НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ

ІНСТИТУТ ЕКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЇ ПАТОЛОГІЇ, ОНКОЛОГІЇ І РАДІОБІОЛОГІЇ ІМ. Р.Є. КАВЕЦЬКОГО

МЕНЬОК ТЕТЯНА АНДРІЇВНА

УДК: 616-006.66:57.083.3

ОБҐРУНТУВАННЯ ВИКОРИСТАННЯ ПРЕПАРАТУ БЛАСТЕН В ЯКОСТІ ЗАСОБУ ПІДТРИМУВАЛЬНОЇ ТЕРАПІЇ ТА ІМУНОРЕАБІЛІТАЦІЇ ОНКОЛОГІЧНИХ ХВОРИХ

14.01.07 – онкологія

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата медичних наук

Київ – 2001

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана в Інституті експериментальної патології, онкології і радіобіології ім. Р.Є. Кавецького НАН України.

Науковий керівник – доктор медичних наук

Савцова Зоя Дмитрівна,

завідувач відділу імуномодуляції Інституту експериментальної патології, онкології і радіобіології ім. Р.Є. Кавецького НАН України.

Офіційні опоненти: – доктор медичних наук, професор

Гріневич Юрій Якимович,

завідувач науково-дослідної лабораторії клінічної імунології Інституту онкології АМН України;–

кандидат медичних наук

Півнюк Валентина Михайлівна,

старший науковий співробітник відділу модифікації протипухлинної терапії Інституту експериментальної патології, онкології і радіобіології ім. Р.Є. Кавецького НАН України.

Провідна установа – Київська медична академія післядипломної освіти ім. П.Л. Шупика МОЗ України, кафедра онкології, м. Київ.

Захист відбудеться “16” травня 2001 року о 15 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д. 26.155.01 в Інституті експериментальної патології, онкології і радіобіології ім. Р.Є. Кавецького НАН України (03022, м. Київ, вул. Васильківська, 45).

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці ІЕПОР ім. Р.Є. Кавецького НАН України.

Автореферат розісланий “___” квітня 2001 року.

Вчений секретар спеціалізованої вченої ради,

доктор медичних наук Н.В. Бородай

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність проблеми. За останні роки, завдяки розробці нових засобів і методів хіміо- (ХТ) та променевої терапії (ПТ), досягнуті певні успіхи в лікуванні онкологічних хворих. Показано, що, як правило, існує пряма залежність між разовою та сумарною дозами хіміопрепаратів або опромінення і терапевтичним ефектом (Н.И. Переводчикова, 1993; М.Л. Гершанович и др., 1995; А.М. Гарин, 1995). Розроблені і впроваджені різноманітні схеми і режими високодозової інтенсивної комбінованої хіміотерапії або хіміопроменевої терапії у лікуванні ряду пухлин (Н.Н. Трапезников, 1996; V.T. DeVita et al., 1995; G.D. Hammond, 1997; M.D. Abeloff et al., 2000; J.F. Holland et al., 2000). Припускається також, що підвищення доз цитотоксичних впливів має важливе значення для подолання резистентності пухлинних клітин (И.С. Долгополов, Г.Л. Менткевич, 2000). Проте, подальше підвищення ефективності ХТ або ПТ обмежується їх побічним токсичним впливом, серед проявів якого чи не найбільше клінічне значення має розвиток цитостатичної мієлодепресії. Післяпроменева та хімічноіндукована мієлодепресія перешкоджає досягненню максимальної ефективності протипухлинної терапії, унеможливлює успішне використання методів імунотерапії пухлин, а в ряді випадків супроводжується розвитком ускладнень, які можуть складати безпосередню загрозу для життя хворого (И.В. Поддубная и др., 1993; A.A. Hewitt, 1994; J. Pereira et al., 1997; R. Kath et al., 1998). Виходячи з цього, обов’язковим компонентом комбінованого лікування онкологічних хворих є використання підтримувальної (супровідної) терапії (Н.И. Переводчикова, 1993; М.Л. Гершанович, В.А. Филов, 1999; И.В. Касьяненко, 2000). Розроблено велику кількість методів і засобів профілактики та лікування цитостатичної мієлодепресії, включаючи трансплантацію клітин кісткового мозку (R.F. Stevens et al., 1992), стовбурових клітин периферичної або кордової крові (L. To et al., 1997), ембріональних кровотворних клітин (В.И. Грищенко и др., 1988) та використання рекомбінантних гемопоетичних ростових факторів (В.А. Горбунова и др., 1995; А.Ф. Возианов и др., 1998). Проте, незважаючи на широке коло сучасних підтримувальних засобів, проблема мієлодепресії все ще залишається не вирішена. Застосування згаданих методів обмежене рядом біологічних або клінічних причин (проблема гістосумісності, токсичність, плейотропність ефектів, відсутність корегуючого впливу на прояви органотоксичності) (С.А. Тюляндин, 1991; Ch.A. Dinarello, 1998). Лише окремі з препаратів підтримувальної терапії здатні одночасно справляти імунореабілітуючий вплив на організм пацієнта (M.A. Williams et al., 1998; В.В. Афанасьева и др., 2000); при використанні більшості з них для покращення імунного статусу необхідно застосовувати ще й імуномодулюючі препарати, що додатково ускладнює схему лікування (А.В. Асеев и др., 1995; F. Sanchiz, 1996; R.J. Holden et al., 1998). Крім того, враховуючи високу вартість сучасних засобів і методів підтримувальної терапії, актуальним для практичної медицини стає питання “ефект лікування-вартість” (B. Leese et al., 1994; G. Lyman et al., 1998).

Одним з можливих і ще мало розроблених підходів до профілактики та лікування побічних ефектів цитостатичної терапії може бути використання імуномодуляторів мікробного походження, вплив яких на організм реалізується через активацію продукції моноцитарними клітинами ряду цитокинів (Р.М. Хаитов, Б.В. Пинегин, 1996). В коло останніх входять, зокрема, інтерлейкін-1 (ІЛ-1) та фактор некрозу пухлин (ФНП), які є чи не найважливішими медіаторами ранніх захисних реакцій організму після пошкодження гемопоезу чинниками різної природи (W.E. Fibbe, 1990; L.S. Constine et al., 1991; M.J. Evans et al., 1991; B.B. Aggarwal, 1996). Недостатньо вивчено можливості таких імуномодуляторів в якості засобів підтримувальної терапії. Клінічні схеми використання хімічних препаратів з цієї групи залишаються в більшості емпіричними. Існує певний розрив між такими схемами та згаданими вище сучасними даними про механізми фізіологічного захисту систем гемо-, імунопоезу та протипухлинної стійкості організму до цитотоксичних впливів, а також сучасною інформацією про можливість подвійного впливу більшості моноцитарних цитокинів на ріст і метастазування пухлин (А.Ф. Возианов и др., 1998; Н.М. Бережная, В.Ф. Чехун, 2000).

Науково-біотехнологічним центром “Ензифарм” (Україна) сумісно з ІЕПОР ім. Р.Є. Кавецького НАН України, Державним НДІ особливо чистих біопрепаратів (Росія), Інститутом фармакології та токсикології АМН України та Національним технічним університетом України “КПІ” розроблено препарат “Бластен” (Пат. 20509 А, А61К 35/74, С12N 1/20. – АТНБЦ “Ензифарм”, UA. Біотехнологічний спосіб одержання імуномодулюючого препарату / Болоховська В.А., Волкова М.Ю., Воспяков В.Г., Даниленко В.С., Латишевська Г.В., Мартинюк Н.Б., Мосієнко В.С., Мосієнко М.Д., Савцова З.Д., Сойченко В.В., Шинкаренко Л.М., Щеглова Н.А. (Україна). – №95083935; Заявл. 28.08.95; Опубл. 15.07.97.) на основі оригінального штаму Lactobacillus Delbrueckii, який, як показали доклінічні дослідження, може ефективно впливати на активність клітин моноцитарного ряду. Медичне застосування бластена дозволено Фармакологічним Комітетом МОЗ України (протокол розширеного засідання Президії ФК МОЗ №1 від 30.01.97); препарат зареєстрований Державним фармакологічним центром МОЗ України, реєстраційне посвідчення №1100/02-563 від 28.08.00.

Зв’язок роботи з науковими програмами, планами і темами. Дисертаційна робота виконана у відповідності з планами науково-дослідної роботи Інституту експериментальної патології, онкології та радіобіології ім. Р.Є. Кавецького НАН України за темами “Дослідження та впровадження в клінічну практику імуномодулятора “Бластен” і протипухлинної вакцини та розробка технології отримання готових лікарських форм пробіотичного імунокоректора “Лактофлор” для підвищення ефективності комбінованої терапії пухлинної хвороби” (реєстраційний номер 0198U00518) та “Дослідити закономірності впливу протипухлинних вакцин (серії ІЕПОР) на систему імунітету та визначити умови їх оптимального використання” (реєстраційний номер 0100U000619).

Мета дослідження. Порівняльне вивчення впливу різних доз бластена на кровотворення експериментальних тварин після сублетального ?-опромінення або застосування цитостатика, активність ефекторів протипухлинної резистентності організму та на перебіг модельних пухлинних процесів і обґрунтування на цій основі схеми застосування препарату для зменшення мієлодепресії та імунореабілітації онкологічних хворих при комплексному лікуванні.

Задачі дослідження.

1. Визначити в експерименті дозозалежність та динаміку впливу бластена на реакції клітинного імунітету та активність неспецифічних ефекторів протипухлинної резистентності.

2. Вивчити вплив бластена на показники клітинного складу периферичної крові опромінених тварин та визначити можливі механізми такого впливу.

3. Охарактеризувати та співставити вплив різних доз бластена на прояви цитотоксичної дії ?-опромінення та на активність природних кілерів (ПК) і продукцію інтерлейкіна-2 (ІЛ-2) клітинами селезінки експериментальних тварин.

4. Дослідити вплив різних доз бластена на прояви токсичності та протипухлинну ефективність циклофосфаміду (ЦФ) у тварин з модельними пухлинами.

5. Оцінити корегуючий вплив на прояви токсичності хіміо- та/або променевої терапії і імунореабілітуючі можливості експериментально обґрунтованих доз і схем застосування бластена при комбінованій терапії хворих на рак молочної залози (РМЗ) ІІ-ІV стадії.

Об’єкт дослідження. Хворі на РМЗ (ІІ-IV стадії), яким було проведене комплексне лікування з застосуванням бластена (основна група) або без цього препарату (контрольна група). Експериментальні тварини (інтактні миші; миші, що зазнали сублетального зовнішнього гама-опромінення або одержували ЦФ; миші з модельними пухлинами), яким проводили введення бластена за різними режимам.

Предмет дослідження. Новий вітчизняний препарат бластен; його вплив на стан імунної системи (в т.ч. основні реакції протипухлинної резистентності) і на прояви токсичної дії протипухлинних хіміопрепаратів та іонізуючого випромінення.

Методи дослідження. При проведенні експериментальних досліджень використовували цитологічні, гістохімічні, імунологічні, радіометричні методики, культури клітин, моделі та методи експериментальної онкології. Для оцінки стану хворих на РМЗ використані загально клінічні, гематологічні і імунологічні (включаючи традиційні лабораторні методики клінічної імунології, а також визначення спонтанної продукції in vitro моноцитами крові ІЛ-1, ІЛ-2, ФНП і вмісту ФНП в плазмі) методи. Всі результати проаналізовані статистично.

Наукова новизна. Вперше охарактеризовані дозозалежність впливу бластена на активність ефекторів специфічного імунітету та природньої резистентності, а також відмінності динаміки імуномодуляції при використанні високих (мг/кг) і низьких (мкг/кг) доз препарату. Встановлено, що протекторний вплив бластена на клітинний склад периферичної крові при опроміненні в сублетальних дозах здійснюється за механізмом активації продукції моноцитами/макрофагами ФНП і ІЛ-1. Вперше виявлено, що бластен здатний зменшувати прояви не тільки мієлотоксичності, але й негативного впливу алкілюючого хіміопрепарата (ЦФ) на епітелій крипт тонкої кишки. Обґрунтовані дози бластена, які корегують побічні токсичні ефекти протипухлинної терапії і, одночасно, є оптимальними за впливом на активність ПК, продукцію ІЛ-2 та протипухлинну і антиметастатичну дію ЦФ. Клініко-лабораторними дослідженнями доведена ефективність бластена в якості препарату підтримувальної терапії та імунореабілітації хворих на РМЗ II-IV стадії.

Практичне значення. Застосування бластена за обґрунтованими схемами в комплексному протипухлинному лікуванні дозволило зменшити прояви побічних ефектів ХТ та ПТ, покращити загальний стан хворих, провести комбіноване лікування хворих на РМЗ ІІ-IV стадії у запланованому обсязі. При застосуванні бластена в схемах неоад’ювантної, ад’ювантної, а в окремих випадках і паліативної терапії виявлено зменшення лейкопенії та диспептичних проявів, а також корекцію стану імунної системи, що, вірогідно, опосередковано чинить позитивний вплив бластена на ефективність спеціального лікування. Результати дослідження впроваджені у науково-дослідному відділенні пухлин молочної залози Інституту онкології АМН України та в Київській міській онкологічній лікарні.

Особистий внесок здобувача. Автором особисто зібрана та проаналізована література за темою дисертації; проведені дослідження ефектів дії бластена на експериментальних тваринах; здійснено визначення активності ПК, спонтанної продукції мононуклеарними клітинами периферичної крові (МКПК) ІЛ-1, ІЛ-2, ФНП та вмісту ФНП в плазмі крові хворих на РМЗ, а також комплексний аналіз результатів клініко-лабораторного обстеження хворих; самостійно проведено статистичну обробку та теоретичне узагальнення результатів роботи.

Апробація результатів дисертації. Основні положення дисертації викладені на конференції ІЕПОР у 1998 році; IV науково-практичній конференції з актуальних питань клінічної імунології та алергології (Київ, 1999); ІІІ міжінститутській конференції молодих вчених “Сучасні проблеми експериментальної і клінічної онкології” (Київ, 2000); II з’їзді онкологів країн СНД (Київ, 2000); V науково-практичній конференції “Актуальні питання алергології, клінічної і лабораторної імунології” (Київ, 2000).

Публікації. За результатами дисертації опубліковано 7 наукових робіт, в тому числі 4 статті у провідних фахових журналах.

Структура та обсяг дисертації. Дисертаційна робота, обсягом 144 сторінки, складається з вступу, огляду літератури, чотирьох розділів власних досліджень, аналізу та узагальнення результатів дослідження, висновків, списку літератури, який включає 303 першоджерела, в тому числі 155 зарубіжних. Робота ілюстрована 3 рисунками та 16 таблицями.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Матеріали та методи дослідження. Репрезентовані в роботі дані одержані на експериментальному та апробовані на клінічному матеріалі.

Експериментальні дослідження проводили на нелінійних білих мишах та мишах ліній А, C57Bl/6, Balb/с, CBA57Bl/F1, С3Н x СС57W/F1 з розплідника віварію ІЕПОР НАН України. В дослідах використовували тварин обох статей, віком 2,5-3,5 міс., масою 19-21 г. Досліджували вплив бластена на показники функціональної активності різних ефекторів протипухлинних реакцій; на прояви депресії кровотворення, імунопоезу, мітотичної активності кишкового епітелію, яка виникала під дією фракціонованого зовнішнього ?-опромінення (джерело опромінення 137Cs, СД – 4,5 Гр) або хімічного цитостатика (циклофосфамід інтраперитонеально 200 мг/кг), на терапевтичну ефективність ЦФ (тричі по 60 мг/кг) у тварин з модельними пухлинами: карциномою легенів Льюїс, саркомою 180. В дослідженнях були застосовані наступні методики: стандартне визначення кількості еритроцитів і лейкоцитів в периферичній крові, відносної маси та клітинності лімфоїдних органів (тимусу, селезінки, периферичних лімфатичних вузлів); дослідження вмісту зрілих Т-, В-лімфоцитів, бластів і великих лімфоцитів в периферичних лімфовузлах (фарбування за Штокінгером і Келльнером) та інтенсивності синтезу в них ДНК (радіометричним методом); визначення проліферативної реакції лімфоцитів лімфовузлів у відповідь на введення поліклональних Т- (Кон А, “Sigma”, США) і В-клітинного (ДС, “Lobo-Chemie”, Австрія) мітогенів in vivo (за допомогою радіометричного методу); визначення функціональної активності ПК, виділених з селезінки, в цитотоксичному тесті in vitro (Р.А. Бурханов и др., 1984); визначення функціональної активності моноцитів/макрофагів за здатністю до спонтанної продукції in vitro ФНП (H. Fisch, G. Gifford, 1983), ІЛ-1 (Дж. Клаус, 1990) та за результатами НСТ-тесту (тест відновлення нітросинього тетразолію); визначення функціональної активності Т-лімфоцитів за здатністю до спонтанної продукції in vitro ІЛ-2 (Дж. Клаус, 1990); визначення мітотичного індексу епітеліальних клітин крипт тонкої кишки в гістологічних препаратах, забарвлених гематоксилін-еозином. Перебіг росту модельних пухлин характеризували за стандартними показниками: розміри пухлинного вузла (на моделі карциноми Льюїс – об’єм в мм3, саркоми 180 – маса в г), частота і інтенсивність метастазування. Терапевтичний ефект використаних препаратів (ЦФ, бластен) оцінювали на обох пухлинних моделях за відсотком гальмування росту пухлин (ГРП), а на моделі карциноми Льюїс також за індексом інгібування метастазування (ІІМ) (Н.В. Чердынцева и др., 1997).

Клініко-лабораторні дослідження проведені у 45 хворих на РМЗ, які проходили спеціальне лікування у науково-дослідному відділенні пухлин молочної залози (керівник – проф. В.І. Тарутінов) Інституту онкології АМН України та у 30 жінок-донорів. Вік хворих на РМЗ становив 46,0 ± 2,3 р. (до 56 – 17 (65після 56 років – 9 (35пацієнток); вік донорів – 43,2 ± 4,6 р. (до 56 – 23 (76 %), після 56 років – 7 (24 %) жінок. Хворих на РМЗ ІІ-ІІІ стадії було 41, IV стадії – 4. Бластен застосовували у 30 хворих на РМЗ II-IV стадії (основна група): у 26 хворих (ІІ-ІІІ стадії) – у комплексному лікуванні, яке складалось з ХТ, ПТ та операції, у 4 (ІV стадії) – під час паліативної ХТ. До контрольної групи (стандартне протипухлинне лікування без використання бластена) увійшли 15 пацієнток з РМЗ ІІ-ІІІ стадії. ХТ виконувалась по загальновідомим схемам (CMF, CAF, CMAF); при паліативній терапії 2 пацієнткам додатково вводили цисплатин (сумарна доза 60-110 мг). ПТ проводилась дистанційним методом на установці “Агат В” (джерело опромінення Со60) за прийнятими при лікуванні РМЗ схемами (СВД – 40-50 Гр протягом 3-4 тижнів при неоад`ювантному та 39,24 0,2 Гр при ад`ювантному лікуванні). У пацієнток до 56 років застосовували також андрогенотерапію (тестостерон по 1,0 мл в/м 1 раз на тиждень), після 56 років – протиестрогенну терапію (тамоксіфен по 20 мг на добу). Хірургічне лікування включало радикальну операцію за Пейті або за Холстедом. Бластен вводили в дозі 0,002 г підшкірно за добу до початку ХТ та/або ПТ, а далі 1 раз на 3-7 добу 3-5 ін’єкцій на курс. У всіх пацієнток основної і контрольної груп визначали кількість лейкоцитів та еритроцитів у периферичній крові до та після лікування, реєстрували диспептичні прояви та оцінювали загальний стан за індексом Карновського. Проведено повне імунологічне обстеження у 15 (11 – ІІ-ІІІ стадії, 4 – IV стадії РМЗ) пацієнток з основної та 15 – з контрольної груп, а також 30 донорів. Перше імунологічне обстеження хворих на РМЗ проводили до початку протипухлинної терапії та введення бластена, друге – через 5–7 днів після закінчення курсу лікування. Загальноприйняті показники клітинного та гуморального імунітету: загальна кількість лімфоцитів; відносний та абсолютний вміст Т-, В-, 0-лімфоцитів в периферичній крові; чутливість лімфоцитів до спленіну та тимогену; концентрація основних класів імуноглобулінів та рівень циркулюючих імунних комплексів (ЦІК) в сироватці крові – визначали за допомогою стандартних методів клінічної імунології (Ю.А. Гриневич, Л.Я. Каменец, 1986; В.Г. Передерий и др., 1995). Визначали in vitro природну цитотоксичну активність мононуклеарних клітин периферичної крові (МКПК) (Р.А. Бурханов и др., 1984), концентрацію ФНП у плазмі крові, а також спонтанну продукцію in vitro МКПК ФНП, ІЛ-1 і ІЛ-2. Визначення ФНП у плазмі крові та супернатантах культур МКПК проводили за допомогою біологічного методу на ФНП-чутливій культурі клітин L929 (H. Fisch, G. Gifford, 1983), користуючись калібрувальною кривою, побудованою за результатами титрування на клітинах L929 рекомбінантного ФНП людини (“Sigma”, США). Вміст ІЛ-1 та ІЛ-2 в супернатантах культур МКПК визначали імуноферментним методом, використовуючи відповідні тест-системи [ТОВ “Протеиновый контур (Россия) та “IMMUNOTECH (Франція)]. Перебіг захворювання був простежений у хворих контрольної та основної груп на протязі 6-37 місяців.

Статистичну обробку результатів проводили з використанням t-критерію Ст’юдента, критерію Пірсона (ч2) та, в окремих випадках, коефіцієнтів кореляції (r) або кореляційного відношення (h) (Л.С. Каминский, 1959; Г.Ф. Лакин, 1980).

РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ ТА ЇХ ОБГОВОРЕННЯ

При дослідженні впливу бластена на показники функціональної активності Т-, В-лімфоцитів та неспецифічних ефекторів клітинного імунітету використовували дози препарату в діапазоні від 0,01ЛД50 (67 мг/кг) до 0,000013ЛД50 (0,09 мг/кг) та вивчали його ефекти в залежності від терміну дії на організм – від 1 до 14 діб після введення. Було показано, що бластен має високий терапевтичний індекс (1000-75000 для різних імунологічних показників) та справляє вплив на широке коло імунологічних реакцій. Істотну позитивну модуляцію специфічної і неспецифічної ланок імунної системи викликали дози, які практично не впливали на такі вихідні характеристики лімфоїдних органів, як клітинність і проліферативна активність. В дослідженому діапазоні доз спостерігали досить чітку дозозалежність окремих імуномодулюючих ефектів (табл. 1). Так, через 7 діб після введення препарату доза 0,001 ЛД50 найбільш ефективно впливала на відповідь Т- та В-лімфоцитів на поліклональні мітогени, а також на продукцію макрофагами ФНП після активації in vitro; 0,01 ЛД50 викликала максимальне підвищення активності ПК.

Таблиця 1

Дозозалежність впливу бластена (індекс модуляції, %) на дискретні імунологічні показники (7 діб після одноразового введення препарату)

Імунологічний показник | ЛД50

0,01 | 0,001 | 0,000013

Вихідні характеристики вторинних лімфоїдних органів

Кількість клітин, що виділені

з селезінки | +129,5* | +70,5 | +49,5

з лімфовузлів | +17,8 | +4,0 | +28,5

Питома проліферативна активність лімфоцитів із лімфовузлів (включення 3Н-тимідина на 106 клітин) | 41,9 | 11,8 | 28,8

РБТЛ на мітогени

Т-клітинний (Кон А) | +8,4 | +173,2* | +37,4

В-клітинний (ДС) | +26,3 | +131,4* | +24,3

Активність неспецифічних ефекторів клітинного імунітету

Цитотоксичність ПК | +325,4* | +103,4* | +44,1

Продукція фактору некрозу пухлин макрофагами167,6/–57,4* | 17,8/+105,0* | 31,0/+31,9

Примітки: 1. 1 – у чисельнику – індекси модуляції продукції ФНП макрофагами без їх додаткової стимуляції in vitro; в знаменнику – індекси модуляції продукції ФНП макрофагами, що були додатково стимульовані ліпополісахаридом; 2. * – p < 0,05 у порівнянні з абсолютними показниками контрольної групи.

При вивченні динаміки імуномодулюючої дії різних доз бластена було виявлено, що 0,01 ЛД50 через 2 доби після введення викликає суттєве посилення реакції лімфоцитів периферичних лімфовузлів на мітогени та збільшення активності макрофагів без додаткової стимуляції in vitro, але через 7-14 діб значення згаданих показників зменшуються до істотно нижчих за контрольні. Динаміка впливу цієї дози бластена на клітинність селезінки та активність ПК була аналогічною, але дещо зміщеною в часі: істотне підвищення відмічалось через 7 діб, різке падіння через 14 діб. Після введення 0,001 ЛД50 істотне збільшення відповіді лімфоцитів на Кон А спостерігали через 2 доби, на ДС – через 5 діб, яке змінювалось зниженням обох реакцій нижче контрольного рівня через 5 та 7 діб відповідно. Спонтанна активність макрофагів не відрізнялась від такої у контрольних тварин через 1 добу та була суттєво зниженою через 7-14 діб; індукована – була підвищеною через 7 та мала тенденцію до зниження порівняно з контролем через 14 діб. Активність ПК істотно підвищувалась через 7 та зменшувалась через 14 діб. Найменша з вивчених доз (0,000013 ЛД50) суттєво підвищувала РБТЛ через 2 доби. В подальшому (на 5-9 добу) рівні РБТЛ знижувались, але в жодному з випадків не ставали нижчими, ніж у контрольних тварин. Активність ПК та макрофагів поступово зростали, досягаючи статистично значущого підвищення через 14 діб. Тобто, зменшення дози препарату дозволило уникнути фази негативної модуляції імунологічних реакцій при збереженні м’якого позитивного впливу на імунну систему. Виходячи з одержаних результатів, в подальших дослідженнях використовували дози бластена, що відповідали 0,001 ЛД50 та 0,000013 ЛД50.

При дослідженні впливу бластена на прояви депресії кровотворення та імунопоезу, які були індуковані фракціонованим зовнішнім ?-опроміненням, ми визначали кількість еритроцитів, лейкоцитів в крові, відносну масу, клітинність тимусу, селезінки, периферичних лімфатичних вузлів та клітинний склад останніх через 1, 2, 3 тижні після опромінення. На динаміку вмісту еритроцитів бластен практично не впливав. Кількість лейкоцитів у тварин, які одержували бластен, відновлювалась до рівня інтактного контролю на кінець спостереження, у тварин контрольної групи – залишалась суттєво зменшеною (рис. 1).

Рис. 1 Вплив бластена на вміст лейкоцитів (х 106) в крові опромінених тварин.

Спостерігали також виразний протекторний вплив бластена на характеристики тимусу і периферичних лімфовузлів. Протягом всього терміну дослідження клітинність тимусу не знижувалась порівняно з інтактним контролем; відносна маса згаданих лімфоїдних органів та показники клітинності периферичних лімфовузлів відновлювались до вихідного рівня через 21 добу після опромінення (рис. 2). При вивченні популяційного складу лімфоцитів в периферичних лімфовузлах ми встановили, що застосування обох доз бластена запобігало суттєвому зниженню вмісту зрілих Т-лімфоцитів та стабілізувало відносний вміст зрілих В-лімфоцитів; відносний вміст бластів і великих лімфоцитів, який, як відомо, є відображенням компенсаторної реакції організму на лімфотоксичні впливи, був вірогідно збільшеним (порівняно з контролем опромінення) в обох дослідних групах тварин на 14 добу після опромінення.

Рис. 2. Вплив бластена на клітинність тимуса (А) та периферичних лімфатичних вузлів (Б) опромінених тварин (позначення як на рис. 1). | Дослідження спонтанної продукції макрофагами ФНП та ІЛ-1 виявило, що через 7 діб після опромінення рівень обох цитокинів, особливо ФНП, підвищений. Введення бластена зумовлювало додаткове зростання їх продукції: доза 0,01 ЛД50 була більш активна по відношенню до ФПН, а на продукцію ІЛ-1 обидві дози впливали однаково. Враховуючи можливість негативної регуляції з боку ФНП або ІЛ-1 (ІЛ-1?) щодо експресії одного з основних цитокинів протипухлинного захисту – ІЛ-2 та активності ПК, які до того ж є найбільш уражуваною популяцією протипухлинних ефекторів при ПТ та при дії практично всіх протипухлинних препаратів (А.Ф. Возианов и др., 1998; J. Brittenden et al., 1996; R.J. Holden et al., 1998), для визначення оптимальної дози бластена у тварин контрольних і дослідних груп досліджували активність ПК та продукцію ІЛ-2 клітинами селезінки. Дослідження ПК показало, що через 21 добу після опромінення активність цих клітин була зниженою в порівнянні з фізіологічною нормою в 3 рази. Результатом введення бластена в дозах 0,001 ЛД50 і 0,000013 ЛД50 було суттєве підвищення цитотоксичності ПК; у мишей, що отримали 0,000013 ЛД50, цей показник досягав рівня інтактних тварин. Продукція ІЛ-2 була суттєво зменшеною у опромінених мишей та у тварин, яким вводили бластен в дозі 0,001 ЛД50. Введення бластена в дозі 0,000013 ЛД50 запобігало зниженню (або прискорювало відновлення) спонтанної та індукованої продукції ІЛ-2: активність супернатантів культур спленоцитів мишей цієї групи не відрізнялась від такої у супернатантах культур клітин інтактного контролю. Таким чином сукупність отриманих даних обґрунтовує, що оптимальною схемою застосування бластена для зняття радіаційної гемо- та імунодепресії є 3-кратне введення препарату з інтервалом в 5 діб в разовій дозі 0,000013 ЛД50.

Ефективність бластена як засобу зменшення цитосупресії, що була індукована ЦФ, визначали за впливом препарату на кількість лейкоцитів в периферичній крові (на 10 добу), на клітинність лімфоїдних органів та субпопуляційний склад лімфоцитів в периферичних лімфовузлах, на кількість макрофагів та їх активність (в НСТ-тесті), а також на мітотичну активність епітеліальних клітин крипт тонкої кишки (на 21 добу). Введення бластена в обох дозах запобігало зниженню вмісту лейкоцитів в периферичній крові та суттєво підвищувало (порівняно з контролем ЦФ) показники клітинності селезінки і периферичних лімфатичних вузлів. У тварин, які отримали бластен в дозі 0,000013 ЛД50, кількість зрілих Т- (відносна та абсолютна) і В-лімфоцитів (абсолютна) в периферичних лімфовузлах досягала рівня інтактного контролю, що вказує на позитивний вплив бластена щодо відновлення обох ланок імунітету. Відносний вміст бластів і великих лімфоцитів в лімфовузлах залишався збільшеним, але не в такій мірі, як у тварин, що одержували тільки ЦФ; абсолютний вміст згаданих клітин вірогідно зростав, що є свідченням високого рівня компенсаторної реакції організма (табл. 2). Крім того, введення бластена в дозі 0,000013 ЛД50 запобігало зменшенню життєздатності перитонеальних макрофагів. Корегуючий вплив на цю популяцію клітин 0,001 ЛД50 бластена був відсутнім. Введення ЦФ призводило до суттєвого зменшення мітотичного індексу (МІ) клітин кишкового епітелію, що є одним з проявів органотоксичної дії хіміопрепарату. При введенні бластена та ЦФ мітотичний індекс клітин кишкового епітелію не мав суттєвої відмінності від інтактного контролю. При порівнянні з МІ тварин, які одержували тільки ЦФ, більшу відмінність спостерігали у мишей, яким вводили бластен в дозі 0,000013 ЛД50 (р < 0,05 проти 0,05 < p < 0,1 після введення 0,001 ЛД50). Між собою показники МІ у мишей, які отримували різні дози бластена, практично не відрізнялись (табл. 2).

При дослідженні впливу бластена на ефективність терапії ЦФ карциноми легенів Льюїс було показано, що ЦФ в низькій терапевтичній дозі (60 мг/кг на 3-ю та 7-у добу після прищеплення пухлинних клітин) інгібує ріст первинних пухлин на 24%, а метастазування – на 51% (облік ефективності ЦФ проводили на 27 добу від початку досліду). При застосуванні ЦФ та бластена (останній вводили на 3-ю, 7-у,

Таблиця 2

Вплив бластена на показники периферичної крові, лімфоїдних органів та клітин кишкового епітелію мишей С57Bl, які одержували циклофосфамід

Показники | Групи тварин:

інтактний контроль | контроль

ЦФ | 0,001 ЛД50 бластена ЦФ | 0,000013 ЛД50 бластена ЦФ

Кількість лейкоцитів в крові, х 106 | 13,80±1,30 | 8,50±2,001 | 10,20±2,20 | 11,60±2,50

*Клітинність лімфоїдних органів, х 6:

тимусу | 74,30±20,40

2,40±0,20 | 19,00±6,002

1,40±0,301 | 19,20±3,402

1,60±0,101 | 21,80±7,502

1,20±0,101

селезінки | 107,70±20,10

1,54±0,05 | 127,30±27,50

0,97±0,071 | 199,30±0,701/3

0,96±0,101 | 247,30±15,101/3/5

1,20±0,051/3/6

лімфатичних вузлів | 8,40±1,00

0,70±0,07 | 4,10±0,201

0,40±0,031 | 11,30±2,303

0,50±0,031 | 9,80±2,604

0,40±0,051

МІ клітин кишкового епітелію, % | 4,50±0,40 | 1,90±0,301 | 4,00±0,904 | 3,50±0,503

Примітки: 1. 1, 2 – р < 0,05, 0,05 < < 0,1, відповідно, при порівнянні з інтактним контролем; 2. 3,  – р < 0,05, 0,05 < < 0,1, відповідно, при порівнянні з контролем дії циклофосфаміду; 3. 5, 6 – р < 0,05, 0,05 < < 0,1, відповідно, при порівнянні груп тварин, що одержували бластен (3 і 4) між собою; 4. * – в чисельнику – кількість клітин на орган; – в знаменнику – кількість клітин на 1 мг маси органа.

11-у добу досліду) терапевтичний ефект підвищується: при використанні 0,001 ЛД50 гальмування росту пухлини склало 60%, ІІМ – 61%, при використані 0,000013 ЛД50 – 70% та 71% (p < 0,05), відповідно. При введенні ЦФ і частота, і інтенсивність метастазування зменшувались порівняно з контролем в 1,4 рази. При введенні ЦФ+0,001 ЛД50 бластена частота метастазування зменшилась в 1,8, інтенсивність – в 1,5 рази; ЦФ+0,000013 ЛД50 бластена – відповідно в 2 та 1,8 рази. За всіма показниками більш ефективно підвищувала терапевтичну дію ЦФ надмала доза бластена.

На моделі саркоми 180 було показано, що бластен не підвищує, але й не зменшує терапевтичний ефект ЦФ, справляючи при цьому чіткий позитивний вплив на вміст лейкоцитів в периферичній крові (облік результатів на 21 добу після прищеплення пухлинних клітин). Використання ЦФ знижувало кількість лейкоцитів на 61% порівняно з інтактним контролем (p < 0,01), а при комбінації з бластеном вміст лейкоцитів в крові був значно вищим (р < 0,05) і не відрізнявся суттєво від інтактного контролю.

Отже, за сукупністю даних, що одержані при дослідженні експериментальних тварин, які зазнали фракціонованого зовнішнього ?-опромінення або впливу ЦФ, продемонстровано високу ефективність бластена як засобу, що запобігає розвитку (або зменшує прояви) радіаційно та хімічноіндукованої гемо- та імунодепресії, а також зменшує негативний вплив цитостатика на клітини кишкового епітелію. Оптимальні результати були виявлені при 3-кратному застосуванні бластена в разовій дозі 0,000013 ЛД50 з інтервалом між введеннями 3-5 діб.

При використанні бластена в комплексній терапії хворих на РМЗ ІІ-IV стадії в жодному випадку не спостерігали ускладнень, пов’язаних з введенням препарату, або стимуляції пухлинного процесу. Співставлення проявів токсичності протипухлинної терапії у пацієнток контрольної та основної груп показало, що після проведення ХТ та/або ПТ у контрольній групі (15 хворих на РМЗ ІІ-ІІІ стадії) суттєво зменшуються показники кількості лейкоцитів та гранулоцитів і спостерігається тенденція до зниження рівня гемоглобіну. В основній групі (26 хворих на РМЗ ІІ-ІІІ стадії) ці показники не змінилися (рис. 3А). В контрольній групі після лікування спостерігали лейкопенію у 47% (1 ступінь – 4 (27%), 2 ступінь – 3 (20%) випадки), гранулоцитопенію у 27% (1 ст. – 3 (20%), 2 ст. – 1 (7%) випадок), анемію у 13% (1 ст. – 1 випадок), диспептичні прояви у 33% (1 ст. – 5 випадків), зниження індексу Карновського до рівня 40-50% відмічалось у 33% (5 випадків) пацієнток. В основній групі значно кращими були як гематологічні показники, так і якість життя хворих. Лейкопенію та анемію зафіксовано відповідно у 15 (p < 0,05) і 8% (4 та 2 випадки, 1 ст.), розвитку гранулоцитопенії не спостерігали (0%, p < 0,05). Диспептичні прояви та зниження індексу Карновського спостерігали рідше (11,5%, 0,05 < 0,01), ніж у пацієнток контрольної групи (рис. 3Б). Слід також зазначити, що в основній групі індекс Карновського не знижувався менше 50%.

Обстеження стану імунної системи пацієнток основної та контрольної груп до і після лікування показало, що використання бластена в комплексному лікуванні пацієнток з II–IІІ стадіями РМЗ справляє корегуючий вплив на клітинний склад периферичної крові (запобігає зниженню загального вмісту лімфоцитів, абсолютного вмісту Т-лімфоцитів, нормалізує відносний та абсолютний вміст 0-лімфоцитів і абсолютний вміст ВГЛ); підвищує природну кілерну та фагоцитарну активність, а також спонтанну продукцію МКПК ІЛ–1, ІЛ–2, ФНП; нормалізує вміст IgА та ЦІК. Ефекти застосування бластена у схемах неоад`ювантної або ад`ювантної протипухлинної терапії були якісно подібними. Різниця полягала у ступені корекції зміни показників у окремих хворих. При неоад`ювантному застосуванні бластена

Рис. 3. Вплив бластена на прояви депресії кровотворення (А, Б) та загальнотоксичної дії (Б) протипухлинної терапії при комплексному лікуванні хворих на РМЗ ІІ–ІІІ стадії |

рівня статистичної вірогідності досягали коефіцієнти кореляції, які характеризували підвищення відносного вмісту Т-лімфоцитів (r ,956), спонтанної продукції ІЛ-2 (r ,866), фагоцитарної активності (r ,779), фагоцитарного індексу (r ,956), природної кілерної активності (r ,933); зменшення чутливості до спленіну (r –0,894), вмісту IgA (r ,968) та вмісту ЦІК (r ,911). При застосуванні бластена в режимі ад’ювантної поліхіміотерапії або ПТ статистично вірогідними були коефіцієнти кореляції підвищення відносного вмісту Т-лімфоцитів (r ,982), 0-лімфоцитів (r ,990), природної кілерної активності (r ,962), спонтанної продукції ІЛ-2 (r ,857) та ФНП (r ,968), а також вмісту ФНП у плазмі (r ,956). Тобто, у хворих на РМЗ ІІ-ІІІ стадії за умов неоад’ювантного використання бластен здатний корегувати гуморальний і клітинний імунітет, при ад’ювантному використанні – клітинний імунітет. Застосування бластена при паліативному лікуванні пацієнток з РМЗ ІV стадії не супроводжувалось вірогідною зміною (порівняно з середніми значеннями показників до лікування) переважної більшості показників, крім рівня ЦІК (зменшення), та спонтанної продукції ІЛ-1 (підвищення). Рівень статистичної значимості досягав коефіцієнт кореляції зниження вмісту IgA (r ,997), що, згідно з даних літератури, є позитивною прогностичною ознакою (Ю.А. Гриневич и др., 1990). При досліджені хворі на РМЗ ІІ-ІІІ стадії не мали ознак прогресування процесу на протязі 2-3 років спостереження. Із 4 хворих на РМЗ IV стадії через 6 міс. після лікування померла 1 хвора, у якої до лікування були діагностовані метастази в легені, ще 1 пацієнтка з метастазом в легені не має ознак прогресування процесу протягом 10 міс., у 2 пацієнток, у яких до лікування діагностовані метастази в лімфатичних вузлах та стернальній кістці, прогресування хвороби не спостерігали протягом 2-2,6 року.

ВИСНОВКИ

1. Спектр імуномодулюючих ефектів бластена включає вплив на реакції як специфічного імунітету, так і природної резистентності організму; для дії на лімфоцити різних субпопуляцій оптимальними є низькі (мкг/кг) дози, активність моноцитів може позитивно модулювати більш широкий діапазон доз (мг/кг – мкг/кг) препарату.

2. За результатами експериментальних і клініко-лабораторних досліджень встановлено корегуючий вплив бластена на гемо- та імунопоез при зовнішньому ?-опроміненні або застосуванні протипухлинних препаратів; одним з механізмів такого впливу є активація продукції моноцитами цитокинів “фізіологічного захисту” – ІЛ-1, ФНП.

3. Бластен здатний зменшувати прояви органотоксичності цитостатичної терапії, зокрема, її негативний вплив на кишковий тракт: введення бластена нормалізувало мітотичний індекс епітеліальних клітин тонкого кишківника мишей С57Bl, що зазнали впливу циклофосфаміду, за даними клінічних досліджень – зменшувало частоту диспептичних проявів при проведенні ПТ та ХТ у хворих на РМЗ II-IVстадії.

4. За критеріями впливу на клітинний склад периферичної крові, імунокомпетентних органів, мітотичну активність кишкового епітелію, активність природних кілерів і макрофагів, продукцію ІЛ-2, протипухлинну та антиметастатичну ефективність циклофосфаміду у експериментальних тварин оптимальною є доза бластена 0,09 мг/кг.

5. Застосування бластена (2 мг, 3-5 введень) в комплексній терапії хворих на РМЗ II-IV стадії дає протекторний ефект, що проявляється в зменшенні частоти та ступеня лейкопенії (15% проти 47% в контрольній групі, р ,05), гранулоцитопенії (0% проти 27%, р < 0,05), диспептичних проявів (11,5% проти 33%, 0,05< p< 0,1), в покращенні загального стану хворих (індекс Карновського < 50 у 0% проти 27% в контрольній групі, р < 0,05), а також сприяє дотриманню режимів ПХТ та ПТ.

6. Бластен справляє імунореабілітуючий вплив при комплексному лікуванні хворих з ІІ-ІІІ ,а в окремих випадках – і з IV стадіями РМЗ, що проявляється після завершення лікування в нормалізації абсолютного вмісту в крові лімфоцитів, Т-, О-лімфоцитів, ВГЛ, достовірному підвищенні (порівняно з контрольною групою) природної кілерної та фагоцитарної активності, спонтанної продукції ІЛ-2, суттєвому зменшенні рівня ЦІК та IgA.

СПИСОК ОПУБЛІКОВАНИХ ПРАЦЬ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ:

1. Мосієнко В.С., Мосієнко М.Д., Савцова З.Д., Даниленко В.С., Волкова М.Ю., Шинкаренко Л.М., Щеглова Н.А., Восп’яков В.Г., Свідро О.В., Меньок Т.А. Бластен – новий вітчизняний імуномодулятор біологічного походження // Журн. АМН України. – 1999.– Т. 5, №1. – С. 79-86; (автором досліджено вплив бластена на вихідні характеристики лімфоїдних органів, на реакцію бласттрансформації лімфоцитів та на активність ПК і макрофагів)

2. Менек Т.А., Воейкова И.М., Юдина О.Ю., Мосиенко В.С., Шинкаренко Л.Н., Савцова З.Д. Влияние нового иммуномодулятора из Lactobacillus delbrueckii на индуцированную циклофосфамидом цитосупрессию и терапевтическую эффективность циклофосфамида у мышей с карциномой Льюїс // Эксперим. онкол. – 2000. – Т. 22, №4. – С 211-215. (автором досліджено вплив бластена на клітинний склад лімфоїдних органів, активність макрофагів та на протипухлинну і антиметастатичну дію циклофосфаміда)

3. Савцова З.Д., Шпильова С.І., Тарутінов В.І., Рогацька В.П., Меньок Т.А., Нікольський І.С., Мосієнко В.С., Шинкаренко Л.М., Чехун В.Ф. Імунокорекція за допомогою імуномодулятора з Laktobacillus Delbrueckii в комплексному лікуванні хворих на рак молочної залози ІІ–ІV стадії // Онкология. – 2000. – Т. 2, №4. – С. 267-271. (автором підібрано наукову літературу що до змін імунного статусу у хворих на рак молочної залози, досліджено активність ПК, продукцію ІЛ-1, ІЛ-2, ФНП у пацієнток з РМЗ та донорів, а також вплив бластена на перелічені показники)

4. Савцова З.Д., Меньок Т.А., Джаман Н.І., Воєйкова І.М., Ковбасюк С.А., Мосієнко