ЛЬВІВСЬКИЙ НАЦІОНАЛЬНИЙ УНІВЕРСИТЕТ імені ІВАНА ФРАНКА
МАЄВСЬКА СОФІЯ МИХАЙЛІВНА
УДК 582.32: 54.06
МОРФО – ФІЗІОЛОГІЧНІ АСПЕКТИ СТІЙКОСТІ МОХІВ
ДО ТОКСИЧНОЇ ДІЇ ІОНІВ ВАЖКИХ МЕТАЛІВ
03.00.12 -фізіологія рослин
Автореферат
дисертації на здобуття наукового ступеня
кандидата біологічних наук
Львів - 2001
Дисертацією є рукопис
Робота виконана у відділі екоморфогенезу рослин Інституту екології Карпат НАН України
Науковий керівник: доктор біологічних наук, професор
ДЕМКІВ Орест Теодорович,
Інститут екології Карпат НАН України,
завідувач відділу екоморфогенезу
рослин
Офіційні опоненти: доктор біологічних наук, професор
Криницький Григорій Томкович
Український державний лісотехнічний
університет,
завідувач кафедри лісівництва
доктор біологічних наук, професор
СИЛАЄВА Алла Михайлівна
Інститут садівництва Української
академії аграрних наук,
завідувач відділу фізіології та
біотехнологічних досліджень
Провідна установа: Інститут фізіології рослин і генетики НАН України, м. Київ
Захист відбудеться 6 липня 2001р. о 12.00 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради К 35.051.14 у Львівському національному університеті імені Івана Франка за адресою: 79005, м. Львів, вул. Грушевського, 4, біологічний факультет Львівського національного університету імені Івана Франка, ауд.333.
З дисертацією можна ознайомитись у науковій бібліотеці Львівського національного університету імені Івана Франка за адресою: 79005, м. Львів, вул. Драгоманова, 17.
Автореферат розісланий 1 червня 2001р.
Вчений секретар спеціалізованої
вченої ради, кандидат біологічних наук Д.І. Санагурський
ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ
Актуальність теми. Пізнання механізмів реакції рослин на вплив екстремальних факторів є однією з найактуальніших проблем сучасної біології. Ця проблема ще більше загострилася у зв"язку із забрудненням атмосфери техногенними продуктами, у тому числі іонами важких металів (Андреева, 1990).
Іони металів входять до складу багатьох ферментів та інших біополімерів і беруть участь у регуляції біохімічних процесів у клітинах (Мецлер, 1980). Забруднення довкілля іонами важких металів призвело до зростання їх вмісту у грунтах і рослинах, унаслідок чого знизилася не лише активність ферментативних систем, але й порушилася їх регуляторна функція у клітинах. Дослідження природи процесів, які регулюються іонами металів, і пошук шляхів управління ними стали нагальною потребою сьогодення.
Інтегральною реакцією на зростання концентрації іонів важких металів є зниження життєдіяльності одних і відмирання інших рослин, у результаті чого на антропогенно змінених територіях зменшилося видове різноманіття і спростилися взаємозв"язки між видами (Мамчур, Демкив, 1991; Мамчур, 1997). Дослідження на видовому рівні залишають поза увагою дослідників зміни і пошкодження, які відбуваються на внутрішньовидовому, клітинному та субклітинному рівнях. У багатьох випадках ці зміни є прихованими, хоча вони визначають і норму реакції, і потенційну спроможність видів адаптуватися до екстремальних умов мінерального живлення (Демків, 1996).
Токсичну дію іонів важких металів вивчали переважно на квіткових рослинах (Егошина, Косицин, 1990). Мохи проаналізовані значно менше, хоча саме у них вплив іонів важких металів проявляється набагато контрастніше. Мохи, як безсудинні рослини, на відміну від інших представників вищих рослин, поглинають мінеральні речовини всією поверхнею тіла, завдяки чому нагромаджують катіони важких металів у підвищених концентраціях, і не виробили ніяких механізмів дискримінації щодо надмірного поглинання токсичних речовин (Бардунов, 1989; Парибок и др., 1985). Висока чутливість мохів до наявності іонів важких металів у субстраті робить їх придатними для розробки швидкого та дешевого експрес-методу оцінки екологічної ситуації не лише у повітрі (Кондратюк та ін., 1991), але й оцінки рівнів забруднення водойм. Вищевикладене обумовило мету і основні завдання дисертаційної роботи.
Зв"язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дослідження виконані в рамках науково-дослідних планових тем Інституту екології Карпат НАН України (№ держ. реєстрації 0193U018316 і 0198U002249 ), які координуються Науковою радою НАН України з проблеми 2.33.1. “Рослинний світ; вивчення, охорона і раціональне використання”.
Мета і завдання досліджень. Основною метою дисертаційної роботи було з"ясувати механізми поглинання іонів важких металів органами гаметофіту мохів, рівні нагромадження і характер їх розподілу у клітинах, природу взаємовпливів різних катіонів, а також реакцію рослин і їх здатність адаптуватися до токсичної дії іонів важких металів. Для досягнення поставленої мети були визначені такі конкретні завдання:
1) оцінити внесок активного і пасивного транспорту в поглинанні іонів важких металів мохами;
2) проаналізувати локалізацію входу і перерозподілу катіонів між клітинами;
3) оцінити ємність сайтів клітинної стінки і внутрішньоклітинних структур для зв"язування іонів важких металів;
4)
дослідити зв"язок структурно-функціональної організації клітин з їхньою здатністю поглинати катіони;
5)
проаналізувати реакцію хлорофілу на рівень техногенного забруднення і запропонувати флуоресценцію хлорофілу як бріоіндикаційний маркер техногенного забруднення довкілля;
6)
оцінити протекторну роль ІОК щодо токсичної дії іонів цинку;
7)
дослідити залежність поглинальної здатності рослинних клітин від токсичністі іонів важких металів;
8)
проаналізувати здатність іонів ванадію і селену впливати на процеси поглинання у рослин і підвищення їхньої толерантності до токсичної дії важких металів;
9)
встановити особливості формування стійкості мохів до токсичної дії іонів важких металів і можливості їх використання для індикації рівнів забруднення середовища.
Об”єкт дослідження – акумулятивні властивості листкостеблових мохів Plagiomnium undulatum (Hedw.) T.Кop. i Funaria hygrometrica Hedw.
Предмет дослідження - здатність мохів поглинати іони важких металів, розподіл їх у клітинах, реакції мохів на дію катіонів та особливості адаптації мохів до їхньої токсичної дії.
Наукова новизна отриманих результатів. Уперше оцінено внесок активного і пасивного транспорту в поглинанні клітинами мохів іонів важких металів та характер їх розподілу у клітинах. Застосування нового цитохімічного методу дозволило виявити і візуалізувати іони важких металів у клітинах листкових пластинок P. undulatum, та запропонувати використання цього методу для оцінки рівнів забруднення питної води. Уперше встановлено зв"язок між акумуляційною здатністю клітин і величиною їх рНі, інтенсивністю флуоресценції хлорофілу і концентрацією іонів важких металів у субстраті.
Практичне значення одержаних результатів.
1.
Спрямоване регулювання процесами поглинання у рослинних клітинах, а також аналітично-експериментальні дані про протекторну роль ІОК щодо токсичної дії іонів важких металів, може знайти широке практичне використання.
2.
Встановлено, що швидке поглинання гаметофітом P. undulatum іонів важких металів можна використовувати для оцінки санітарного стану питної води, її біологічного очищення, та у процесах фіторемедіації.
3.
На основі встановленої від"ємної кореляції між інтенсивністю флуоресценції хлорофілу і нагромадженням іонів важких металів гаметофітом P. undulatum запропоновано експрес-метод бріоіндикації техногенного забруднення рослин.
4.
Матеріали і методичні розробки, у тому числі аналіз природи поглинання іонів важких металів і їх розподіл у клітинах, цитохімічне визначення концентрації катіонів свинцю і кадмію, рівнів забруднення природного середовища використовуються у курсі лекцій "Фізіологія рослин" та у спецкурсах "Мінеральне живлення рослин" і "Фізіологія росту і розвитку рослин" біологічного факультету Львівського національного університету ім. Ів. Франка й стали основою для виконання студентами курсових і дипломних робіт.
Особистий внесок здобувача полягає у виконанні всього обсягу експериментальних робіт дисертації, статистичної обробки результатів, підборі й опрацюванні літературних джерел, а також за участю наукового керівника та співавторів у аналізі та інтерпретації одержаних результатів.
Апробація результатів дисертації. Основні положення дисертаційної роботи були викладені у доповідях на наукових конференціях і симпозіумах: засіданнях відділу екоморфогенезу рослин Ін-ту екології Карпат НАНУ (1992-1999 рр.), на наукових конференціях професорсько-викладацького складу біол. факультету Львівського національного університету ім. Івана Франка (1993-1999 рр.), на міжнародній конференції '' Промышленная ботаника: состояние и перспективы развития" (Кривий Ріг, травень 1993 р.), на конференції молодих вчених і спеціалістів (Ялта, 12-19 жовтня 1993р.), на Х з"їзді Укр. ботан. т-ва "Проблеми ботаніки і мікології на порозі третього тисячоліття" (Полтава, 1997) і міжнародній конференції "Онтогенез рослин у природному і трансформованому середовищі" (Львів, 1998 р.), першій та другій конференціях молодих учених м. Львова "Екологічні проблеми збереження та відтворення біологічного різноманіття" (Львів, 1998, 1999 р.), на VІІ конф. мол. вчених " Проблеми фізіології рослин і генетики на рубежі третього тисячоліття" (Київ, 2000 р.).
Публікації. За матеріалами дисертації опубліковано 12 праць, з них 6 статей в наукових журналах і збірниках праць і 6 тез доповідей на конференціях.
Структура дисертації. Дисертація складається зі вступу, 4 розділів, висновків і списку використаних джерел; вона написана на 142 сторінках і включає 14 таблиць і 18 рисунків.
ОСНОВНИЙ ЗМІСТ
ОБ”ЄКТИ І МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ
Дослідження проводили із широко розповсюдженими видами Plagiomnium undulatum (Hedw.)T.Kop. i Funaria hygrometrica Hedw.
Рослини вирощували в контрольованих умовах на середовищі Кнопа-ІІ (Демкив, Сытник, 1985). Спостереження за проростанням спор, ростом і диференціацією клітин протонеми, а також за характером регенерації ізольованих гаметофорів і листків проводили на 1-16 добу після посіву спор або регенерації у чашках Петрі, не порушуючи їх стерильності, підраховуючи не менше 100 зразків у кожному варіанті (Кардаш, Демків, 1991).
Важкі метали вносили у середовище перед стерилізацією у вигляді солей: азотнокислого свинцю (1,0-100,0 мкмоль/л), хлористого кадмію і селеніту натрію (0,01-10,0 мкмоль/л) та сірчанокислого цинку (10,0-100,0 мкмоль/л).
Вплив іонів важких металів на листкостеблові пагони імітували оббризкуванням дернинок двічі на тиждень, протягом 2 місяців відповідними концентраціями солей свинцю, кадмію і селену (Лобачевська та інші, 1992). Вміст важких металів у рослинному матеріалі та розчинах визначали атомно-абсорбційним методом на спектрофотометрі "C-115М1" (Методические...- 1981). Розподіл іонів важких металів, а також візуальну оцінку вмісту свинцю і кадмію у клітинах листкових пластинок проводили за методом І.В.Серьогіна і В.Б.Іванова (Seregin, Ivanov, 1997) з використанням дитізону. Для вимірювання рНі використовували флуоресцеїндіацетат (ФДА), який додавали у середовище до кінцевої концентрації 5 мкМ (Оглобина, Литинская, 1991).
Інтенсивність флуоресценції хлорофілу визначали на цитофлуориметрі ЛЮМАМ-Р3 з інтенференційним світлофільтром =68514 нм під впливом синьо-фіолетового світла.
Співвідношення активного і пасивного транспорту оцінювали із застосуванням ортованадату натрію (Медведєв, 1996), а розподіл поглинутих іонів за методом послідовного вимивання (Brown, Wells, 1988).Здатність мохів адаптуватися до токсичної дії катіонів аналізували експериментально, порівнюючи регенераційну здатність, ріст і диференціацію вторинної протонеми, вирощеної на субстратах з різним вмістом кадмію. Експерименти проводили у 4-кратній повторності, аналізуючи щонайменше 25 клітин або столонів. Цифровий матеріал обробляли статистичними методами (Плохинский, 1970).
РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ
Індивідуальний розвиток моху Plagiomnium undulatum. Широке розповсюдження моху P. undulatum, в основному, зумовлене високою інтенсивністю вегетативного поновлення, здатністю усіх його органів, тканин і клітин гаметофіту чи спорофіту до регенерації. Регенерація органів гаметофіту може відбуватися як епідермальними клітинами, так і безпосередньою проліферацією глибше розташованих тканин і утворенням нових пагонів. У процесі регенерації нові пагони закладаються, як правило, біполярно. Ізольовані листки P. undulatum та їх фрагменти в лабораторних умовах регенерували виключно протонемою, виявляючи чіткий апікально-базальний градієнт на фоні дорзовентральності як для листкової пластинки, так і жилки незалежно від умов вирощування. Вторинна протонема, яка утворилася з клітин листків, прискорено розросталася і морфологічно диференціювалася. Бруньки гаметофорів, як правило, закладалися вже на другій-третій клітині протонеми, через що створювалося враження, ніби вони формуються безпосередньо з клітин листкової пластинки.
Особливості поглинання іонів свинцю гаметофітом P.undulatum. Дослідженнями, проведеними з різними концентраціями азотнокислого свинцю (0,01-1,0 ммоль/л), встановлено, що вміст цього елемента у клітинах зростав пропорційно із концентрацією у середовищі (табл. 1).
Таблиця 1.
Поглинання іонів свинцю гаметофорами P. undulatum з розчинів різної концентрації і його вимивання
Загальний вміст Pb2+ у розчині, мг | Залишок Pb2+ у розчині, мг | Вміст Pb2+ у гаметофорах, мг | Вимивання Pb2+, мг
на світлі у темряві
Контроль | 0 | 0 | 0 | 0
0,207 * | 0,01 | 0,18 0,02 | 0,01 | 0,01
2,07 * | 0,05 0,01 | 1,94 0,19 | 0,01 | 0,01
20,7 * | 17,00 0,24 | 2,85 0,74 | 0,51 0,05 | 0,83 0,10
*Відповідає концентрації 0,01, 0,1 і 1,0 ммоль/л
Проведені експерименти виявили, що 1 г моху за 1 год здатний поглинути до 2 мг іонів свинцю із 100 мл розчину і зв"язувати його у клітинах, концентруючи у 100 і більше разів.
Цитохімічно було показано, що вже через 5 хв з початку занурення 3-5 см гаметофорів у 0,01 ммоль/л розчин азотнокислого свинцю вдавалося виявити червоне забарвлення комплексу катіонів з дитізоном (дитізонати) в окремих клітинах крайової зони листкової пластинки (облямівки), а через 15 хв спостерігалося яскраво-червоне забарвлення клітин облямівки і верхівки жилки (рис.1б). Із збільшенням часу експозиції до 30 хв спостерігали суцільне забарвлення клітин облямівки (рис.1в), а до 1 год - всіх клітин листкової пластинки (рис.1г). Вибіркове поглинання катіонів свинцю і кадмію відбувалося переважно листками центральної частини та основи гаметофорів. Молоді листки верхівкової зони пагону нагромаджували катіони рівномірно - всією поверхнею листкової пластинки, набуваючи спочатку рожевого, а з часом - інтенсивного червоного кольору за рахунок нагромаджених дитізонатів.
Залежна від концентрації кольорова реакція давала можливість візуально і цитофотометрично оцінювати рівень концентрації іонів свинцю у клітинах листкової пластинки мохів. Червоне забарвлення клітин може свідчити, що концентрація іонів металу близька до 1,0 ммоль/л, нижчі концентрації катіонів з дитізоном утворювали в клітинах комплекси слаборожевого забарвлення, а концентрації катіонів вищі, ніж 1,0 ммоль/л мали червоно-фіолетове забарвлення. Порівняно з інтактними клітинами листкової пластинки (рис.1а), пошкоджені клітини могли нагромаджувати катіони із набагато слабших розчинів солей свинцю і кадмію (1,0 мкмоль/л), концентруючи їх до рівня 1,0 ммоль/л.
Дослідження співвідношення активного і пасивного транспорту іонів свинцю і кадмію гаметофорами P. undulatum. Гаметофори моху, занурені у 0,1ммоль/л розчин азотнокислого свинцю, вже за 0,5 год поглинали 41,44,7%, а
за 1,0 годину – 55,7±6,1% катіону. За 12 годин рослини поглинали практично весь свинець зрозчину (рис.2).
Попереднє оброблення рослин ортованадатом натрію пригальмувало поглинальну здатність рослин. Так, за 0,5 год зразки поглинули лише 4,70,5% свинцю. Незважаючи на те, що за 24 години вміст іонів свинцю у клітинах гаметофорів зріс більше, ніж у 3 рази і досягнув 15,11,4% від наявного у розчині, все ж таки вплив ортованадату натрію виявився істотним впродовж усього часу експерименту.
Катіони кадмію ще активніше, ніж свинцю поглиналися клітинами гаметофіту. Вже за 0,5 год з розчину хлористого кадмію 88,49,0% поглинулося листкостебловими пагонами (рис.3).
За 12 год зразки моху поглинули 99,01,0%, а за 24 год ввібрали практично весь Cd2+. Зразки мохів попередньо оброблені ортованадатом натрію дещо повільніше, але лише на початкових етапах поглинали наявний у розчині кадмій. За перших 30 хв вони поглинули 25,23,1% Cd2+. Різниця у поглинанні катіонів кадмію між контрольними та обробленими ортованадатом натрію зразками мохів зберігалася лише протягом 1 години, хоча на 12 годину в обох випадках мохи поглинули майже весь наявний у розчині кадмій.
Дослідження локалізації поглинутих катіонів важких металів у клітинах моху P. undulatum. Для мохів зроблений простий і надійний метод оцінки вмісту внутрішньоклітинних і позаклітинних катіонів (Brown, Wells, 1988). Ми застосували цей метод для визначення вмісту й розподілу свіжопоглинутих катіонів свинцю і кадмію металотолерантним видом P. undulatum (рис. 4, 5).
Експериментально було встановлено, що приблизно четверта частина свинцю затримувалася у клітинній стінці. Кадмію у клітинній стінці затримувалося набагато менше - близько 5%.
Відмінності значень рНі у клітинах листкової пластинки та їх модифікації катіонами важких металів. Ми показали, що клітини облямівки листків і верхівкові клітини жилки листка P.undulatum здатні поглинати не лише важкі метали, але й диацетатфлуоресцеїн; у цих клітинах наявні найвищі значення рНі (табл. 2).
Таблиця 2.
Вплив катіонів свинцю на величину рНі клітин листкової пластинки P. undulatum. |
Контрольні клітини | Клітини, навантажені свинцем
Клітини листка | Проаналізовано клітин | Середнє значення рНі | Проаналізо-вано клітин | Середнє значення рНі
Облямівки | 207 | 7,29 0,02 | 198 | 7,04 0,02
Верхівки
жилки | 95 | 7,32 0,02 | 87 | 6,99 0,02
Середини
жилки | 158 | 7,08 0,02 | 132 | 6,91 0,02
Листкової пластинки | 216 | 6,88 0,02 | 254 | 6,75 0,02
У листках, навантажених катіонами свинцю, не зважаючи на зниження рНі, найвищі значення були визначені в клітинах облямівки і верхівки жилки, які істотно відрізнялися від інших клітин листкової пластинки і середини жилки ( td між найближчими значеннями рН клітин верхівки жилки - 6,99+0,02 і середини жилки 6,91+0,02 становить 2,85, коли t0,95=2,00). Мабуть, особливості мінерального живлення мохів всією поверхнею тіла спричинилися до диференціації спеціалізованих клітин, які ми виявили для моху P. undulatum.
Ранні зміни структури і функціонування клітин під впливом катіонів кадмію. У техногенно забруднених екотопах для мохів, як і судинних рослин, першою візуальною реакцією є знебарвлення, а відтак і руйнування хлорофілу, за яким настає некроз і відмирання клітин. Виходячи з цього, ми досліджували зміну інтенсивності люмінесценції хлорофілу в листках P. undulatum з метою використання цього показника для оцінки екологічної ситуації у конкретних екотопах.
Вагомим для біоіндикації є той факт, що порівняно невисокі концентрації катіонів кадмію (0,1 мкмоль/л) істотно знижують (td=2,1, коли t0,95=2,00) інтенсивність люмінесценції хлорофілу (32528) порівняно з контролем (41231). Такі рівні забруднення сполуками кадмію в умовах антропогенного пресу не є рідкісними, а їх виявлення цитофлуориметричним методом свідчить про те, що він може бути чутливим індикатором техногенного забруднення середовища (рис. 6).
Вплив катіонів кадмію на швидкість та характер вегетативного розмноження моху P. undulatum. Низькі концентрації катіонів кадмію (0,01-0,1 мкмоль/л) стимулювали регенераційну здатність ізольованих гаметофорів й активували швидкість росту регенерантів. Підвищені концентрації катіонів кадмію, навпаки, пригнічували ріст, починаючи з концентрації 0,1 мкмоль/л. Тільки дуже високі концентрації катіонів кадмію (10,0 мкмоль/л) виявилися летальними для ізольованих гаметофорів. Хоча навіть дуже низькі концентрації солянокислого кадмію (0,01 мкмоль/л) істотно знижували швидкість росту регенеративної протонеми. На середовищах без кадмію і на низьких концентраціях солянокислого кадмію протонема швидко диференціювалася, формуючи бруньки гаметофорів. Формування бруньок гаметофорів було найактивнішим у контролі і поступово знижувалося із зростанням вмісту солянокислого кадмію у субстраті, а на концентрації 0,5 мкмоль/л і вищих блокувалося повністю (табл. 3.).
Листки, ізольовані з гаметофорів, що виросли на субстраті зі стимулюючою (0,01 мкмоль/л) концентрацією солянокислого кадмію, як і в контролі, найкраще регенерували на середовищах, які містили Cd2+ в концентраціях 0,01 та 0,05 мкмоль/л.
Таблиця 3
Вплив Cd2+ на регенерацію ізольованих листків P. undulatum, що виросли на контрольному середовищі без хлористого кадмію
Концентрація | Кількість | Кількість регенерантів на 1 листок
Cd 2+, мкмоль/л | проаналізованих
листків | протонемних | листкостебло-
вих пагонів
0 (контроль) | 45 | 27,3 0,8 | 4,9 0,3
0,01 | 57 | 36,0 0,8 | 3,2 0,2
0,05 | 49 | 31,1 0,8 | 1,8 0,2
0,10 | 52 | 26,7 0,7 | 0,6 0,1
0,50 | 61 | 6,4 0,5 | 0
1,00 | 38 | 2, 1 0,1 | 0
5,00 | 54 | 0 | 0
Листки ізольовані з гаметофорів, що виросли на інгібуючій (0,10 мкмоль/л) концентрації іонів кадмію, мали істотно підвищену регенераційну і диференційну спроможність на середовищах з токсичними концентраціями кадмію (табл. 4).
Таблиця 4
Вплив Cd2+ на регенераційну здатність листків гаметофорів P. undulatum, що виросли на середовищі Кнопа з 0,10 мкмоль/л CdCl2.
Концентрація | Кількість | Кількість регенерантів на 1 листок
Cd2+,мкмоль/л | проаналізованих
листків | протонемних | листкостебло-
вих пагонів
0 (контроль) | 63 | 20,1 0,6 | 2,2 0,2
0,01 | 59 | 28,3 0,7 | 5,1 0,3
0,05 | 67 | 47,1 0,8 | 6,2 0,3
0,10 | 42 | 42,4 1,0 | 5,9 0,4
0,50 | 61 | 24,3 0,6 | 2,1 0,2
1,00 | 49 | 9,5 0,4 | 0
5,00 | 73 | 3,9 0,2 | 0
Таким чином, листки гаметофорів, що виросли на субстраті з концентрацією солянокислого кадмію 0,05 і 0,10 мкмоль/л, очевидно, адаптувалися саме до таких концентрацій катіона, однак, високі концентрації солей (1,00 і 5,00 мкмоль/л) виявилися все ж таки токсичними.
Листки, ізольовані з гаметофорів, що виросли на вищих концентраціях солей кадмію (0,50 і 1,00 мкмоль/л), характеризувалися набагато нижчою регенераційною здатністю, як і диференціацією вторинної протонеми у бруньки гаметофорів. Частіше ніж в інших варіантах спостерігалося відмирання новоутворених столонів. Найчастіше відмирали лише апікальні клітини, хоча гинули столони повністю. Ще виразніше це явище спостерігалося під час регенерації протонеми з листків гаметофорів, що утворилася в умовах високих концентрацій солянокислого кадмію (5,0 мкмоль/л) ( табл. 5).
Таблиця 5
Вплив Cd2+ на регенераційну здатність листків P. undulatum, ізольованих з гаметофорів, що виросли на середовищі з 5,00 мкмоль/л концентрацією солянокислого кадмію.
Концентрація | Кількість | Кількість регенерантів на 1 листок
Cd2+, мкмоль/л | проаналізованих
листків | протонемних | листкостеблових пагонів
0 (контроль) | 43 | 12,3 0,5 | 0
0,01 | 34 | 10,4 0,6 | 0,9 0,2
0,05 | 48 | 15,8 0,6 | 1,0 0,1
0,10 | 39 | 11,7 0,5 | 0
0,50 | 37 | 17,4 0,7 | 0
1,00 | 42 | 6,0 0,4 | 0
5,00 | 45 | 0 | 0
Регенеративна протонема росла і розвивалася набагато повільніше, ніж в інших варіантах. Крім того, тут не виявлено конкретної залежності від умов регенерації, з чого можна зробити висновок, що ці зміни випадкові, а загальною є тенденція пониженої життєвості листків гаметофорів, що виросли на токсичних для розвитку моху концентраціях солянокислого кадмію.
Взаємовплив сполук селену та солей важких металів на ріст і розвиток мохів. У результаті вирощування культури Funaria hygrometrica Hedw. і Plagiomnium undulatum (Hedw.) T. Kop. на середовищах з різними концентраціями селену (0,01-100 мкмоль/л) було встановлено, що лише високі його концентрації (50-100 мкмоль/л) пригнічували розвиток мохової дернини: гальмували проростання спор, ріст і диференціацію протонеми. Спільно зі сполуками Cd2+ (0,06 мкмоль/л) і Pb2+ (400 мкмоль/л) селен посилював їх токсичну дію, а у потрійних сумішах - антагонізм між ними. Отримані результати дають підставу стверджувати, що іони селену по-різному взаємодіють з іонами важких металів і не завжди протидіють їх токсичному впливу, а отже селен не може вважатися протектором щодо токсичної дії забруднення середовища іонами важких металів.
Вплив іонів цинку й ІОК на ріст протонеми мохів. Іони цинку у межах концентрацій 10,0-100,0 мкмоль/л слабо пригнічували ріст протонеми. ІОК у концентрації 0,1 мкмоль/л, спільно з цинком 10,0 мкмоль/л, пришвидшували ріст протонеми. Максимальний стимуляційний ефект проявився за присутності ІОК у концентрації 1,0 мкмоль/л. ІОК в концентрації 10,0 мкмоль/л виявилася надоптимальною, її взаємодія з іонами цинку із слабо стимулюючої ставала інгібуючою. Одержані результати підтверджують думку про можливий непрямий вплив іонів Zn2+ на ІОК шляхом стимуляції синтезу попередника ІОК амінокислоти триптофану.
АНАЛІЗ ТА УЗАГАЛЬНЕННЯ РЕЗУЛЬТАТІВ ДОСЛІДЖЕННЯ
Специфіка мінерального живлення мохів, яка виражається в поглинанні поживних речовин усією поверхнею тіла, не могла грунтуватися лише на пасивній дифузії мінеральних елементів. Як відомо, ні катіони свинцю, ні кадмію не входять до складу необхідних елементів мінерального живлення, і здатність клітин акумулювати ці елементи у підвищених концентраціях (Маєвська, 2000) може свідчити про недостатню селективність відбору елементів. Однак виявилося, що характер поглинання цих елементів далеко не тотожний: поглинання іонів кадмію тільки на початкових етапах є енергетично залежним процесом, тоді як для поглинання іонів свинцю енергетичне забезпечення необхідне впродовж усього періоду. Хімічна близькість елементів свинцю і кальцію, не виключено, зумовили їх активне поглинання за участю АТФ-залежної кальцієвої помпи плазматичної мембрани. Вважають (Медведев, 1996), що для переносу іонів важких металів, у тому числі кадмію і свинцю, можуть бути задіяні Са2+-АТФази Р-типу і/або системи вторинного активного транспорту.
Поглинуті клітинами полютанти призводять до глибоких, а часто й незворотних фізіологічних і біохімічних змін задовго до того, як це можна оцінити візуально - хлорози, некрози, коли ситуація набуває незворотнього характеру (Шабала, Войнов, 1994). Однією з найчутливіших систем рослинної клітини є реакції фотосинтезу (Тарчевский и др., 1975). Її зміни призводять до істотних модифікацій обміну речовин у клітині й організмі загалом. Було показано, що під впливом іонів кадмію у клітинах листкової пластики моху P. undulatum знижується інтенсивність флуоресценції хлорофілу і ця зміна наступає дуже швидко - через 1-2 години після занурення рослин у розчини з порівняно низькими, починаючи з 0,1 мкмоль/л концентраціями хлористого кадмію (Маєвська та ін., 2000).
Як уже відзначалося, одним з показників первинних неспецифічних змін є підкислення цитозолю, що також може бути чутливим маркером техногенної токсикації. Цитофлуориметрично нами показано, що вибіркове поглинання іонів важких металів клітинами облямівки і жилки листків тісно скорельоване з підвищеними значеннями рНi. Незважаючи на загальне зниження рНi на 0,2-0,3 одиниці під впливом іонів свинцю, різниця між клітинами облямівки листків, жилки і листкової пластинки зберігалася. Механізм цього явища не відомий, однак він може мати принципове значення для перерозподілу поглинутих катіонів між клітинами листкової пластинки.
Не менш важливою є інформація щодо локалізації поглинутих катіонів, оскільки їх розподіл між різними сайтами зв”язування у клітині має принципове значення як для оцінки поглинальної здатності рослин, так і їх толерантності до токсичної дії полютантів. Ми показали, що іони кадмію нагромаджуються у більшій мірі в середині клітин, чим і пояснюється його вища токсичність, порівняно із свинцем.
Однією з найважливіших проблем техногенного забруднення природного середовища є проблема виживання живих організмів у екстремальних умовах. Розглядаючи проблему виживання, необхідно підкреслити, що існує генотипова й фенотипова адаптації. У результаті генотипової адаптації на основі спадкової мінливості, мутацій і природного добору сформувалися сучасні види тварин і рослин. У процесі фенотипової адаптації організм реалізує свої потенційні можливості без кількісної чи якісної зміни наявної генетичної інформації. В основі фізіологічної адаптації лежить регуляція внутрішньоклітинного метаболізму у зв"язку зі зміною умов зовнішнього середовища під контролем генотипу. Наявна адаптивність рослин непостійна впродовж онтогенезу. У мохів толерантність до токсичної дії іонів важких металів поступово зростає з віком гаметофіту (Речевська, 1999), хоча найкритичнішим етапом онтогенезу є репродуктивна фаза розвитку організму.
Експериментально встановлена адаптація до токсичної дії іонів кадмію залежно від умов вирощування вихідного матеріалу. Регенерація ізольованих листків моху P. undulatum була активнішою у випадку, коли гаметофори, з яких ізольовували листки, вирощували на відносно невисоких концентраціях хлористого кадмію, які слабо інгібували ріст. Високі концентрації хлористого кадмію призводили до послаблення їх регенераційної здатності. Ми показали, що нагромадження іонів кадмію у клітинах викликало зниження рНі, а також різке зростання, а потім поступову нормалізацію вмісту мембранно-зв"язаного кальцію, самоізоляцію клітин за допомогою калозного бар"єру (Хоркавців та ін., 1994), до зниження активності внутрішньоклітинного метаболізму (Речевська, Демків, 1997), активації синтезу та розширення електрофоретичного спектру білків (Речевська, 1999), з чого можна зробити висновок про те, що адаптація мохів до токсичної дії катіонів здійснюється за участю загальних механізмів виживання біотичних систем.
Однак, на відміну від інших організмів, мохам притаманна важлива перевага в тому відношенні, що, завдяки високій регенеративній здатності й прискореному розвитку їх вегетативний цикл (від диференціації і закладання бруньок гаметофорів і формування листкостеблового пагону) можна повторювати багаторазово у різних умовах, аналізуючи реакцію на ці умови.
Таким чином, мохи можуть бути задіяні не тільки як чутливі індикатори техногенного забруднення природного середовища, але й як перспективні об"єкти дослідження механізмів виживання рослин в екстремальних природних умовах. На мохах експериментально вдалося показати, що рівень адаптованості чи неадаптованості залежить від стану, в якому організм вийшов із стресу: з активованим внутрішньоклітинним метаболізмом, чи з активованими процесами старіння і деградації.
ВИСНОВКИ
У дисертації відповідно до поставленої мети та завдань дослідженення проаналізовано особливості поглинання іонів важких металів гаметофітом моху, їх розподілу між клітинами та у клітинах, рівнів акумуляції, та їх токсичну дію на ростові процеси, а також на підставі експериментальних даних уточнена концепція функціональної адаптації рослин до токсичної дії полютантів.
1.
На мохах апробований новий цитохімічний метод оцінки вмісту іонів свинцю і кадмію. Показано, що у клітинах листкової пластинки ці катіони концентрувалися до 1,0 мМ і більше з розчинів концентрацією не нижчою, ніж 0,01 мМ.
2.
У Plagiomnium undulatum перша візуальна реакція на наявність іонів важких металів у субстраті проявлялася через 10-15 хв після занурення гаметофорів у розчини солей, спочатку у клітинах облямівки і жилки, а потім у решти клітин листкової пластинки, що може свідчити про послідовність заповнення їх сайтів катіонами. Вибірковість проявлялася лише у повністю сформованих листках; молоді листки поглинали катіони однаково всіма клітинами листкової пластинки.
3.
Поглинання іонів кадмію відбувалося переважно шляхом дифузії і тільки на початкових етапах було задіяне активне перенесення іонів. На відміну від кадмію активний транспорт домінував у поглинанні свинцю протягом усього процесу: кінцевий вміст катіонів у клітинах також контролювався активним транcпортом.
4.
Показано, що поглинуті катіони, в основному, концентрувалися в середині клітини. Клітинна стінка мохів може затримати не більше 25% іонів свинцю і не більше 5% іонів кадмію.
5.
Іони кадмію модифікували проростання спор, ріст та диференціацію клітин протонеми, а також регенерацію ізольованих стебел і листків. Низькі концентрації іонів кадмію (0,01 мкмоль/л) стимулювали регенераційну здатність, а високі (10,0 мкмоль/л) виявилися летальними як для ізольованих листків, так і для гаметофорів.
6.
Показано, що листкостеблові пагони, які виросли на субстраті з хлористим кадмієм мали підвищену толерантність до токсичної дії катіонів. Післядія елементу найефективніше проявлялася на слабо інгібуючих концентраціях (0,01-0,05 мкМ) хлористого кадмію. Концентрації близькі до летальних (5,0-10,0 мкМ), пригнічували ріст, блокували здатність гаметофорів адаптуватися до токсичної дії кадмію.
7.
Сумісна дія селену і свинцю та селену і кадмію інгібували ріст і розвиток протонеми мохів, а за умов потрійної дії селену, свинцю і кадмію - селен підсилював антагонізм цих іонів.
8.
На підставі виявленої нами від"ємної кореляції між вмістом важких металів у середовищі та інтенсивністю флуоресценції хлорофілу у листках P. undulatum i F. hygrometrica запропоновано ще один бріоіндикаційний маркер антропогенного забруднення довкілля.
9.
Виявлена синергічна взаємодія іонів цинку та ІОК на ріст протонеми: за низьких концентрацій вони стимулювали ростові процеси, а за умов високих - взаємопосилювали інгібуючий вплив.
10.
Рівень адаптованості мохів чи його зниження залежить від концентрації катіонів: помірно токсичні - сприяють підвищенню адаптивної здатності, а сублетальні - її зниженню.
СПИСОК ПРАЦЬ, ОПУБЛІКОВАНИХ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ
1. Лобачевська О.В., Коструба С.М., Демків Л.О. Взаємовплив цинку й ІОК на ріст протонеми мохів // Фізіолого-біохімічна оцінка дії техногенних факторів на рослини / Вісник Львів. ун-ту. - Сер. Біологічна. - 1997. - Вип. 24. - С.55 - 57.
2. Маєвська С.М., Кардаш О.Р., Демків Л.О. Розподіл свинцю і кадмію у клітинах гаметофіта Plagiomnium undulatum (Hedw.) T. Kop. (Mniaceae, Bryopsida) // Укр. ботан. журн. - 2000. - 57, № 3. -С. 310 - 315.
3. Лобачевська О.В., Маєвська С.М. Вплив селену і важких металів на ріст і розвиток моху Funaria hygrometrica Hedw. // Вісник Львів. ун-ту. Сер. біологічна. - 2000. - Вип. 25.- С. 85 - 92.
4. Маєвська С.М., Кардаш О.Р., Демків Л.О., Лобачевска О.В. Особливості поглинання іонів важких металів мохом Plagiomnium undulatum (Hedw.) T. Kop. та його реакція на їх токсичну дію // Вісник Львів. ун-ту. Сер. біологічна. - 2000. - Вип. 26.- С. 134 - 141.
5. Маєвська С.М., Кардаш О.Р., Демків Л.О., Речевська Н.Я. Гістохімічне визначення важких металів у мохах // Темат. збірник Ін-ту екології Карпат НАН України: Матеріали першої наук. конф. молодих учених м. Львова "Наукові основи збереження біотичного різноманіття" (Львів, листопад 1998 р.). Львів: "Ліга - Прес", 2000.- вип. 1. - С. 59-66.
6. Маєвська С. М. Вивчення сорбційної здатності мохів на прикладі виду Plagiomnium undulatum (Hedw.) T. Kop. // Темат. збірник Ін-ту екології Карпат НАН України: Матеріали другої наук. конф. молодих учених м. Львова " Наукові основи збереження біотичного різноманіття" (Львів, 14 грудня 1999 р.). Львів: "Ліга - Прес", 2000.- вип. 2. - С. 37- 44.
7. Лобачевська О.В., Коструба С.М. Морфофізіологічні особливості толерантності мохів // Промышленная ботаника: состояние и перспективы развития / Тезисы докл. Межд. научной конференции, Кривой Рог, май 1993/, Донецк.- 1993.- С.121.
8. Коструба С.М. Вплив цинку на ріст протонеми моху Pohlia nutans Hedw. // Тези доп. конф. молодих учених і спеціалістів. Актуальні питання ботаніки і екології (19-21 жовтня 1993, Ялта) Київ.- 1993.- С.64.
9. Коструба С.М., Лобачевська О.В. Реакція мохів на токсичний вплив кадмію // Проблеми ботаніки та мікології на порозі третього тисячоліття / Матеріали Х з"їзду Укр.ботан. товариства (Полтава, 22 -23 травня 1997р.). - Київ - Полтава, 1997.- С.138.
10 Лобачевська О.В., Маєвська С.М. Вплив селену на ріст та розвиток моху Funaria hygrometrica Hedw. // Онтогенез рослин в природньому і трансформованому середовищі / Матер. міжнар. конф. (Львів, липень 1-4, 1998), - Львів , "СПОЛОМ", 1998. - С. 220 - 221.
11. Маєвська С.М., Лобачевська О.В., Речевська Н.Я., Демків Л.О. Вплив кадмію на регенераційну здатність і розвиток регенерантів гаметофіту Plagiomnium undulatum // Онтогенез рослин в природньому і трансформованому середовищі / Матер. міжнар. конф. (Львів, липень 1-4, 1998). - Львів, "СПОЛОМ", 1998. - С.221-222.
12. Маєвська С.М. Дослідження співвідношення активного і пасивного поглинання свинцю і кадмію листкостебловими пагонами Plagiomnium undulatum (Hedw.) T. Kop. // Проблеми фізіології рослин і генетики на рубежі третього тисячоліття / Тези доп. VII конф. молод. вчених (18-20 жовтня 2000 р.), Київ.- 2000.- С. 56.
АНОТАЦІЯ
Маєвська С. М. Морфо-функціональні аспекти стійкості мохів до токсичної дії іонів важких металів. - Рукопис.
Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 03.00.12 - фізіологія рослин - Львівський національний університет імені Івана Франка, Львів, 2001.
Дисертацію присвячено дослідженню здатності мохів поглинати іони свинцю і кадмію та акумулювати їх у клітинах, динаміці поглинання, рівнів нагромадження та розподілу між клітинами і у клітинах; індивідуальному розвитку моху Plagiomnium undulatum, регенерації ізольованих гаметофорів, листків та їх фрагментів, а також здатності рослин адаптуватися до токсичної дії іонів важких металів.
Показано, що у поглинанні свинцю домінує активний транспорт, а кадмію - пасивна дифузія. Основна маса поглинутих катіонів зосереджувалася у цитозолі, а у клітинній стінці затримувалося близько 5% кадмію і 25% свинцю; концентрація катіонів зростала у 100 і більше разів у порівнянні з концентрацією у середовищі. Під впливом токсичної дії іонів свинцю у клітинах знижувалося рНі на 0,2-0,3 одиниці та інтенсивність люмінесценції хлорофілу. Найнижчі концентрації кадмію (0,01 мкмоль/л) стимулювали регенерацію ізольованих листків, але гальмували диференціацію регенеративної протонеми, вищі концентрації гальмували обидва процеси. Встановлено, що 0,10 мкмоль/л концентрація кадмію індукувала адаптацію моху до токсичної дії кадмію. Сублетальні концентрації кадмію (5,00 мкмоль/л), які не тільки гальмували ріст, але й відмирання клітин, посилювали їх чутливість до токсичної дії кадмію. Сполуки селену слабо гальмували ростові процеси, але спільно зі свинцем і кадмієм посилювали їх токсичну дію, а також антагонізм між ними при потрійній дії суміші іонів. Іони цинку посилювали стимулюючий вплив ІОК на ріст протонеми.
Ключові слова: мохи, індивідуальний розвиток, регенерація, акумуляція, Pb2+ , Cd2+, Zn2+, Se4+, інтенсивність люмінесценції, рНі, фенотипова адаптація.
АННОТАЦИЯ
Маевская С.М. Морфо-функциональные аспекты стойкости мхов к токсическому действию ионов тяжелых металлов - Рукопись.
Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.12 - физиология растений. - Львовский национальный университет имени Ивана Франко, Львов, 2001.
Диссертация посвящена исследованию способности мха поглощать ионы свинца и кадмия, уровней их накопления и распределения между клетками и в клетках, динамике поглощения ионов свинца и кадмия, цитохимической оценке распределения и содержания катионов в клетках; индивидуальному развитию мха Plagiomnium undulatum, регенерации изолированных гаметофоров, листьев и их фрагментов, а также способности растений адаптироваться к токсическому действию ионов тяжелых металлов.
Показано, что в поглощении свинца доминирует активный транспорт, а кадмия - пассивная диффузия; поглощенные катионы преимущественно накапливаются в цитозоле, клеточная стенка задерживает не более 5% кадмия и 25% свинца. Концентрация катионов в клетках возрастает в 100 и более раз по-сравнению со средой. Под влиянием токсического действия ионов свинца и кадмия в клетках происходило закисление цитозоля на 0,2-0,3 единицы и снижение интенсивности люминесценции хлорофилла. Самые
