НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ
НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ
ІНСТИТУТ ФІЗІОЛОГІЇ ІМЕНІ О.О.БОГОМОЛЬЦЯ
Ларіонова Наталія Анатоліївна
УДК: 616.13 - 004.6 – 092 + 616 - 008.9
ПОРІВНЯЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА ПОКАЗНИКІВ ЛІПІДНОГО ОБМІНУ ТА ВІЛЬНОРАДИКАЛЬНИХ ПРОЦЕСІВ У КРОЛІВ ПРИ МОДЕЛЮВАННІ РІЗНИХ ВИДІВ АРТЕРІОСКЛЕРОЗУ
14.03.04-патологічна фізіологія
АВТОРЕФЕРАТ
дисертації на здобуття наукового ступеня
кандидата медичних наук
Київ - 2001 г.
Дисертацією є рукопис
Роботу виконано на кафедрі патологічної фізіології Національного медичного університету ім. О.О.Богомольця
Наукові керівники: доктор медичних наук, професор Биць Юрій Вікторович, завідувач кафедри патологічної фізіології НМУ ім. О.О.Богомольця
доктор медичних наук Чаяло Петро Петрович, завідувач лабораторії радіаційної біохімії НЦРМ АМН України
Офіційні опоненти: провідний науковий співробітник відділу по вивченню гіпоксичних станів Інституту фізіології ім. О.О.Богомольця НАН України, доктор медичних наук Маньковська І.М.;
завідувач лабораторії патофізіології НДІ кардіології ім. М.Д.Стражеска АМН України, доктор медичних наук, професор Братусь В.В.
Провідна установа: Інститут геронтології АМН України
Захист вібудеться 27 лютого 2001 року о 14 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.198.01 при Інституті фізіолоігї ім. О.О.Богомольця НАН України за адресою: 01024 Київ, вул. Богомольця 4.
З дисертацією можна ознайомитись в бібліотеці Інституту фізіолоігї ім. О.О.Богомольця НАН України
Автореферат розіслано 26 січня 2001 року.
Вчений секретар спеціалізованої вченої ради, доктор біологічних наук |
Сорокіна-Маріна З.О.
ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ
Актуальність проблеми. Превалювання серцево-судинної патології в структурі захворюваності та смертності населення, за прогнозами, збережеться і в ХХІ столітті (Lee R.T., Libby P., 1998). Головною передумовою її розвитку є склеротичні ураження судин. При цьому акцент ставиться на атеросклерозі як найбільш поширеній формі. Інший вид артеріосклерозу, якому притаманні первинні зміни в середньому шарі судин у вигляді медіанекрозу, медіакальцинозу та медіасклерозу (Mцnckeberg, 1903), ?кладає морфологічну основу розшаровуючої аневризми аорти (Глагола М.Д., 1994), деяких вад серця (Шаенко О.Ю., Кириллов А.М., Соловьев Г.М., 1997; Шестаков В.Н. и др., 1987), в частині випадків - ішемічної хвороби серця (Simon A.M. et al., 1998). Цей вид артеріосклерозу формує суттєвий внесок в розвиток і артеріальної гіпертензії (Hubner G.H. et al., 1995; Hodson E.M., Antico V.F., O’Neill P., 1992). Артеріосклероз Менкеберга з високою частотою зустрічається у людей похилого віку (Кадырова Д.А., 1990) та у хворих на цукровий діабет (Gentile S. et al., 1990; Hirschl M. et al., 1991; Lehto S. et al., 1996). Вказані аналогії з класичним атеросклеротичним ураженням судин підтверджуються також і тим, що артеріосклероз менкебергівського типу розвивається переважно в судинах великого та середнього калібру (Elliott R. J., McGrath L.T., 1994). У чоловіків він розвивається частіше (Соколова Р.И., 1996), початкові його ознаки з'являються вже в дитячому віці (Schiffmann J.H. et al., 1992). Спонтанний медіакальциноз відмічено у мавп (Yanai T. et al., 1994), він легко індукується у кролів (Doebler J.A. et al., 1982). З метою його експериментального відтворення використовують багаточисельні впливи (Быць Ю.В., 1973). Проте, в більшості робіт автори обмежуються лише констатацією факту розвитку артеріосклерозу менкебергівського типу. Питання про те, в чому полягають його взаємовідносини з атеросклерозом, які спеціальні патогенетичні ланки визначають формування саме артеріосклерозу Менкеберга, а не атеросклерозу, не мають чітких відповідей.
Неодноразово встановлені схожі риси між артеріосклерозом Менкеберга та атеросклерозом дозволяють припустити певну спільність механізмів їх розвитку. Це, в першу чергу, стосується ролі гіперліпідемії та дисліпопротеїдемії (ДЛП). По-перше, зростаючи по мірі старіння, збільшений вміст та до деякої міри змінений склад ліпідів плазми крові часто поєднується з ураженням судин різного генезу (цукровий діабет, атеросклероз). По-друге, гіперліпідемія та ДЛП є необхідними біохімічними факторами ризику розвитку ліпідної інфільтрації інтими артерій, які нерідко супроводжують інші ураження судин (атероматоз, кальциноз, гіаліноз).
Невід’ємною ланкою в реалізації ліпідних механізмів пошкодження є активація процесів перекисного окиснення ліпідів (ПОЛ). Продукти ПОЛ здатні викликати безпосереднє пошкодження структур судинної стінки (Akiba S. et al., 1997). Перекисне окиснення жирних кислот ліпопротеїдів (ЛП) є важливим механізмом утворення модифікованих ЛП і, таким чином, сприяє активному їх надходженню в судинну стінку (Климов А.Н., Никульчева Н.Г., 1995; Partasarathi S., Santanam N., Auge N., 1998).
Особливості метаболізму вищих жирних кислот, які є структурними компонентами клітинних мембран, субстратами окиснення, попередниками багаточисельної групи ейкозаноїдів, багато в чому зумовлюють спрямованість патофізіологічних змін в судинній стінці.
Зокрема, не виключена можливість участі порушень обміну ліпідів в реалізації інших, відмінних від атеросклерозу, видів судинних уражень. Беручи до уваги специфіку біохімічних порушень при атеросклерозі та універсальне значення ліпідних механізмів пошкодження, наявні підстави для дослідження саме цих показників при визначенні паралелей в динамиці експериментального відтворення різних видів артеріосклерозу.
Виходячи з цього, нами проведено роботу по вивченню ролі ліпідних механізмів на ранніх стадіях експериментального відтворення судинного пошкодження менкебергівського типу в співставленні з класичною моделлю атеросклерозу. Такі дослідження можуть наблизити нас до розуміння сутності змін, що розвиваються в судинній стінці і зумовлюють формування різних видів її пошкодження.
Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Робота виконана в рамках тематики кафедри патологічної фізіології НМУ ім. О.О.Богомольця: “Вивчення системи “протеоліз – інгібітори протеолізу” в крові, тканинах судин та серця при різних пошкоджуючих впливах”
Мета дослідження: проведення порівняльної оцінки показників ліпідного обміну в крові та судинній стінці при моделюванні різних видів артеріосклерозу для встановлення можливої патогенетичної ролі порушень обміну ліпідів в їх розвитку.
Задачі: 1) вивчення особливостей змін ліпідного та ліпопротеїдного складу сироватки крові при моделюванні різних видів артеріосклерозу;
2) дослідження ліпідного складу тканин аорти при моделюванні різних видів артеріосклерозу;
3) оцінка комбінованого впливу агентів, що викликають атеросклероз або артеріосклероз Менкеберга, на вираженість ліпоїдозу судинної стінки;
4) характеристика процесів перекисного окиснення ліпідів в крові в формуванні уражень судинної стінки на ранніх стадіях експериментального артеріосклерозу;
5) характеристика стану антиоксидантної (АО) системи на ранніх стадіях розвитку експериментального артеріосклерозу;
6) дослідження жирнокислотного складу стінки аорти при моделюванні різних видів артеріосклерозу
Наукова новизна одержаних результатів. Вперше отримано дані про розвиток ДЛП при моделюванні артеріосклерозу менкебергівського типу. Встановлені особливості розвитку гіперліпідемії та ДЛП при індукуванні менкебергівського артеріосклерозу різними агентами. Встановлені зміни ліпідного складу аорти в процесі моделювання менкебергівського артеріосклерозу. Комбінований вплив на судини різних ангіосклеротичних агентів зумовлює розвиток меншого ступеню ліпоїдозу у порівнянні з дією класичного індуктора атеросклерозу (холестерину).
Отримано докази активації процесів ПОЛ як при розвитку артеріосклерозу Менкеберга, так і при поєднанні його з класичним атеросклеротичним типом судинного ураження. Оцінка балансу між окислювальними реакціями та станом АО вказує на формування змін, що сприяють пошкодженню судинної стінки.
Встановлені близькі зміни в жирнокислотному складі ліпідів аорти при різних видах експериментального артеріосклерозу, що може вказувати на схожість у формуванні ліпідних порушень in situ без залежності від виду застосованого впливу.
В цілому, результати роботи свідчать про існування деяких загальних патогенетичних механізмів, що полягають в порушенні ліпідного складу крові та судинної стінки, в розвитку не лише атеросклеротичного, але й первиннодистрофічного типу артеріосклерозу Менкеберга.
Теоретичне та практичне значення роботи. Односпрямовані зміни в ліпідному, ліпопротеїдному, а також окислювально-АО балансі як при розвитку холестеринового атеросклерозу, так і артеріосклерозу Менкеберга, свідчать про важливу роль патохімічних змін в ліпідному обміні в генезі різноманітних видів судинних пошкоджень. Комплексний підхід до вирішення задач, багатофакторний аналіз особливостей ліпідного обміну дає можливість досить об’єктивно розглядати значення ліпідної ланки в патогенезі артеріосклерозу в цілому. Співставлення даних біохімічного дослідження крові та тканин аорти дозволяє визначити схожі та відмінні риси в розвитку атеросклерозу та медіасклерозу, що, на наш погляд, дасть поштовх до подальшого розвитку наукових уявлень про співвідношення між різними видами артеріосклерозу.
Отримані результати, крім того, надають можливість розробки нових патогенетично обгрунтованих заходів лікування та профілактики первиннодистрофічних артеріосклеротичних уражень, зокрема, із застосуванням засобів гіполіпідемічного спрямування.
Особистий внесок здобувача. Здобувачем проведено аналіз літературних джерел, виконано повний комплекс необхідних експериментальних досліджень, проведено обробку даних, їх аналіз та узагальнення.
Апробація роботи. Результати виконаних досліджень представлялись на ІІІ науково-практичній конференції “Актуальні проблеми експериментальної медицини” (8-10 квітня 1999 р., Київ), засіданні апробаційної ради НМУ ім. О.О.Богомольця “Теоретична медицина” (31 серпня 1999 р.), засіданні Київського міського товариства патофізіологів (14 лютого 2000 р.), ІІІ Національному конгресі патофізіологів України (29-31 травня 2000 р., Одеса).
Публікації. За результатами роботи опубліковано 11 наукових робіт, з них 6 журнальних статей.
Структура та обсяг дисертації. Дисертація складається з вступу, огляду літератури, опису матеріалів та методів дослідження, викладення результатів та їх обговорення, висновків та списку 236 використаних джерел. Робота викладена на 137 сторінках, містить 14 таблиць та 30 малюнків.
ОСНОВНИЙ ЗМІСТ
Матеріали та методи досліджень. Для моделювання різних видів артеріосклерозу використано 90 кролів породи шиншила віком 4-8 місяців, середньою масою 2,82 0,08 кг. Тварини утримувались у віварії НМУ, де знаходились на стандартному раціоні та в подібних умовах. Матеріалом для дослідження були аорта та сироватка крові піддослідних тварин.
Моделювання артеріосклерозу Менкеберга здійснювали шляхом введення 1% розчину монойодацетату (МЙА) із розрахунку 25 мг/кг внутрішньовенно через день (рН 7,4) протягом 30 діб та ергокальциферолу з розрахунку 50 000 ОД/кг (0,125%-й масляний розчин, в 1 мл – 50 000 ОД) перорально протягом 14 діб. Моделювання артеріосклерозу за допомогою введення ергокальциферола пов’язане з його здатністю істотно збільшувати загальний вміст кальцію в крові. Ергокальциферол також індукує проліферацію гладеньком’язових клітин з подальшим збільшенням продукції екстрацелюлярного матриксу. Типовим для гіпервітамінозу D є прошаркова кальцифікація сполучнотканинних структур судин. МЙА використано як класичний інгібітор гліколізу, а, крім того, за сучасними даними, і системи тканинного дихання судинної стінки з розвитком в подальшому типових для артеріосклерозу вказаного типу морфологічних змін. Атеросклероз відтворювали шляхом перорального введення 10% емульсії холестерину (ХС) в олії з розрахунку 0,2 г кристалічного ХС на 1 кг маси тварин протягом 30 діб. Крім того, в окремій серії дослідів проводили моделювання комбінованого типу ураження судин за допомогою одночасного введення МЙА та ХС по вищенаведеній схемі.
Загальний ліпідний екстракт готували, використовуючи однофазну систему розчинників хлороформ-метанол-вода (1:2:0,8 по об’єму) (Кейтс М., 1975). Вміст загального холестерину визначали по колориметруванню проб проти реакційної суміші (Чаяло П.П., 1990). Визначення тригліцеридів (ТГ) та загальних ліпідів проводили з використанням тест-наборів фірми “Лахема” (Чехія). Вміст фосфоліпідів (ФЛ) визначали колориметрично після мінералізації ліпідного екстракту (Покровський А.А., 1969). Розподіл ліпопротеїдів сироватки крові проводили в градієнті поліакриламідного гелю з наступною автоматичною денситометрією результатів (Маграчова Е.Я., 1973). Визначення вмісту гідроперекисів ліпідів (ГП) в сироватці крові здійснювали за УФ-поглинанням ліпідного екстракту крові (Гаврилов М.Б., Мишкорудная М.И., 1983). Активність каталази визначали спектрофотометрично (Королюк М.А. и соавт., 1988) відповідно до її здатності гальмувати утворення забарвленого комплексу з солями молібдена. Визначення продуктів перекисного окиснення ліпідів в сироватці крові здійснювали по тесту з тіобарбитуровою кислотою в бутанольному екстракті, що дозволяло в подальшому розрахувати концентрацію активних продуктів (Гаврилов В.Б., Гаврилова А.Р., Мажуль Л.М., 1987). Активність супероксиддисмутази (СОД) визначали по відсотку блокування утворення нітроформазану (Чевари С., Андял Т., Штренгер Я., 1991). Реєстрацію індукованої хемілюмінесценції проводили після додавання до сироватки крові перекису водню шляхом оцінки світлосуми спалаху (Журавлев А.К., Шерстнев М.П., 1985). Визначення вищих жирних кислот (ЖК) в ліпідному екстракті аорт (Гичка С.Г. и соавт., 1998) виконано у відділі газової хроматографії НДЛЦ НМУ ім.О.О.Богомольця. Математична обробка отриманих експериментальних даних здійснювалась на ПК ІВМ Am586 із використанням програм Sigma Plot 5.0, Exel 97. Визначали М – середню арифметичну, m – її помилку, Р – вірогідність розбіжностей середніх величин.
РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ ТА ЇХ ОБГОВОРЕННЯ
Дослідження ліпідних показників в сироватці крові та тканинах аорти кролів при моделюванні різних видів артеріосклерозу.
В результаті біохімічних досліджень сироватки крові піддослідних тварин було встановлено, що зміни ліпідного складу крові відбуваються вже на початкових стадіях артеріосклерозу. Зокрема, за умов моделювання МЙА-го та ергокальциферолового артеріосклерозу відмічено прогресуюче збільшення вмісту загальних ліпідів, головним чином, за рахунок гіперхолестеринемії (ГХС) та гіпертригліцеридемії (ГТГ) (табл. 1-3).
Таблиця 1. Вміст загальних ліпідів в сироватці крові кролів при моделюванні різних видів артеріосклерозу (г/л, Мm).
Термін експери-менту | Експериментальний вплив | Введення ерго-кальциферолу
n=20 | Введення монойодацетату
n=25 | Введення
холестерину
n=14 | Комбіноване введення холестерину та монойодацетату
n=18 | Вихідне значення | 2,32 0,06 | 2,23 0,09 | 2,33 0,10 | 2,22 0,12 | 1 тиждень | 4,81 0,30* | 3,37 0,17* | 6,64 0,15* | 4,22 0,11* | 2 тижні | 5,90 0,30* | 3,21 0,12* | 8,63 0,14* | 7,22 0,31* | 3 тижні | - | 3,55 0,20* | 10,23 0,22* | 10,22 0,40* | 4 тижні | - | 4,53 0,17 * | 13,70 0,57* | 13,11 0,20* | * - тут та в табл.2-11 Р0,05 у порівнянні з контролем.
Таблиця 2. Вміст загального холестерину в сироватці крові кролів при моделюванні різних видів артеріосклерозу (ммоль/л, Мm).
Термін експери-
менту | Експериментальний вплив
Введення ергокальци-
феролу
n=17 | Введення монойодацетату
n=18 | Введення
холестерину
n=12 | Комбіноване введення холестерину та монойодацетату
n=14
Вихідне значення | 1,58 0,04 | 1,44 0,10 | 1,63 0,07 | 1,76 0,10
1 тиждень | 3,24 0,33* | 1,90 0,10* | 4,02 0,22* | 4,04 0,26*
2 тижні | 2,93 0,38* | 1,85 0,13* | 6,75 0,27* | 6,04 0,23*
3 тижні | - | 1,85 0,11* | 8,64 0,59* | 7,87 0,47*
4 тижні | - | 1,86 0,13* | 11,31 0,85* | 9,15 0,58*
Таблиця 3. Вміст тригліцеридів в сироватці крові кролів при моделюванні різних видів артеріосклерозу (ммоль/л, Мm).
Термін експери-менту | Експериментальний вплив
Введення ергокальци-
феролу
n=16 | Введення монойодацетату
n=16 | Введення
холестерину
n=14 | Комбіноване введення холестерину и монойодацетату
n=18
Вихідне значення | 1,21 0,08 | 1,14 0,06 | 1,23 0,08 | 1,27 0,11
1 тиждень | 1,88 0,14* | 1,50 0,06* | 1,88 0,15* | 1,36 0,13
2 тижні | 2,50 0,23* | 1,43 0,08* | 1,92 0,17* | 1,93 0,17*
3 тижні | - | 1,58 0,15* | 2,42 0,26* | 2,49 0,17*
4 тижні | - | 2,20 0,24* | 3,41 0,36* | 3,42 0,38*
Проведений аналіз розподілу ЛП сироватки крові при ергокальцифероловій моделі артеріосклерозу демонструє прогресуюче збільшення фракції ліпопротеїдів низької щільності (ЛПНЩ), приріст яких складав 153% у порівнянні з вихідним значенням та зниження на 20% вмісту ліпопротеїдів високої щільності (ЛПВЩ). В цілому, це свідчить про розвиток “атерогенного” дисбалансу ЛП (рис.1).
При іншій моделі менкебергівського артеріосклерозу – монойодацетатній – встановлено аналогічну тенденцію у зміні ЛП-складу сироватки крові. При цьому приріст відносного вмісту ЛПНЩ через 4 тижні складав 41% у порівнянні з контролем. При співставленні вмісту в сироватці крові ХС та фракції ЛПНЩ чітко виявляється односпрямованість їх змін. Крім того, наведена модель характеризувалась відносним збільшенням вмісту ЛПДНЩ, що корелює з ГТГ. Динаміка вмісту ЛПВЩ при введенні МЙА характеризується в цілому їх поступовим зменшенням. Таким чином, і при моделюванні МЙА-артеріосклерозу менкебергівського типу формується ДЛП-стан крові (рис.2).
Комбінованою дією ХС та МЙА поредбачалось відтворити ГХС та одночасне пригнічення енергозабазпечення судин з подальшим розвитком в них дистрофічних змін. Проведена при цьому порівняльна оцінка гіперліпідемії та ДЛП демонструє значення цього біохімічного фактору в розвитку склерозу судин. Так, тварин з ХС- та комбінованим артеріосклерозом спостерігався найбільший вміст загальних ліпідів, ХС та ТГ в сироватці крові (див. табл. 1-3). Їх абсолютне значення при зазначених моделях майже не відрізнялось. Визначення ЛП-спектру сироватки крові через 4 тижні експерименту при комбінованому впливі показало збільшення вмісту ЛПНЩ на 319% (Р0,05) та зменшення ЛПВЩ на 65% (Р0,05) (рис.3). Така зміна спектру ЛП крові є характерною для атерогенного типу ДЛП.
Відмічені порушення ліпідного складу сироватки крові формують біохімічні передумови для розвитку ураження судинної стінки. Складні структурні зміни в межах середнього шару судин, що розвиваються під дією ергокальциферолу та МЙА, певною мірою впливають на транспорт ЛП через судинну стінку. Зокрема, пошкоджуючий вплив високих доз ергокальциферолу на клітини судинної стінки (Атаман А.В., 1991) може порушувати рецептор-опосередкований шлях надходження ЛП-комплексів та певною мірою зумовлювати вибіркове накопичення лише ТГ (табл. 4).
Таблиця 4. Вміст ліпідів в тканинах аорти кролів при моделюванні різних видів артеріосклерозу (мг/г тканини, Мm).
Експериментальний впливЗагальний холестерин | Тригліцериди | Фосфоліпіди
І Контрольна група (n=8) | 2,38 0,15 | 13,98 0,95 | 7,16 0,56
ІІ Введення ергокальциферолу (n=12) | 2,30 0,10 | 21,50 1,66*5,26 0,22*
ІІІ Введення монойодацетату (n=15) | 3,33 0,07*, ** | 28,85 1,72*, ** | 22,54 1,28*, **
ІV Введення холестерину (n=10) | 4,47 0,10*, **, *** | 30,91 2,83*, **9,73 0,55*, **, ***
V Комбіноване введення холестерину та монойодацетату (n=15) | 3,56 0,15*, **, **** | 23,51 0,93*,***, **** | 21,35 1,41*, **, ****
** - Р0,05 у порівнянні з групою ІІ, *** -у порівнянні з групою ІІІ, **** - у порівнянні з групою ІV.
Дослідження ліпідного екстракту аорт при введенні МЙА показало збільшення вмісту ХС на 40% (Р0,05). Рівень ХС в тканинах аорти в даному випадку адекватно відображає відповідний приріст ХС в сироватці крові (наприкінці досліду його приріст становив 30%, вміст найбільш багатої на ХС фракції ЛПНЩ – на 41%). В наших дослідах мало місце збільшення вмісту в аорті кролів і ТГ (на 106%, Р0,05). Відповідно сироватковий приріст ТГ складав 93%, приріст ЛПДНЩ – 111%. Вміст ФЛ в аорті при введенні МЙА збільшився на 215% (Р0,05), що значно перевищує приріст інших класів ліпідів. Це дозволяє припустити можливу активацію їх біосинтезу. Таким чином, МЙА, використаний для моделювання судинних уражень з первинно дистрофічним механізмом їх розвитку, сприяв формуванню як гіперліпідемії та ДЛП, так і розвитку ліпоїдозу аорти.
Відтворення холестеринового атеросклерозу у кролів супроводжувалось значним збільшенням вмісту ліпідів в тканинах аорти. Зокрема, рівень ХС збільшився на 88% (Р0,05), ТГ – на 121% (Р0,05), ФЛ – на 36% (Р0,05). Вміст ХС та ТГ в сироватці крові також мав найбільші значення: приріст становив відповідно 594% та 177%.
В серії дослідів по вивченню комбінованого впливу на судини ХС та МЙА отримано такі дані. Вміст в аорті ХС збільшився на 50% (Р0,05). Співставлення даного показника в цьому експерименті і при введенні тваринам лише МЙА показує, що одночасна дія ХС та МЙА не сприяє більшому накопиченню ХС в судинній стінці (різниця між моделями 0,05). Порівняльний аналіз вмісту ХС в аорті при комбінованій дії та відтворенні холестеринового атеросклерозу доводить, що додаткове введення МЙА гальмує накопичення ХС (р0,05). Таку ж саму особливість виявлено і при порівняльному аналізі вмісту в аорті ТГ: значення данного показника було вірогідно меншим ніж при введенні ХС чи МЙА. Проте, звертає на себе увагу, що відтворення у кролів комбінованого типу судинного ураження супроводжується розвитком ліпоїдозу аорти, однак ступінь його менша, ніж при введенні кожного з агентів порізно. Нарешті, вміст ФЛ у тварин цієї групи значно перевищує відповідний показник у тварин ХС-групи (в 2,2 рази, Р0,05). Звертають на себе увагу близькі значення вмісту ФЛ при введенні МЙА в комбінації з ХС чи порізно (Р0,05). Ймовірно, має місце стимуляція синтезу цього класу ліпідів під дією МЙА.
2. Дослідження вмісту жирних кислот в стінці аорти при моделюванні різних видів артеріосклерозу.
Функціонування ЛП як транспортної системи кровотоку відображає спрямованість потоків вищих жирних кислот (Титов В.Н., 1999). Природньо, що від особливостей їх обміну безпосередньо в судинній стінці залежить і спрямованість патофізіологічних змін in situ.
Як видно з наведених в таблиці 5 даних, моделювання менкебергівського артеріосклерозу шляхом введення ергокальциферолу та МЙА супроводжується істотними змінами в ЖК-спектрі ліпідів аорти. Встановлено, що вміст насичених ЖК зменшився відповідно на 22% (Р0,05) та 27% (Р0,05).
Таблиця 5. Вміст жирних кислот в стінці аорти кролів при моделюванні різних видів артеріосклерозу (%, Мm).
Жирова кислота | Експериментальний вплив
Контроль
n=8 | Введення ергокальциферолу
n=13 | Введення монойодацетату
n=13 | Введення холестерину
n=6 | Комбіноване введення холестерину та монойодацетату
n=14
С16:042,0 1,0 | 33,0 1,731,3 0,726,2 0,933,2 1,3
С18:017,2 0,3 | 13,2 0,6 | 11,8 0,8 | 13,3 1,1 | 11,5 0,7
С18:121,9 1,2 | 18,2 0,7 | 18,9 0,6 | 18,8 1,5 | 17,8 0,6
С18:213,4 1,2 | 24,3 1,725,2 0,816,4 1,4 | 25,2 1,6
С20:45,5 1,5 | 11,3 1,812,8 1,825,3 3,912,3 2,5
Сума насичених жирових кислот | 59,2 1,0 | 46,2 2,243,1 1,539,5 1,244,7 1,3
Сума ненасичених жирових кислот | 40,8 1,0 | 53,8 2,256,9 1,560,5 1,255,3 1,3
Сума поліне-насичених жирових кислот | 18,9 1,5 | 35,6 2,638,0 1,641,7 2,637,5 1,6
Припущення про можливі механізми цих змін пов’язані як з місцевими факторами в судинній стінці, так і з змінами в спектрі ліпідів та ЛП крові, що виникають в умовах експерименту. Так, відомо, що транспорт насичених ЖК здійснюється, головним чином, ТГ, структурованими в ЛПДНЩ (Титов В.Н., 1999). Проте, в нашому дослідженні при введенні ергокальциферолу не знайдено збільшення вмісту фракції ЛПДНЩ, так само як і не зріс вміст ТГ в стінці аорти. Навпаки, під дією МЙА збільшився відностний вміст ЛПДНЩ, що супроводжувалось накопиченням в стінці аорти ТГ. За цих умов зниження вмісту насичених ЖК може бути наслідком пригнічення їх синтезу in situ, викликаному зумовленим ефектами МЙА глибоким енергодефіцитом (Биць Ю.В., 1973).
З літератури відомо, що полієнові кислоти надходять в клітини у складі ефірів ХС (ЕХС) ЛПНЩ (Титов В.Н., 1998). В наших дослідах по відтворенню ергокальциферолового артеріосклерозу мало місце відносне збільшення вмісту ЛПНЩ. Проте, значний приріст ненасичених ЖК в стінці аорти не супроводжувався накопиченням ХС. Отже, гіперліпідемія та ДЛП, що розвиваються під дією ергокальциферолу, з якихось причин не сприяли надходженню ЕХС до клітин судинної стінки, не зважаючи на збільшення питомої ваги модифікаційних форм ЛП (зокрема, за рахунок перекисного шляху). Слід припустити можливість того, що розвиток в даних експериментальних умовах виражених некротичних змін внаслідок активації кальцієвих механізмів пошкодження виключає участь структур судинної стінки в захваті та депонуванні транспортованих поліненасичених жирових кислот (ПНЖК). Відмічене збільшення вмісту ненасичених ЖК може бути зумовлене їх вивільненням їз зруйнованих клітин (Ажгихин И.С. и соавт., 1987). Крім того, збільшення вмісту ПНЖК створює сприятливі передумови для перебігу в стінці аорти реакцій ПОЛ, що зумовлює включення додаткового важливого механізму пошкодження.
Що стосується збільшення в судинній стінці вмісту ненасичених ЖК під впливом МЙА (на 40%, Р0,05), то, враховуючи описані вище зміни ЛП-спектру крові при цій моделі, їх додаткове надходження може бути пов’язане із збільшенням рівня ЛПНЩ. В подальшому це обумовлює і накопичення ХС в стінці аорти. Зміна жирнокислотного складу мембран сприяє порушенню іонної сталості клітин, що викликає активацію синтезу та секреції компонентів сполучнотканинного матриксу, зокрема, фібробластами (Орехов А.Н., 1991; Cabrera Fischer E.I., Armentano R.L., Levenson J., 1991). Додатковий внесок в синтез колагену та еластину вносять трансформовані гладеньком’язові клітини (Тертов В.В. и соавт., 1982).
ХС-модель атеросклерозу характеризувалась найбільш вираженими змінами в ЖК-складі стінки аорти: в досліді вміст насичених ЖК зменшився на 34% (Р0,05), вміст ненасичених ЖК зріс на 48% (Р0,05), ПНЖК – на 121% (Р0,05). Звертає на себе увагу виражений (на 360%) приріст арахідонової кислоти. За даними літератури, переважання в ЖК-спектрі ненасичених, зокрема, арахідонової, кислот оцінюється як прогностична ознака прогресування атеросклерозу (Гичка С.Г. и соавт., 1998). Наявні свідоцтва безпосередньої стимулюючої дії арахідонової кислоти на генерацію супероксид-аніону (O’Donnel V.B., Azzi A., 1996; Easton A.S., Fraser P.A., 1998). Особливу роль відіграє порушення метаболізму арахідонової кислоти при атерогенезі, яке характеризується збільшенням продукції вазоконстрикторів та проагрегантів (Ferretti A., Nelson G.J., Schmidt P.C., 1997). Крім того, певне співвідношення в сироватці крові ейкозапентаєнової та арахідонової кислот безпосередньо зумовлюють її атерогенність (Ли Хва Рен, Васильев А.В., Тутельян В.А., 1988). Описані також і особливості антиагрегаційного потенціалу в залежності від типу ДЛП (Малая Л.Т., Ладный А.И., 1991).
Комбінована дія ХС та МЙА призвела до змін в ЖК-складі аорти, подібних до описаних вище. Зокрема, в умовах гіперліпідемії та накопичення ТГ в стінці аорти має місце парадоксальне, на перший погляд, зменшення вмісту насичених ЖК. Очевидно, проявляє свою важливу дію або механізм пригнічення транспорту насичених ЖК та/або їх синтезу. Загальний рівень ненасичених ЖК зріс на 36% (Р0,05), ПНЖК – на 98% (Р0,05). Збільшення вмісту в крові ЛПНЩ та, як наслідок, ХС в аорті, підтверджує саме такий шлях надходження полієнових кислот в клітини. Збільшена ненасиченість ліпідного складу аорти може сприяти подальшим змінам метаболізму полієнових ЖК.
Загалом, в умовах моделювання атеросклерозу і артеріосклерозу Менкеберга відмічене значне збільшення вмісту ненасичених ЖК на фоні інтенсифікації процесів ПОЛ означають наявність важливих субстратних змін в синтезі ейкозаноїдів. Подібні зміни оцінюються як патологічні, вони сприяють пошкодженню судинної стінки. Зниження рівня насичених ЖК в тканинах аорти також вказує на порушення метаболізму ЖК. Найбільш вірогідним поясненням цього може бути порушення їх синтезу внаслідок пошкодження клітин судинної стінки.
Дослідження процесів перекисного окиснення ліпідів та антиоксидантної активності в сироватці крові при моделюванні різних видів артеріосклерозу.
Активні форми кисню – О-2 , О·, ОН-, НО2 – викликають вільнорадикальне окиснення полієнових ЖК мембранних ФЛ з утворенням різних цитотоксичних продуктів (Akiba S. et al., 1997). Ліпопероксиди є нестійкими та можуть підлягати подальшому перекисному окисненню з утворенням вторинних продуктів, які, в свою чергу, зумовлюють суттєве порушення клітинного метаболізму внаслідок пошкодження структури мембран та активності мембранозв’язаних ферментів (Владимиров Ю.А., Арчаков А.И, 1972). Цьому протидіють АО ферменти – СОД, каталаза та ін. Якщо баланс між напруженістю процесів ПОЛ та активністю АО системи порушується, то це відіграє важливу роль у формуванні судинних пошкоджень.
В роботах останніх років доведено, що визначення хемілюмінесценції (ХЛ) сироватки крові адекватно відображає стан ПОЛ в організмі (Барабой В.А., Сутковой Д.А., 1997). Результати наших досліджень ХЛ сироватки крові при моделюванні артеріосклерозу наведено в таблиці 6.
Таблиця 6. Інтенсивність хемілюмінесценції сироватки крові кролів при моделюванні різних видів артеріосклерозу (mV, M m).
Термін експерименту | Експериментальний вплив
Введення ергокальциферолу
n=16 | Введення монойодацетату
n=16 | Введення холестерину
n=10 | Комбіноване введення холестерину та монойодацетату
n=13
Вихідне значення | 50,83 2,73 | 50,83 2,73 | 50,83 2,73 | 50,83 2,73
1 тиждень | 42,20 2,25*78,40 3,9560,26 0,8994,02 4,02
2 тижні | 32,62 3,8442,41 2,6167,56 0,7580,16 4,12
3 тижні | - | 69,90 3,7475,79 1,2190,00 1,12
4 тижні | - | 93,46 4,7046,09 2,15 | 86,34 1,83
У тварин ергокальциферолової групи зареєстровано прогресивне зниження ХЛ. Приймаючи до уваги вказівки на прооксидантну дію вітаміну D, можна передбачати утруднення процесів рекомбінації вільних радикалів, що, як відомо, і зумовлює квантовий вихід світіння (Барабой В.А., Орел В.Э., Карнаух И.М., 1991). Крім того, значне та довготривале посилення ПОЛ призводить до зменшення вмісту легко окислюваних ненасичених ЖК (Дудник Л.Б., Биленко М.В., Алесенко А.В., 1981).
Дія МЙА супроводжувалась різноспрямованими змінами ХЛ протягом експерименту, проте в цілому мала місце значна активація ПОЛ.
Перекисні ланки патогенезу медіакальцинозу певною мірою підтверджуються роботами по вивченню функціонування кальцієвих каналів, залежних від метаболітів ПНЖК (Архипенко Ю.В. и соавт., 1987; Асташкин Е.И. и соавт., 1998).
Комбінована дія ХС та МЙА супроводжується найбільшим ступенем активації ПОЛ, яка реєструвалась по ХЛ. При цьому зафіксовано значно більші величини ХЛ у порівнянні з ХС-моделлю атеросклерозу у всі терміни дослідження, у порівнянні з МЙА-моделлю – протягом перших трьох тижнів. Очевидно, комбінована дія вказаних ангіосклеротичних агентів призводить до кумуляції їх ефектів по відношенню до ПОЛ.
В результаті ланцюга окисних реакцій утворюються гідроперекиси ліпідів. Так, ненасичені ЖК, які входять до складу ТГ, ФЛ, ЕХС, взаємодіють з первинним вільним радикалом (переважно кисневим, але також і ліпідним) з утворенням вільного ліпідного радикала. Останній, взаємодіючи з молекулярним киснем, утворює ліпідний перекис. Далі, ліпідний перекис, взаємодіючи з новою молекулою ненасиченої ЖК, утворює ліпідний гідроперекис та новий вільний ліпідний радикал (КлимовА.Н., Никульчева Н.Г., 1995). Вміст ГП дозволяє оцінити ступінь активації ПОЛ.
Таблиця 7. Вміст гідроперекисів ліпідів в сироватці крові кролів при моделюванні різних видів артеріосклерозу (D233/ мл, М m).
Термін експерименту | Експериментальний вплив
Введення ергокальциферолу
n=16 | Введення монойодацетату
n=16 | Введення холестерину
n=10 | Комбіноване введення холестерину та монойодацетату
n=13
Вихідне значення | 0,21 0,03 | 0,22 0,05 | 0,21 0,03 | 0,22 0,04
1 тиждень | 1,36 0,11*2,07 0,07* | 3,32 0,13* | 2,89 0,21*
2 тижні | 4,19 0,47*1,76 0,28* | 1,77 0,07* | 2,87 0,35*
3 тижні | - | 2,05 0,28* | 2,92 0,07* | 2,19 0,25*
4 тижні | - | 1,71 0,09*3,72 0,09* | 4,07 0,60*
Як видно з наведених в таблиці 7 даних, моделювання ергокальциферолового артеріосклерозу супроводжується різко вираженим збільшенням вмісту ГП. Таке накопичення ГП свідчить про виражену активацію ПОЛ. Виявлена невідповідність між інтенсивністю ХЛ та значним збільшенням вмісту ГП певною мірою може бути пов’язана з кінетикою ПОЛ, а саме – з гальмуванням подальшого розпаду ГП з утворенням вільних радикалів (Сидорик Е.П., Баглей Е.А., Данко М.И., 1989).
Введення МЙА також призвело до збільшення вмісту ГП, рівень яких значно зріс вже через 1 тиждень, в подальшому також був істотно збільшеним. Пояснення цьому факту можна знайти в ряді робіт, із яких витікає, що МЙА через стадію утворення -гліцерофосфату активує синтез ліпідів, зокрема ненасичених ЖК, що створює передумови для активації ПОЛ (Либерман А.Д., 1964; Сагидуллин Ф.А., 1965).
Дія на піддослідних тварин ХС супроводжувалась значним збільшенням вмісту ГП в крові протягом всього терміну експерименту. Такі високі показники вмісту ГП спостерігали і інші автори при дослідженні ПОЛ в динаміці розвитку атеросклерозу (Ланкин В.З. и соавт., 1979; Давидко Л.В., 1998).
Комбіноване введення тваринам ХС та МЙА сприяло різкому збільшенню вмісту ГП вже через 1 тиждень із збереженням досягнутого рівня протягом 2-го та 3-го тижнів. Наприкінці досліду (4 тижні) їх рівень додатково значно збільшився, склавши 18,5-кратне перевищення вихідного значення.
Таким чином, встановлені високі рівні ГП в крові експериментальних тварин свідчать про активацію процесів ПОЛ. Зважаючи на кореляцію між швидкісю накопичення ГП та ступенем ненасиченості ЖК (Серкиз Я.И. и соавт., 1989), та приймаючи до уваги відсутність додаткового надходження ПНЖК піддослідним тваринам з їжею, слід передбачати глибокі структурні зміни з боку ліпідних фракцій крові та клітин з використанням ЖК як субстрата вільнорадикального окиснення.
В результаті подальшої деградації ЖК-залишків утворюються проміжне і кінцеві молекулярні продукти. Один з них – малоновий діальдегід (МДА), визначення динаміки концентрації якого використовується як показник інтенсивності ПОЛ (Барабой В.А., Орел В.Э., Карнаух И.М., 1991).
Таблиця 8. Вміст малонового діальдегіду в сироватці крові кролів при моделюванні різних видів артеріосклерозу (нмоль/мл, М m).
Термін експерименту | Експериментальний вплив
Введення ергокальциферолу
n=16 | Введення монойодацетату
n=16 | Введення холестерину
n=10 | Комбіноване введення холестерину та монойодацетату
n=13
Вихідне значення | 2,28 0,06 | 2,28 0,06 | 2,28 0,06 | 2,28 0,06
1 тиждень | 3,84 0,09*2,92 0,15* | 3,27 0,04* | 2,66 0,09
2 тижні | 3,47 0,09* | 2,84 0,24* | 3,52 0,06* | 3,00 0,09*
3 тижні | - | 3,12 0,09* | 3,63 0,09* | 3,26 0,05*
4 тижні | - | 3,34 0,06* | 3,72 0,05* | 3,61 0,10*
З наведених в таблиці 8 даних видно, що моделювання у тварин артеріосклерозу менкебергівського типу супроводжується накопиченням прикінцевого продукту ПОЛ – МДА, що вказує на можливу патогенетичну роль активації вільнорадикального окиснення ліпідів в розвитку цього типу ураження судин. Вплив ергокальциферолу та МЙА на ПОЛ зумовлений як збільшенням кількості субстрату окиснення (що підтверджується даними про вміст різних класів ліпідів в сироватці крові та тканинах аорти), так і прямою прооксидантною дією застосованих агентів (Абрамова Ж.И., Оксегендлер Г.И., 1985).
Відтворення ХС-атеросклерозу та комбінованого типу судинного ураження у кролів призвело до збільшення вмісту МДА, яке наростало з часом. Дані про збільшення вмісту МДА широко приводяться в роботах по вивченню ліпідних механізмів атерогенезу (El Hafidi M., Banos G., 1997). Відомо, що накопичення МДА та інших ненасичених альдегідів викликає модифікацію ЛПНЩ та збільшує їх поглинання клітинами, що здатні до скевенджер-активності, з подальшою трансформацією останніх в так звані “пінні” (Томпсон Г.Р., 1990; Lu G. et al., 1998).
Кінетика реакцій перекисного окиснення значною мірою пов’язана з активністю АО ферментів. В літературі СОД розглядається як маркер АО забезпеченості (Rao J., Jagadeesan V., 1996). Дані визначення активності СОД наведені в таблиці 9.
Моделювання у тварин артеріосклерозу менкебергівського типу характеризується різноспрямованими 2-фазними змінами активності СОД. При цьому збільшення її активності через 2 тижні введення ергокальциферолу та протягом 3 тижнів введення МЙА, згідно з літературними даними, може свідчити про адаптивне посилення функціонування АО системи (Lin C-S. et al., 1997; Байкова В.Н. и соавт., 1998).
Таблиця 9. Активність супероксиддисмутази в сироватці крові кролів при моделюванні різних видів артеріосклерозу (в умовних одиницях, М m).
Термін експерименту | Експериментальний вплив
Введення ергокальциферолу
n=16 | Введення монойодацетату
n=16 | Введенння холестерину
n=10 | Комбіноване введення холестерину та монойодацетату
n=13
Вихідне значення | 19,61 1,35 | 19,61 1,35 | 19,61 1,35 | 19,61 1,35
1 тиждень | 10,79 1,25* | 30,47 0,66* | 19,40 1,01 | 17,67 0,78
2 тижні | 34,31 1 ,15* | 29,82 1,95* | 17,40 0,47 | 18,46 0,77
3 тижні | - | 31,12 1,59* | 34,12 1,01* | 21,31 1,31
4 тижні | - | 13,83 1,36* | 14,00 0,64* | 13,59 0,62*
Дослідження активності СОД у тварин ХС-групи не показало значних змін протягом першої половини експерименту. В подальшому коливання активності СОД відображають ступінь участі даної ланки АО системи в перебігу процесів ПОЛ. В цілому, для ХС-моделі характерна невисока активність СОД, що свідчить про переважання пошкоджуючих впливів продуктами ПОЛ.
При комбінованому способі відтворення артеріосклерозу не відмічено різких змін активності СОД: протягом перших 3-х тижнів вона не змінювалась, наприкінці досліду – зменшилась на 31% (Р0,05).
Обговорення ролі каталази в механізмах розвитку артеріосклерозу базується на оцінці її як показника активності АО системи. Про компенсаторне значення збільшення активності цього АО ферменту мова йде в більшості літературних джерел (Hanashima C., Namiki H., 1997). Однак наявні літературні дані не дають можливості однозначного їх тлумачення (Mohan I.K., Das U.N., 1997; Metsuki O. et al., 1998). Наведені дані і про протилежні зміни СОД та каталази при атеросклерозі (Rao J., Jagadeesan V., 1996).
За нашими даними, моделювання разних видів артеріосклерозу супроводжується в цілому зниженням активності каталази (табл. 10.).
Таблиця 10. Активність каталази в сироватці крові кролів при моделюванні різних видів артеріосклерозу (мкат/л, Мm).
Термін експерименту | Експериментальний вплив
Введення ергокальциферолу
n=16 | Введення монойодацетату
n=16 | Введення холестерину
n=10 | Комбіноване введення холестерину та монойодацетату
n=13
Вихідне значення | 78,761,06 | 78,351,24 | 73,230,51 | 70,970,63
1 тиждень | 58,642,67* | 57,631,57* | 53,024,50* | 69,382,32
2 тижні | 45,991,94* | 49,095,50* | 53,890,79* | 59,032,25*
3 тижні | 64,422,13* | 59,311,51* | 56,182,14*
4 тижні | 73,901,86 | 60,900,76* | 61,053,79*
Відмічене зниження активності каталази в процесі моделювання атеросклерозу та артеріосклерозу Менкеберга вказує на недостатність АО ферментативних систем організму. Це дозволяє передбачати зсув динамічної рівноваги між АО системою та ПОЛ в бік переважання останнього з формуванням важливої ланки пошкодження в розвитку цих видів судинної патології.
На завершення проведена оцінка сумарного балансу між процесами вільнорадикального окиснення та активністю АО захисту по фактору АО стану, який розраховується таким чином: активність каталази активність СОД / концентрація МДА (табл.11) (Чевари С., Андял Т., Штренгер Я., 1991).
Таблиця 11. Величина фактору антиоксидантного стану при моделюванні різних видів артеріосклерозу.
Термін експерименту | Експериментальний вплив
Введення ергокальциферолу | Введення монойодацетату | Введення холестерину
