КИЇВСЬКИЙ НАЦІОНАЛЬНИЙ УНІВЕРСИТЕТ

ІМЕНІ ТАРАСА ШЕВЧЕНКА

ЛЯЩЕНКО ТАРАС ПЕТРОВИЧ

УДК 612.35:616.36

ВПЛИВ СУБСТАНЦІЇ Р НА ЖОВЧОСЕКРЕТОРНУ

ФУНКЦІЮ ПЕЧІНКИ І ХІМІЧНИЙ СКЛАД ЖОВЧІ

03.00.13 – фізіологія людини і тварин

Автореферат дисертації на здобуття

наукового ступеня кандидата біологічних наук

КИЇВ – 2001

Дисертацією є рукопис

Роботу виконано в НДІ фізіології імені академіка Петра Богача

Київського національного університету імені Тараса Шевченка

Науковий керівник: доктор біологічних наук, старший

науковий співробітник Масюк Анатолій Іванович, НДІ

фізіології імені академіка Петра Богача Київського

національного університету імені Тараса Шевченка,

старший науковий співробітник відділу загальної фізіології

Офіційні опоненти: доктор біологічних наук, професор,

Цибенко Всеволод Олексійович, кафедри фізіології

людини і тварин біологічного факультету Київського

національного університету імені Тараса Шевченка, професор

Доктор медичних наук, професор, член-кореспондент АПН України

Шевчук Віктор Григорович,

Національний медичний університет ім. О.О.Богомольця,

завідуючий кафедрою нормальної фізіології

Провідна установа: Інститут ендокринології

та обміну речовин АМН України, Київ.

Захист відбудеться 18 червня 2001 року о 14 годині

на засідання спеціалізованої вченої ради Д 26.001.38 при Київському

національному університеті імені Тараса Шевченка за адресою:

01033 Київ-33, вул. Володимирська, 64, біологічний факультет, ауд. 215.

З дисертацією можна ознайомитися у бібліотеці Київського

національного університету імені Тараса Шевченка за адресою:

01033 Київ, вул. Володимирська, 58.

Автореферат розісланий 16 травня 2001 року.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради Т.Л.Давидовська.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Однією з традиційних галузей фізіології людини і тварин є дослідження механізмів регуляції процесів життєдіяльності організму. Як відомо, в живому організмі існує декілька типів регуляторних систем, серед яких одне з провідних місць посідає пептидергічна система регуляції. Основним компонентами цієї системи є низькомолекулярні пептиди, що забезпечують перенесення необхідної інформації, координацію, нормальне функціонування, розвиток та взаємодію клітинних популяцій. Такі речовини були виділені із багатьох тканин і органів, досліджено їх вплив на життєдіяльність організму за умов норми і патології (Ашмарин, 1984; Ашмарин, Обухова, 1986; Громов, 1992; Holzer and Holzer-Petsche, 1997).

Пептидним регуляторам притаманний широкий спектр впливу на функціональний стан органів і їх систем. Значна кількість регуляторних пептидів нервової і ендокринної систем бере участь у нейрогуморальній регуляції жовчоутворювальної функції печінки (Климов, 1986; Масюк, 1991). Перелік таких пептидів постійно збільшується. Очевидно, до них слід віднести і субстанцію Р. З відкриття 70 років тому von Euler and Gaddum (1931) в мозкові і кишківнику коней неподібної до ацетилхоліну речовини, що справляла гіпотензивну дію, викликала скорочення кишківника і була названа субстанцією Р (від “powder” - порошок) і почався період інтенсивного вивчення гуморальних регуляторних факторів пептидного походження. Секреція жовчі - одна з найважливіших функцій печінки, яка регулюється багатьма пептидами, а роль субстанції Р в цьому процесі достатньо не вивчена. Відомо, що тахікініни відіграють важливу роль в регуляції моторної функції різних ділянок шлунково-кишкового тракту (Добровольська, 1988; Llewelyn-Smith et al., 1988; Otsuka and Yoshioka, 1993; Watson et al., 1994), секреторної функції шлунка (Holzer and Holzer-Petsche, 1997; Гушинець, 1999), екзокринної функції підшлункової залози (Фокина, Павлов, 1986; Bhatia et al., 1998), скоротливої діяльності жовчного міхура (Mawe, 1995). Слід зазначити, що роль і місце субстанції Р в механізмах регуляції жовчоутворювальної функції печінки до тепер практично не зясовані. Поодинокі тезисні суперечливі повідомлення з цього приводу не дозволяють скласти певну думку про значення субстанції Р в нейрогуморальних механізмах регуляції рівня холерезу і якісного складу жовчі (Янчук і співавт., 1990; Сокур, 1995; Масюк, 1999). Результати експериментального дослідження змін функціонального стану печінки становитимуть певний інтерес для теорії нейрогуморальної регуляції холерезу і практикуючих гепатологів, котрі нерідко мають справу з порушеннями останнього. Вищевикладене обумовило мету і основні завдання дисертаційної роботи.

Звязок роботи з науковими програмами, планами, темами. Роботу було виконано в рамках наукової тематики НДІ фізіології імені академіка Петра Богача “Дослідити функціональні взаємостосунки тироксину і деяких пептидів в регуляції секреторної функції травних залоз, електрогенезу і механічної активності гладеньких мязів шлунково-кишкового тракту” (1992-1996 рр.), номер держреєстрації 0194U017665 і “Дослідження внутрішньоклітинних механізмів регуляції функціонального стану гепато-біліарної системи” (1997-2000 рр.), номер держреєстрації 0197U003102.

Мета і задачі дослідження. Мета роботи - дослідити зміни рівня жовчоутворювальної функції печінки і хімічного складу жовчі під впливом субстанції Р.

Основні завдання роботи:

- визначити інтенсивність секреції жовчі у собак при дії субстанції Р;

- дослідити вміст жовчних кислот, холестерину, білірубіну і загального білка в жовчі собак під впливом субстанції Р;

- дослідити вплив речовини Р на рівень холесекреції і хімічний склад жовчі у атропінізованих собак;

- визначити рівень секреції жовчі у щурів при дії субстанції Р;

- дослідити вміст жовчних кислот і ліпідних складових в жовчі щурів під впливом речовини Р;

- вивчити вплив селективних агоністів тахікінінових рецепторів NK1 і NK3 типу на рівень секреції і хімічний склад жовчі у щурів;

- дослідити вплив субстанції Р, NK1 і NK3 тахікінінових агоністів на рівень холерезу у щурів з пригніченою М-холінергічною нервовою сиситемою.

ОБЄКТ ДОСЛІДЖЕННЯ – жовчоутворювальна функція печінки у собак і щурів.

ПРЕДМЕТ ДОСЛІДЖЕННЯ – рівень холерезу і хімічний склад жовчі у тварин.

Наукова новизна одержаних результатів. Вперше ретельно вивчена секреторна функція печінки при дії субстанції Р на двох видах лабораторних тварин. Встановлено, що субстанція Р виражено і довготривало підвищує рівень холесекреції. При цьому змінюється секреція з жовчю основних органічних компонентів секрету - жовчних кислот, білірубіну, білків і ліпідів. Зміни рівня холерезу, кількісного і якісного складу хімічних компонентів жовчі під впливом речовини Р свідчать про те, що пептид впливає на жовчосекреторну функцію печінки на рівні метаболічних процесів. Проаналізовані можливі механізми регуляції секреторної функції печінки субстанцією Р. Вперше показано, що цей поліпептид підвищує біосинтетичну активність гепатоцитів, зокрема щодо новоутворення вільних жовчних кислот – природних регуляторів жовчоутворення.

Практичне значення одержаних результатів. Встановлені закономірності змін секреторної функції печінки при дії субстанції Р розширюють і поглиблюють наші уявлення про роль цього поліпептидного регулятора в організмі. Показано, що для адекватної секреторної відповіді печінки на введений поліпептид необхідна нормальна активність М-холінергічної нервової системи, від чого залежить функціональна готовність ефектора відповідати на гуморальний сигнал. Обгрунтовані гіпотези щодо механізмів регуляції жовчоутворення тахікінінами. Дані про вплив селективних агоністів тахікінінових рецепторів на секреторну функцію печінки становлять практичний інтерес у зв`язку з їх можливим широким застосуванням в лікувальній практиці, зокрема, в гепатології і гастроентерології.

Особистий внесок здобувача. Всі результати дослідження, викладені в дисертаційній роботі, отримані особисто здобувачем. Загальна схема і окремі етапи експерименту, аналіз першоджерел і теоретичні узагальнення, статистична обробка фактичного матеріалу, як і загальні висновки, належать особисто здобувачеві. Наукова оцінка отриманих даних зроблена спільно з науковим керівником доктором біологічних наук А.І. Масюком.

Апробація результатів дисертації. Результати досліджень були представлені, обговорені і схвалені на ХIV зїзді українського фізіологічного товариства (Київ, 1994), науковій конференції Росії і країн СНГ (Томськ,1997), на симпозіумі LIVER AND NERVOUS SYSTEM (Freiburg, Germany, 1997), Всеукраїнській науковій конференції (Луцьк,1998), на конференції “Інформаційна і негентропійна терапія” (Київ, 2000), на міжнародній конференції “Механизмы функционирования висцеральных систем”, присвяченій 75-річчю А.М. Уголєва (Санкт-Петербург, 2001).

Публікації. За матеріалами дисертації опубліковано 10 статей і 3 тез.

Структура і обсяг роботи. Робота викладена на 168 сторінках машинописного тексту. Дисертація складається із вступу, огляду літератури, матеріалів та методів дослідження, результатів досліджень, обговорення результатів, висновків та 19 додатків. Список використаних джерел містить 174 найменувань, у тому числі 125 іноземних авторів. Робота ілюстрована 35 рисунками і 3 таблицями.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ ДИСЕРТАЦІЇ

Матеріали і методи досліджень

Вплив субстанції Р на жовчосекреторну функцію печінки досліджували на 7 безпородних голодних (18-20 годин після годівлі) собаках з комбінованою У-подібною холецисто-дуоденальною фістульною трубкою при двічі перевязаній і перерізаній загальній жовчній протоці (Лященко, 1975). Використана нами методика дозволяє отримувати для аналізу чисту жовч впродовж тривалого експерименту у клінічно здорових собак.

Всі операції проводились за умов асептики і антисептики. Експерименти починали через 18-20 днів після оперативного втручання.

Досліди проводили на голодних собаках в один і той же час доби, тобто з 10 до 14 годин, що запобігало можливим похибкам в оцінці отриманих результатів, повязаних із впливом добового обмінного ритму на холерез. У дослідах враховували кількість жовчі за кожні 30 хвилин впродовж 4 годин секреції. У кожній півгодинній пробі жовчі визначали концентрацію жовчних кислот, холестерину, білірубіну і загального білка (Ростовцев, Резник, 1982; Чевари, Чаба, Эртл, 1983; Петровский и соавт., 1986; Мирошниченко, Савельев, 1989; Весельський та співавт., 1991). Загальний вміст (дебіт) підраховували, помножуючи кількість речовини в одиниці обєму на весь обєм отриманої проби жовчі.

Кількість і хімічний склад жовчі, одержаної в дослідах з експериментальним впливом на тварин, порівнювали з такими ж даними контрольних спроб (спонтанний холерез). За різницею в показниках кількості і якості жовчі певним чином судили про холеретичний вплив субстанції Р, котру в кожній спробі вводили тваринам об 11 год. 00 хв.

Значна кількість даних отримана на 100 білих щурах лінії Вістар масою 200-250 г у гострих спробах. Під час досліду тварини знаходились під тіопенталовим наркозом (5мг/100г маси тварини). Перед дослідом тварини голодували впродовж доби, доступ до води був вільним.

У наркотизованих щурів розтинали черевну порожнину і у відпрепаровану загальну жовчну протоку вводили тонку металеву канюлю, зєднану поліетиленовою трубкою з мікропіпеткою. Інтенсивність секреції жовчі визначали кожні 10 хвилин впродовж 2,5 годин після введення біологічно активної речовини. Обємну швидкість секреції жовчі розраховували в нл/г маси тіла тварини/хв. У кожній пробі жовчі визначали вміст жовчних кислот і склад ліпідної фракції секрету (Ростовцев, Резник, 1982; Петровский и соавт., 1986; Весельський та співавт., 1991). Дебіт складових частин жовчі визначали множенням кількості речовини в одиниці обєму на весь обєм отриманої проби секрету. Досліди без пептидного навантаження організму щурів слугували контролем.

У дослідах застосовували субстанцію Р (“Sigma”,США) в дозах 0,18-1,0 мкг/кг маси тіла собак в мязи і 0,1; 1,0; 10,0 мкг/100 г маси тіла щурів внутрішньочеревно. Селективні агоністи тахікінінових рецепторів NK1- і NK3-типів (SP-methyl ester і SENKTIDE відповідно, “Sigma”,США) вводили в дозі 1,0 мкг/100г маси тіла щурів. Атропін в розрахунку 0,03 г/кг маси тіла собак і 0,02 г/100г маси тіла щурів вводили підшкірно в 0,1% розчині.

Фактичний матеріал оброблено з допомогою компютерної техніки (Pentium II) методом варіаційної статистики з врахуванням критерію Стюдента. Достовірними вважалися відмінності між контролем і дослідом при Р0,05.

Результати дослідження та їх обговорення

Роль субстанції Р в регуляції жовчоутворення. Наші досліди показали, що обємна швидкість холесекреції і дебіт хімічних компонентів в жовчі в контрольних спробах, проведених на собаках і щурах зменшуються впродовж всього досліду. Це стосується вмісту в жовчі вільних і конюгованих жовчних кислот, холестерину і його ефірів, фосфоліпідів, тригліцеридів, вільних жирних кислот, загального білка та білірубіну.

Речовина Р в переважній більшості наших дослідів справляла гіперхолеретичний ефект (рис.1). Найбільш виражено цей пептид збільшував рівень холесекреції у собак в дозі 0.18 мкг/кг, навіть в другій і третій півгодинах досліду змінював характер кривої динаміки холерезу, притаманний контрольним спробам. Ця доза тахікініну є найбільш ефективною з обраних нами і, мабуть, більш наближеною до фізіологічних концентрацій речовини Р в крові ссавців. Відповіді печінки собак на введення більших доз нейропептиду (0.36 і 1.0 мкг/кг) демонстрували так званий “феномен вислизання” фізіологічного ефекту із збільшенням концентрації біологічно активної речовини, хоча і в цих дозах пептид справляв виражений стимулюючий вплив на жовчосекреторну функцію печінки собак.

Рис.1. Зміни рівня холерезу у собак під впливом субстанції Р (n=38)

Поряд із підвищенням рівня холесекреції під впливом субстанції Р змінювався якісний склад жовчі у собак, про що свідчать зміни як концентрації, так і дебіту вільних і конюгованих жовчних кислот, холестерину білірубіну і загального білка. На фоні протилежної залежності концентрації органічних компонентів жовчі від рівня жовчоутворення їх дебіт перевищував контрольні значення, тобто субстанція Р виявилася справжнім холеретиком, котрий справляє регулючий вплив на функціональний елемент печінки собак (табл1).

Таблиця 1

Вплив субстанції Р на секрецію жовчних кислот у собак (Mm; 0.18 мкг/кг; n=38)

Примітки: в чисельнику – контроль; в знаменнику – дослід; * - P0.5;** - Р<0.01; *** - P<0.001; ТХК – таурохолева, ТХДХК – таурохенодезоксихолева, ТДХК – тауродезоксихолева, ХК – холева, ХДХК – хенодезоксихолева, ДХК – дезоксихолева жовчні кислоти

Треба зазначити, що субстанція Р збільшує холато-холестериновий коефіціент, що свідчить про певне підвищення солібілізуючої здатності секрету і про зменшення його літогенної активності, тобто здатності до утворення жовчних камінців. Речовина Р збільшує коефіціент кон”югації, що свідчить про підвищення в гепатоцитах активності ферментних систем, які звязують синтезовані de novo вільні жовчні кислоти з таурином, тим самим підвищуючи емульгуючу активність жовчі. Збільшення коефіціента гідроксилювання під впливом субстанції Р свідчить про те, що під дією тахікініну в клітинах печінки підсилюється діяльність 7-гідроксилази – ферменту, який гідроксилює молекулу холестерину у відповідному положенні. Цей пептид впливає на жовчотворну функцію печінки як таку, а не окремі її ланки.

В дослідах на щурах спостерігалася аналогічна картина змін рівня секреції жовчі (рис.2) і вмісту в ній органічних речовин. Звертає на себе увагу те, що речовина Р не тільки збільшує об`ємну швидкість жовчоутворення, а й змінює кут нахилу кривої динаміки холерезу впродовж досліду. Про це свідчить співвідношення між показниками холесекреції останньої і першої проби жовчі, що виділялася в контролі і на фоні дії тахікініну. Так, у контрольних спробах остання десятихвилинна проба жовчі на 29.9 % була меншою за об`ємом порівняно з першою, тоді як у дослідах з застосуванням речовини Р цей показник для доз 0.1і 10.0 мкг/100 г становить 11.5% і 23.1% відповідно, а в дозі 1.0 мкг/100 г маси тіла тварини - 0.3%, але з протилежним знаком. Отже, субстанція Р зменшує кут нахилу кривої динамики холерезу впродовж досліду, хоча її характер, притаманний контрольним спробам, зберігається.

Рис.2. Зміни рівня холерезу у щурів під впливом речовини Р (n=56)

Речовина Р максимально (в дужках доза) збільшувала продукцію жовчі у щурів на 21.1% (1.0мкг/100г) і дебіт сумарних холатів на 45.3% (1.0мкг/100г), таурохолевої кислоти на 62.3% (1.0мкг/100г), таурохенодезоксихолевої + тауродезоксихолевої на 55% (1.0/100г), глікохолевої на 18.8% (1.0мкг/100г), глікохенодезоксихолевої + глікодезоксихолевої на 73.1% (10.0мкг/100г), холевої кислоти на 35.9% (10.0мкг/100г), хенодезоксихолевої + дезоксихолевої на 80.1% (10.0мкг/100г), холестерину на 53% (10.0мкг/100г), його ефірів на 63.6% (1.0мкг/100г), вільних жирних кислот на 52.9% (1.0мкг/100г), тригліцеридів на 66.7% (1.0мкг/100г). В дозі 10.0 мкг/100 г дебіт двох останніх ліпідних складових жовчі був меншим на 26.7% та 22% відповідно.Отримані результати є підгрунтям для висновку, що речовина Р справляє істинно холеретичний вплив на функціональний елемент печінки, змінюючи рівень фільтраційно-дифузійних і біосинтетичних процесів в залозі.

Вплив селективних агоністів NK1 і NK3 тахікінінових рецепторів на жовчосекреторну функцію печінки. З метою визначення можливої локалізації і ступеня активності певних рецепторних структур, відповідальних за тахікінінову регуляцію жовчосекреторної функції печінки, ми вводили в організм щурів SP-methyl ester (селективний агоніст NK1 тахікінінових рецепторів) і SENKTIDE (специфічний агоніст рецепторів NK3-типу) в дозі 1.0 мкг/100 г маси тіла тварини.

Наші досліди показали, що агоністи тахікінінових рецепторов значно і тривало стимулюють жовчосекреторну функцію печінки щурів. Так, SP-methyl ester і SENKTIDE, починаючи з четвертої десятихвилинної проби і до закінчення спроби, підвищують рівень секреції жовчі у щурів. Для NK1 тахікінінового агоніста ці зміни були вірогідними в сьомій, одинадцятій, тринадцятій - п`ятнадцятій пробах досліду (Р<0.05; рис.3). Максимальні відмінності між контролем і дослідом спостерігались наприкінці спроби: 46.82.18 проти 36.023.06 нл/г маси тіла тварини/хв. (29.9%; Р<0.05; рис.3).

Рис. 3. Зміни рівня холесекреції у щурів під впливом селективних агоністів тахікінінових рецепторів (n=42)

SENKTIDE - селективний агоніст тахікінінових рецепторів NK3-типу, починаючи з сьомої десятихвилинної проби, ще більш виражено підвищував секрецію жовчі. Достовірним таке збільшення було в одинадцятій, тринадцятій - п`ятнадцятій пробах з максимумом в останній (49.52.21 проти 36.023.06 нл/г маси тіла тварини/хв.; 37.4%; Р<0.01; рис.3).

Співставляючи сумарні дані рівня холесекреції в контролі і під впливом тахікінінових агоністів, знаходимо, що SP-methyl ester впродовж всього досліду збільшує рівень холерезу на 13.3% (69525.4 проти 61344.5 нл/г маси тіла тварини в контролі), а SENKTIDE - на 16.4% (71435.6 проти 61344.5 нл/г маси тіла тварини в контролі). Звертає на себе увагу, що, як і у випадку з субстанцією Р, агоністи не тільки збільшують об`ємну швидкість жовчоутворення, а й змінюють кут нахилу кривої динамики холерезу впродовж досліду. Про це свідчать співвідношення між показниками холесекреції останньої і першої проби жовчі, що виділялася в контролі і на фоні дії тахікінінових агоністів. Так, у контрольних спробах остання десятихвилинна проба жовчі була меншою за об`ємом на 20.6% порівняно з першою, тоді як у дослідах з застосуванням селективних агоністів тахікінінових рецепторів цей показник для NK1 і NK3 дорівнював відповідно 2.8% і 4.5%, але з протилежним знаком.

Таблиця 2

Зміни дебіту жовчних кислот в жовчі щурів під впливом NK1 і NK3 агоністів

(нг/г маси тіла тварини/хв.; Mm; n=42).

Примітки: в чисельнику – контроль; в знаменнику – дослід; * - P0.5;** - Р<0.01; *** - P<0.001; ТХК – таурохолева, ТХДХК – таурохенодезоксихолева, ТДХК – тауродезоксихолева, ГХК – глікохолева, ГХДХК – глікохенодезоксихолева, ГДХК – глікодезоксихолева, ХК – холева, ХДХК – хенодезоксихолева, ДХК – дезоксихолева жовчні кислоти

Як і субстанція Р, агоністи тахікінінових рецепторів на фоні підвищення рівня холесекреції у щурів значно змінюють і вміст в секреті органічних компонентів, зокрема, жовчних кислот (табл.2). Підвищення абсолютного вмісту жовчних кислот в жовчі щурів під впливом селективних агоністів тахікінінових рецепторів NK1- і NK3-типів носило більш генералізований зарактер порівняно з дією нативної субстанції Р, хоча ці впливи були односпрямовані. Зміни концентрації холатів в секреті не були закономірними. Отже, певний паралелізм у впливах субстанції Р і селективних агоністів NK1 і NK3 тахікінінових рецепторів на рівень холесекреції та вміст жовчних кислот в жовчі піддослідних щурів наштовхує на думку про однакові шляхи впливу цих речовин на печінку.

Досліди показали, що поряд з жовчними кислотами виражено змінюється і ліпідний склад жовчі щурів під впливом NK1 і NK3 тахікінінових агоністів. Так, SP-methyl ester і SENKTIDE вірогідно збільшують загальний вміст фосфоліпідів в секреті під час всієї спроби, але для першого агоніста максимуму це підвищення набуває в останній пробі досліду (117%; Р<0.001), а для другого - в четвертій півгодині спроби (132%; Р<0.001).

NK1 тахікініновий агоніст, починаючи з другої півгодини і до кінця досліду, достовірно збільшує загальний вміст холестерину в жовчі піддослідних щурів. Максимальних значень таке збільшення набуває в третій пробі (55.9%; Р<0.001) Дебіт холестерину в жовчі, що печінка виробляла на фоні дії агоніста тахікінінових рецепторів NK3-типу, найбільш виражено перевищував такий контролю через годину після введення тваринам препарату (49.6%; Р<0.001). Вірогідними зміни були в четвертій і п`ятій пробах жовчі в дослідах з застосуванням SENKTIDE.

Тахікінінові агоністи впродовж всього досліду значно і тривало збільшували і дебіт ефірів холестерину в секреті. Найбільш вираженими такі зміни спостерігались через півтори години після введення тваринам препаратів. NK1-агоніст підвищував загальний вміст ефірів холестерину в третій пробі жовчі на 95% (Р<0.001), а агоніст тахікінінових рецепторів NK3-типу - на 181% (Р<0.001).

На фоні гіперхолеретичної дії тахікінінових агоністів на печінку щурів дебіт вільних жирних кислот в жовчі збільшувався. Так, для NK1-агоніста таке збільшення дебіту ВЖК було вірогідним в другій - четвертій пробах жовчі (Р<0.01), а для NK3 - в другій і третій півгодинах спроби (Р<0.01).

На відміну від дебіту тригліцеридів в жовчі щурів контрольних дослідів, котрий з їх перебігом виявив тенденцію до збільшення, такий в дослідах з застосуванням тахікінінових агоністів вірогідно зменшувався з першої до останньої проби. Цілком закономірно, що найбільшою різниця між контролем і дослідами з застосуванням NK1- i NK3-агоністів була наприкінці спроби і становила 64.3% і 57.1% відповідно (Р<0.001).

Отже, секреція з жовчю фосфоліпідів, холестерину, його ефірів і вільних жирних кислот підвищувалась впродовж двох з половиною годин після введення тваринам агоністів тахікінінових рецепторів. Секрецію з жовчю тригліцеридів агоністи тахікінінових рецепторів пригнічують. Зміни концентраціЇ і загального вмісту готових і синтезованих de novo ліпідів є підставою для висновку, що агоністи тахікінінових рецепторів, як і субстанція Р, впливають не тільки на механізми, що забезпечують секрецію ліпідів в жовч, а і на процеси їх синтезу і розпаду.

Резюмуючи викладене, зауважимо, що субстанція Р, котра бере участь в регуляції багатьох функцій, в тому числі і вісцеральних, була недостатньо вивчена як можливий регулятор зовнішньосекреторної функції печінки. Актуальність цього питання визначається тим, що цей поліпептид знаходиться в тканинах центральної нервової системи і в травному тракті, а тому логічно було припустити його регулючу роль в реалізації секреторних процесів в останньому. Застосовані нами агоністи тахікінінових рецепторів показали односпрямованість ефектів на жовчоутворення і хімічний склад жовчі, як це спостерігалось за умов дії субстанції Р. Ці дані свідчать, що субстанція Р впливає на секрецію жовчі, взаємодіючи з відповідними тахікініновими рецепторними утвореннями. При цьому важливо, що агоністи тахікінінових рецепторів підвищують рівень секреції жовчі і збільшують вміст в ній органічних компонентів. Разом з тим становить інтерес значення рівня активності секреторної для печінки М-холінергічної нервової системи в ефектах субстанції Р і агоністів тахікінінових рецепторів на холерез

Вплив субстанції Р і тахікінінових агоністів на секрецію жовчі у тварин з пригніченою активністю М-холінергічної нервової системи. Після введення атропіну виражено і тривало гальмується жовчосекреторна функція печінки у собак. Так, впродовж 2.5 годин на фоні дії атропіну об`ємна швидкість холесекреції була меншою за контрольні показники. Дві перші півгодинні проби жовчі були вірогідно меншими на 58.3% і 63.6% відповідно (Р<0.05). Починаючи з другої години спроби з застосуванням атропіну спостерігається поступове підвищення об”ємної швидкості холесекреції, що, ймовірно, є наслідком метаболічної трансформації і вимивання алкалоїду з рецепторних утворень на клітинах печінки. В останню півгодину показники рівня холерезу були більші за контрольні, що можна вважати секреторною відповіддю печінки на відновлення активності парасимпатичної нервової системи у собак. Достовірним було зменшення і сумарних даних об”ємної швидкості секреції жовчі за всі три години спроб з введенням тваринам атропіну порівняно з такими контрольних дослідів (38.9%; Р<0.05).

На фоні вираженого зниження рівня холерезу у собак з інактивованою М-холінергічною нервовою системою значно змінюється вміст хімічних компонентів жовчі. При цьому спостерігається істотне підвищення в жовчі концентрацій таурохолевої кислоти (Р<0.05), ТХДХК+ТДХК (Р<0.001), вільних жовчних кислот (Р<0.01; 0.001), холестерину (Р<0.05), білірубіну (Р<0.05) і зменшення в секреті концентрації загального білка (Р<0.01). Отже, значне зменшення обємної швидкості холерезу призводить до збільшення концентрації більшості досліджених органічних компонентів жовчі.

Дебіт органічних складових жовчі атропінізованих собак за час досліду змінювався відносно контролю неоднаково. Якщо в першій годині дослідів з застосуванням алкалоїду загальний вміст всіх хімічних складових жовчі собак був вірогідно меншим за контрольні значення (Р<0.05; 0.01), то в подальшому контрольні і експериментальні показники дебіту інгредієнтів жовчі зрівнювались, а в третій годині атропінової холесекреції останні були більшими за контрольні (Р<0.05; 0.01). Винятком був абсолютний вміст в жовчі атропінізованих собак загального білка, який впродовж всього досліду був меншим порівняно з контролем.

Хоча наприкінці дослідів з застосуванням атропіну дебіт органічних складових в жовчі собак дещо підвищувався, його сумарні значення за весь період експерименту в переважній більшості були меншими за такі контрольних спроб (Р<0.05). Лише сумарні дебіти ХДХК+ДХК і холестерину в жовчі собак за весь період експериментальної холесекреції були більшими за контрольні (Р<0.05).

Отже, атропін значно гальмує рівень холесекреції у собак, на фоні чого збільшується концентрація хімічних компонентів жовчі. Дебіт їх змінюється двофазно: спочатку зменшується, а наприкінці досліду зростає, що в сумі істотно не відрізняє його від загального вмісту органічних інгредієнтів жовчі в контрольних спробах. Загальний білок жовчі – єдиний її компонент, на концентрацію і дебіт якого атропін справляє справжній інгібуючий вплив.

Зовсім інший характер холесекреції у собак спостерігається при введенні тваринам 0.18 мкг/кг субстанції Р на фоні дії атропіну. Якщо об”ємна швидкість холесекреції в цих спробах, як і в дослідах з введенням собакам тільки одного атропіну, в перші дві півгодини вірогідно менша за контрольну (51% і 38.9%; Р<0.01; 0.001), то через півтори години після введення субстанції Р атропінізованим собакам показники рівня холерезу цих спроб і контрольних дослідів майже зрівнюються, а починаючи з четвертої півгодини і до кінця спроби холесекреція була більшою за контрольну. Вірогідним таке збільшення було в двох останніх півгодинах досліду (82.1% і 92.8; Р<0.01; 0.001). Загальний вміст органічних інгредієнтів в жовчі цих спроб в першу годину секреції був меншим за контрольні значення (Р<0.05; 0.01;), але вже в другій годині значення дебіту всіх хімічних компонентів жовчі в наших дослідах були більшими за такі дослідів без пептидного навантаження. Вірогідними в другій годині експерименту були збільшення в секреті абсолютного вмісту ТХК, загальних таурокон”югатів, ХК, ХДХК+ДХК, сумарних жовчних кислот, холестерину (для всіх Р<0.01) і білірубіну (Р<0.05). Дебіти ТХДХК+ТДХК і загального білка збільшувались не вірогідно. В останній годині досліду субстанція Р на фоні дії атропіну вірогідно підвищувала абсолютний вміст всіх хімічних компонентів в жовчі.

Порівнюючи відносні зміни рівня холесекреції і хімічного складу жовчі в дослідах з введенням собакам атропіну і субстанції Р на фоні дії алкалоїду, знаходимо, що при певному їх паралелізмі в перші півгодини досліду, спостерігаються відмінності в подальшому (рис.4). Для спроб з введенням речовини Р атропінізованим собакам характерне менше зниження холесекреції в перших трьох півгодинах і значна гіперхолесекреція наприкінці досліду, тоді як застосування атропіну гальмує жовчоутворення практично впродовж всього досліду.

Так, в першій півгодині після введення собакам атропіну на фоні зменшення рівня холерезу на 58.3% дебіт ТХК в жовчі знижувався відносно контролю на 45,7%, ТХДХК+ТДХК – на 46,2%, холевої кислоти – на 40%, ХДХК+ДХК – на 29,4%, сумарних жовчних кислот – на 44.4%, холестерину – на 25.5%, білірубіну – на 41.7%, загального білка – на 56.2%. В дослідах з введенням атропінізованим собакам 0.18 мкг/кг маси тіла тварини речовини Р такі показники становили відповідно 51.0, 28.2, 44.1, 22.7, 20.6, 32.4, (без змін), 19.3 і 44.0%.

Рис. 4. Вплив субстанції Р на об”ємну швидкість жовчоутворення у атропінізованих собак (n=28).

Про відмінність ефектів атропіну і атропіну + субстанція Р на дебіт органічних інгредієнтів жовчі свідчать і сумарні показники за весь час експериментальної секреції.Так, під впливом атропіну сумарні дебіти холатів, білірубіну і загального білка в жовчі собак були меншими за такі контрольних спроб, а після введення тваринам з блокованою М-холінергічною нервовою системою субстанції Р (0.18 мкг/кг) сумарний абсолютний вміст органічних складових жовчі збільшувався порівняно з контролем. Вірогідним таке збільшення було для ХК, ХДХК+ДХК і для холестерину (Р<0.01).

Отже, результати наших дослідів показали, що субстанція Р в застосованій нами дозі проявляє стимулюючий ефект на жовчотворну функцію печінки у атропінізованих собак, однак такий вплив був менш виражений, ніж у тварин з інтактною парасимпатичною нервовою системою. Це стосується як рівня холерезу, так і абсолютного вмісту в жовчі вільних і конюгованих жовчних кислот, білірубіну і загального білка. Це свідчить про те, що для адекватної холесекреторної відповіді печінки на введений пептид необхідна нормальна функціональна активність М-холінергічної іннервації залози.

На відміну від собак парасимпатична система у щурів не має такого вираженого впливу на рівень спонтанної холесекреції, що і показали наші спроби з застосуванням атропіну. Так, об`ємна швидкість холесекреції у атропінізованих тварин була дещо меншою за контрольну в 1-4, 6-10 десятихвилинних проміжках часу після введення тваринам препарату.Наприкінці досліду спостерігалось навіть деяке збільшення рівня холерезу у тварин з дещо блокованою М-холінергічною нервовою системою, що можна пояснити певним відновленням активності парасимпатичної іннервації печінки, оскільки з перебігом досліду атропін розпадався і виводився з організму. Це сприяло відновленню ацетилхолінової передачі сигналів до гепатоцитів і деякому підсиленню секреції жовчі в кінці спроби.

Холесекреторна реакція печінки щурів на введену субстанцію Р на фоні дії атропіну значно відрізнялась від рівня холерезу під впливом нейропептиду у інтактних тварин. У інтактних тварин впродовж всього досліду спостерігалася чітко виражена гіперхолесекреція під впливом речовини Р. У дослідах з застосуванням алкалоїду об`ємна швидкість холерезу тільки в 1, 2, 4, 6, 11, 15 десятихвилинних проміжках спроби була незначно більшою порівняно з контролем. Інші проби майже не відрізнялися від контролю. Ці дані свідчать, що для реалізації адекватного стимулюючого впливу субстанції Р на жовчосекреторну функцію печінки необхідна інтактна парасимпатична нервова система.

Неоднаково змінювалась швидкість холесекреції у атропінізованих щурів під впливом NK1 та NK3 селективних агоністів тахікінінових рецепторів. Так, NK1-агоніст впродовж всього досліду виражено і довготривало збільшував об`ємну швидкість секреції жовчі у атропінізованих щурів. Вірогідним це збільшення було в 11, 13-15 десятихвилинних проміжках спроби після введення тваринам препарату і становило 48.92.6, 50.32.2, 50.32.3, і 50.82.0 нл/г маси тіла тварини/хв. проти 36.13.1, 36.73.7, 37.62.6 і 36.03.1 нл/г маси тіла тварини/хв. в контролі відповідно (35.5%; 37.1%; 33.8% і 41.1%; Р<0.05). Крива динаміки холесекреції під впливом SP-methyl ester у атропінізованих тварин не відрізняється від такої в спробах на щурах з інтактною М-холінергічною нервовою системою, чого не можна сказати про таку у атропінізованих щурів, котрим вводили селективний агоніст тахікінінових рецепторів NK3-типу. Якщо у інтактних тварин NK3-агоніст значно збільшував секрецію жовчі впродовж всього досліду, то в спробах з попереднім введенням щурам атропіну застосування SENKTIDE до десятої проби жовчі супроводжувалось деяким зниженням рівня холерезу відносно контрольних значень, а наприкінці досліду незначним збільшенням, що можна віднести на рахунок вимивання атропіну з рецепторів на мембранах клітин печінки. Безперечно, для прояву гіперхолеретичного впливу агоніста NK3 тахікінінових рецепторів необхідна інтактна М-холінергічна нервова система, яка, безумовно, є останньою ланкою в ланцюзі регуляторного каскаду тахікінінового впливу на жовчоутворювальну функцію печінки через рецепторні структури NK3-типу.

Отже, атропінізація значно гальмує гіперхолеретичні впливи субстанції Р і SENKTIDE у щурів, практично не впливаючи на ефекти селективного тахікінінового агоністу NK1-типу, що свідчить про відсутність в регуляторному каскаді останнього ацетилхоліну і про можливе розташування NK1 тахікінінових рецепторів на мембранах гепатоцитів.

Щодо субстанції Р, то ймовірніше всього, її вплив реалізується через як NK1 тахікінінові рецептори, про що свідчить деяке підвищення рівня холесекреції у атропінізованих тварин на початку досліду, так і через NK3 тахікінінові рецептори. Слід зазначити, що субстанція Р і SENKTIDE після розпаду і видалення атропіну з організму щурів проявляли свої гіперхолеретичні властивості.

Отже, тахікініни, а серед них і субстанція Р, відіграють важливу роль у регуляції секреторних функцій, зокрема, нейросекреції, секреторної функції слинних залоз, шлунка і кишківника, екзокринної функції підшлункової залози (Фокіна, Павлов, 1986; McGregor and Conlon, 1991; Cooke et al., 1997; Field et al., 1997; Гушинець та співавт., 1999).

Враховуючи отримані нами дані і дані, наведені в огляді літератури щодо регуляції тахікінінами секреторної функції шлунка і екзокринної функції підшлункової залози, ми дійшли висновку, що субстанція Р є ендогенним регулятором, дія якого спрямована на стимулювання секреторних процесів в організмі ссавців. Ці дані показують, що субстанція Р, як інші поліпептиди, може відігравати інтегративну роль в організації синхронної секреторної діяльності залоз шлунково-кишкового тракту.

Фізіологічні ефекти речовини Р на жовчоутворювальну функцію печінки мали завжди односпрямований характер, але не при всіх дозах поліпептиду вони були однаково виражені. І для собак, і для щурів виявилися оптимальні дози поліпептиду, в яких він максимально збільшував об”ємну швидкість холесекреції. Для собак такою дозою була 0.18 мкг/кг маси тіла, а для щурів – 1.0 мкг/100 г.

Різниця у величині найбільш ефективних щодо жовчоутворення доз поліпептиду може бути пояснена тим, що спроби проводилися на собаках в бадьорому стані, а на щурах – за умов глибокого загального знеболювання. Крім того, не виключена неоднакова чутливість різних видів тварин до досліджуваного нами регуляторного пептиду.

ВИСНОВКИ

Регуляторний поліпептид субстанція Р впливає на функціональний стан печінки. Вона є істинним холеретиком, оскільки підвищує обємну швидкість жовчоутворення і збільшує абсолютний вміст в жовчі органічних компонентів, зокрема вільних і конюгованих жовчних кислот.

Гіперхолесекреторний ефект субстанції Р реалізується шляхом підсилення як дифузно-фільтраційних, так і біосинтетичних процесів в паренхімі печінки, про що свідчать викликані поліпептидом зміни хімічного складу жовчі.

Субстанція Р підвищує рівень синтезу жовчних кислот в печінці і їх поглинання з крові, збільшує вміст ліпідних інгредієнтів, загального білка і пігментів в жовчі.

Печінка у собак і щурів неоднаковою мірою чутлива до субстанції Р. Найбільш виражений гіперхолесекреторний ефект у собак цей регулятор справляє в меншій дозі, ніж у щурів.

Речовина Р може реалізувати свій вплив на жовчоутворення через тахікінінові рецептори NK1- і NK3-типу, підвищуючи його рівень і змінюючи хімічний склад секрету.

Адекватний холеретичний ефект пептидного регулятора залежить від нормальної активності М-холінергічної нервової системи: у атропінізованих собак і щурів гіперхолесекреція менш виражена.

Субстанція Р діє в складному нейрогуморальному механізмі регуляції вісцеральних функцій, в тому числі і жовчоутворення, відіграючи корегуючу і інтергративну роль в організації секреторних процесів травного тракту.

Отримані результати становлять інтерес для дослідників-теоретиків і для практикуючих гепатологів, котрі переймаються проблемою нейрогуморальної регуляції жовчоутворення і корекції при його порушеннях.

СПИСОК ДРУКОВАНИХ ПРАЦЬ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

1. Весельський С.П., Каревіна Т.Г., Лященко Т.П. Зміни рівня холерезу та вмісту органічних компонентів жовчі у собак під дією Л-тироксину і субстанції Р // Вісник КУ “Проблеми регуляції фізіологічних функцій”. – 1996. – вип.2. – С.67-76.

2. Лященко Т.П. Регуляторний вплив субстанції Р на холерез у собак // Вісник КУ “Проблеми регуляції фізіологічних функцій”. – 1996. – вип.2. – С.77-86.

3. Гушинець Г.П., Каревіна Т.Г., Лященко Т.П., Куровська Л.Ф. Вплив тироксину, пентагастрину і субстанції Р на шлункову секрецію і холерез у собак // Вісник КУ “Проблеми регуляції фізіологічних функцій”. – 1997. – вип.3. – С.10-13.

4. T.P. Lyashchenko, S.P. Veselsky, A.I. Masyuk. Effect of substance P on choleresis and chemical composition of the bile in conscious dogs // Liver and nervous system. Falk Symposium. – Freiburg. – 1997. – N 103. – P.53a.

5. Лященко Т.П., Костенко С.И. Влияние субстанции Р и даларгина на уровень холереза и качественный состав желчи // Труды конф. ученых России и стран СНГ, посвящ. 90-летию со дня рожд. Е.Ф. Ларина. – Томск. – 1997. – С.137-139.

6. Лященко Т.П., Весельський С.П., Масюк А.І. Про холеретичні властивості субстанції Р // Доп. НАН України. – 1998. - №7. – С.158-161.

7. Весельский С.П., Каревина Т.Г., Лященко Т.П. Желчеотделение у собак под влиянием L-тироксина и субстанции Р // Рос. физиол. журн. – 1998. – Т.84. - №4. – С.406-412.

8. Лященко Т., Шевчук В., Весельський С., Костенко С., Місан В. Регуляторний вплив деяких пептидів на жовчоутворення // Зб: Проблеми вікової фізіології. Матер. всеукр. наук. конференції присвяч., 5-ій річн. Волинського держ. ун-ту ім. Лесі Українки. – 1998. – С.45-46.

9. Весельський С.П., Гушинець Г.П., Каревіна Т.Г., Лященко Т.П., Куровська Л.Ф. Вплив Л-тироксину та деяких поліпептидів на секрецію шлункового соку і жовчі у собак // Фізіологічний журнал. – 1998. – Т.44. - №3. – С.155-156.

10. Гушинець Г.П., Весельський С.П., Лященко Т.П., Куровська Л.Ф. Участь L-тироксину та субстанції Р в регуляції секреторної функції травних залоз у собак // Вісник КУ “Проблеми регуляції фізіологічних функцій”. – 1999. – вип.4. – С.11-17.

11. Лященко Т.П.,