кетонових тіл у мозку риб, які утримуються у середовищі з катіонами Zn2+, Pb2+, Cu2+. Таким чином, для водних організмів при дії токсикантів важливим є можливість включення компенсаторного механізму синтезу кетонових тіл як додаткового енергетичного субстрату.

Основні напрямки адаптації головного мозку коропа до підвищених рівнів аміаку. Аміак є кінцевим продуктом обміну білків, вміст якого підвищується при дії більшості абіотичних факторів середовища, включно токсикантів, за рахунок посилення катаболізму білків. Крім того, аміак утворюється у водоймах унаслідок біодеструкції, виділяється гідробіонтами і нагромаджується у водному середовищі при застосуванні інтенсивних методів рибництва.

Наши дослідження показують, що збільшення вмісту аміаку у воді не призводить до вірогідного підвищення концентрації його у мозку риб (табл. 1).

Таблиця 1

Вміст основних субстратів g-амінобутиратного шунту

при 14-добовій аклімації коропа у середовищі з вмістом аміаку 0,1 мг/л

(мкмоль на 1 г сирої тканини. М±m; n=9).

Місяці | Аміак | Глутамат | ГАМК

Контроль | Дослід | Контроль | Дослід | Контроль | Дослід

Червень | - | - | 6,70±1,08 | 2,71±0,29* | 1,53±0,16 | 0,94±0,24

Вересень | 8,11±1,33 | 8,86±0,94 | 0,36±0,03 | 0,47±0,09 | 0,28±0,03 | 0,34±0,09

Жовтень | 1,07±0,09 | 1,07±0,10 | 0,45±0,09 | 2,33±0,64* | сліди | 1,65±0,58*

Листопад | 6,49±0,33 | 8,14±1,02 | - | - | - | -

Грудень | 4,50±0,45 | 5,39±0,71 | 1,18±0,20 | 0,66±0,21* | 1,32±0,23 | 1,41±0,11

Січень | 3,50±0,28 | 3,00±0,18 | 1,66±0,33 | 1,62±0,68 | 1,64±0,32 | 1,59±0,17

Лютий | - | - | - | - | 0,88±0,07 | 1,40±0,33

Квітень | 6,79±0,85 | - | 0,12±0,02 | 0,26±0,09 | 1,80±0.12 | 2,46±0,19

”-” - не визначали; “X” - не виявлено.

????????? ?? ??????????? ?????? ?????????????? ? ????????, ??? ???? ????????? ? ?????????, ?????? ? ??????, ????? ? ?? ??????, ???? ? ????? ??? ???????????? ?????????? ????????? ?????? ?? ??????? ??????????????????? ??????. ? ?????? ??????? ??? ??? ?????? ??????????????? ????? ????????? ?? ?????????? ?????? ?????????. ? ??`???? ? ?????????? ?????? ?????? ??? ????????????? ????????? ????????? ? ????????? ? ???????????? ????? ??? ? ?????? ???????, ????? ??????????, ?? ??????? ???? ??? ????????, ????? ?????? ? ????? ???, ??? ???? ?????????? ?????? ? ??????????, ?????????? ????????. ?????????????? ?????????? ???? ??????? ????? ?????????? ? ?????? ?????? ??? ????????? ????????? ?????? ?????????, ? ????? ????????? ?????????? ? ?????? ??????????????????? ??????????. ? ???? ?????????? ???????? ????? ?? ???????? ?????????? ?????????? ?????????????????, ? ? ?????? ?????? (????????, ????????) ?????????? ???????? ????????? ???????????. ?????????? ?????????? ?? ??? ???????? ?????? ? ????????? ?? ??????????????, ???????? ???? ????????? ??????????? ?? ???????? ??????????? ??`????.

Аналіз отриманих даних підтверджує незначну роль глутаміну в детоксикації аміаку і перевагу глутаматної гілки його знешкодження. При цьому утворення глутамату може мати і нейромедіаторне значення. Синтез глутаміну із глутамату і його розпад здійснюється, в основному, з метою регуляції гомеостатичного (функціонально необхідного) рівня глутамату у мозку.

При вивченні реакції глутамат-глутамінової системи в умовах спільної дії аміаку і катіонів деяких металів (марганцю, магнію, кобальту), які широко застосовувались у рибництві як мікроелементи, була показана їх протекторна дія. Катіони Со2+, Mn2+, Mg2+ сприяють підтриманню гомеостатичного рівня аміаку. Крім того, необхідність в інтенсивній детоксикації аміаку в мозку риб може бути низькою у зв`язку із функціонуванням в організмі гемато-енцефалічного захисного бар`єру. Крім глутамат-глутамінової системи у мозку коропа при дії аміаку функціонує також гама-амінобутиратний шунт, який забезпечує толерантність центральної нервової системи до цього токсиканту.

Інтенсивне функціонування ГАМК-шунту при дії аміаку в усі періоди підтверджує аналіз відповідних ферментативних активностей (табл. 2). Аміак збільшує в різні сезони ГАМК-трансаміназну активність, що призводить до використання ГАМК для продукування нейромедіатора ГОМК (g-оксимасляна кислота). Глутаматдекарбоксилазна активність, як правило, також підвищується екзогенним аміаком. Останнє передбачає посилене утворення ГАМК з глутамату. Його джерелом при аміачному токсикозі, як показано нами раніше, служить активне функціонування NADP-глутаматдегідрогенази у мітохондріях мозку. При цьому досягається як посилення перетворення глутамату в ГАМК, з подальшим трансамінуванням і спрямуванням його у нейромедіаторну гілку шунту, так і витримування стаціонарних рівнів аміаку в мозку. У цьому випадку регулятором перемикання шунту, очевидно, виступає аміак, який сам є потужним нейромедіатором.

Таблиця 2

Активність основних ферментів g-амінобутиратного шунту і ацетилхолінестерази

при 14-добовій аклімації коропа в середовищі з вмістом аміаку 0,1 мг/л (M±m; n=9). |

А к т и в н і с т ь

Місяці | ГАМК-трансамінази | Глутаматдекарбоксилази | Ацетилхолінестерази

Контроль | Дослід | Контроль | Дослід | Контроль | Дослід

Вересень | 0,35±0,07 | 2,26±0,66* | сліди | 0,87±0,11* | 0,86±0,08 | 0,97±0,12

Жовтень | - | - | X | X | 0,41±0,03 | 0,09±0,01*

Листопад | - | - | 0,83±0,11 | 1,52±0,27* | - | -

Грудень | - | - | 5,43±0,55 | 6,74±0,61 | 4,98±0,45 | 2,98±0,21*

Квітень | 0,16±0,03 | 0,68±0,02* | 6,68±0,71 | 7,71±0,63 | 3,06±0,23 | 1,20±0,12*

У зв`язку зі значним зменшенням ацетилхолінестеразної активності при дії аміаку, слід відмітити ослаблення нейромедіаторної функції ацетилхоліну. Це активізує використання ГАМК як вихідного субстрату для синтезу більш потужного нейромедіатора ГОМК і знижує її використання в енергетичній гілці для задоволення енергетичних потреб мозку, який відчуває нестачу енергозабезпечення при аміачному токсикозі. Таким чином, енергетична гілка ГАМК-шунту при аміачному токсикозі у риб інгібується, а одним з головних субстратів енергозабезпечення є кетонові тіла. Одночасно зменшується активність ацетилхолінестерази. Збільшення ГАМК-трансаміназної активності свідчить про перевагу перетворення ГАМК у ГОМК і загальне гальмування нейрофізіологічних функцій організму. У зв`язку з цим нами здійснена спроба корекції розглянутих реакцій деякими іонами-активаторами детоксикуючих аміак систем.

Присутність іонів магнію у водному середовищі знижує вміст аміаку у мозку. При цьому не змінюється вміст глутамату і ГАМК, а також збільшується ацетилхолінестеразна активність, яка пригнічується дією аміаку. Із розглянутих катіонів (Mg2+, Mn2+, Co2+) протекторну дію, щодо g-амінобутиратного шунту і ацетилхолінестерази, виявляють катіони магнію, що дозволяє рекомендувати їх використання в указаних концентраціях (4,52 млмоль/л) для корекції ГАМК-обміну і нейрофізіологічних функцій у риб при аміачному токсикозі. Таким чином, співвідношення вмісту субстратів гама-амінобутиратного шунту і активність їх ферментативних перетворень погоджується з фізіолого-біохімічною динамікою обміну речовин у риб протягом річного циклу. Встановлені закономірності підтверджують існування адаптивних змін у функціонуванні гілок гама-амінобутиратного шунту в залежності від потреб організму і свідчить про їх участь у формуванні компенсаторно-захисної відповіді організму на дію несприятливих факторів зовнішнього середовища: сезонні коливання температури і живлення, дія токсикантів та ін. Припускаємо, що максимальне виявлення вказаних факторів призводить до дисбалансу протікання вивчених реакцій, порушення нейрофізіологічних функцій і загибелі риб. Тому, виявлена нами можливість їх корекції іонами деяких металів є перспективним методом управління фізіолого-біохімічним станом риб при стресі. Потенційними для практичного застосування з цією метою є іони магнію.

Відомо, що для нормального розвитку та життєдіяльності організму необхідні метали, в тому числі і важкі, однак в певній кількості та відповідній формі. Збільшення вмісту одного або кількох елементів у середовищі та організмі відносить їх до разряду токсикантів. При цьому вони пригнічують ті функції в організмі, які раніше, знаходячись в малих кількостях, регулювали або активували.

Особливості метаболізму у мозку коропа за дії іонів свинцю. Свинець є токсичним стрес-фактором для гідробіонтів. Його дія призводить до формування у клітинах катаболічного стрес-синдрому, який полягає в деградації клітинних структур, найперше білків. Природньо, буде збільшуватися активність ферментів енергоутворюючих процесів: гліколізу, циклу трикарбонових кислот, пентозофосфатного шунту.

Отримані дані відображають загальну тенденцію до збільшення активності енергозабезпечуючих ферментів і зниження активності ферментів енергозатратних реакцій при дії катіонів свинцю, які інгібують процес глюконеогенезу. Рівень активності цитоплазматичних Г-6-Ф-ази зменшився відносно контролю у 69 разів, Ф-1,6-ДФ-ази у 26 разів, за рахунок чого зменшується використання глюкози тканинами мозку в енергетичних цілях. Можна припустити взаємодію катіонів свинцю, як проникаючого токсиканту, з цими ферментами. Таким чином, дія катіонів свинцю призводить до зміщення метаболічних реакцій у бік катаболізму, на шкоду анаболітичним процесам.

Крім енергетичного гомеостазу, провідну роль у підтримці функціональної активності мозку риб відіграє підтримання азотистого гомеостазу. Відомо, що вплив на риб токсикантів в концентраціях, близьких до летальних, викликає реакцію, аналогічну гострому аміаковому токсикозу. Це порушення зв`язано з дисбалансом процесів утворення і виведення NH3. Дія катіонів свинцю призводить до накопичення аміаку у мозку і токсичному впливу на нервову систему. За

нашими даними, концентрація NH3 в мозку збільшується на 12%. Цей факт при інгібуванні активності глутамінсинтетази пояснюється тим, що детоксикація відбувається обходним шляхом за рахунок амінування 2-оксоглутарату, що відповідає збільшенню рівня активності мітохондріальної NADР(Н)-залежної глутаматдегідрогенази.

Аналіз наших даних підтверджує незначну роль глутамінової системи в детоксикації аміаку і переважання глутаматної гілки його знешкодження. Процес утворення глутамату може мати і нейромедіаторне значення. Це припущення підтверджується зниженням рівня активності NAD(H)-глутаматдегідрогенази в цитоплазматичній фракції у 95 разів, а мітохондріальній - у 1,9 разів.

Із зміною активності ферментів в тканинах риб змінюється як концентрація, так і співвідношення метаболітів енергетичного обміну. Так, в нервовій тканині дослідних риб, порівняно з контролем, виявлено зниження рівня глюкози в 2,8 раза, в 1,3 раза - рівня лактату і пірувату і збільшення активності цит. ЛДГ; цит. МДГ; мх. МДГ; мх. СДГ, що свідчить про подальше використання даних метаболітів в окислювальних реакціях для енергозабезпечення мозку риб (рис. 1). Суттєве зниження концентрації глюкози в мозку коропа при дії катіонів свинцю до 0,20 мкмоль/г тканини призводить до труднощів в енергозабезпеченні даного органу. Додатковим джерелом енергії для мозку коропа при дії катіонів важких металів є кетонові тіла. Їх роль в енергетичному забезпеченні мозку коропа в умовах свинцевого отруєння може бути доведена збільшенням суми кетонових тіл на 11% у мозку дослідних риб. При цьому рівень 2-оксибутирату збільшується у 3,8 рази при деякому зниженні концентрації ацетоацетату і ацетону порівняно з контролем. Унаслідок синтезу кетонових тіл відбувається відтік ацетил-СоА з циклу трикарбонових кислот. У зв`язку з цим активація ферментів циклу Кребса і пентозофосфатного шунту не призводить до забезпечення макроергічними сполуками процесів глюконеогенезу, не збільшує вмісту аденілатів, але сприяє зростанню рівня відновлених форм NADPH, забезпечуючи тим самим синтез кетонових тіл. При цьому відмічена зміна якісного складу кетонових тіл -збільшення відновленої форми 2-оксибутирату і зменшення концентрації ацетону і ацетоацетату. Таким чином, в умовах гальмування глюконеогенезу, у мозку риб утворюється визначений запас енергетичних субстратів, які забезпечують енергетичних гомеостаз і функційну здібність органу в умовах стресу, викликаного дією Pb2+.

Ключовим показником енергетичного гомеостазу головного мозку коропа служить рівень глюкози – головного енергетичного субстрату, вміст якої не може бути нижчим 0,2 мкмоль/г тканини, а також вміст кетонових тіл як додаткового джерела енергії.

Зміну активності ферментів та спрямованості метаболізму можна використовувати як біоіндикаторні показники.

Вплив фенолу на метаболізм у мозку коропа. Реакція-відповідь організму риб при дії фенолу у зв’язку з його хімічною природою специфічна. Одержані дані (таб. 3), свідчать про зниження у мозку дослідних риб порівняно з контрольними, рівня АТР у 2,9 раза, АД (сума аденілатів) - у 1,7 раза, АТР/ADP - в 3,14 раз.

Таблиця 3

Показники енергетичного стану мозку коропа в нормі і при інтоксикації фенолом

(мкмоль/г тканини; M±m; n=9).

Показники | Контроль | Фенол

ATP | 1,20 ± 0,40 | 0,41 ± 0,11*

ADP | 0,81 ± 0,26 | 0,87 ± 0,33

AMP | 0,71 ± 0,19 | 0,30 ± 0,11*

AD | 2,72 | 1,58

АЕЗ | 0,59 | 0,53

ДМАК | 1,29 | 0,16

ATP/ADP | 1,48 | 0,47

Pi | 3,96 ± 0,36 | 2,91 ± 0,27

ATP

ADP*Pi |

0,58 |

0,16

Поясненням значного різкого зниження вмісту макроергів у мозку служить встановлений факт про роз`єднання при дії фенолу окислення і фосфорилювання. Його підтвердженням служить також зменшення співвідношення діючих мас АТР-системи більше, ніж у 3 рази. У нормі, коли система АТР-ADP майже повністю фосфорильована, це співвідношення велике. Воно вказує на те, що швидкість ресинтезу АТР достатня для задоволення поточних потреб клітини. У випадку дії фенолу, для його виведення витрачається додаткова енергія. Збільшення на 7% концентрації ADP у мозку дослідних риб може сприяти посиленню синтезу АТР з ADP шляхом збільшення швидкості переносу електронів через мембрану. Неорганічний фосфор, на думку С.Е. Северина (1965), також служить своєрідним резервом для утворення макроергічних сполук і зниження його рівня на 27% у мозку риб, які зазнали дії фенолу, чинить негативну дію, зменшує енергоємкість клітин мозку.

До інгібування ресинтезу АТР призводить також різке зниження (більше, ніж у 8 разів), співвідношення діючих мас аденілаткіназної реакції. Тільки значення аденілатного енергетичного заряду у мозку дослідних і контрольних риб відрізнялися незначно. Це можна пояснити функціонуванням АМР- дезаміназного механізму, згідно якого зниження аденілатного енергетичного заряду компенсується дезамінуванням АМР. Можливість цього процесу підтверджують наші дані по зниженню рівня АМР в мозку дослідних риб у 2,4 раза порівняно з рівнем АМР в мозку контрольних риб. Значення АЕЗ=0,59 - для мозку дослідних риб і АЕЗ=0,53 - для контрольних, показують, що аденіннуклеотидний пул фосфорильован не повністю і існує необхідність наповнення аденіннуклеотидної системи високоенергетичними фосфатними групами. Для встановлення можливості протікання даного процесу було вивчено активність ферментів основних енергоутворюючих і енергозатратних процесів (гліколізу, циклу Кребса, пентозофосфатного шунту, глюконеогенезу), а також вміст окремих метаболітів цих реакцій. Одержані дані подано в таблиці 4.

Таблиця 4

Вміст деяких метаболітів енергетичного обміну в мозку коропа при дії фенолу

(мкмоль/г тканини; M±m; n=9). |

Кетонові тіла

Показники | Глюкоза | Лактат | Піруват | Ацетон + ацетоацетат | 2-оксибутират | Сума

Контроль | 0,55±0,06 | 2,53±0,32 | 0,18±0,02 | 0,57±0,01 | 0,08 ± 0,015 | 0,65

Фенол | 0,21±0,07* | 1,79±0,28* | 0,12±0,01 | 0,51±0,09 | 0,31 ± 0,11* | 0,82

Збільшення активності цитоплазматичної лактатдегідрогенази у 3 рази, мітохондріальної сукцинатдегідрогенази у 2 рази, а мх. малатдегідрогенази на 6% свідчать про активацію катаболізму, в основному за рахунок глюкози, вміст якої зменшився на 62% у мозку дослідних риб порівняно з контрольними (табл. 4). Активація процесів катаболізму може бути пояснена дією гормонів гіпоталамо-гіпофізарної системи (Матей В.Є., 1976; Флеров Б.А., 1983). У зв`язку з тим, що запаси глікогену у мозку риб незначні, нами були вивчені незворотні реакції глюконеогенезу. Рівень активності глюкозо-6-фосфатази зріс у 4,3 раза; фруктозо-1,6-дифосфатази - у 1,8 рази. Ці дані свідчать про активацію, поряд з катаболічними, і анаболітичних реакцій, якщо останні спрямовані на синтез глюкози і енергозабезпечення мозку коропа.

Отже, реакція-відповідь мозку риб на дію катіонів свинцю і фенолу може бути однакова, що проявляється у збільшенні активності ферментів енергетичного обміну, і різна - в анаболітичних реакціях. Така відповідь, більшою мірою, залежить від природи токсиканту і, як наслідок, від механізмів його взаємодії з ферментами.

Таким чином, вплив стрес-факторів водного середовища на адаптивні функції нервової системи коропа можна представити у вигляді схеми (рис. 1). Центральним напрямком адаптаційних процесів у мозку коропа при дії токсикантів є енергетичний. Підтримання енергетичного гомеостазу в мозку відбувається шляхом активації катаболічних процесів - збільшення рівня активності основних ферментів гліколізу, циклу Кребса, пентозофосфатного

шляху, окислювального дезамінування амінокислот і забезпечення цих ферментів енергетичними субстратами: глюкозою – визначальним субстратом, кетоновими тілами – додатковим джерелом енергії, а також вільними амінокислотами.

????????? ????????? ?????????????? ??????? ???? ????????? ?? ?????????? ?????? ?????? ? ????? ??????, ??? ????? ?? ???????????? ????????? ????????? ???? ?????? ????????????: ????? ??????? ????????? ?? ????????? ?? ?? ??????? 2-????????????? ? ?????????? ????????? ??? ?????? NADP(H)–?????????????????????. ???? ??????? ????????? ?????? ???????? ???????????? ???????? ??? ??? ??????? ?? ??????? ?????????? ? ???????????.

Третій напрямок адаптаційних процесів знаходить своє відображення у функційному стані риб, який, в свою чергу, характеризується існуванням гама-амінобутиратного шунту у мозку коропа, при дії екстремальних факторів водного середовища, що забезпечує розвиток у мозку охоронного гальмування. Це проявляється, наприклад, у зниженні рухливості риб при температурі води 4оС.

Для подолання несприятливого впливу стрес-факторів і формування адаптаційних механізмів можна рекомендувати застосування у штучних кормах вітамінів групи В, катіонів кальцію і розвиток природньої кормової бази.

ВИСНОВКИ

В дисертації наведене теоретичне узагальнення впливу сезонних змін температури і рівня токсикантів у водному середовищі на адаптивні функції нервової системи коропа. Комплексне вивчення процесів, які відбуваються у мозку коропа за дії амонійного азоту, катіонів свинцю на фоні аміачної інтоксикації, фенолу та іншіх стрес-факторів, дозволило пояснити стан метаболічного та енергетичного забезпечення мозку риб:

1. Сезонні фактори водного середовища змінюють спрямування енергетичної ланки метаболізму та якісний і кількісний склад метаболітів у мозку коропа в бік енерговитратних процесів з активацією тих ланок метаболізму, які забезпечують адаптацію організмів до несприятливих умов. Гіпотермія в природних умовах сприяє переорієнтації метаболізму глутамату з енергетичної ланки на регуляторну через його перетворення у медіатор гальмування ГАМК.

2. Регуляція вмісту глутамату, аміаку та глутаміну здійснюється залежно від температури шляхом зв`язування аміаку в глутамін при низьких температурах або 2-оксоглутаратом в глутамат за участю NADP(H)-глутаматдегідрогенази.

3. У мозку риб виявлено функціонування g-амінобутиратного шунту, активність якого змінюється під впливом екстремальних факторів водного середовища.

4. При дії аміаку, важких металів і фенолу в клітинах мозку риб активуються катаболічні процеси. Катіони свинцю, більшою мірою, ніж фенол, сприяють збільшенню глюкозо-6-фосфатдегідрогеназної активності цитоплазматичної фракції клітин мозку коропа, яка забезпечує його відновленим NADPH, що необхідно для синтезу кетонових тіл як додаткового джерела енергії для мозку риб.

5. Збільшення вмісту аміаку у воді не призводить до вірогідного підвищення концентрації його у мозку коропа внаслідок активації глутаматного шляху його детоксикації.

6. Визначальним субстратом для підтримання енергетичного гомеостазу у головному мозку коропа є глюкоза, критичний рівень якої становить 0,2 мкмоль/г тканини. В умовах адаптації до токсичних умов додатковим джерелом енергії є кетонові тіла.

7. Іони кобальту і марганцю спільно з аміаком проявляють синергічний негативний вплив на ГАМК-систему мозку риб. Катіони магнію, за несприятливого впливу токсикантів, активують зв’язування аміаку, зменшують вміст ГАМК, відновлюють активність ацетилхолінестерази, що є свідченням їх протекторної дії при стресових впливах на риб.

Список опублікованих праць за темою дисертації:

1.

2. Жиденко В.В., Жиденко А.О. Показники енергетичного обміну мозку коропа для моніторингу забруднення навколишнього середовища //Науковий вісник: Сучасна екологія і проблеми сталого розвитку суспільства /Збірник науково-технічних праць- Львів: Укр. ДПТУ.- 1999.- Вип. 97.- С. 66-72.

3. Жиденко А.А., Кривопиша В.В., Грубинко В.В. Роль g-аминобутиратного шунта мозга в адаптации рыб к экстремальным факторам среды //Гидробиол. журн.- 1999.- 35, № 5.- С. 96-101.

4. Грубінко В.В., Кривопиша В.В., Жиденко А.О. Особливості енергетичного метаболізму у мозку коропа при інтоксикації фенолом //Біологія тварин.- 2000.- Т. 2, № 1.- С. 65-71.

5. Жиденко В.В., Ребенок Е.В., Усов А.Е. Об экологической обстановке и основных направлениях стратегии защиты малой реки Стрижень //”Экология и молодёжь” (Исследование экосистем в условиях радиоактивного и техногенного загрязнения окружающей среды). Материалы І Межд. научно-практической конференции.- 17-19 марта 1998 г.- Гомель: Б.И.- Т. 1, Ч. 1.- С. 93-94.

6. Жиденко А.О., Грубінко В.В., Жиденко В.В. Енергетичний гомеостаз мозку риб при дії катіонів свинцю //VII Укр. біохімічний з`їзд. Київ, вересень 1997 р. Тез. доп. Київ: НАУ.- 1997.- Ч. 1.- С. 94-95.

7. Жиденко А.А., Грубинко В.В., Жиденко В.В. Особенности метаболизма углеводов в мозге карпа при интоксикации ионами свинца //ІІ З`їзд гідроекологічного товариства України. Київ, 27-31 жовтня 1997 р. Тез. доп. Київ: МПП “Август”.- 1997.- Ч. 2.- С. 122-123.

8. Жиденко А.А., Жиденко В.В. Метаболические механизмы адаптации головного мозга рыб при действии фенола //Екологічний стрес і адаптація в біологічних системах: Матеріали І Всеукраїнської наук. конф., 27-29 жовтня 1998р.- Тернопіль: ТДПУ, 1998.- С. 48-49.

Анотація

Кривопиша В.В. Вплив стес-факторів водного середовища на адаптивні функції нервової системи коропа.- Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 03.00.10 - іхтіологія. Інститут гідробіології НАН України, Киів.- 2001.

Дисертацію присвячено питанням комплексного вивчення процесів, які відбуваються у мозку коропа під впливом сезонних змін температури і токсикантів: аміаку, катіонів важких металів, фенолу та при зміні рН водного середовища.

Встановлено, що гіпотермія і інтоксикація сприяє активації катаболічних процесів. У мозку коропа виявлено функціонування гама-амінобутиратного шунту, який бере участь в регуляції енергетичного і метаболічного гомеостазу та процесів гальмування. Катіони магнію, на фоні несприятливого впливу токсикантів, сприяють зменшенню концентрації аміаку, ГАМК, відновленню активності ацетилхолінестерази, що є свідченням їх протекторної дії при стресових впливах на риб.

Особливостями енергетичного забезпечення мозку коропа при дії токсикантів поряд із зниженням концентрації АТР є використання кетонових тіл як додаткового енергетичного субстрата.

Ключові слова: короп, мозок, інтоксикація, глутамат-глутамінова система, ГАМК-система, енергетичний гомеостаз, адаптація.

Кривопиша В.В. Влияние стрес-факторов водной среды на адаптационные функции нервной системы карпа..- Рукопись.

Диссертация на соискание учёной степени кандидата биологический наук по специальности 03.00.10 – ихтиология. Институт гидробиологии НАН Украины, Киев.- 2001.

Диссертация посвящена вопросам комплексного изучения процессов, которые происходят в мозге карпа под влиянием сезонной смены температуры и токсикантов: аммиака, катионов тяжёлых металлов и при изменении рН водной среды.

Установлено, что гипотермия и интоксикация способствует активизации катаболитических процессов. В мозге карпа выявили функционирование гамма-аминобутиратного шунта, который учавствует в регуляции энергетического и метаболического гомеостаза, а также в процессах торможения. Катионы магния, на фоне неблагоприятного воздействия токсикантов, способствуют уменьшению концентрации аммиака, ГАМК, восстановлению активности ацетилхолинэстеразы, что свидетельствует о протекторном действии их при стрессовых влияниях на рыб.

Особенностью энергетического обеспечения мозга рыб при действии токсикантов, наряду со снижением концентрации АТР, является использование кетоновых тел в качестве дополнительного энергетического субстрата.

Ключевые слова: карп, мозг, интоксикация, глутамат-глутаминовая система, ГАМК-система, энергетический гомеостаз, адаптация.

Kryvopysha V.V. – The Influance of the Stress-factors of the Aqueous Environment on the Adoptive Functions of the Carp’s Nervous System. – Manuscript.

Thesis for a candidate’s degree by spesiality 03.00.10. - ichthyology. – The Institute of Hydrobiology of Natural Academy of Science of Ukraine, Kyiv, 2001.

This thesis dedicated the guestions of complex invastigation of the processes in the carp’s brain under the influance of seasonal prevalence of temperature, changers of pH in the environment and toxicants such as ammonia, cations of hard metals.

It has been establshed that hydrothermia and toxicity promote the activity of catabolistic processes. The functioning of gammaaminobutirate shunt which is one of the components in the regulation of energy and metabolic homeostasis and in the inhibition of processes has been exposed. The cations of magnium promote the decreasing of the concentration of ammonia, GABA, renewing the activity of acetilholinesterase against the background of the unfavourable influance of toxicants. These facts are indicative of their protective effect in stress influences onto the fish.

The peculiarity of the carp’s brain’s energy supply under the influence of toxicants and the decrease of ATP concentration is