НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ

ІНСТИТУТ МОЛЕКУЛЯРНОЇ БІОЛОГІЇ І ГЕНЕТИКИ

Лівшиць Людмила Аврамівна

УДК 575.11+577.21+577.213.3+616.832-009.55

ПРИРОДА, ПОХОДЖЕННЯ ТА ШЛЯХИ РОЗПОВСЮДЖЕННЯ МУТАЦІЙ, ЩО СПРИЧИНЮЮТЬ МОНОГЕННІ СПАДКОВІ ЗАХВОРЮВАННЯ

03.00.26 - молекулярна генетика

Автореферат дисертації на здобуття наукового ступеня

доктора біологічних наук

КИЇВ - 2001

Дисертацією є рукопис.

Роботу виконано у відділі генетики людини Інституту молекулярної біології і генетики НАН України, м. Київ.

Науковий консультант: доктор медичних наук, професор Бариляк Ігор Романович, Інститут гігієни та медичної екології АМН України, м. Київ, директор Наукового центру медичної генетики

Офіційні опоненти: доктор біологічних наук Соломко Олександр Петрович, Інститут молекулярної біології і генетики НАН України, м. Київ, завідувач відділу біохімічної генетики; доктор медичних наук, професор Пілінська Марія Андріївна, Науковий центр радіаційної медицини АМН України, м. Київ, завідувач лабораторії цитогенетики; доктор біологічних наук, старший науковий співробітник Литошенко Олександр Якович, Інститут геронтології АМН України, м. Київ, керівник лабораторії молекулярної генетики.

Провідна установа: Київський національний університет ім. Тараса Шевченка, кафедра загальної та молекулярної генетики, м. Київ.

Захист дисертації відбудеться 24.04.2001 р. о 15 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.237.01 Інституту молекулярної біології і генетики НАН України за адресою: 03143, м. Київ-143, вул. академіка Заболотного, 150.

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Інституту молекулярної біології і генетики НАН України, 03143, м. Київ-143, вул. академіка Заболотного, 150.

Автореферат розіслано 22.03.2001 р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради

кандидат біологічних наук Підпала О.В.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Протягом останніх років під час інтенсивних спільних досліджень молекулярних біологів, генетиків та клініцистів було відкрито гени тяжких спадкових захворювань таких як: муковісцидоз (Kerem et al., 1989), спінальна м`язова атрофія (Lefebvre et al., 1995 рік), синдром Мартіна-Бела (Kremer et al., 1991), м'язова дистрофія Дюшена (France et al., 1985) та інші.

Відкриття цих генів та їх мутантних варіантів у хворих з різними клінічними проявами однієї спадкової патології, а також результати аналізу розповсюдженості мутантних генів у популяціях та етнічних групах висвітлили перед дослідниками нові питання, для вирішення яких в молекулярній генетиці людини почав формуватися новий науковий напрямок. Цей напрямок був присвячений дослідженням молекулярно-генетичної природи патогенезу спадкових захворювань та основних механізмів розповсюдження цих захворювань в популяціях та етнічних групах. Перші дослідження в цьому напрямку ми розпочали ще в 1987 році в рамках Всесоюзної програми "Геном человека". Пізніше дослідження проводились в рамках міжнародної програми "Human Genetic Diversity", започаткованої в 1992 р. Коваллі-Сфорца (Cavali-Sforza, 1992). Наша робота починалась в той період коли ще тільки формувалась стратегія дослідження природи та механізмів розповсюдження мутантних генів спадкових захворювань. Одним із принципових, розроблених нами підходів, було поєднання дослідження частоти та спектра мутацій цих генів в популяції та родинного аналізу зчеплення мутантних генів з алельними варіантами поліморфних послідовностей ДНК (ПДРФ, STR та VNTR). Завдяки цьому стало можливим дослідити і змоделювати процес походження і розповсюдження мажорних мутацій в популяціях України та провести безпосередню оцінку важливих генетичних чинників - селективного процесу і мутагенезу в геномі статевих клітин людини. Наступним методичним підходом стало поєднання ДНК-аналізу мутацій та клінічного обстеження хворих на моногенні спадкові захворювання: муковісцидоз, спінальну м`язову атрофію, синдром ламкої Х-хромосоми, м`язову дистрофію Дюшена для дослідження асоціації мутантного генотипу та характеру клінічних проявів у хворих. Зосередивши свої зусилля на дослідженні а) ролі гетерогенності геному в патогенезі спадкових захворювань, б) природі, походженні та механізмах розповсюдження мутантних генів у популяції, ми окреслили основні питання, вирішення яких і стало предметом даної роботи, а саме: який характер асоціації мутантного генотипу з комплексом клінічних проявів спадкових захворювань, яка роль ендогенних і екзогенних чинників, що модифікують клінічний фенотип. Також досліджувались загальні закономірності і роль окремих чинників (мутагенезу, міграції та селективних факторів) у процесі успадкування та розповсюдження в популяції мутантних генів спадкових захворювань.

Вирішення цих питань є принциповим для з'ясування молекулярно-генетичних основ спадкової патології, природи генетичної гетерогенності, а також для створення загальної теорії спадковості та мінливості у людини, і в підсумку, стане підґрунтям для розробки ефективних засобів діагностики, профілактики та лікування спадкових захворювань.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами.

Дисертаційна робота відповідає основному планові науково-дослідних робіт відділу генетики людини Інституту молекулярної біології і генетики НАН України; зокрема бюджетні теми: "Молекулярно-генетичний аналіз мутацій в генах, що призводять до розвитку тяжких спадкових захворювань людини в Україні" (№ держ. реєстрації UA01004707p); "Популяційно-генетичні дослідження мутацій в групах високого ризику тяжких спадкових патологій в Україні" (№ держ. реєстрації 0196U005251, 1996-2000 рр.).

Частково робота виконувалась в рамках отриманих на конкурсних засадах вітчизняних та міжнародних проектів: "Поліморфізм ДНК деяких локусів геному людини" (програма "Фонд фундаментальних досліджень" ДКНТ України, шифр 5.3/9, 1994-1995рр.); "Створення тест-систем для ДНК-дiагностики спадкових хвороб, поширених на Українi" (шифр 01.01.01/056-92, 1992-1995рр.) та "Використання молекулярно-генетичного аналiзу для дiагностики та розробки засобiв профiлактики найбiльш поширених спадкових захворювань серед населення рiзних регiонiв України" (державна програма "Захист генофонду населення України" ДКНТ України, шифр 01.01.01/055-92, 1992-1995рр.); "Розробка молекулярно-генетичних методів оцінки генетичного ризику мутацій в геномі людини під впливом іонізуючої радіації" (державна програма "Захист генофонду населення України" Міністерство освіти і науки України, N держ. реєстрації 0195U019255, 1997-2000); (CT93-0101) та (DGA/DSP/STTC) гранти Інституту Захисту та ядерної безпеки та національного інституту рака за програмою EUROGEM (Франція).

Мета і завдання дослідження. Метою роботи було дослідження асоціації мутантного генотипу з різними клінічними проявами моногенних спадкових захворювань, а також аналіз основних чинників розповсюдження мутацій в популяціях.

Для досягнення мети були поставлені основні завдання дослідження:

1.Створити банки зразків лейкоцитарної ДНК:

а) хворих та їх родичів з родин високого ризику захворювання на муковісцидоз, спінальну м`язову атрофію, синдром ламкої Х-хромосоми, м`язову дистрофію Дюшена, а також пацієнтів з необструктивними формами безпліддя;

б) членів родин ліквідаторів аварії на ЧАЕС (батько-ліквідатор; мати; діти, народжені після 1986 р.);

в) здорових донорів та членів родин (мати; батько; діти, народжені після 1986 р.) з різних регіонів України, що не були радіаційно забруднені внаслідок аварії на ЧАЕС.

2.На основі власних досліджень частоти, спектра, природи та походження мутацій, а також аналізу їх асоціації з інтрагенними та фланкуючими ДНК-маркерами встановити основні закономірності походження і розповсюдження в популяції України мутацій генів ТРБМ (трансмембранного регуляторного білка муковісцидозу), SMN (ген виживання рухових нейронів), FMR-1 (ген ламкого сайту розумової відсталості) і дистрофіну.

3.Встановити основні характеристики спонтанного мутаційного процесу, що призводить до зміни протяжності (делеції-інсерції) мінісателітних послідовностей ДНК в геномі статевих клітин людини. Оцінити зв'язок між дією іонізуючої радіації та рівнем мутацій в мінісателітних локусах.

4.На основі аналізу власних даних та даних літератури встановити особливості асоціації певних типів мутацій генів ТРБМ, SMN, NAIP (ген білка-інгібітора неврального апоптозу), FMR-1, дистрофіну та AZF (фактор азооспермі) з різними проявами клінічного фенотипу у хворих на муковісцидоз, спінальну м`язову атрофію, синдром ламкої Х-хромосоми, м`язову дистрофію Дюшена та необструктивні форми порушень сперматогенезу.

5.Розробити ефективну стратегію діагностики (включаючи пренатальну) та профілактики муковісцидозу, спінальної м`язової атрофії, синдрому ламкої Х-хромосоми, м`язової дистрофії Дюшена, та чоловічого безпліддя нез`ясованої етіології.

Об`єктом дослідження були моногенні спадкові патології, а предметом - молекулярно-генетичні закономірності їх патогенезу та розповсюдження. В роботі використовувались загальноприйняті методи: виділення та очищення ДНК, рестрикційний аналіз, блот-гібридізація за Саузерном, полімеразна ланцюгова реакція та статистичної обробки даних.

Наукова новизна одержаних результатів. Вперше у хворих на муковісцидоз, спінальну м'язову атрофію, синдром Мартіна-Бела, м'язову дистрофію Дюшена, необструктивні форми чоловічого безпліддя з України встановлено характер асоціації між мутантним генотипом (за мутаціями генів: ТРБМ, SMN, NAIP, FMR-1, дистрофіну та AZF) та клінічними проявами захворювань. На основі узагальнення одержаних даних розроблено концепцію про те, що прояви фенотипу моногенних спадкових захворювань формуються в результаті взаємодії мутантного генотипу з ендогенними (іншими генами) та екзогенними (чинниками навколишнього середовища) модифікуючими факторами.

На основі аналізу власних даних про походження та розповсюдженість мутацій генів спадкових захворювань встановлено основні закономірності процесів підтримання окремих генних мутацій в популяціях населення України. Вперше показано, що мутації delF508 та CFTRdele2,3(21kb) гена ТРБМ мають одноподійне походження і розповсюджувались шляхом ендемічної дифузії, про що свідчать отримані нами дані про обмежену розповсюдженість CFTRdele2,3(21kb) лише в популяціях слов'янського походження. Мутація delF508 в Україні, як і в багатьох популяціях світу є мажорною, оскільки поширювалася за умов селективної переваги гетерозиготних носіїв цієї мутації в постнатальному періоді онтогенезу.

Встановлено, що мутації генів SMN та дистрофіну у хворих на СМА та МДД мають не одноподійне походження, а є результатом рекурентного мутаційного процесу утворення делецій різної протяжності, або химерних послідовностей гомологічних генів cen/telSMN. Вперше продемонстровано можливість існування селективного процесу проти гомозиготних носіїв делецій генів SMN на периімплантаційних стадіях ембріогенезу.

Вперше встановлено, що не менш ніж 5% хворих з необструктивними формами порушення сперматогенезу є носіями делецій послідовностей регіону AZF довгого плеча Y хромосоми.

За результатами дослідження динамічного мутаційного процесу в CGG-послідовностях гена FMR1 запропоновано гіпотезу утворення в цих послідовностях інсерцій та делецій протягом успадкування на мейотичних та мітотичних стадіях.

Вперше, в запропонованих в якості моделі дослідження спонтанного та індукованого мутагенезу в геномі статевих клітин людини теломерних мінісателітних послідовностях встановлені основні характеристики мутаційного процесу типу делеції-інсерції. За результатами дослідження успадкованих мутацій в цих локусах у дітей батьків-ліквідаторів аварії на ЧАЕС можна зробити припущення про те, що найбільш чутливими до мутагенної дії іонізуючої радіації є мейотичні стадії сперматогенезу.

Теоретичне та практичне значення одержаних результатів.

На основі узагальнення одержаних даних розроблено концепцію, що прояви фенотипу моногенних спадкових захворювань формуються внаслідок взаємодії мутантного генотипу з ендогенними (іншими генами) та екзогенними (чинниками навколишнього середовища) модифікуючими факторами, яка є підґрунтям для розвитку теорії патогенезу спадкових захворювань та пошуків нових підходів до їх лікування та профілактики.

Отримані дані про походження та процеси розповсюдження мутацій генів ТРБМ, telSMN, дистрофіну, FMR1 та AZF, а також аналіз зчеплення цих мутантних генів із високоінформативними ДНК-поліморфними маркерами надають можливість ретроспективно змоделювати природу та закономірності процесів, які зумовили генетичну гетерогенність сучасних популяцій людини.

Дослідження частоти, спектра та можливих механізмів виникнення мутацій делеції-інсерції в генах SMN, дистрофіну, FMR1 та AZF, а також в гіперваріабельних мінісателітних локусах дозволили охарактеризувати складну природу мутаційного процесу у геномі людини та відкрили шляхи до пошуку його первинних чинників.

Розроблено стратегію використання прямого аналізу мутацій генів ТРБМ, telSMN, дистрофіну, FMR1 та AZF а також аналізу зчеплення цих мутантних генів з високоінформативними ДНК-поліморфними маркерами для діагностики (включаючи пренатальну), масового та селективного скринінгу гетерозиготних носіїв мутантних генів з метою профілактики тяжких спадкових захворювань в Україні.

Результати роботи використовують при читанні курсу лекцій " Генетика людини" студентам біологічного факультету Київського національного університету ім. Тараса Шевченка

Особистий внесок здобувача. Нові теоретичні та експериментальні ідеї, що розроблялися в дисертації, належать автору. Основні експериментальні результати, викладені в дисертації, одержані автором самостійно. У виконанні окремих експериментів брали участь співробітники відділу генетики людини ІМБіГ НАНУ, Інституту ПАГ АМНУ, Українського наукового центру медичної генетики. Це зазначено на сторінках дисертації. Одержані в співробітництві з колегами результати опубліковано в спільних наукових працях, які наведені в переліку праць за темою дисертації.

Апробація результатів дисертації. Основні положення роботи доповідались на вітчизняних та зарубіжних з'їздах та конференціях: IX-му з'їзді дитячих лікарів України (Одесa, 1993), II-му з'їзді медичних генетиків України (Львів, 1995), науково-практичній конференції "Сучасний стан медичної генетики в Україні (Київ, 1999) та міжнародних: конференції "Human Genome Project International Conference" (Франція, 1992), "Human Genom Mapping Workshop (Японія, 1993), конференції "Impact of nucleic acid-based technology" (Нідерланди, 1994), 8-му з'їзді по генетиці людини (Німеччина,1996), конференції "First European Cytogenetics Conference" (Греція, 1997); симпозіумі "V International Symposium on Mutations in the Human Genome" (Італія 1999); міжнародних курсах "Biomembranes and molecular medicine" (Румунія, 1999)

Публікації. За темою дисертації опубліковано 40 друкованих праць, зокрема 1 монографію, 29 статей у вітчизняних та міжнародних фахових виданнях та тези 10 доповідей на вітчизняних та міжнародних конференціях та з'їздах.

Обсяг та структура роботи. Дисертація складається із вступу, огляду літератури, опису матеріалів та методів дослідження, отриманих результатів власних досліджень та їх обговорення, заключення, висновків та переліку використаних джерел. Текст дисертації проілюстровано 32 таблицями та 41 рисунком. Перелік використаних джерел містить 521 найменування. Дисертаційну роботу викладено на 377 сторінках машинописного тексту.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ

Матеріали та методи. Матеріалом дослідження були зразки крові хворих на досліджувані спадкові патології та членів їх родин, родин ліквідаторів аварії на ЧАЕС та здорових донорів з різних регіонів України. Ці зразки та результати клініко-генеалогічного обстеження надані Інститутом ПАГ АМН України, Українським науковим центром медичної генетики МОЗ України та іншими медико-генетичними установами України, що зазначено в дисертації. В роботі використовувались загальноприйняті методи: виділення та очищення ДНК, рестрикційний аналіз, блот-гібридизація за Саузерном (Wehnert, 1988; Маниатис, 1988) та полімеразна ланцюгова реакція (Saiki et al., 1983). Власні модифікації, а також послідовності олігонуклеотидних праймерів наведені в дисертації. Статистичну обробку даних проводили за загально прийнятими методами (Лакин,. 1980) з використанням пакету програм "GENEPOP" і (Raymond, 1986).

Молекулярно-генетичний аналіз мутацій, що спричинюють розвиток моногенних спадкових захворювань.

Мутації в гені ТРБМ досліджували в 2-му, 3-му, 4-му, 7-му, 10-му, 11-му, 20-му, 21-му екзонах та в 2-му, 3-му, 4-му і 10-му інтронах гена серед членів 305-ти родин високого ризику муковісцидозу (хворих та їх батьків) з різних регіонів України, 100 чоловіків з необструктивними формами олігоспермії та азооспермії, а також в популяції здорового населення (донорів). Було створено банк зразків лейкоцитарної ДНК осіб з усіх груп обстеження (1770 зразків). Для аналізу мутацій проводили ампліфікацію in vitro послідовностей ДНК відповідних екзонів та інтронів гена з використанням специфічних олігонуклеотидних праймерів для полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР), частково, або повністю гомологічних 5' та 3' послідовностям відповідних екзонів та інтронів гена. Диференційну детекцію мутацій R117H, 621+1G-T, R347P, R334W, 1154insTC, 1717-1GaA, S5491, R553X, G551D, G542X, N1303K, W1282X проводили шляхом аналізу рестрикційних фрагментів продукту ПЛР. Дослідження делецій delF508, delI 507 та 1677delTA проводили за результатами аналізу продуктів ПЛР (гомо- і гетеродуплексів) послідовності 10-го екзона гена ТРБМ (рис. 1а). Нещодавно нами в складі інтернаціональної групи дослідників з різних країн світу було відкрито мутацію CFTRdele2,3(21 kb), яка охоплює інтрони 1-3, екзони 2 і 3 та має розмір 21 т.п.н. (Dіork et al., 2000). Для аналізу проводили ПЛР послідовності, що утворюється внаслідок делеції гена ТРБМ (рис. 1б). Результати аналізу цих мутацій, у хворих на муковісцидоз з різних регіонів України, а також у хворих з різних країн Європи, отримані нами під час спільних досліджень проведених членами ECCFCA (Спільні дослідження муковісцидозу під егідою Європейського Союзу) свідчать про те, що як в Україні, так і в багатьох інших країнах світу з населенням європейського походження, мажорною мутацією гена ТРБМ є делеція F508 в 10-ому екзоні гена (Лівшиць, 2000). Ії частота серед хворих з України становить 40,8%, а частка

Рис. 1. Аналіз мутацій гена ТРБМ: а) в 10-му екзоні,12%-й ПААГ:

1 – гетерозиготний носій делеції 1677delTA;

2 – індивід із генотипом 1677delTA/delF508;

3 – гетерозиготний носій делеції delF508;

4 – індивід із генотипом delF508/delF508;

б) протяжної делеції CFTRdele2,3(2,1 kb). 1,8%-вий агарозний гель:

М – маркер молекулярної маси (Ladder 100 bp, Pharmacia).

1 – носій мутації; 2, 3 – здорові індивіди.

генотипів з мутацією delF508 складає 56,1%. В гомозиготному стані delF508 виявлено у 25,6% хворих, а у 30,5% хворих в компаунді з іншими мутаціями гена ТРБМ. Частота delF508 коливалась від 15,97% в Туреччині до 70,74% в Чехії. Естівілом із співавторами (1997) було показано, що найбільш розповсюдженою (частота – 87,2%) ця мутація є в Данії. За результатами аналізу зчеплення цієї мутації з гаплотипами ПДPФ та STR-маркерів хромосомної області 7q31.1 нами підтверджено гіпотезу про єдине походження delF508 в Україні та Європі. Результати такої оцінки отримані нами незалежно, як на основі аналізу зчеплення, так і аналізу частоти delF508 серед здорового населення та хворих на муковісцидоз з урахуванням можливої селективної "цінності" мутації delF508, змодельовано процеси успадкування цієї мутації в поколіннях (Livshits, Кravchenko, 1996), а також проведено розрахунки "віку" delF508 в Україні (періоду, коли вона вперше виникла або була занесена міграційним потоком). Оцінки "віку" delF508, отримані на базі аналізу зчеплення, дали нам можливість реконструювати, що при початковому ефективному розмірі популяції в 1000 осіб, частота мутації повинна була досягнути своєї сучасної частоти в популяції України за 175–210 поколінь (3300–4200 років), що збігається з розрахунками "віку" цієї мутації в країнах Західної Європи. При цьому, найбільш імовірним видається "просування" цієї мутації з міграційним потоком населення за течією ріки Дніпро, найважливішої транспортної та торгівельної магістралі на території України. Результати дослідження поширеності протяжної делеції CFTRdele2,3(21 kb) свідчать про те, що ця делеція є однією з найрозповсюдженіших в Україні (її частота становить 1,4%). Також ця мутація поширена в країнах Центральної та Східної Європи – Чехії, Словаччині, Росії, Білорусії, Польщі та Словенії. Тобто вона є ендемічною для країн з населенням слов'янського походження. Обмежену розповсюдженість CFTRdele2,3(21 kb) можна пояснити відносно "молодим віком" цієї мутації та її походженням в одній з популяцій східних слов'ян. Іншими чинниками можуть бути дрейф генів та історично низький темп еміграції східнослов'янського населення, про що свідчать отримані нами результати аналізу алельного поліморфізму ДНК Y-хромосоми в популяціях Європи (Rosser et al., 2000). В усіх обстежених хворих делецію CFTRdele2,3(21kb) виявлено на хромосомах 7 з однаковим поліморфним гаплотипом XV2c / KM-19A i 16-33-13 (IVS8GT – IVS17bTA - IVS17dCA), що свідчить про єдине одноподійне походження цієї мутації. Аналогічні дані про єдине походження були отримані і для мажорної в Україні мутації R408W гена фенілаланінгідроксилази (Мусиенко и др.,1996; Нечипоренко и др., 2000). Також поширеною в Україні є мутація N1303K в 21-му екзоні гена ТРБМ (частота-2,65%). Вона розповсюджена майже в усіх досліджуваних країнах, а найвищу її частоту зафіксовано в Тунісі (17,2%). Інші виявлені нами мутації гена ТРБМ зустрічалися дуже рідко, лише в поодиноких випадках із частотою менш, ніж 1%. Варто зазначити, що хоча на сьогодні виявлено вже більш, ніж 900 різних мутацій гена ТРБМ, лише невелика кількість з них зустрічається з частотою більш, ніж 1% (Consortcium datebase, 2000). Дуже цікавими виявилися результати аналізу динуклеотидної делеції 1677delTA (10-й екзон). Цю мутацію було виявлено у двох хворих з України, які мали походження із країн Закавказзя. Серед інших країн світу цю мутацію було виявлено лише в Росії, Болгарії, Греції, Грузії та Туреччині. Причому найвищу частоту цієї мутації зафіксовано саме для Туреччини – 2,24%. Ця "чорноморська мутація", найімовірніше, має турецьке, або грецьке походження, оскільки вона розповсюджена лише в країнах Чорного моря і в Греції, яка мала на Чорному морі численні колонії. Можна дійти висновку, що сучасна розповсюдженість мутацій гена ТРБМ в Україні та в інших популяціях світу, є наслідком міграції, що спричинює ендемічну дифузію окремих мутацій та результатом дрейфу генів в окремих популяціях. Також селективний процес може сприяти як зрoстанню частоти мутантного алеля, так і його елімінації з популяції. Досить висока порівняно з іншими летальними спадковими захворюваннями частота муковісцидозу в багатьох країнах (1:2000 новонароджених) може бути наслідком того, що саме елективні процеси підтримують частоту мутантного гена ТРБМ на рівні 2,2%. Для перевірки гіпотези ембріонального відбору на користь носіїв делеції F508 проводили оцінку постімплантаційної загибелі (частота спонтанних абортів) у матерів-носіїв мутацій гена ТРБМ. Цей показник становив 17%, тобто постімплантаційні втрати в цій групі не відрізняються від зафіксованого рівня (16-20%) в загальній групі жінок (Тимченко та ін., 2000). Також не встановлено статистично вірогідних відмінностей між рівнем спонтанних абортів у жінок - гетерозиготних носіїв delF508 та інших мутацій гена ТРБМ. Також проведено аналіз розподілу генотипів плодів, визначених під час пренатальної діагностики у матерів-гетерозиготних носіїв мутації delF508. Спостережене співвідношення статистично вірогідно не відрізнялося від теоретично очікуваного при аутосомно-рецесивному типі успадкування (1:2:1). Аналогічні дані отримані під час досліджень при генотипуванні більш ніж 1000 сибсів з родин з високим ризиком муковісцидозу (EWGCF, 1995). Таким чином за результатами наших досліджень та досліджень інших авторів не отримано даних на користь селективної переваги гетерозигот за мутаціями гена ТРБМ. Існує гіпотеза про підвищену стійкість гетерозиготних носіїв мутантного гена ТРБМ до деяких інфекційних захворювань, підтверджена даними про стійкість культивованих клітин, гетерозиготних по delF508, до інфікування холерним вібріоном (Gabriel, 1994). Обговорювалась імовірність високих темпів розповсюдження алеля delF508 в період середньовічних епідемій холери в Європі. Результати аналізу розповсюдженості делеції 32 п.н. в гені білка CCR5, яка забезпечує підвищену стійкість (для гетерозигот) або повну резистентність (у гомозигот) до інфекції вірусом ВІЛ, демонструють, що такий алель сягає дуже високої частоти в популяції (в Україні-10%). У популяції кримських татар, як і в інших популяціях світу тюркського походження, ця делеція спостерігається рідше (частота-5%) (Лившиц и др., 2000). Тобто ця мутація має градієнт розповсюдженості, подібний до градієнтного зниження з півночі на південь України частоти delF508. Як і у випадку з delF508, делеція 32 п.н. має розрахунковий "вік" 2000 років. Поширення цього алелю за розрахунками почалося 700 років тому, під час середньовічної епідемії чуми, оскільки можливо рецептори CCR обумовлюють стійкість до інфікування Yersinia pestis (Mill et al.,1997). Саме завдяки цьому можна пояснити селективні переваги носіїв Дccr5 (Stephens et al,1998). Тому цілком правдоподібною є гіпотеза про аналогічний тиск епідемій холери в Європі, який і зумовив селективну перевагу носіїв delF508 та опосередковано сприяв розповсюдженості муковісцидозу в багатьох популяціях світу.

Аналіз мутантних генів SMN та NAIP в родинах високого ризику спінальної м`язової атрофії (СМА). Аналіз делецій 7-го та 8-го екзонів генів SMN (survival motor neuron gene) проведено у членів 72-х родин високого ризику СМА, у 116-ти індивідів з контрольної групи та у 104-х пацієнтів з безпліддям невизначеної природи. Диференційну детекцію послідовностей 7-го та 8-го екзонів генів telSMN і cenSMN проводили шляхом рестрикційного аналізу продуктів ПЛР. За результатами дослідження у 60 хворих на СМА гомозиготну делецію 8-го екзону гена telSMN було виявлено у 53 (88,3%) хворих, у яких було раніше виявлено гомозиготну делецію 7-го екзону даного гена. Такі ж делеції виявлено в 3-х із 115-ти батьків хворих (2,6%) та у одного сибсу. У невеликої частини хворих на СМА (9,3%) ми виявили делецію лише 7-го екзону гена telSMN. Передбачають, що це не є ізольованою делецією, а є заміною послідовності 7-го екзону цього гена на гомологічну внаслідок утворення химерного гена, до складу якого входять послідовності як теломерного, так і центромерного генів SMN (Hahnen et al., 1996). З огляду на ці дані, у таких індивідів нами було проведено аналіз походження послідовності 7-го екзону гена telSMN. Для диференційного дослідження послідовностей 7-го і 8-го екзонів (як теломерного, так і центромерного генів SMN) проводили аналіз EcoRV та DdeI-рестрикційних фрагментів продукту ПЛР цих екзонів. Сайти для цих ендонуклеаз рестрикції містяться лише в послідовності гена cenSMN, і ми могли фіксувати заміни послідовностей одного з генів на гомологічну з іншого. В усіх хворих з цієї групи виявлено химерний ген cen/telSMN, послідовність 7-го екзону якого походить від гена cenSMN, а 8-го екзону - від гена telSMN (рис 2).

Рис. 2. Електрофореграма продуктів ПЛР, що містять 7-й і 8-й екзони генів SMN, гідролізованих ендонуклеазами рестрикції EcoRV і DdeI. 1,8%-й агарозний гель: 1 – носій СМА з гомозиготною делецією гена cenSMN; 2 - хворий на СМА, у якого виявлено гомозиготну делецію 7-го і 8-го екзонів гена telSMN; 3 - мати, носій химерного гена cen/telSMN; 4 - хворий на СМА, у якого виявлено гомозиготну делецію тільки 7-го екзону гена telSMN; 5 - здоровий донор; М - маркер молекулярної маси 100 Base-Pair Ladder.

За результатами аналізу походження цієї послідовності в 3-х випадках було підтверджено успадковане її походження. Було показано, що дупліковані гени (як гени SMN) і цілі геномні регіони, такі як регіон 5q13, схильні до незбалансованих перебудов, що призводять до утворення делецій і дуплікацій або випадків генної конверсії. За результатами аналізу поліморфного локусу Ag1CA в 4-х випадках ми визначили фазу зчеплення химерного гена з алельними варіантами локусу Ag1CA і спостерігали успадкування на одній хромосомі двох різних послідовностей цього локусу разом з химерним геном cen/telSMN та геном cenSMN. Даний результат свідчить про те, що найбільш імовірним серед трьох гіпотетичних механізмів утворення химерних генів SMN (генна конверсія, нерівний кросинговер, делеції) є генна конверсія. Саме при утворенні химерного гена SMN внаслідок генної конверсії на хромосомі має з'являтися два гени SMN і дві копії алельних варіантів локусу Ag1CA. У трьох випадках химерний ген успадковувався разом з гаплотипом локусу Ag1CA "100/106". Таке зчеплення може свідчити про одноподійне походження химерного гена cen/telSMN на хромосомі 5 з утворенням гаплотипу 100/106. Для оцінки селективного процесу в ембріогенезі проводили розподіл плодів за генотипами, виявленими під час пренатальної діагностики СМА. Співвідношення за статусом плодів – 4-и хворих (гомозиготи за делеціями) і 22-е здорових (носіїв та не носіїв делеції генів SMN) – наводить на думку про селективний процес проти гомозигот за мутаціями гена telSMN. У цьому аспекті цікаві результати аналізу делеції 7-го екзону генів SMN 104-х пацієнтів з безпліддям нез`ясованого генезу, серед яких виявлено 12 носіїв гомозиготних делецій (11,5%), що майже в 10 разів (статистично вірогідно) більше, ніж у групі здорових донорів (1,7%). Таким чином можна зробити припущення про відбір проти зигот з делеціями 7-го екзону генів SMN на преімплантаційній стадії. Подібне явище відбору було раніше досліджено на мишах (Лившиц и др., 1980). Можливо, що цей селективний процес діє як презиготична сегрегація гамет ще до запліднення і спричинює безпліддя в родинах носіїв делецій. В родинах хворих на СМА було проведено аналіз делеції 5-го екзону гена NAIP, локалізованого в хромосомній області 5q13. Делецію 5-го екзону гена NAIP було виявлено у 17 (28,3%) хворих на СМА дітей і у одного з батьків. У жодного з індивідів контрольної групи такий генотип не було виявлено. Важливо зазначити, що в усіх хворих з таким генотипом були виявлені також гомозиготні делеції 7-го та 8-го екзонів гена telSMN. Таким чином у 28.3% хворих нами виявлено протяжну делецію 7-го, 8-го екзонів гена telSMN та 5-го екзону гена NAIP в гомозиготному стані. За результатами аналізу розповсюдженості гомозигот за цією протяжною делецією в різних країнах світу (Simard et al., 1997) частота цього генотипу коливалась в межах від 100% у Кувейті до 5,6% у Китаї. Проте у країнах Європи (враховуючи Україну) і в США ці показники були більш близькими. Результати порівняльного аналізу розповсюдженості гомозигот за делеціями 7-го та 8-го екзонів гена telSMN серед хворих на СМА з України та з інших досліджених популяцій (Simard et al., 1997) свідчать про те, що частота цього генотипу у більшості популяцій світу, враховуючи Україну, становить понад 90%. Найрідкіснішою виявилась частота генотипів із мутантною химерною послідовністю сen/telSMN (10%). Цікаво зазначити, що ця мутація в жодному випадку не зустрічалася у гомозиготному стані, а лише в компаунді з іншими мутаціями цього гена. Результати аналізу нерівноваги за зчепленням поліморфізму локусів 2AE9.1 та LAS96 з мутаціями генів telSMN та NAIP свідчать про відсутність статистично вірогідної асоціації певних алельних варіантів з мутаціями цих генів (p>0,05 для всіх алелей). Таким чином можна зробити висновок про неодноподійне походження делецій генів telSMN та NAIP. Відсутність зчеплення з окремими поліморфними ДНК-гаплотипами є наслідком декількох мутаційних подій, що відбуваються в усіх популяціях з практично однаковою частотою.

Дослідження мутацій типу делеція-інсерція, що призводять до розвитку Х- та Y- зчепленних спадкових патологій.

Аналіз кількості копій CGG-повторів у 5? області гена FMR1 було проведено серед 46 неспоріднених жінок з родин, де не було хворих на синдром Мартіна – Бела. Для цього проводили ампліфікацію in vitro ДНК послідовності гена FMR1, що містить CGG-повтори, та блот-гібридизацію із специфічними зондами. Встановлено, що розмір дослідженої області відповідав 13 різним алельним варіантам кількості CGG- повторів (від 23-х до 35-ти копій). Перевірка відповідності розподілу спостережених генотипів теоретично очікуваному згідно рівноваги Харді–Вайнберга свідчила про відсутність селективних процесів, спрямованих на користь або проти будь-якого з виявлених генотипів. Найчастішим виявився алельний варіант, що містив 30 копій CGG-тринуклеотидів. За результатами аналізу ділянки CGG-повторів гена FMR-I у 53 хворих з клінічними ознаками синдрому Мартіна-Бела у 44-х пацієнтів кількість CGG-копій варіювала в межах, зафіксованих для здорових індивідів. Проте у 9-ти хворих (17%) довжина відповідної послідовності гена FMR-I варіювала від 1,8 до 9 т.п.н. (250-2500 CGG-копій). В 7-ми родинах результати аналізу успадкування алелів з експансією області CGG-повторів, свідчили про те, що в усіх цих випадках у хворих відбувався динамічний процес утворення de novo мутантного алеля з більшим числом CGG-повторів, ніж у їх матерів (рис. 3). Тобто відбувався перехід від стану премутації до повної мутації. Можна передбачити, що цей процес відбувається в жіночих статевих клітинах в період мейозу – на презиготичній стадії. Проте, безальтернативність цієї схеми спростовують результати, отримані нами у 4-х індивідів, в яких було виявлено декілька гібридизаційних фрагментів, що відповідали CGG–області з премутацією та з повною мутацією різної протяжності. Це явище можна пояснити існуванням в популяції лейкоцитів цих пацієнтів клітин з різною кількістю CGG-повторів (соматичний мозаїцизм). Виявлений феномен соматичного мозаїцизму у хворих чоловічої статі та у їхніх матерів може бути свідченням на користь як мейотичної, так і соматичної нестабільності даного регіону. Цікавими є результати аналізу CGG-ділянки гена FMR-I в родині В., в якій у пробанду виявили делецію de novo, а у його матері декілька мутантних алелів у цій області.

Рис. 3. Блот-гібридизація з зондом РХ6 в сім'ї Б:

1 – бабуся пробанда;

2 – мати пробанда;

3 – пробанд;

4 – сестра пробанда;

5 – здоровий донор.

Можна припустити, що у жінок із усіх цих родин на ранніх стадіях ембріогенезу відбувалися множинні мутаційні події як у соматичних, так і в статевих клітинах, що призвели до появи у нащадків різних за кількістю CGG-повторів або делетованих алельних варіантів. На користь запропонованої нами схеми динамічних мутаційних подій свідчать також результати аналізу соматичного мозаїцизму та делецій de novo, а також дослідження CGG-ділянки у дочок хворих на синдром Мартіна-Бела та чоловіків-трансміттерів (Willems, 1992).

Дослідження мутантного гена дистрофіну у хворих на м'язову дистрофію Дюшена було проведене в попередньо створеному банку зразків ДНК з лейкоцитів 111 хворих на м'язову дистрофію Дюшена та 100 їх родичок. У цих індивідів проводили аналіз послідовностей м'язовоспецифічного промотора, 18-ти екзонів гена дистрофіну (3-го, 6-го, 8-го, 13-го, 17-го, 19-го, 22-го, 43-го, 44-го, 45-го, 47-го, 48-го, 49-го, 50-го, 51-го, 52-го, 53-го, 60-го) та поліморфізму ДНК в інтронах. Ми використовували різні схеми мультилокусної полімеразної ланцюгової реакції (Chamberlain et al., 1988). За результатами аналізу у 32,4% пацієнтів виявлено делеції різних послідовностей гена. Дослідження спектру делетованих послідовностей в межах гена свідчили про те, що більшість їх (65,7%) зосереджена в центральній та 3ў-частинах гена (рис 4). Найчастіше, у хворих на МДД був делетований 50-й екзон. У 14-ти пацієнтів (38,9%) виявлені делеції поодиноких екзонів гена дистрофіну. В 6–ти випадках вдалося прокартувати межі цих делецій. Усі вони локалізувалися в центральній та 3ў-частинах гена і охоплювали послідовності 44-го, 50-го, 51-го та 52-го екзонів. У 22-х хворих були виявлені протяжні делеції послідовностей двох і більше екзонів гена дистрофіну. У 10-ти індивідів з цієї групи нам вдалося точно прокартувати 5ў та 3ў границі цих делецій, переважна більшість яких зосереджена в центральній та 3ў-частинах гена. В 65,7% випадків були делетовані послідовності саме цього регіону. В решті випадків, за обмежень методу дослідження, ми не можемо визначити, що виявлені делеції сягають лише границь відповідних екзонів. За результатами картування 5ў границь делецій можна зробити висновок, що "гарячі точки" розриву зосереджені в 44-51-му екзонах гена. Інша "гаряча точка" розриву найімовірніше локалізується в 5ў-частині 3-го екзону. В жодному випадку не було виявлено делецій в м'язово- специфічному промоторі. Широкий спектр виявлених делецій та існування "гарячих точок" розриву наводять на думку про неодноподійне їх походження. На користь цього свідчать також отримані нами результати внутрішньородинного аналізу зчеплення ПДРФ-варіантів локусу рЕRT та делецій різних екзонів гена дистрофіну. Відсутність нерівноваги за зчепленням між алельними ПДРФ-варіантами в ділянках рЕRT-87-8, рERT-87-15 та делеціями є непрямими, але досить переконливим підтвердженням неодноподійного характеру походження цих делецій. Саме про такий характер мутагенезу та існування "гарячих точок" делецій в 3ў- та в 5ў-частинах гена свідчить аналіз делецій у хворих на МДД з різних популяцій світу. У хворих із багатьох країн Східної та Західної Європи, Азії та Латинської Америки спостерігається однаковий спектр делецій гена дистрофіну. Така розповсюдженість є доказом активного мутаційного процесу, що нівелює вплив дрейфу та міграційних потоків. За результатами аналізу родоводів хворих на МДД наявність хворого родича виявлена лише в 30% випадків. Це означає, що в решті випадків (за винятком родин, де відсутні відомості про усіх родичів чоловічої статі) мали місце мутації гена дистрофіну de novo, які й реєструються, як спорадичні випадки МДД. В дослідженнях інших авторів також отримано дані про високий рівень мутацій de novo, виявлених за результатами аналізу зчеплення мутацій з поліморфними ДНК-маркерами в родинах хворих на МДД. Високий рівень мутабільності пояснюють особливим механізмом мутаційного процесу в гені дистрофіну за рахунок транспозоноподібних елементів, виявлених в послідовності 48-50-го екзонів гена.

Рис. 4. Спектр делецій в гені дистрофіну у хворих на МДД.

- - - делеції з невстановленими границями

___ делеції з картованими границями

Аналіз мікроделецій довгого плеча Y-хромосоми у чоловіків з порушенням сперматогенезу. Для дослідження делецій в області Yq11 був створено банк зразків ДНК з лейкоцитів 95-ти пацієнтів з необструктивними формами олігоспермії та азооспермії. Всі вони лікувалися за програмою екстракорпорального запліднення шляхом інтрацитоплазматичної ін'єкції одиничних сперміїв (ICSI). Аналіз мікроделецій, як і у випадку делецій гена дистрофіну, проводили методом специфічної ампліфікації за допомогою мультилокусної ПЛР в ділянках sY153 (DYS 237), sY84 (DYS273), sY85 (DYS274), sY117 (DYS209), sY141 (DYS229), sY124 (DYS215), sY240, sY254 (DAZ), sY255 (DAZ), sY134 (DYS224), sY146 (DYF52S1), sY158 (DYS241)). Відсутність продуктів ампліфікації відповідних розмірів свідчила про делеції в досліджуваних ділянках (рис. 5). У 5-ех пацієнтів (5,3%) були виявлені делеції різної протяжності, що охоплювали обширні послідовності з області Yq11. У більшості випадків (80%) ці делеції починалися точкою розриву в регіоні родини генів YRRM, та охоплювали область AZFc, де саме локалізується ген DAZ (deleted in azoospermia) (Cooke, 1996). Лише в одного пацієнта виявлено делецію послідовності з області AZFb від локусу DYS209 до DYS224. Варіювання протяжності делетованих послідовностей, а також їх переважна концентрація в області AZFc свідчать про те, що саме цей регіон є "гарячою точкою" делеції. Можна передбачити, що зафіксовані мутації є лише "верхівкою айсберга", оскільки цілком імовірно, що досить потужні селективні процеси можуть впливати на