НАЦІОНАЛЬНИЙ АГРАРНИЙ УНІВЕРСИТЕТ

МАРЕНЕЦЬ Микола Володимирович

УДК:619:577.12:632.2

СТАН ЕНЕРГЕТИЧНИХ ПРОЦЕСІВ У СПЕРМАТОЗОЇДАХ БУГАЇВ ЗА УМОВ ШТУЧНОГО ГІПОБІОЗУ

03.00.04-біохімія

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата ветеринарних наук

Київ-2001

Дисертацією є рукопис

Робота виконана в Національному аграрному університеті Кабінету Міністрів України

Науковий керівник – доктор біологічних наук, академік НАН України та УААН, професор Мельничук Дмитро Олексійович, Національний аграрний університет, ректор

Офіційні опоненти – доктор біологічних наук, професорКалачнюк Григорій Іванович, НДІ біотехнологічних основ підвищення продуктивності тварин Львівської державної академії ветеринарної медицини ім. С.З.Гжицького, директор, професор кафедри органічної та неорганічної хімії–

кандидат ветеринарних наук Чумаченко Володимир Володимирович, Інститут ветеринарної медицини УААН, старший науковий співробітник лабораторії неінфекційних хвороб с.-г. тварин та ветеринарної санітарії

Провідна установа Інститут біології тварин УААН, лабораторія біотехнології відтворення тварин м. Львів

Захист відбудеться “14” вересня 2001 р. о 1200 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.004.08 у Національному аграрному університеті за адресою: 03041, м. Київ-41, вул. Героїв оборони 15, навчальний корпус № 3, ауд. 65

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Національного аграрного університету: 03041, м. Київ-41, вул. Героїв оборони 11, навчальний корпус № 10

Автореферат розісланий “ 12 ” серпня 2001 р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради Грищенко В.А.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Відомо, що одним із способів пристосування деяких видів тварин та мікроорганізмів до несприятливих умов зовнішнього середовища є перехід у стан гіпобіозу. Стан зниженої життєдіяльності організму супроводжується суттєвими змінами метаболічних процесів у тканинах. Встановлено, що окислення органічних речовин у клітині за умов гіпобіозу відбувається майже без участі кисню. У цьому разі гальмується утворення та виділення води з організму. Тому вивчення біохімічних механізмів розвитку гіпобіозу у різних видів живих організмів є актуальним (Larkin J.E., Heller C.H., 1998; Shiomi H., Tamura Y.,2000).

Однією з проблем ветеринарної медицини є продовження терміну зберігання сперми поза організмом. Слід зазначити, що сперматозоїдам притаманні ряд особливостей. Так сперматозоїди, які знаходяться в придатку сім’яника тварин перебувають у стані зниженої активності. В активний стан вони переходять тільки після еякуляції, тобто після змішування їх із секретами придаткових залоз (Okamura N., 1985; Tajima Y., Okamura N., Sugata Y.,1987). Це явище має пристосувальний характер, оскільки сперматозоїди, на відміну від інших клітин, не здатні накопичувати значні кількості органічних речовин. Крім того, сперматозоїди тварин здатні до активного руху. Інтенсивність їх руху є одним з головних факторів, що забезпечує запліднення яйцеклітини. Головне місце в забезпеченні енергії для руху належить анаеробному та аеробному розщепленню вуглеводів. Слід зазначити, що ці процеси, в основному, залежать від доступності позаклітинних субстратів. Зниження їх кількості в середовищі, де зберігається сперма, супроводжується зменшенням активності та загибеллю сперматозоїдів. Одними з перших досліджень у цьому напрямку були роботи І.І. Іванова, проведені ще на початку 20 століття. Спеціальні поживні середовища дають змогу використовувати сперму для осіменіння тварин протягом декількох діб, що має велике практичне значення для тваринництва та ветеринарної медицини. Удосконалення поживних середовищ триває і нині (Boatman D.E, Robbins R.S.,1991).

Спосіб глибокого заморожування сперми суттєво продовжує термін її зберігання (десятки років). Проте близько 50% сперматозоїдів гине під час заморожування та розморожування. Тому, пошук способів підвищення життєдіяльності сперматозоїдів при глибокому її заморожуванні залишається актуальним і по нині.

З удосконаленням способів короткострокового зберігання сперми було встановлено, що переведення сперматозоїдів у стан гіпобіозу з використанням явища зниження температури (+2…+40С) значно продовжує їх життєдіяльність. Другим способом переведення сперматозоїдів у цей стан життєдіяльності є вуглекислотний гіпобіоз. Розробка цього методу зберігання сперми проводилась проф. І.В. Смірновим та його учнями в 60-х роках 20 століття. Ними було встановлено, що насичення середовища для зберігання сперми вуглекислим газом переводило сперматозоїди в стан зниженої життєдіяльності. Це дало можливість продовжити термін зберігання розбавленої сперми на 48 годин. Але цей спосіб не знайшов широкого практичного застосування, бо насичення середовища вуглекислим газом обумовлює різке його закислення (рН 5,0 і нижче), що викликало, через вказаний час, масову загибель статевих клітин (Смірнов І.В., 1964).

Слід зазначити, що дослідники того часу не звертали увагу на роль інших форм вуглекислоти в регуляції біохімічних процесів. Роботами, проведеними під керівництвом акад. Д.О. Мельничука у Національному аграрному університеті та в Інституті біохімії ім. О.В. Палладіна НАН України було показано, що така форма вуглекислоти як бікарбонати також здатна суттєво впливати на біохімічні процеси в сперматозоїдах тварин та на ступінь їх виживаності після розморожування (Мельничук Д.О., Мельничук С.Д., Роговський С.П. 1995-2001).

Нами встановлено, що змінюючи концентрацію та співвідношення НСО3- та рСО2 у поживному середовищі можна попереджувати розвиток респіраторного ацидозу, а також впливати як на характер обміну речовин у сперматозоїдах, так і на їх запліднювальну здатність.

Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертаційна робота є частиною тематичного плану науково-дослідних робіт кафедри біохімії тварин, якості та безпеки с.-г. продукції НАУ і виконана в проблемній лабораторії “Біохімії гіпобіозу тварин” при цій кафедрі за темою “Розробка та впровадження системи кріоконсервації та збереження сперми плідників великої рогатої худоби в умовах штучного гіпобіозу” (номер держреєстрації 0196 U 013527, завідувач кафедри і лабораторії канд. біол. наук Мельничук С.Д.)

Мета і задачі досліджень. Основна мета досліджень – вивчення комплексного впливу рСО2 та НСО3- на показники енергетичних процесів у сперматозоїдах бугаїв, їх технологічну придатність і запліднювальну здатність.

Для досягнення цієї мети були поставлені такі задачі:

- вивчити вплив комбінованого вуглекислотного гіпобіозу на перебіг основних енергетичних процесів у сперматозоїдах шляхом визначення концентрацій ряду метаболітів фруктолізу та циклу трикарбонових кислот (фруктози, молочної, піровиноградної, лимонної, a-кетоглутарової, яблучної та щавлевооцтової кислот ) у статевих клітинах та в плазмі сперми бугаїв;

- вивчити вплив комбінованого вуглекислотного гіпобіозу на технологічну придатність сперматозоїдів порівняно із стандартним методом зберігання;

- в умовах виробництва вивчити вплив комбінованого вуглекислотного гіпобіозу на запліднювальну здатність сперматозоїдів порівняно із стандартним методом.

Об’єкт дослідження – явище впливу штучного комбінованого вуглекислотного (рСО2 та НСО3-) гіпобіозу на стан енергетичних процесів, технологічну придатність та запліднювальну здатність сперматозоїдів бугаїв.

Предмет дослідження – рівень метаболітів фруктолізу та циклу трикарбонових кислот у сперматозоїдах, що зберігались у стандартному поживному середовищі та за умов комбінованого вуглекислотного гіпобіозу; технологічна придатність сперми бугаїв та її запліднювальна здатність при зберіганні в стандартному середовищі та у середовищі, яке модифіковане авторами.

Методи дослідження. Колориметричні та спектральні методи визначення фруктози, молочної, піровиноградної, лимонної, ?-кетоглутарової, яблучної та щавлевооцтової кислот; потенціометричний метод визначення рН, метод оцінки якості сперми: визначення активності сперматозоїдів з використанням світлового мікроскопа, об’єму еякуляту – зважуванням, концентрації сперматозоїдів за допомогою електрофотоколориметра.

Наукова новизна одержаних результатів. Вперше показано можливість зменшення інтенсивності фруктолізу та циклу трикарбонових кислот у сперматозоїдах за умов переведення їх у стан комбінованого вуглекислотного гіпобіозу. Завдяки одержаним результатам досліджень запропонована модифікація стандартного середовища для зберігання сперми бугаїв, що забезпечує як збільшення терміну її зберігання, так і підвищення її запліднювальної здатності.

Практичне значення одержаних результатів. Показано, що зберігання сперми, розбавленої модифікованим стандартним середовищем при температурі (+12…+13оС), подовжує термін її використання до 6 діб, що в 1,5-2 рази більше порівняно із стандартним методом зберігання (Инструкция по организации и технологии работы станций и предприятий по искусственному осеменению сельскохозяйственных животных. МСХ СССР.М., 1981 “Інструкція…”).

Показано, що запліднювальна здатність сперматозоїдів, які зберігались у розробленому нами середовищі вища на 8,6% порівняно із стандартом.

Розроблений метод зберігання сперми методично простий, не потребує використання спеціального високотехнологічного обладнання, що дає змогу широко застосовувати його на підприємствах з отримання та технологічної обробки сперми бугаїв.

Пріоритетність розробленого методу підтверджена патентом на винахід (Пат. 24696 А Україна, A61D7/00. Середовище для зберігання сперми бугаїв/ Мельничук С.Д., Мельничук Д.О., Кругляк А.П., Смірнова О.І., Журавель М.П., Кругляк П.А., Маренець М.В.; Національний аграрний університет - № ; Заявл. 16.12.97; Опубл. 04.08.98. - 1с.).

Розроблені рекомендації представлені для розгляду в науково-технічну раду департаменту ветеринарної медицини Міністерства аграрної політики України.

Особистий внесок здобувача. Всі дослідження проведені за безпосередньою участю здобувача. Експериментальні дослідження з біохімії, фізіології, морфології сперми, перевірці запліднювальної здатності сперми проводились дисертантом на базі Головного селекційного центру України (м. Переяслав-Хмельницький), Київського племпідприємства (м.Бровари), Бородянського міжгосподарського об’єднання з штучного осіменіння в Київський області та проблемній лабораторії “Біохімії гіпобіозу тварин” Національного аграрного університету за участю авторів вказаного вище патенту.

Особисто здобувачем проведено огляд та аналіз джерел наукової літератури за темою дисертації, статистичну обробку отриманих результатів.

Аналіз та обговорення результатів досліджень, підготовку їх до друку та написання дисертації й автореферату здійснено самостійно за допомогою наукового керівника.

Апробація роботи. Матеріали роботи доповідались на: VII Українському біохімічному з’їзді (Київ, 1997); галузевій науково-виробничій конференції, присвяченій 50-річчю відкриття здатності сперміїв ссавців зберігати біологічну повноцінність і генетичну інформацію після заморожування (Київ, 1997); науково-практичній конференції “Хвороби органів травлення новонароджених тварин, діагностика, лікування, профілактика та прогнозування” (Київ, 1998); наукових конференціях професорсько-викладацького складу НАУ (Київ, 1998-2001).

Публікації. Основні положення дисертації викладено у 6 наукових працях, з яких 3 статті, 2 матеріали конференції та 1 патент.

Структура та обсяг дисертації. Дисертація викладена на 136 сторінках, складається із вступу, 3-х розділів, висновків та списку використаних джерел, який включає 233 джерела, з них 141 – іноземних; містить 4 таблиці і 20 рисунків.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

ЗАГАЛЬНА МЕТОДИКА ТА ОСНОВНІ МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ

Для досліджень використовували сперму бугаїв голштино-фризької породи, які належать Київському племпідприємству (м. Бровари) і Головному селекційному центру України (м. Переяслав-Хмельницький). Досліди на отриманій спермі проводили паралельно.

Сперму отримували від тварин згідно з графіком роботи підприємств (одна дуплетна садка протягом трьох днів) за допомогою штучної вагіни. Відразу ж оцінювали рухливість сперматозоїдів – світловим мікроскопом, концентрацію – фотоелектроколориметром, об'єм еякуляту – зважуванням. У досліді використовували сперму, яка відповідає технологічним вимогам відповідної інструкції (“Інструкція…”), а також розроблений нами спосіб переведення сперматозоїдів бугаїв у стан комбінованого вуглекислотного гіпобіозу, який розроблений за безпосередньою участю здобувача (Пат. 24696 А Україна, A61D7/00. Середовище для зберігання сперми бугаїв).

Для вирішення поставлених задач було заплановано проведення трьох серій досліджень. У першій серії вивчали особливості енергетичних процесів сперматозоїдів, що знаходились у стані комбінованого вуглекислотного гіпобіозу; концентрацію ряду метаболітів фруктолізу та циклу трикарбонових кислот. У сперматозоїдах та плазмі визначали концентрацію фруктози (Милованов В.К., 1962), лимонної (Афанасьев В.Г., 1973), молочної, піровиноградної (Hohorst.J., 1959), a-кетоглутарової (Bergmeyer H.U., 1963), яблучної та щавлевооцтової кислот (Hohorst H.J., 1963).

Для проведення цієї серії досліджень еякулят ділили на дві частини – контроль та дослід. Контрольні зразки розводили у співвідношенні 1:1 1%-м розчином натрію хлориду, а дослідні – сумішшю розчинів натрію хлориду та натрію бікарбонату з такого розрахунку, що концентрація натрію бікарбонату була 40,0 ммоль/л (кінцева концентрація натрію в контрольних та дослідних зразках була однакова) та насичували середовище вуглекислим газом до величини рН 6,7. Кількість вуглекислого газу в середовищі при цьому становила 10,05 ммоль/л. Величину рН середовища контролювали за допомогою лабораторного іономіру И-130.

Вказані концентрації натрію бікарбонату і рСО2, а також величина рН середовища були підібрані у попередніх дослідженнях як найбільш оптимальні для переведення сперматозоїдів у стан гіпобіозу. Ці досліди проводились за участю та під керівництвом канд. біол. наук С.Д. Мельничука; параметри були використані нами для більш детального вивчення їх впливу на енергетичні процеси, технологічну придатність та запліднювальну здатність сперматозоїдів.

Контрольні та дослідні зразки зберігали у герметично закритому посуді при температурі +12…+13оС. Відбір проб проводили безпосередньо, а потім через 1, 2, 3, 4, 12 та 24 години після їх підготовки (об'єм зразків – 1 мл). Після зберігання, з метою відокремлення сперматозоїдів від компонентів розбавника та плазми сперми, проби центрифугували двічі протягом 15 хвилин при 5000 об/хв. Клітини ресуспензували 1%-м розчином натрію хлориду, доводячи об'єм кожного зразка до 1 мл. Після відмивання ресуспензовані сперматозоїди та відокремлену плазму сперми зберігали в герметично закритому посуді в рідкому азоті до моменту проведення біохімічних досліджень.

У другій серії досліджували вплив комбінованого вуглекислотного гіпобіозу на технологічну придатність сперматозоїдів порівняно із стандартним методом зберігання.

У третій серії вивчали вплив комбінованого вуглекислотного гіпобіозу на запліднювальну здатність сперматозоїдів порівняно із стандартним методом.

Для проведення другої та третьої серій досліджень підготовку сперми проводили за однаковою схемою.

Еякулят ділили на дві частини. Першу частину (контроль) розбавляли стандартним (“Інструкція…”) глюкозо-цитратно-жовтковим (ГЦЖ) середовищем, до складу якого входили: глюкоза (медична, безводна) —30,0 г; натрій лимоннокислий (трьохзаміщений, п’ятиводний) — 14,0 г; спермосан-3 — 750–900 тис.од; жовток курячого яйця — 200,0 мл; вода дистильована до 1000,0 мл. Підготовлені зразки зберігали при температурі +2…+40С. Другу частину (дослід) – розбавляли ГЦЖ-середовищем, в який вносили NaНСО3 (кінцева концентрація – 40,0 ммоль/л) та насичували середовище вуглекислим газом до величини рН 6,7. Кількість вуглекислого газу в середовищі у цьому разі становила 10,05 ммоль/л. За цих умов сперматозоїди переходили в стан комбінованого вуглекислотного гіпобіозу, про що свідчить припинення їх рухливості у полі зору мікроскопа. Дослідні зразки зберігали при температурі +12…+130С.

Величину рН середовища контролювали за допомогою лабораторного іономіру И-130 (табл.1).

Таблиця 1– Склад середовища та умови зберігання сперми

Зразки | рН | НСО3-,

ммоль/л | РСО2,

Ммоль/л | Температура, оС

Для проведення біохімічних досліджень

Контроль | 6,7 | 0,13 | 0,05 | +12…+13

Дослід | 6,7 | 40,0 | 10,05 | +12…+13

Для вивчення виживаності та запліднювальної здатності

Контроль | 7,1 | 0,5 | 0,05 | +2…+4

Дослід | 6,7 | 40,0 | 10,05 | +12…+13

Розбавляли еякулят з розрахунку 40-50 млн активних сперматозоїдів на 1мл розбавленої сперми. Критерієм для розбавлення сперми слугували активність та концентрація сперматозоїдів.

З метою вивчення впливу комбінованого вуглекислотного гіпобіозу на технологічну придатність сперматозоїдів, двічі на добу за допомогою мікроскопа контролювали їх рухливість. Підрахунок відсотка рухливих сперматозоїдів проводили при кімнатній температурі. У цьому разі з контрольних та дослідних проб брали по 0,5 мл сперми і розбавляли її фізіологічним розчином у співвідношенні 1:2. В результаті такої маніпуляції концентрація бікарбонатів та рСО2, в дослідних пробах зменшувалась в 3 рази від початкового рівня, що виводило сперматозоїди дослідних зразків із стану гіпобіозу. Краплю розбавленої сперми контрольних та дослідних проб наносили на предметне скло і здійснювали підрахунок активних сперматозоїдів загальноприйнятим методом (“Інструкція…”).

Для порівняльного вивчення запліднювальної здатності сперматозоїдів, які зберігались в умовах комбінованого вуглекислотного гіпобіозу в господарствах Бородянського району Київської області (КСП “Україна”, “Дружба”, СВК “Зоря”, ПСП “Колос”, дослідне господарство Немішаївського державного аграрного коледжу) за участю фахівців Бородянського міжгосподарського об’єднання з штучного осіменіння тварин були проведені виробничі досліди. Для проведення дослідів були відібрані корови 2-4-ї лактації, які приходили в стан охоти перший раз після отелу. З цих тварин було сформовано дві групи контроль та дослід.

У контрольній групі осіменили 196 голів спермою, розбавленою стандартним ГЦЖ середовищем (“Інструкція…”), а в дослідній 198 голів – спермою, розбавленою ГЦЖ-середовищем з додаванням до нього вуглекислого газу та натрію бікарбонату в концентрації 10,05 і 40,0 ммоль/л відповідно.

Осіменяли корів ректо-цервікально одноразово під час статевої охоти, з останньої декади травня по першу декаду червня.

Вагітність корів у дослідній та контрольній групі визначали через 90 діб після осіменіння (ректальним методом), враховувався відсоток запліднених тварин. Результати цих дослідів викладені у відповідному акті.

Матеріали досліджень оброблені статистично (Поляков О.В. та ін., 1985).

РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ

ВПЛИВ КОМБІНОВАНОГО ВУГЛЕКИСЛОТНОГО ГІПОБІОЗУ НА ІНТЕНСИВНІСТЬ ЕНЕРГЕТИЧНИХ ПРОЦЕСІВ У СПЕРМАТОЗОЇДАХ БУГАЇВ

Інтенсивність процесів фруктолізу в сперматозоїдах та плазмі сперми вивчали за динамікою концентрації фруктози, молочної та піровиноградної кислот.

Вивчення інтенсивності фруктолізу

Результати досліджень свідчать, що вміст фруктози в плазмі сперми бугаїв на початку зберігання (1-а година) у дослідних зразках порівняно з контрольними практично не змінився (рис.1). Однак через 2 години зберігання сперми вміст фруктози в контрольних зразках знижується тоді як в дослідних залишається на вихідному рівні (різниця між контрольними зразками є вірогідною). Концентрація фруктози в спермі дослідних зразків протягом перших двох годин зберігання становить 0,030-0,031 ммоль/мл (рис.1).

Після третьої годин зберігання концентрація фруктози в плазмі сперми в дослідних зразках зменшується, але залишається вірогідно вищою від контрольних зразків. Зменшення концентрації фруктози в плазмі сперми дослідних зразків пов’язане з виходом сперматозоїдів із стану гіпобіозу, внаслідок змін у співвідношенні форм вуглекислоти в середовищі.Концентрація молочної кислоти в контрольних зразках плазми сперми до першої години її зберігання знаходиться на вихідному рівні (рис. 2). В дослідних зразках, починаючи з моменту введення вуглекислого газу та натрію бікарбонату до 4-ї години зберігання, концентрація цього метаболіту нижча, ніж у нативній спермі. Ці зміни свідчать про гальмування обмінних процесів у сперматозоїдах за умов комбінованого вуглекислотного гіпобіозу. При подальшому зберіганні сперми концентрація молочної кислоти в плазмі сперми підвищується як в контрольних, так і в дослідних зразках. Слід зазначити, що інтенсивність накопичення молочної кислоти в плазмі сперми контрольних зразків вища. Починаючи з 1- до 24-ї години зберігання різниця за вмістом молочної кислоти в плазмі сперми між дослідом та контролем вірогідна. Такий характер зміни концентрації молочної кислоти в плазмі сперми узгоджується із зміною концентрації фруктози. Так, у плазмі сперми контрольних зразків концентрація фруктози нижча, а молочної кислоти вища порівняно з дослідними (рис.1;2).

Динаміка концентрації молочної кислоти в сперматозоїдах корелює із зміною її концентрації в плазмі сперми (рис. 3).

Протягом перших двох годин концентрація цього метаболіту в сперматозоїдах, які переводились у стан гіпобіозу, зменшується. Це свідчить про сповільнення інтенсивності процесів фруктолізу. В той же час, у контрольних зразках спостерігається вірогідне підвищення вмісту молочної кислоти в сперматозоїдах. На третю годину зберігання в дослідних зразках концентрація цього метаболіту в сперматозоїдах підвищується, що свідчить про початок їх виходу із стану гіпобіозу.

При подальшому зберіганні кількість молочної кислоти в сперматозоїдах дослідних зразків суттєво не змінюється. З 3- до 24-ї години досліду вірогідної різниці між контрольними та дослідними зразками не відмічається.

Концентрація піровиноградної кислоти в сперматозоїдах контрольних зразків протягом перших 3-х годин не змінюється. На 4-у годину зберігання вона різко зменшується (рис. 4). Ця тенденція спостерігається до моменту припинення спостережень (24-а година зберігання). У дослідних зразках концентрація піровиноградної кислоти в сперматозоїдах на 2-у годину незначно підвищується, а починаючи з 2-ї години зберігання, навпаки знижується.

Слід зазначити, що концентрація піровиноградної кислоти на 24-у годину зберігання майже не відрізняється від початкового рівня. В інтервалі з 4- по 24-у години зберігання кількість піровиноградної кислоти у дослідних зразках залишається вірогідно вищою порівняно з контролем. Важливо, що концентрація піровиноградної кислоти у сперматозоїдах у два рази вища, ніж молочної.

Результати досліджень динаміки концентрації фруктози та молочної кислоти в плазмі сперми, а також молочної та піровиноградної кислот у сперматозоїдах свідчать, що застосування вуглекислого газу та натрію бікарбонату, як чинників гіпобіозу, викликають зниження інтенсивності процесів фруктолізу в сперматозоїдах.

З метою вивчення особливостей функціонування циклу трикарбонових кислот у сперматозоїдах в умовах комбінованого вуглекислотного гіпобіозу визначали динаміку концентрації лимонної, ?-кетоглутарової, щавлевооцтової та яблучної кислот. Показано, що вміст лимонної кислоти в сперматозоїдах контрольних і дослідних зразків знижується, але має різний характер (рис.5).

У дослідних зразках різке зниження вмісту лимонної кислоти в сперматозоїдах спостерігається з початком переведення їх у стан гіпобіозу. Для контрольних зразків характерно те, що протягом першої години зберігання концентрація лимонної кислоти не змінюється, після чого знижується. Для періоду зберігання (з моменту введення до складу середовища вуглекислого газу та натрію бікарбонату до 12-ї години зберігання) різниця в концентраціях вірогідна. На 24-у годину зберігання різниця в концентрації лимонної кислоти в сперматозоїдах між контрольними та дослідними зразками практично відсутня.

Вміст б-?етоглутарової кислоти в сперматозоїдах контрольних зразків на першу годину зберігання незначно підвищується, але вже на 2-у годину різко знижується (рис.6). У сперматозоїдах дослідних зразків зниження концентрації цього метаболіту збігається з введенням у середовище вуглекислого газу та натрію бікарбонату і триває протягом усього часу зберігання. На 1-у годину зберігання між контрольними та дослідними зразками різниця вірогідна. При подальшому зберіганні концентрація цього метаболіту в сперматозоїдах контрольних та дослідних зразків незначна.

Концентрація яблучної кислоти в сперматозоїдах при зберіганні їх у стані комбінованого вуглекислотного гіпобіозу протягом періоду досліду змінюється не суттєво і дещо відрізняється від її початкового рівня, а у контрольних зразках вміст цього метаболіту знижується протягом періоду досліджень (рис.7). На 3-ю та 4-у години зберігання різниця між контрольними та дослідними зразками вірогідна. Після 4-ї години зберігання концентрація яблучної кислоти в сперматозоїдах контрольних зразків незначна.

Концентрація щавлевооцтової кислоти в сперматозоїдах контрольних зразків з початком досліду знижується до моменту припинення спостережень (рис. 8). У дослідних зразках цей показник до 1-ї години зберігання майже не змінюється, а починаючи з 2-ї години рівень щавлевооцтової кислоти повільно зменшується. З 3- до 12-ї години зберігання різниця в концентрації щавлевооцтової кислоти в сперматозоїдах між контрольними та дослідними зразками вірогідна.

Отже, зменшення концентрації лимонної та -кетоглутарової та підвищення вмісту щавлевооцтової та яблучної кислот у дослідних зразках свідчить, що стан комбінованого вуглекислотного гіпобіозу змінює напрям деяких реакцій та інтенсивність перебігу реакцій циклу трикарбонових кислот.

ВПЛИВ КОМБІНОВАНОГО ВУГЛЕКИСЛОТНОГО ГІПОБІОЗУ НА ТЕХНОЛОГІЧНУ ПРИДАТНІСТЬ СПЕРМАТОЗОЇДІВ

Виходячи з результатів попередньої серії досліджень, були підібрані оптимальні концентрації рСО2 та НСО3- для створення комбінованого вуглекислотного гіпобіозу (табл. 2).

Контрольні зразки сперми розводили ГЦЖ-середовищем, яке використовується для розбавлення та зберігання сперми бугаїв (“Інструкція…”), а дослідні – ГЦЖ-середовищем з додаванням до нього вуглекислого газу та натрію бікарбонату в концентрації 10,05 і 40,0 ммоль/л відповідно.

Результати досліджень контрольних і дослідних проб сперми показали, що рухливість сперматозоїдів у спермі, яка розбавлялась стандартним ГЦЖ-середовищем, знижувалась через 72 години. Рухливість сперматозоїдів дослідних проб зберігалась до 120 годин.

Отримані результати досліджень свідчать про те, що зберігання сперми в умовах комбінованого вуглекислотного гіпобіозу значно покращує життєздатність розбавленої сперми бугаїв у процесі її зберігання порівняно із загальноприйнятим методом.

Таблиця 2 – Вплив комбінованого вуглекислотного гіпобіозу на технологічну придатність сперматозоїдів бугаїв, (Mm) n=6

Назва проби | рН середо-вища | Концентрація НСОз- у середовищі, ммоль/л | Концентрація вуглекислого газу в середо- вищі, ммоль/л | Температура середовища,

°C | Час збереження активності сперматозоїдами

5 балів , год.

Стандарт (контроль ) | 7,1 | 0,5 | 0,05 | +2…+4 | 72±5

Дослід | 6,7 | 40,0 | 10,05 | +12…+13 | 120±5*

Примітка:* ступінь вірогідності Р=0,05.

ВПЛИВ КОМБІНОВАНОГО ВУГЛЕКИСЛОТНОГО ГІПОБІОЗУ НА ЗАПЛІДНЮВАЛЬНУ ЗДАТНІСТЬ СПЕРМАТОЗОЇДІВ

Як відомо, для осіменіння корів використовується сперма з активністю сперматозоїдів не менше 5 балів (“Інструкція…”). У контрольних зразках сперми, розбавлених стандартним ГЦЖ-середовищем, активність сперматозоїдів 5 балів зберігається протягом 3-х діб, а в дослідних, розбавлених ГЦЖ-середовищем, модифікованим додаванням вуглекислого газу та натрію бікарбонату в концентрації 10,05 і 40,0 ммоль/л відповідно – до 6-ї доби.

Важливо, що протягом трьох діб використання сперми заплідненість корів у контрольній групі становить 60,7%, тоді як у дослідній сягає – 69,3%. Тобто, зберігання сперми в стані штучного гіпобіозу не погіршує запліднювальну здатність сперматозоїдів.

Слід зазначити, що загальна кількість доз сперми, приготовлених із застосуванням стандартного ГЦЖ-середовища становила 320, але за 3 доби зберігання було використано 196 доз. Зменшення активності сперматозоїдів, при подальшому зберіганні, не дозволяло використовувати її для осіменіння тварин. Тобто, сперма контрольних зразків на 4-у добу не відповідала технологічним вимогам (табл. 3).

Сперма, яка зберігалась у стані комбінованого вуглекислотного гіпобіозу відповідала вимогам інструкції протягом 6 діб використання. Крім того, вона зберігала на 4-у добу задовільну запліднювальну здатність 61,3%, на 6-у добу – 33,3%. Крім того, слід зазначити, що дослідні зразки сперми були використані на 100%, тоді як контрольні на 61,3%.

Таблиця 3 – Вплив комбінованого вуглекислотного гіпобіозу на запліднювальну здатність сперматозоїдів бугаїв

Доба вико-ристання | Контроль | Дослід

осіме-нили, гол. | запліднилось | осіме-нили, гол. | запліднилось

гол. | % | гол. | %

1 | 60 | 37 | 61,6 | 26 | 18 | 69,2

2 | 70 | 42 | 60 | 30 | 21 | 70

3 | 66 | 40 | 60,6 | 32 | 22 | 68,8

Всього за три | 196 | 119 | 60,7 | 88 | 61 | 69,3

4 | - | - | - | 31 | 19 | 61,3

5 | - | - | - | 34 | 15 | 44,1

6 | - | - | - | 45 | 15 | 33,3

Всього з 4-ї по 6-у | 0 | 0 | 0 | 110 | 49 | 46,2

Отримані в досліді дані свідчать про те, що введення до складу середовища для зберігання сперми вуглекислого газу та натрію бікарбонату значно покращує запліднювальну здатність сперматозоїдів та дає змогу використовувати сперму протягом 6-и діб, що вдвічі довше порівняно із загальноприйнятим методом.

ВИСНОВКИ

1.

2.

3.

4.

5.

6.

СПИСОК ОСНОВНИХ ПРАЦЬ, ОПУБЛІКОВАНИХ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

1.

2.

3.

4.

5.

6.

Маренець М.В. Стан енергетичних процесів у сперматозоїдах бугаїв за умов штучного гіпобіозу. –Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата ветеринарних наук за спеціальністю 03.00.04 – біохімія. – Національний аграрний університет, Київ, 2001.

Дисертацію присвячено вивченню впливу комбінованого вуглекислотного гіпобіозу на інтенсивність фруктолізу та циклу трикарбонових кислот у сперматозоїдах бугаїв, їх технологічну придатність та запліднювальну здатність.

Встановлено, що переведення сперматозоїдів у стан комбінованого вуглекислотного гіпобіозу знижує інтенсивність фруктолізу, про що свідчить зміна концентрації фруктози, молочної та піровиноградної кислот в плазмі сперми та в сперматозоїдах.

Стан штучного комбінованого гіпобіозу викликає зміни інтенсивності та направленості реакцій циклу трикарбонових кислот, про що свідчить зміна концентрації лимонної, б-?етоглутаровой, яблочной та щавлевооцтової кислот у сперматозоїдах.

Зберігання сперми бугаїв у стані комбінованого вуглекислотного гіпобіозу значно подовжує її технологічну придатність та не знижує запліднювальну здатність порівняно із загальноприйнятим методом, що регламентовано відповідною інструкцією.

Ключові слова: гіпобіоз, фруктоліз, цикл трикарбонових кислот, сперма, технологічна придатність, запліднювальна здатність.

Маренец Н.В. Состояние энергетических процессов в сперматозоидах быков в условиях искусственного гипобиоза. – Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата ветеринарных наук по специальности 03.00.04 – биохимия. – Национальный аграрный университет, Киев, 2001.

Диссертация посвящена изучению влияния комбинированного углекислотного гипобиоза на интенсивность процессов фруктолиза и цикла трикарбоновых кислот в сперматозоидах быков, их технологическую пригодность и оплодотворяющую способность.

Установлено, что перевод сперматозоидов в состояние комбинированного углекислотного гипобиоза снижает интенсивность процессов фруктолиза.

О снижении интенсивности процессов фруктолиза свидетельствует динамика концентрации фруктозы, молочной и пировиноградной кислот. Концентрация фруктозы в плазме спермы больше в 1,2-1,3 раза, молочной кислоты в плазме спермы и в сперматозоидах меньше в 1,2-1,8 раза по сравнению с контролем. Концентрация пировинограной кислоты в опытных образцах практически не изменяется, тогда как в контрольных снижается в 1,2-2,2 раза.

Состояние комбинированного углекислотного гипобиоза вызывает в сперматозоидах существенные изменения интенсивности и направленности функционирования цикла трикарбоновых кислот. Так, установлено уменьшение концентрации лимонной (в 1,8-2,5 раза ) и ?-кетоглутаровой (в 1,5 раза), а также повышение уровня яблочной (в 1,2 раза) и щавелевоуксусной (в 1,9 раза) кислот в сперматозоидах по сравнению с контролем.

Такие изменения фруктолиза и цикла трикарбоновых кислот способствуют повышению жизнедеятельности сперматозоидов.

Хранение спермы в условиях комбинированного углекислотного гипобиоза улучшает жизнеспособность сперматозоидов быков в процессе ее хранения по сравнению с общепринятым методом, регламентированным соответствующей инструкцией. Так сперма, которая хранилась в условиях комбинированного углекислотного гипобиоза сохраняла технологическую пригодность до 120 часов, в то время как контрольные образцы теряли её после 72 часов хранения.

При изучении влияния комбинированного углекислотного гипобиоза на оплодотворяющую способность сперматозоидов установлено, что в течение трех суток использования спермы количество оплодотворившихся животных в контрольной группе составило 60,7%, тогда как в опытной – 69,3%. То есть, хранение спермы в состоянии комбинированного углекислотного гипобиоза не ухудшает оплодотворяющую способность сперматозоидов.

Сперма, которая хранилась в состоянии комбинированного углекислотного гипобиоза отвечала требованиям соответствующей инструкции в течении 6 суток использования, сохраняя удовлетворительную оплодотворяющую способность от 61,3% – на 4-е сутки, до 33,3% – на 6-е сутки.

Проведенные нами исследования указывают на то, что хранение сперматозоидов в состоянии комбинированного углекислотного гипобиоза эффективнее по сравнению с кратковременным хранением разбавленной спермы.

Ключевые слова: гипобиоз, фруктолиз, цикл трикарбоновых кислот, сперма, технологическая пригодность, оплодотворяющая способность.

Marenets’ N. State of energy processes of bovine spermatozoa in conditions of artificial hypobiosis. – Manuscript.

Thesis of a scientific degree of the candidate of veterinary sciences on a specialty 03.00.04 – biochemistry. – National Аgrarian University, Kyiv, 2001.

The thesis is devoted to study of influence of the combined carbonic hypobiosis on intensity of fructolysis and Krebs’ cycle in bovine spermatozoa it’s technological suitability and fertility ability.

It is established, that the combined carbonic hypobiosis lowers intensity of fructolysis that confirms the change of concentration of fructose, lactate and pyruvate in plasma of sperm and spermatozoa.

Combined carbonic hypobiosis causes the change of an intensity and orientation of reactions of Krebs’ cycle, that confirms the change of a concentration citrate, -ketoglutarate, malate and oxaloacetate in spermatozoa.

The storage of bovine sperm in a condition of the combined carbonic hypobiosis considerably increases it’s technological suitability and fertility ability, in comparison with the standard method, which is recommended the appropriate instruction

Key words: hypobiosis, fructolysis, Krebs’ cycle, sperm, technological suitability, fertility ability.