КИЇВСЬКИЙ НАЦІОНАЛЬНИЙ УНІВЕРСИТЕТ

ІМЕНІ ТАРАСА ШЕВЧЕНКА

ЛУК’ЯНЕНКО Ірина Анатоліївна

УДК 612.35:616.36

ВПЛИВ ІНСУЛІНУ І ГЛЮКАГОНУ

НА СЕКРЕТОРНУ ФУНКЦІЮ ПЕЧІНКИ

03.00.13 –фізіологія людини і тварин

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

Київ - 2001

Дисертацією є рукопис

Робота виконана в НДІ фізіології імені академіка

Петра Богача Київського національного

університету імені Тараса Шевченка

Науковий керівник доктор біологічних наук,

старший науковий співробітник

Лященко Петро Сергійович

НДІ фізіології імені академіка

Петра Богача Київського

національного університету

імені Тараса Шевченка,

директор

Офіційні опоненти: доктор біологічних наук,

старший науковий співробітник Макарчук Микола

Юхимович, кафедра фізіології людини і тварин

Київського національного університету

імені Тараса Шевченка, завідувач кафедри

доктор біологічних наук, старший науковий

співробітник Олійник Борис Власович, Інститут

ендокринології і обміну речовин АМН України,

старший науковий співробітник

Провідна установа – Інститут фізіології

імені О.О.Богомольця НАН України

Захист відбудеться “18” червня 2001р. о 12 годині на засіданні

спеціалізованої вченої ради Д 26.001.38 Київського

національного університету імені Тараса Шевченка

за адресою Київ-22, проспект Глушкова 2,

біологічний факультет

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці

Київського університету імені Тараса Шевченка

за адресою 01033, Київ-33, вул.Володимирська,58

Автореферат розісланий “14” травня 2001 р.

Вчений секретар

спеціалазованої вченої ради

кандидат біологічних наук Давидовська Т.Л.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Печінка віддавна привертає увагу дослідників, оскільки є залозою, в якій відбуваються численні і складні біохімічні процеси, що забезпечують гомеостаз життєвоважливих і тісно пов’язаних з обміном речовин систем в організмі. Вона бере участь в обміні білків, ліпідів, вуглеводів, пігментів, виконує дезінтоксикаційну та жовчоутворювальну функції. Остання за сучасними уявленнями є осмотично-залежне надходження води в жовчні каналікули, при якому транспорт осмотично-активних речовин у каналікулярну жовч спряжений з чисельними метаболічними процесами, що відбуваються в гепатоцитах та на їх цитоплазматичних мембранах. Основними осмотично-активними компонентами жовчі є жовчні кислоти (Масюк, 1990; Meier, 1995; Boyer, Nathanson, 1999). На інтенсивність секреції жовчі також впливають білки жовчі (Масюк з співавт., 1992; Масюк, 1996), глутатіоно-, глюкуро- і сульфокон'югати, НСО3Ї (Nathanson, Boyer, 1991; Gatmaitan, Arias, 1995; Keppler et al., 1995; Muller, Jansen, 1998; Boyer, Nathanson, 1999). ?екрецію цих компонентів жовчі здійснюють з затратами енергії АТФ транспортні системи синусоідальної та каналікулярної плазматичних мембран гепатоцитів (Масюк, 1996).

Жовчоутворення здійснюється постійно і регулюється нервовою і гуморальною системами, причому важлива роль в регуляції належить інкреторній функції підшлункової залози (Лященко, 1988; Масюк, 1991; 1996; Nathanson, Boyer, 1991; Boyer, Nathanson, 1999). Відомо також, що інсулін стимулює жовчоутворення, збільшуючи об’єм секретованої жовчі та змінюючи її якісний склад (Масюк, 1991). Однак, дані літератури відносно якісних змін жовчі під впливом інсуліну суперечливі. Механізми інсулінової гіперсекреції жовчі також не встановлені. Відомо, що гепатоцити мають специфічні рецептори до інсуліну, однак через них здійснюється не лише і не стільки регуляція жовчоутворення, скільки регуляція цукрообмінної функції печінки. Розмежувати метаболічні процеси, що перебігають в гепатоцитах і визначити роль внутрішньоклітинних посередників цих процесів при здійсненні печінкою цукрообмінної і жовчоутворювальної функцій досі не вдалось.

Незважаючи на те, що переважна більшість біологічних ефектів глюкагону пов’язана з печінкою, його вплив на жовчосекреторну функцію досліджений недостатньо. Більшість авторів вважають, що глюкагону притаманна холеретична дія на печінкову паренхіму, оскільки під його впливом на фоні гіперсекреції жовчі збільшується абсолютний вміст органічних і мінеральних речовин (Branum et al., 1991; Hamada et al., 1995; Solomon et al., 1996). Дані літератури суперечливі відносно впливів глюкагону на секрецію ліпідів (Branum et al., 1990; Теруо Накамура, 1996), а також білків жовчі ( Lenzen et al., 1990; 1995). Щодо впливів гормону на холерез більшість авторів вважає, що глюкагон змінює рівень каналікулярної секреції жовчі (Romanski, 1995), прямо співдіючи з гепатоцитами. При цьому вуглеводообмінні і холеретичні ефекти цього гормону можуть перебігати незалежно один від одного і забезпечуються різними механізмами (Lenzen, 1997).

Про механізми впливу гормонів підшлункової залози на жовчотворний процес можна судити за характером змін секреції і екскреції основних органічних (жовчні кислоти, ліпіди, білки, пігменти) і неорганічних (кальцій, мінеральний фосфор) компонентів жовчі. Наша робота присвячується з’ясуванню механізмів впливу цих гормонів на холерез у собак з хронічними холецисто-дуоденальними фістульними трубками за умов цілісного організму. Відомості про зміни якісного складу жовчі, особливо, про перерозподіл вільних і кон’югованих жовчних кислот в їх спектрі, викликані інсуліном і глюкагоном, допоможуть розширити і поглибити наші уявлення про взаємодію цих гормонів з гепатоцитами і визначити їх регулюючу роль стосовно жовчоутворювальної функції печінки.

Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертаційна робота виконана в рамках науково-дослідних тем “Изучить влияние гипоталамических механизмов и миндалевидных ядер мозга на моторную функцию пищеварительного тракта и секреторную деятельность печени при изменении гормонального статуса организма и функционального состояния центральной нервной системы”, № держреєстрації 81005026; “Вивчити нервово-гуморальну регуляцію проміжного обміну жовчних кислот і пігментів” № держреєстрації 0193U004316; “Дослідити функціональні взаємостосунки тироксину і деяких пептидів в регуляції секреторної функції травних залоз, електрогенезу і механічної активності гладеньких м’язів шлунково-кишкового тракту” № держреєстрації 0194U017665.

Мета і задачі дослідження – дослідити вплив інсуліну і глюкагону на жовчоутворювальну функцію печінки у собак за умов цілісного організму. Для досягнення поставленої мети вирішували такі завдання:

дослідити спонтанну секрецію і якісний склад жовчі у голодних собак;

з’ясувати вплив інсуліну і глюкагону на об’ємну швидкість жовчоутворення і хімічний склад жовчі у собак з інтактною активністю М-холінергічної нервової системи;

вивчити вплив інсуліну і глюкагону на рівень холерезу і якісний склад жовчі за умов пригніченої активності М-холінергічної нервової системи у собак;

дослідити спільну дію інсуліну і глюкози на рівень жовчоутворення і хімічний склад жовчі;

дослідити вплив інсуліну і глюкагону на зміни спектра жовчних кислот в жовчі, викликані гормонами.

Об’єкт дослідження – гуморальна регуляція жовчоутворювальної функції печінки у собак.

Предмет дослідження - вплив інсуліну і глюкагону на секреторну функцію печінки.

Методи дослідження - хронічні спроби на собаках з холецисто-дуоденальними фістульними трубками при обтурованій загальній жовчній протоці, біохімічні методи визначення в жовчі концентрації жовчних кислот, холестерину, загального білка, білірубіну, неорганічного фосфору і кальцію, модифікованим нами методом тонкошарової хроматографії визначали спектр жовчних кислот в секреті.

Наукова новизна одержаних результатів. Вперше в динаміці вивчена секреція жовчі, жовчних кислот, холестерину, загального білка, неорганічного фосфору і кальцію, екскреція білірубіну під дією інсуліну і глюкагону на рівні цілісного організму. Встановлено, що гіперхолеретичний ефект інсуліну частково реалізується через викликану ним гіпоглікемію і пов’язаним з нею підвищенням функціональної активності М – холінергічної нервової системи, яка є для печінки секреторною. Вперше досліджені зміни спектра жовчних кислот (вільних і кон’югованих) за умов спонтанної секреції жовчі та при її стимуляції гормонами підшлункової залози у собак. Показано, що для реалізації адекватних холеретичних ефектів інсуліну і глюкагону необхідна нормальна функціональна активність М-холінергічної нервової системи. Встановлено, що в механізмах впливу інсуліну на жовчоутворення певну роль відіграє викликана гормоном гіпоглікемія, котра в свою чергу підвищує активність центрів блукаючих нервів і, як наслідок, відбувається збільшення інтенсивності холерезу при певних змінах хімічного складу жовчі. Встановлено, що регуляція жовчоутворення гормонами підшлункової залози в цілісному організмі здійснюється на рівні метаболічних процесів, які забезпечують синтез і активний транспорт органічних компонентів жовчі, зокрема, жовчних кислот і білка, і, як наслідок, пасивне надходження води у жовчні каналікули.

Практичне значення одержаних результатів. Встановлені закономірності змін секреторної активності печінки під дією інсуліну і глюкагону поглиблюють і розширюють наші знання про механізми нейро-гормональної регуляції жовчоутворення, що набуває особливого інтересу в зв’язку з ростом числа захворювань на цукровий діабет в світі і супутнім порушенням жовчоутворювальної функції печінки у цих хворих. Дані про вплив гормонів підшлункової залози на секреторну функцію печінки мають практичне значення в зв’язку з їх широким застосуванням в медичній практиці.

Особистий внесок здобувача полягає в здійсненні інформаційного пошуку та критичній оцінці наявної літератури за темою дослідження, у самостійному виконанні експериментальної частини роботи, аналізі одержаних результатів і їх узагальненні. Загальна мета і основні завдання роботи сформульовані за участю наукового керівника. Здобувач є співавтором модифікації метода визначення жовчних кислот в біологічних рідинах, захищеної авторським свідоцтвом.

Апробація результатів дисертації. Матеріали дисертації були викладені і обговорені на 12-й Всесоюзній конференції по фізіології і патології кортиковісцеральних взаємовідношень, присвяченій 100-річчю від дня народження академіка К.М.Бикова (Ленінград, 1986), на Всесоюзній науковій конференції “Нейрогуморальні механізми регуляції вісцеральних органів і систем” (Томськ, 1989), на науковому засіданні кафедри нормальної фізіології Українського державного медичного університету імені О.О.Богомольця (Київ, 1996), на науковій конференції НДІ фізіології імені академіка Петра Богача Київського університету імені Тараса Шевченка (Київ, 1997); на ХV з’їзді Українського фізіологічного товариства (Донецьк, 1998), на всеукраїнській науковій конференції “Проблеми вікової фізіології” (Луцьк, 1998); на конференції професорсько-викладацького складу Київського національного університету імені Тараса Шевченка (Київ, 1999).

Публікації. За матеріалами дисертації опубліковано 2 наукові статті, 3 тези доповідей і 1 авторське свідоцтво.

Структура дисертації. Робота складається з вступу, огляду літератури, загальної методики і основних методів дослідження, результатів дослідження та їх обговорення, узагальнення результатів дослідження, висновків, списку використаних джерел літератури, який складається з 59 вітчизняних та 179 іноземних публікацій. Основний текст викладено на 111 сторінках машинопису. Роботу ілюстровано 23 малюнками та 4 таблицями.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Матеріали і методи досліджень.

Дослідження проведені на 7 дорослих безпородних собаках в умовах хронічного експерименту. Всього проведено 164 досліди, в яких біохімічно досліджено 1148 проб жовчі.

В наших дослідженнях використовувалась У-подібна комбінована холецисто-дуоденальна фістульна трубка ( П.С.Лященко, 1975), зконструйована за принципом спеціальної металевої канюлі, яка була запропонована О.М.Бакурадзе (1941) для вивчення панкреатичної секреції у собак. Модифікована методика одержання фістульних собак є більш досконалою в порівнянні з раніше запропонованими і придатною для вивчення жовчної секреції у цих тварин і полягає в наступному. Пошаровий розріз черевної стінки довжиною 7-9 см проводиться паралельно білій лінії на 1-1,5 см праворуч від неї і відступаючи на 1-1,5 см від мечеподібного хряща. В рану підтягується дванадцятипала кишка разом з підшлунковою залозою, загальна жовчна протока, що знаходиться у товщині гепато-дуоденальної зв’язки, вивільнюється від оточуючих тканин, двічі перев’язується шовком (№6), між лігатурами видаляється шматочок протоки довжиною 0,3-0,5 см, щоб уникнути його відновлення після операції, що деякі автори спостерігали після звичайної перев’язки загальної жовчної протоки у собак і інших лабораторних тварин через різні проміжки часу після оперативного втручання. Перев’язка і навіть перерізка загальної жовчної протоки не виключає можливості її відновлення, оскільки тканинам вивідних проток залоз характерна значна здатність до регенерації. З цього приводу І.П.Павлов писав: “ Ні перев’язка, ні проста перерізка ductus choledochus не гарантують непрохідність цієї протоки на більш тривалий час” (І.П.Павлов. Повн.зб.тв., т.11, кн.2, М., 1951, с.581).

Після обтурації загальної жовчної протоки на стінку жовчного міхура накладається кисетний шов, відсмоктується жовч і вшивається фланець бокового відростка фістульної трубки. Фланець корпусу фістульної трубки після введення в його канал позадослідного вкладиша з гумовим клапаном вшивається в дванадцятипалу кишку на 2-3 см дистальніше Фатерова соска. Рана черевної стінки закривається багатоповерховим швом. Вивід фістульної трубки фіксується у передньому кутку рани або трохи праворуч в спеціально зробленому у черевній стінці отворі, що залежить від ширини грудної клітки тварини.

Модифікована П.С.Лященко методика одержання фістульних собак є більш досконалою в порівнянні з запропонованими раніше і придатною для вивчення жовчної секреції у собак. Вона передбачає такі можливості:

а) вирізання між двома лігатурами шматочка (0,3-0,5 см) загальної жовчної протоки виключає надходження жовчі в кишку природним шляхом і забезпечує повний облік кількості виробленої печінкою чистої жовчі;

б) наявність фістул жовчного міхура і дванадцятипалої кишки, сполучених між собою внутрішнім анастомозом, по якому жовч поза дослідом надходить в кишку, виключає порушення травлення та жовчоутворення, які неминуче виникають при хронічній втраті жовчі;

в) наявність в сполучній трубці гумового клапана забезпечує проходження жовчі і слизу в напрямку кишківника і запобігає рефлюксу хімусу в жовчний міхур при підвищенні тиску в дванадцятипалій кишці, попереджує запальні процеси печінки, жовчного міхура і протоків;

г) використання комбінованих фістульних трубок має переваги в порівнянні з металевими й пластиковими: вони більш легкі і не викликають некрозу тканин, що запобігає випадінню трубки при вільному русі тварини; крім того, плексигласові трубки менше подразнюють слизову оболонку жовчного міхура і кишки;

д) достатньо довгий вивід фістульної трубки позбавляє експериментатора від вибору для операцій тільки широкогрудих собак. Однак, цей метод не дозволяє вивчати закономірності виходу жовчі в дванадцятипалу кишку через дистальну частину загальної жовчної протоки, що, правда, не входило в задачі наших досліджень.

Всі операції виконані з дотриманням умов асептики й антисептики під нембуталовим наркозом (30-40 мг\кг маси тварини внутрішньочеревно). Післяопераційний період проходив нормально. Досліди починали проводити через 3 тиждні після оперативного втручання.

Нормальний стан оперованих нами тварин і відсутність при розтині патологоанатомічних змін в печінці й інших внутрішніх органах дозволяють вважати, що ця методика цілком придатна для тривалого вивчення жовчоутворювальної функції печінки у собак за умов хронічного експерименту.

Відмітимо, що в наших дослідженнях впливів гормонів підшлункової залози на жовчоутворювальну функцію у собак концентраційна діяльність жовчного міхура не могла суттєво змінювати хімічний склад жовчі, оскільки остання в ньому практично не затримувалась, а виливалась через фістулу у жовчоприймач.

Враховуючи, що інтенсивність секреції жовчі певною мірою відображує добовий ритм обміну речовин, всі досліди проводили на голодних (18-20 годин після годівлі) безпородних собаках в один і той же час доби, тобто з 10 до 14 години, що запобігало можливим похибкам в оцінці отримуваних результатів, пов’язаним із впливом добового метаболічного ритму на холерез. У дослідах враховували об’єм жовчі за кожні 30 хв впродовж 4 годин секреції. В кожному досліді спочатку, впродовж однієї години, збирали жовч до введення гормонів підшлункової залози (фон), після чого вводили певний гормон і збирали жовч для дослідження впродовж ще трьох годин. Фон дозволяв оцінювати функціональний стан печінки в день досліду. У кожній півгодинній пробі жовчі визначали вміст вільних та кон’югованих жовчних кислот, холестерину, білірубіну, неорганічного фосфору і кальцію. Дебіт складових частин жовчі визначали множенням кількості речовини в одиниці об’єму на весь об’єм отриманої проби секрету. Контролем слугували досліди, в яких у собак вивчалась секреція жовчі за цими ж показниками без застосування гормонів. Кількість і хімічний склад експериментальної жовчі порівнювали з такими контрольних спроб. Різниця в показниках рівня холерезу і якості жовчі дозволяла певним чином судити про холеретичний ефект гормонів. В одній серії дослідів застосовували глюкагон (Glucagon Novo Nordisk A\S, Denmark) у дозі 0,05 мг\кг маси тіла собак. В другій серії дослідів застосовували інсулін (Insulin S.N.C. Berlin- Chemie AG) в дозах 0,5 і 1,0 ОД\кг маси тварини, що становить відповідно 0,023 і 0,045 мг\кг. Інсулін вводили підшкірно, а глюкагон внутрішньовенно один раз за дослід об 11 год. 00 хв. Інсулін для ін’єкцій здійснює швидкий і відносно не тривалий гіпоглікемічний ефект: його дія починається через 15-30 хвилин після ін’єкції; максимальна дія припадає на 2-4 години; загальна тривалість дії до 6 годин, тобто всі ефекти інсуліну реалізувались впродовж чотирьох годин експерименту. Тимчасовий дефіцит інсуліну створювали внутрішньовенними ін’єкціями глюкози – 400 мг\кг маси тварини в гіпертонічному 40%-му розчині. Впливи парасимпатичної нервової системи, яка стимулює жовчоутворення, пригнічували атропіном, який вводили підшкірно у вигляді 0,1%-го розчину в дозі 0,001 г за 30 хвилин до ін’єкції інсуліну.

В кожній відібраній півгодинній порції жовчі за допомогою мікрофотометрії визначали сумарний вміст жовчних кислот за методом Л.М.Кульберг і М.Є.Маляревської (1951); хроматографічний розподіл вільних та кон’югованих жовчних кислот з подальшою кількісною оцінкою вмісту кожної жовчної кислоти проводили на стандартних пластинах “Silufol” за розробленим нами методом, який значно підвищив точність і чутливість способу. Метод включає екстрагування жовчних кислот з жовчі при зниженних температурах сумішшю етанолу з ацетоном (1:3), хроматографічний розподіл в гомогенній загальній системі розчинника для вільних і кон’югованих жовчних кислот, яка складається з амілового ефіру оцтової кислоти, толуолу, бутанолу, oцтової кислоти і води (3:1:1:3:1). Кількісна денситометрична оцінка вмісту жовчних кислот здійснюється після фарбування хроматограм комплексним барвником, який містить 15 мл льодяної оцтової кислоти, 1г фосфорномолібденової кислоти, 1 мл концентрованої сірчаної кислоти і 5 мл 50%-го водного розчину трихлороцтової кислоти. Крім того, в кожній півгодинній порції жовчі мікрофотометрично визначали: холестерин – за методом М.А.Левченко (1955) і В.П.Мирошниченко з співавт.(1978), неорганічний фосфор – за модефікованим методом Делорі, білірубін – за методом Хійманс ван-ден Берга.

Визначення білірубіну полягало в слідуючому. До 1 мл жовчі додавали 4 мл етилового спирту для осадження білку. Суміш центрифугували, після чого надосадову рідину зливали. До осаду додавали 0,25 мл діазореактиву Ерліха і перемішували. Діазореактив складається з двох розчинів, які з’єднували кожного разу перед початком досліджень: розчин А – 1 г сульфанилової кислоти С6Н4[NH2]SO3H·2H2O і 15 мл хлористоводневої кислоти (питомої ваги 1,125) розчиняли в 1 л дистильованої води. Розчин Б – 0,5% розчин азотнокислого натрію NaNO2. Перед визначенням готували суміш: до 8 мл реактиву А додавали 0,25 мл реактиву Б. Кількісне визначення білірубіну проводили за допомогою фотоелектроколориметру ФЕК-56, а також фотоколориметру-нефелометру ЛМФ-69, стандартизуючи їх показання за допомогою чистого кристалічного білірубіну (з цією метою складалась спеціальна калібровочна крива). Приготування стандарту проводили таким чином: на аналітичних терезах важили 5 мг білірубіну і розчиняли його в 100 мл хлороформу. 1 мл такого розчину містить 0,05 мг білірубіну. Це – розчин А, з якого готували робочий розчин Б, для чого 1 мл розчину А доливали до 5 мл хлороформом. Такий розчин містить в 1 мл 0,01 мг білірубіну. При побудові калібровочної кривої для колориметрії на ФЕК-56 в ряд пробірок відливали різну кількість робочого розчину Б (1, 2, 3 мл і т.д. в залежності від того скільки точок потрібно було одержати на кривій). На водяній бані випаровували хлороформ досуха (температура кипіння хлороформу 61,2° С). Після цього осад білірубіну знову розчиняли в однаковій кількості хлороформу, перемішували, додавали 3 мл 96° спирту і 0,5 мл діазореактиву. В залежності від кількості білірубіну в пробірках з’являлось забарвлення різної інтенсивності. Колір пробірок визначали в ФЕК і відмічали відповідні точки на міліметровому папері. В подальшому визначали кількість білірубіну по цьому графіку.

Білок в жовчі визначали за методом Лоурі, який полягає в слідуючому. До 0,4 мл досліджуваного розчину (0,01 мл жовчі + 0,38 мл дистильованої води) додавали 2 мл робочого розчину, який складається з реактиву 1 ( 1 мл 0,5%-ного розчину CuSO4·5H2O в 1%-ному розчині цитрату натрію) і реактиву 2 (50 мл 2%-ного розчину Na2CO3 в 0,1 Н розчині NaOH). Робочий розчин готували в день визначення. Досліджуваний розчин залишали при кімнатній температурі на 10 хвилин, після чого додавали 0,2 мл розчину Фоміна-Чокальтеу. Вміст пробірки ретельно перемішували і через 30 хвилин колориметрували при довжині хвилі 750 нм на фотометрі КФК-3. Чутливість метода – 10 – 100 мкг білка в пробі.

Концентрацію сумарних жовчних кислот, холестерину, і неорганічного фосфору в жовчі визначали за допомогою специфічних кольорових реакцій, використовуючи при цьому фотоелектроколориметри ФЕК-56 і АІ-ЕЦ2-С, фотоколориметр-нефелометр ЛМФ-69 та спектрофотометр СФ-46. Відлік сумарної кількості жовчних кислот (за холевою кислотою), холестерину (за чистим холестерином), і неорганічного фосфору (за фосфорнокислим калієм) проводили за калібровочними кривими, накресленими з цією метою. Абсолютний вміст досліджуваних нами компонентів жовчі визначали математично, множачи їх кількість в одиниці об’єму на величину півгодинної порції секрету. Кількість жовчі та абсолютний вміст її складових компонентів перераховані на 1 кг маси тварини, що дозволило обробляти статистично дані, одержані в дослідах на собаках з різною масою тіла.

Фактичний матеріал оброблено методом варіаційної статистики з урахуванням критерію t Стьюдента (Венчиков А.И., Венчиков В.А., 1974). Достовірними вважалися відмінності між контролем і дослідом при р<0,05.

Одержанні в дослідах данні представлені у вигляді таблиць і графіків, які показують зміни жовчної секреції по групі тварин. В деяких випадках індивідуальні особливості жовчоутворювального процесу коментуються окремо.

Необхідно відмітити, що експериментальна частина нашої роботи виконана на здорових тваринах. Використана нами методика дозволяла одержувати жовч в чистому вигляді і в необхідний час досліду, точно визначати кількість виробленого печінкою секрету при нормальній діяльності всього шлунково-кишкового тракту, тобто проведені нами дослідження цілком відповідають основним вимогам об’єктивного вивчення функцій травних залоз, які в свій час були чітко сформульовані засновником синтетичної фізіології І.П.Павловим.

Результати дослідження та їх обговорення.

Наші дослідження показали, що рівень спонтанної натщесерце секреції жовчі у собак впродовж чотирьох годин досліду знижується, причому одночасно спостерігається зменшення виділення з жовчю жовчних кислот (вільних і кон’югованих), холестерину, білірубіну, кальцію та неорганічного фосфору. Поступове зниження як секреції самої жовчі, так і її складових інгредієнтів було статистично вірогідним (р<0,01, р<0,001). Отже, з перебігом контрольних дослідів знижується функціональний рівень гепатоцитів, що ми пов’язуємо з відсутністю регулюючих впливів на них жовчних кислот, значна частина яких вилучається з ентеро-гепатичного циклу при заборі проб жовчі під час досліду (Рис.1).

Рис.1. Динаміка спонтанної секреції жовчі у собак в період досліду (M±m; n=31). Примітка.** - p < 0,01 відносно першої проби

Наші досліди показали, що інсулін стимулює печінкову секрецію, що відображується як на рівні секреції жовчі, так і на її якісному складі, причому холеретичний вплив гормону був дозозалежним – в дозі 1 од\кг цей гормон стимулював жовчоутворення більш істотно, ніж в дозі 0,5 од\кг. Підвищення жовчоутворення під впливом інсуліну спостерігалось впродовж всього досліду, але максимальним гіперхолеретичний ефект гормону був через годину після його підшкірного введення. Так, в дозі 0,5 од\кг інсулін збільшував секрецію жовчі через годину після введення на 67%, а в дозі 1 од\кг в цей же проміжок часу секреція зросла на 167% (р<0,001; Рис.2).

Рис.2. Вплив різних доз інсуліну на динаміку жовчоутворення у собак (M±m; n=37). Примітки: * - p < 0,05; ** - p< 0,01; *** - p < 0,001 порівняно з спонтанною секрецією.

Дозозалежними були й зміни якісного складу жовчі під дією цього чинника, тобто в дозі 1 од\кг цей гормон більш істотно стимулював секрецію з жовчю солей жовчних кислот, кальцію і неорганічного фосфору, ніж в дозі 0,5 од\кг.

Окреме місце в змінах якісного складу жовчі під впливом інсуліну посідає секреція білка з жовчю, яка виявилась також дозозалежною. Якщо в дозі 0,5 од\кг цей гормон стимулював цю секрецію, то в дозі 1 од\кг – зменшував її. Оскільки синтез і секреція білка з жовчю є процес енергозалежний, а дія інсуліну на жовчоутворення опосередковується викликаною ним гіпоглікемією, ми припускаємо, що секреція білка з жовчю більше, ніж решта досліджуваних нами компонентів жовчі залежить від рівня глікемії і гальмується при значному зменшенні рівня глюкози в крові.

Застосування інсуліну в більших дозах (1,5 од\кг) у голодних собак викликало різке зниження концентрації глюкози в крові і гіпоглікемічну кому, що супроводжувалось значним зменшенням і навіть повним припиненням жовчоутворення. Цей важливий факт доводить, що дія інсуліну на процес жовчоутворення опосередковується викликаною інсуліном гіпоглікемією і пов’язаним з нею підвищенням тонусу ядер блукаючих нервів, котрі є для печінки секреторними.

В складі сумарних холатів жовчі інсулін змінив секрецію як таурохолатів, які становлять більшу частину сумарних холатів, так і вільних жовчних кислот. Наші досліди показали, що інсулін в дозі 0,5 од\кг підвищував секрецію таурохолатів холевої і диоксихоланових кислот, однак майже не змінював співвідношення між ними. В цій же дозі інсулін збільшував і секрецію вільних жовчних кислот з жовчю, що відобразилось на секреції як холевої кислоти, так і диоксихоланових кислот. Однак, секреція вільної холевої кислоти проходила інтенсивніше під впливом цього гормону, ніж секреція диоксихоланових кислот. Якщо зважити, що холева кислота є первинною, збільшення її секреції під дією інсуліну може свідчити про вплив цього гормону саме на біосинтез жовчних кислот в гепатоцитах. Про це ж свідчить і той факт, що інсулін більшою мірою стимулює секрецію вільних жовчних кислот, ніж таурокон’югатів.

Для з’ясування ролі парасимпатичної М-холінергічної нервової системи в реалізації гіперсекреторних впливів інсуліну на жовчоутворення ми дослідили вплив цього гормону на секреторну функцію печінки у попередньо атропінізованих собак. Наші досліди показали, що окремо введений інсулін в дозі 1 од\кг підвищує секрецію жовчі впродовж всього досліду, тоді як введений на фоні дії атропіну цей гормон збільшує секрецію жовчі лише в останню годину досліду, через дві з половиною години після введення атропіну, коли блокатор частково інактивується, а дія інсуліну ще продовжується. Крім змін динаміки жовчоутворення у атропінізованих собак спостерігались аналогічні зміни її якісного складу, що відобразилось на секреції з жовчю сумарних холатів і кальцію. Наші дані свідчать, що атропінізація значно зменшує стимулюючий вплив інсуліну на жовчоутворення за рахунок блокади М-холінергічної парасимпатичної нервової системи, нормальна активність якої необхідна для реалізації стимулюючих впливів інсуліну на секрецію жовчі. Якщо зважити, що рівень активності М-холінергічної парасимпатичної нервової системи залежить від рівня глікемії, можна припустити, що вплив інсуліну на жовчоутворення опосередковується викликаною цим гормоном гіпоглікемією і підвищенням тонусу ядер блукаючих нервів (Рис.3).

Рис.3. Вплив інсуліну на рівень жовчоутворення у атропінізованих собак (M±m; n=12). Примітки: * - p < 0,05; ** - p< 0,01; *** - p < 0,001 порівняно з контролем.

Для з’ясування ролі глікемії в реалізації гіперсекреторних ефектів інсуліну на печінку ми провели серію експериментів , в яких дослідили спільну дію інсуліну і глюкози на жовчосекреторний процес. Результати наших дослідів свідчать, що внутрішньовенне введення гіпертонічного розчину глюкози на фоні дії екзогенного інсуліну короткочасно зменшує гіперхолеретичний ефект цього гормону, який через півгодини відновлюється і посилюється, що, на нашу думку, викликано спільним впливом екзогенного і ендогенного інсуліну, який секретується у відповідь на викликану гіперглікемію. При порівнянні спільної дії інсуліну і глюкози не з рівнем спонтанної секреції жовчі, а з секрецією під впливом окремо введеного інсуліну на динаміку жовчоутворення з’ясувалось, що гіперглікемія гальмує секрецію жовчі впродовж 2,5 годин секреції (Рис.4). Спільна дія екзогенного інсуліну і глюкози викликала також аналогічні зміни секреції сумарних холатів і кальцію з жовчю. Приймаючи до уваги те, що під впливом інсуліну в гепатоцитах здійснюються численні специфічні метаболічні реакції, пов'яз’ні з обміном вуглеводів, білків та жирів, цілком можливо, що вплив цього гормону на жовчоутворення запускається викликаною ним гіпоглікемією і підвищенням тонусу ядер блукаючих нервів, а далі підтримується специфічними внутрішньоклітинними механізмами, які стимулюються гормон-рецепторною взаємодією.

Рис.4. Вплив спільної дії інсуліну (0,5 од\кг) і глюкози на рівень жовчоутворення у собак (M±m; n=8). Примітки: * - p < 0,05; ** - p< 0,01; *** - p < 0,001 порівняно з контролем.

Глюкагон, що був введений внутрішньовенно в дозі 0,05 мг\кг, стимулював процес жовчоутворення, що відобразилось як на рівні секреції, так і на якісному складі жовчі. У тварин з нормальною активністю парасимпатичної нервової системи глюкагон збільшував кількість секретованої жовчі впродовж всього досліду, однак максимальна глюкагонова гіперсекреція жовчі тривала годину і розпочиналась з другої півгодини досліду після введення гормону (Табл.1).

Таблиця 1.

Вплив глюкагону (0,05 мг\кг) на динаміку жовчоутворення та секрецію жовчних кислот і холестерину з жовчю у собак (M±m).

Примітка. Глюкагон введено внутрішньовенно в дозі 0,05 мг\кг об 11.00.

На фоні гіперсекреції жовчі і збільшення в ній абсолютного вмісту холатів дебіт холестерину в цьому секреті майже не змінювався і була помітна лише тенденція до зменшення цього показника під впливом глюкагону впродовж досліду. Зазначені зміни абсолютного вмісту холестерину в жовчі собак після глюкагонового навантаження виявилися не істотними (р > 0,05).

Наші досліди показали, що глюкагон в дозі 0,05 мг\кг стимулював секрецію сумарних холатів жовчі, причому найвищий гіперсекреторний ефект спостерігався вже через півгодини після введення гормону і тривав впродовж години, тобто проявлявся на півгодини раніше, ніж вплив глюкагону на рівень секреції самої жовчі. За допомогою тонкошарової хроматографії ми з’ясували, що глюкагон стимулював секрецію і таурохолатів, і вільних жовчних кислот жовчі. При абсолютному збільшенні секреції всіх жовчних кислот, і кон’югованих, і вільних, співвідношення між ними лишалось постійним. Але в складі вільних жовчних кислот збільшення секреції останніх відбувалось переважно за рахунок диоксихоланових кислот, секреція яких зростала інтенсивніше, ніж вільної холевої кислоти, що свідчить про активацію глюкагоном переважно тих ферментів, котрі забезпечують біосинтез і секрецію саме диоксихоланових кислот жовчі.

Зміни секреції білків жовчі під впливом глюкагону відбувались синхронно змінам секреції жовчних кислот, тобто стимуляція їх секреції спостерігалась одразу ж після введення гормону з першої півгодини досліду, максимум гіперсекреції тривав годину, далі секреція поступово зменшувалась, але до кінця експерименту залишалась вищою за контрольні показники.

Секрецію кислотонезалежної фракції жовчі, окрім секреції її білків, характеризує секреція неорганічних іонів, яку ми вивчали на прикладі секреції кальцію і неорганічного фосфору. Глюкагон викликав зростання секреції кальцію, яка була підвищеною впродовж всього досліду, але починаючи з другої півгодини після введення гормону. Аналогічні зміни під впливом цього гормону відбулись і з секрецією неорганічного фосфору (Табл.2).

Таблиця 2.

Вплив глюкагону (0,05 мг\кг) на секрецію кальцію і неорганічного фосфору та екскрецію білірубіну з жовчю у собак (M±m).

Примітка: Глюкагон введено внутрішньовенно в дозі 0,05 мг\кг об 11.00.

У попередньо атропінізованих собак глюкагон не проявляв гіперсекреторного ефекту, що відобразилось як на рівні секреції жовчі (Рис.5), так і на секреції сумарних солей жовчних кислот, кальцію і неорганічного фосфору. Секреція холестерину, хоча і не збільшувалась під впливом гормону у інтактних тварин, у атропінізованих була істотно меншою від спонтанної секреції. І тільки екскреція білірубіну дещо зросла під впливом глюкагону у атропінізованих собак. Описані зміни секреції жовчі і її складових компонентів у атропінізованих собак свідчать про необхідність інтактної холінергічної парасимпатичної нервової системи для прояву гіперхолеретичних ефектів глюкагону.

Рис. 5. Вплив глюкагону на рівень жовчоутворення у атропінізованих собак (M±m; n=14). Примітки: * - p < 0,05; ** - p< 0,01 порівняно з контролем.

В И С Н О В К И

Гормони підшлункової залози інсулін і глюкагон беруть участь в регуляції жовчоутворювальної функції печінки.

Інсулін стимулює жовчоутворювальну функцію печінки, підвищуючи рівень холерезу і збільшуючи вміст складових інгредієнтів в жовчі. Ступінь вираженості гіперхолеретичного впливу гормону прямо залежить від дози останнього.

Інсулін та глюкагон не змінюють співвідношення між таурохолатами і вільними жовчними кислотами в спектрі жовчних кислот жовчі при значному збільшенні абсолютної кількості як таурохолатів, так і некон’югованих жовчних кислот.

Для прояву гіперхолеретичних ефектів інсуліну та глюкагону необхідна інтактна холінергічна нервова система. При її блокаді атропіном такі ефекти гормонів менше виражені або зовсім не проявляються.

Гормони інсулін і глюкагон є справжніми холеретиками, оскільки вони стимулюють жовчоутворення за рахунок збільшення як кислотозалежної, так і кислотонезалежної фракцій жовчі.

Рівень глюкози в крові впливає на холеретичні ефекти інсуліну, як і активність М-холінергічної нервової системи.

Збільшення вмісту жовчних кислот і загального білка в жовчі є доказом, що інсулін і глюкагон стимулюють в печінці специфічні метаболічні процеси, котрі визначають рівень секреції і якісний склад жовчі.

СПИСОК РОБІТ, ЩО ОПУБЛІКОВАНІ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

І.Лук’яненко, П.Лященко, В.Шевчук. Вплив глюкагону на секрецію таурохолатів жовчі у собак // Науковий вісник ВДУ. Журнал Волинського державного університету ім.Лесі Українки. Біологічні науки.- 1999.- №4.- С.85-88.

І.А.Лук’яненко. Вплив глюкагону на жовчоутворювальну функцію у собак // Проблеми регуляції фізіологічних функцій. Вісник Київського університету імені Тараса Шевченка.- 1999.- Вип.4.- С. 22-26.

І.А.Лук’яненко, Т.Г.Каревіна. Жовчоутворення у собак під дією глюкагону і інсуліну // Фізіологічний журнал.- 1998.- Том 44, № 3.- С.168.

Лук’яненко І., Гушинець Г., Місан В. Вплив глюкагону на жовчоутворювальну функцію печінки у собак // Матеріали Всеукраїнської наукової конференції “Проблеми вікової фізіології”.- Луцьк.- 1998.- С. 42.

И.А.Лукьяненко, П.С.Лященко Т.Г.Каревина, В.Г.Шевчук. Холерез у собак под влиянием инсулина и глюкагона // Труды конференции ученых России и стран СНГ, Томск.- 1997.- С.140-141.

Весельский С.П., Лященко П.С., Лукьяненко И.А. Способ определения желчных кислот в биологической жидкости. Авторское свидетельство SU 1624322 А1.- 1991.- бюл.4.

АННОТАЦИЯ

Лукьяненко И.А. Влияние инсулина и глюкагона на секреторную функцию печени. Рукопись диссертации на соискание ученого звания кандидата биологических наук. Специальность 03.00.13 – физиология человека и животных. Киевский национальный университет имени Тараса Шевченко. Киев, 2001.

Изучено влияние инсулина и глюкагона на секрецию желчи и ее основные ингредиенты у собак с холецисто-дуоденальными фистульными трубками в условиях хронического эксперимента. Инсулин вводили животным подкожно в дозе 0,5 или 1,0 ед\кг, что соответствует 0,023 и 0,045 мг\кг, однократно в течение опыта, глюкагон – в дозе 0,05 мг\кг внутривенно. Показано, что инсулин стимулирует желчеобразование, повышая секрецию желчи и изменяя ее качественный состав. Повышение секреции желчи под влиянием инсулина носило дозозависимый характер – в дозе 1 ед\кг этот гормон стимулировал желчеобразование более существенно, чем в дозе 0,5 ед\кг, что отразилось на количестве секретируемой желчи и на секреции суммарных желчных кислот, белка, кальция и неорганического фосфора в ее составе. Повышая секрецию суммарных холатов желчи, инсулин не изменял соотношение между таурохолатами и свободными желчными кислотами в желчи собак. Применение инсулина в бoльших дозах (1,5 ед\кг) вызывало у голодных собак резкое снижение концентрации глюкозы в крови и сопровождалось значительным уменьшением и даже полным прекращением желчеобразования. Это свидетельствует, что действие инсулина на желчеобразование опосредуется вызванной инсулином гипогликемией и повышением активности ядер блуждающего нерва, который общепризнан для печени секреторным. Показано, что атропинизация животных значительно уменьшает стимулирующее влияние инсулина на желчеобразование за счет блокады М-холинергической парасимпатической нервной системы, нормальная активность которой необходима для реализации гиперхолеретических эффектов гормона. Внутривенное введение гипертонического раствора глюкозы на фоне действия экзогенного инсулина кратковременно снижает гиперхолеретический эффект гормона, который через полчаса восстанавливается и усиливается, что, очевидно, вызвано сочетанным влиянием экзогенного и эндогенного инсулина, который выделяется в ответ на поступление глюкозы.

У собак с нормальной активностью парасимпатической нервной системы глюкагон повышал количество секретируемой желчи в течение всего опыта, но максимальный гиперхолеретический эффект наблюдался в течение часа и проявлялся через полчаса после внутривенного введения гормона.

Глюкагон повышал содержание конъюгированных и свободных желчных кислот в желчи собак, но соотношение между ними оставалось постоянным, что свидетельствует о генерализованном влиянии гормона на биосинтез и транспорт желчных кислот в гепатоците. Секреция свободных желчных кислот возрастала преимущественно за счет диоксихолановых кислот, секреция свободной холевой кислоты под влиянием глюкагона возрастала менее существенно.

Под влиянием глюкагона произошли изменения в продукции кислотонезависимой фракции желчи, секрецию которой обуславливают белки и неорганические ионы. Глюкагон увеличил секрецию белка с желчью, а также секрецию кальция и неорганического фосфора у собак. Этот гормон не оказывал влияния на секрецию холестерина с желчью.

У предварительно атропинизированных собак глюкагон не проявлял гиперхолеретического влияния, что свидетельствует о необходимости нормальной активности М-холинергической парасимпатической нервной системы для реализации желчесекреторного влияния гормона на гепатоцит.

Ключевые слова: инсулин, глюкагон, желчеобразование, желчные кислоты.

ANNOTATION

Lukyanenko I.A. The influence of insulin and glucagon on the secretory function of liver.

The thesis for obtaining scientific degree of Candidate of Biological Sciences on speciality 03.00.13 – physiology of man and animals, Taras Shevchenko Kyiv University, Kyiv; 2001.

The thesis is devoted to investigation of mechanisms of hormonal regulation of bile formation. The effects of insulin and glucagon on choleresis and chemical composition of the bile was studied in mongrel dogs with chronic combined cholecystoduodenal fistulaes. Insulin was injected in doses 0,023