ІНСТИТУТ ПРОБЛЕМ КРІОБІОЛОГІЇ І КРІОМЕДИЦИНИ

ОСТАНКОВ МАКСИМ ВАДИМОВИЧ

УДК: 615.361.013.11.014.413

Теоретичне обгрунтовування та експерИментальна перевірка ефективності швидкого двоступінчастого заморожування

03.00.19 – кріобіологія і кріомедицина

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

Харків – 2001

Дисертацією є рукопис

Робота виконана в Інституті проблем кріобіології і кріомедицини НАН України

Науковий керівник: доктор біологічних наук, старший науковий співробітник Гордієнко Євген Олександрович, Інститут проблем кріобіології і кріомедицини НАН України, завідувач відділу низькотемпературної консервації

Офіційні опоненти:

Доктор біологічних наук, професор Жегунов Геннадій Федорович, Харківський державний медичний університет МОЗ України, завідувач кафедри загальної медичної біології

Доктор біологічних наук, старший науковий співробітник Вишневський Валентин Йосипович, Інститут тваринництва УААН, головний науковий співробітник

Провідна установа:

Харківський національний університет ім. В.Н. Каразіна, кафедра фізіології, Міністерство освіти і науки України

Захист відбудеться “26” лютого 2002 року о 1330 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 64.242.01. при Інституті проблем кріобіології і кріомедицини НАН України, 61015, Харків – 15, вул. Переяславська, 23

З дисертацією можна ознайомитися у бібліотеці ІПКіК НАН України:

61015, Харків – 15, вул. Переяславська, 23

Автореферат розісланий “26” січня 2002 р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради

докт. мед. наук, професор Гольцев А.М.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Необхідність створення запасів і способів кріоконсервування кісткового мозку економічними й ефективними методами з метою трансплантації його в клініці [Цуцаева А.А., 1983; Гольцев А.Н. и соавт., 1996, 1999; Hill R.S. et al., 1973; Choi et al., 2001] не викликає сумнівів. Однак вирішення цього питання неможливе без глибоких досліджень характеру фізико-хімічних процесів, що відбуваються у суспензії клітин кісткового мозку при заморожуванні-відтаванні, без з'ясування ролі режимів заморожування і відігрівання в забезпеченні ефективності кріоконсервування й удосконалення устаткування для їх низькотемпературного консервування.

Відповідно до загальноприйнятої на даний час двофакторної теорії кріопошкодження [Mazur P., 1963], для кожного типу клітин існує оптимальне значення швидкості охолодження. При швидкостях більш високих, ніж оптимальні, монотонно росте переохолодження внутрішньоклітинного розчину і неминучим є утворення внутрішньоклітинних кристалів льоду [Hey J.M. et al., 1998], що пошкоджують мембрани і внутрішньоклітинні структури [Diller K.R., 1975; Choi C. et al., 2001]. При швидкостях охолодження менших, ніж оптимальні, клітини пошкоджуються за рахунок надмірного зневоднення і тривалого контакту з гіпертонічними розчинами [Acker J.P., McGann L.E., 1998; 2001]. Межі застосування зазначеної теорії обмежені припущенням про лінійність режиму охолодження.

В літературі з'явилися повідомлення про більшу ефективність нелінійних режимів охолодження в порівнянні з традиційними лінійними програмами заморожування [Вишневский В.И., 1980; Новиков А.Н., Ткаченко С.И., Стрибуль Т.Ф., Риндин В.Ф., 1985], зокрема, повідомлення про ефективність кусково-лінійних та експоненціальних режимів охолодження [Фарант Дж., 1974; Вильмут И., 1972; Новиков А.Н., 1985], що не описуються моделлю П. Мейзура. У зв'язку з цим актуальною стала задача критичного перегляду двофакторної теорії та створення кількісної моделі, що описує процеси масопереносу в клітинній суспензії на різних етапах низькотемпературного консервування, і пояснює причину й механізми ефективності нелінійних режимів охолодження. Швидке двоступінчасте заморожування технічно є простішим, економічнішим та ефективнішим за лінійні режими, не вимагає високої кваліфікації обслуговуючого персоналу.

За даними теоретичних розрахунків, проведених у роботах [Гордиенко Е.А., Розанов Л.Ф., Коваленко И.Ф., 1992], кріозахисний ефект швидкого двоступінчастого заморожування обумовлений зниженням ступеня і тривалості переохолодження внутрішньоклітинного розчину та зменшенням тривалості перебування клітин у гіпертонічних розчинах на етапі кристалізації клітинної суспензії в порівнянні з охолодженням з постійною швидкістю. На підставі викладеного вище постає питання про необхідність експериментального підтвердження правомірності теоретичних розрахунків, що вказують на можливість використання при кріоконсервуванні біооб'єктів нелінійних режимів заморожування. Однак, правомірність цієї тези повинна бути підтверджена на конкретному біологічному матеріалі.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Обраний напрямок досліджень пов'язаний з науковою темою Інституту проблем кріобіології і кріомедицини НАН України: “Побудова й експериментальна перевірка кількісної теорії кріоконсервування біооб’єктів”, (шифр – 2.2.6.70, № держреєстрації 0100U004235).

Мета і задачі дослідження. Мета роботи полягала у порівняльному вивченні ефективності швидкого двоступінчастого і лінійних режимів охолодження при низькотемпературному консервуванні клітин кісткового мозку миші й селекції окремих пулів гемопоетичної тканини за допомогою заморожування-відтавання.

Об'єктом дослідження є низькотемпературне консервування кісткового мозку миші методом швидкого двоступінчастого заморожування в порівнянні з лінійним режимом охолодження.

Предметом дослідження є побудова фізико-математичної моделі дії факторів охолодження і вивчення структурної організації, функціональної активності (у системі in vitro та in vivo) клітин кісткового мозку миші при різних режимах кріоконсервуванния.

Для досягнення поставленої мети необхідно було вирішити наступні задачі:

1. Теоретично розрахувати залежність від температури величини ефективного переохолодження, концентрації внутрішньоклітинного розчину й об'єму клітин кісткового мозку миші при лінійних та експоненціальних режимах охолодження під захистом диметилсульфоксиду;

2. Шляхом зіставлення теоретичних розрахунків з експериментальними даними про кількість, збереження , якісний склад і функціональну повноцінність (в системі in vitro та in vivo) клітин кісткового мозку миші після заморожування-відтавання визначити умови кріоконсервування, при яких забезпечується оптимальне збереження трьох основних ростків кровотворення чи здійснюється селективна виживаність окремих популяцій кісткового мозку;

3. Теоретично визначити й експериментально підтвердити оптимальні умови кріоконсервування клітин кісткового мозку миші на етапі видалення кріопротектору з розмороженої клітинної суспензії.

Методи дослідження. Для дослідження морфофункціональних характеристик кісткового мозку миші використовували методи світлової та флуоресцентної мікроскопії, для вивчення внутрішньоклітинного кристалоутворення й дослідження кінетики процесів дегідратації-регідратації клітин застосовували метод інтерференційно-поляризаційної кріомікроскопії.

Наукова новизна отриманих результатів. Вперше розрахунковим шляхом отримана залежність переохолодження внутрішньоклітинного розчину в процесі глибокого охолодження клітин кісткового мозку при постійній швидкості охолодження і при швидкому двоступінчастому заморожуванні. Для цих швидкостей заморожування визначені оптимальні параметри кріозахисного середовища, зокрема, його осмолярність і вміст у ньому кріопротектору ДМСО.

Теоретично визначені й експериментально підтверджені оптимальні з огляду збереження клітин основних трьох ростків кровотворення умови видалення кріопротектору з відталої клітинної суспензії.

Встановлено умови, при яких здійснюється селективна виживаність окремих ростків кровотворення.

Практичне значення отриманих результатів. Визначено оптимальний режим швидкого двоступінчастого заморожування клітин кісткового мозку миші, що дозволило створити простий, ефективний спосіб їхнього низькотемпературного консервування. Отримані результати мають універсальне значення і можуть бути використані при розробці способів низькотемпературного консервування клітин кісткового мозку людини. На підставі отриманих даних був розроблений посібник для лікарів по консервуванню кісткового мозку.

Особистий внесок здобувача Представлені для захисту наукові результати отримані дисертантом особисто. Сумісні дослідження з теоретичної частини були проведені під керівництвом д.б.н. Гордієнка Е.О., який брав участь у постановці задач і обговоренні отриманих результатів. Всі експериментальні дослідження з порівняльного вивчення впливу різних режимів кріоконсервування кліток кісткового мозку проведені дисертантом особисто. Співавтор робіт співробітник Кіровського НДІ гематології і переливання крові РАН к.б.н. Костяєв А.А. надавав консультативну та методичну допомогу в проведенні експериментів з кріоконсервування. У сумісних дослідженнях дисертанту належить ідея планування експериментів, проведення власне експерименту, обговорення наукових результатів та підготовка матеріалів до друку. Самостійно проведено аналіз отриманих результатів, зроблено висновки щодо проведеної роботи.

Апробація результатів дисертації. Основні матеріали дисертаційної роботи доповідалися й обговорювалися на V Російському національному конгресі "Людина і ліки" (Москва, 1998) "Життєздатність кісткового мозку під час консервування (-45 – -500С) під захистом гліцерину, ДМСО й А-378”; на науковій сесії Пермської державної медичної академії (Перм, 1999) "Організація заготівлі й консервування клітин крові в спеціалізованих ЛПУ"; на щорічній науково-технічній конференції В’ятського державного технічного університету "Наука – виробництво – технологія – екологія" (Кіров, 1999) "Осмотичні характеристики клітинних кріопротекторів"; на III Всеросійському з'їзді гематологів і трансфузіологів (Санкт-Петербург, 1999), на міжнародному симпозіумі з трансфузії крові в новому сторіччі “Transfusion 2000” (Японія, 1999) "Freezing bone marrow under exponential programs".

Публікації. Основні положення дисертації викладені у восьми роботах: трьох наукових статтях, опублікованих у провідних фахових журналах, у посібнику для лікарів і чотирьох тезах доповідей.

Структура дисертації. Робота викладена на 127 сторінках і має вступ, основну частину, яка складається з трьох розділів (огляд літератури, матеріали і методи дослідження, одержані результати та їх обговорювання), заключення, висновки, список використаних джерел (205 найменувань на 21 сторінці). Дисертація містить 39 рисунків і 7 таблиць.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ

Загальна методика й основні методи дослідження. Теоретичний розрахунок переохолодження внутрішньоклітинного розчину, об'єму клітин і концентрації розчинених усередині них речовин від температури при охолодженні клітин кісткового мозку миші з постійною швидкістю і при швидкому двоступінчастому заморожуванні проводили шляхом чисельного рішення рівнянь Кедем-Качальського, адаптованих до розв'язуваних задач.

При розрахунках використовувалися відомі з літератури геометричні, транспортні і морфологічні характеристики клітин кісткового мозку миші.

Середнє значення об'ємної фракції осмотично неактивних внутрішньоклітинних речовин й енергія активації процесу переносу молекул води через мембрани клітин кісткового мозку визначені на підставі спостереження процесу зневоднювання клітин при температурах 37, 20 і 0С в світловому мікроскопі з кріоприставкою, розробленою в СКТБ і ДВ ІПКіК НАН України.

В основу розрахунків покладені наступні припущення:

·

·

·

·

Заморожування клітин кісткового мозку з постійною швидкістю охолодження 1С/хв і 10С/хв здійснювався на програмному заморожувачі УОП-06 виробництва СКТБ з ДВ ІПКіК НАН України. Швидке двоступінчасте заморожування проводилося за допомогою спеціального кріостата виробництва СКТБ з ДВ ІПКіК НАН України. Відігрівання здійснювали на водяній бані при 410С.

Для дослідження внутрішньоклітинного кристалоутворення використовували метод кріомікроскопії [Розанов Л.Ф., 1977]. Дослідження кінетики процесів дегідратації-регідратації клітин кісткового мозку при контакті з кріозахисними середовищами проводилося на експериментальній установці, розробленій в ІПКіК НАН України, що включає інтерференційно-поляризований мікроскоп МПІ-5 з кінокамерою й оптичною приставкою до мікроскопа.

Кількість клітин кісткового мозку підраховували в камері Горяєва. Ступінь збереження клітин кісткового мозку вивчали методом суправітального забарвлення трипановим синім у світловому мікроскопі і акридиновим жовтогарячим у люмінесцентному мікроскопі в полі зору при підрахуванні 500 клітин, виражаючи їх у відсотках стосовно вихідних показників [Кост Е.А., 1968]. Мієлограми готували із суспензії клітин, фіксуючи метанолом і офарблюючи азур-II еозіном за Романовським. Підрахунок якісного складу клітин кісткового мозку миші здійснювали у світловому мікроскопі PZO (об. х 90 – імерсія; ок. х 10) по полях зору на 500 клітин, виражаючи у відсотках до вихідних показників [Меркулов Г.А., 1961]. Функціональну повноцінність (в системі in vitro та in vivo) клітин кісткового мозку миші визначали за допомогою тесту фагоцитарної активності, що дозволяє визначити здібність гранулоцитів кісткового мозку поглинати загиблу культуру стафілокока [Александров М.Г., 1988]. Стан стовбурових клітин, їх колонієутворюючу активність оцінювали за допомогою методу селезінкового колонієутворення в опромінених летальною дозою мишей (СВАхC57Вl)F1 [Till, McCulloch, 1961].

Статистичну обробку одержаних результатів проводили за методом Стьюдента – Фішера [Ашмарин И.П., Воробьев А.А., 1962] на IBM PC Pentium-II з використанням пакета програм Microsoft Excel.

Результати власних досліджень автора. Результати розрахунку величини ефективного переохолодження цитоплазми клітин кісткового мозку при заморожуванні з постійною швидкістю і при швидкому двоступінчастому заморожуванні представлені на рис. 1 і 2.

Рис.1 Залежність ефективного переохолодження цитоплазми клітин кісткового мозку від зведеної температури при заморожуванні з постійною швидкістю: 1)Т0/(Т0)=10; 2)Т0/(Т0)=15; 3)Т0/(Т0)=25; де Т0 – початкова температура; т – швидкість охолодж.; 0=(Loin)-1; – поверхнево-об'ємне відношення клітин; L– коефіцієнт фільтрації клітинної мембрани; oin – осмотичний тиск фізіологічного розчину

Очевидно, при швидкому двоступінчастому заморожуванні ефективне переохолодження клітин після занурення зразка в рідину , охолоджену до -30С, у всіх розглянутих випадках лише на невеликий проміжок часу сягає значення близько 5С, а потім падає до нуля.

Рис.2 Залежність ефективного переохолодження цитоплазми клітин кісткового мозку миші від зведеної температури на першій стадії швидкого двоступінчастого заморожування: 1)/0=1; 2)/0=2; 3)/0=10; 4)/0=100

Таким чином, швидке двоступінчасте заморожування є більш оптимальним з огляду запобігання внутрішньоклітинній кристалізації, ніж охолодження з постійною швидкістю 1С/хв. Оптимальним часом витримування зразка в рідинному кріостаті можна вважати 15 хвилин, оскільки переохолодження внутрішньоклітинного розчину падає до нуля протягом часу, що не перевищує 12 хвилин. Оскільки при швидкому двоступінчастому охолодженні час заморожування порівняно з характерним часом проникнення води через клітинні мембрани є значно меншим, ніж час проникнення кріопротектора в клітини, після відтавання клітини є стійкішими до постгіпертонічного лізису, ніж заморожені зі швидкістю 1С/хв.

У такий спосіб розрахунковим шляхом установлено, що оптимальним режимом заморожування, з огляду запобігання клітин ушкодженню внутрішньоклітинними кристалами, є занурення клітинної суспензії в рідинний кріостат з температурою –30С на 15 хвилин із наступним переміщенням контейнера безпосередньо у рідкий азот.

При проведенні порівняльного експериментального вивчення якісно-кількісних параметрів кісткового мозку було встановлено, що кількість клітин кісткового мозку до і після швидкого двоступінчастого заморожування зменшувалася тільки на 6,413,50%, а збереженість – на 11,321,73%, в той час, як заморожування клітин з постійною швидкістю 1С/хв і 10С/хв призводило до більш вираженого зниження кількості клітин – на 22,212,13% і 47,343,72% відповідно і до зменшення їхнього збереження на 25,312,34% і 60,113,52% у порівнянні з нативним кістковим мозком.

При вивченні складу кісткового мозку встановлено, що заморожування клітин кісткового мозку з постійною швидкістю 1С/хв і 10С/хв призводило до більшого ушкодження більш диференційованих клітин мієлоїдного ряду – гранулоцитів (табл. 1).

Таблиця 1

Клітинний склад кісткового мозку до і після кріоконсервування (Мм), n=7

Тип клітин | Нативний кістковий мозок (контроль) | Двоступінчасте охолодження | Постійна швидкість охолодження 10С/хв | Постійна швидкість охолоджен-ня 100С/хв

Мієлобласти | 4,710,31 | 4,920,23 | 4,640,52 | 4,210,71

Мієлоцити | 2,130,13 | 2,030,32 | 2,130,33 | 2,320,21

Метамієлоцити | 8,820,32 | 8,120,32 | 5,720,14 | 5,230,21

Гранулоцити | 35,120,91 | 33,421,41 | 26,622,31 | 20,714,12

Мієлоїдний росток | 50,711,62 | 48,432,11 Р10,05 | 35,113,23 Р10,05

Р20,05 | 32,425,02 Р10,05 Р20,05 Р30,05

Еритробласти | 3,540,81 | 3,140,72 | 4,750,51 | 3,300,34

Нормобласти | 23,342,33 | 23,142,21 | 23,522,15 | 29,733,12

Еритроїдний росток | 26,833,12 | 26,232,91 Р10,05 | 28,212,62 Р10,05

Р20,05 | 33,01 3,32 Р10,05 Р20,05 Р30,05

Лімфобласти | 1,820,32 | 1,920,24 | 2,500,41 | 3,611,13

Лімфоцити | 19,110,81 | 22,231,92 | 21,911,33 | 29,932,23

Лімфоїдний росток | 20,921,31 | 24,152,31 Р10,05 | 24,321,82 Р10,05

Р20,05 | 32,023,31 Р10,05 Р20,05 Р30,05

Голоядерні клітини | 1,610,73 | 1,320,51 | 2,430,92 | 2,151,01

Примітка: Р1 – вірогідність випадкових розходжень з даними до охолодження; Р2 – вірогідність випадкових розходжень з даними після швидкого двоступінчастого заморожування; Р3 – вірогідність випадкових розходжень з даними після охолодження з постійною швидкістю 1С/хв

Так при лінійній швидкості охолодження 1С/хв відзначалося зниження клітин цього типу на 34,212,62 % і на 41,063,51% при охолодженні зі швидкістю 10С/хв у порівнянні з вихідними показниками. В еритроїдному й лімфоїдному ростках кровотворення зі збільшенням швидкості охолодження до 10С/хв підвищувався відносний зміст лімфоцитів і нормобластів, морфологічна будова яких пов'язана з невеликим поверхнево-об'ємним відношенням, відсутністю лізосом і специфічної грануляції, а також малою кількістю мітохондрій. У порівняльному аспекті при вивченні двоступінчастого і лінійного заморожування зі швидкістю 1С/хв і 10С/хв було встановлено, що, змінюючи режим охолодження при однаковому методі відтавання, можна регулювати співвідношення клітин мієлоїдно-еритроїдного й, особливо, лімфоїдного ростків кровотворення.

Таким чином, експериментально й теоретично встановлено, що швидке двоступінчасте заморожування клітин кісткового мозку є більш ефективним для збереження трьох основних ростків кісткового мозку, ніж заморожування з постійною швидкістю охолодження.

У зв'язку з тим, що найбільш уразливими при заморожуванні-відтаванні, особливо при використанні постійної швидкості заморожування виявилися клітини мієлоїдного ростка, тобто, гранулоцити, було цікавим вивчити вплив фізико-хімічних факторів кріоконсервування на одну з найбільш специфічних для них функцію – фагоцитоз. Отримані експериментальні дані підтвердили теоретичні розрахунки про те, що швидке двоступінчасте заморожування клітин кісткового мозку є більш ефективним, ніж заморожування з постійною швидкістю охолодження. Було встановлено, що для збереження даної функції в найбільш кріолабільній клітинній популяції кісткового мозку - гранулоцитах, дані умови заморожування виявилися оптимальними і після їхнього відтавання абсолютний показник фагоцитарного індексу (ФІ) знизився усього на 9,332,21%, фагоцитарне число (ФЧ) - на 20,261,31%, абсолютний показник фагоцитарної активності гранулоцитів (АПФАГр) – на 18,720,65% при абсолютному числі гранулоцитів (АЧГр) = 89,721,92% (рис. 3).

Рис. 3 Фагоцитарна активність кісткового мозку до і після кріоконсервування

Заморожування з постійною швидкістю охолодження 10С/хв зберігало ФІ на 65,012,24% з 58,051,12% АЧГр, що становило тільки 36,390,52% АПФАГр у порівнянні з нативним кістковим мозком. Підвищення швидкості до 100С/хв ще більше пригнічувало цю функцію гранулоцитів. ФІ знизився на 53,321,98%, АЧГр – на 85,021,12%, а АПФАГр – на 85,460,43% (рис. 3)

Вивчення реакції клітин кісткового мозку на контакт із гіпертонічними розчинами диметилсульфоксиду дозволило оцінити характерний час зневоднення клітин у цих розчинах при температурах 370С і 00С, час, необхідний для проникнення кріопротектору в клітини, а також енергію активації процесу переносу молекул води з клітин у навколишній розчин. Дослідження показали, що в 0,5М і 1М водних розчинах диметилсульфоксиду вже на першій хвилині експозиції клітини кісткового мозку встигали відновити свій об’єм після дегідратації, до десятої хвилини багато клітин набрякало. Однак навіть на двадцять п'ятій хвилині експозиції не всі клітини виглядали набряклими. Це, в першу чергу, стосувалося клітин з малим об’ємом (лімфоцити і нормобласти) і клітин з рівномірним ядерно-цитоплазматичним співвідношенням (бласти), а також клітин з невеликим вмістом внутрішньоклітинних структур (мітохондрії, лізосоми, специфічна грануляція). Об'єм клітин у процесі еквілібрації збільшувався менше, ніж прогнозувалося (приблизно в 1,5 рази). При цьому спостерігалися морфологічні зміни клітин (в основному, гранулоцитів) у вигляді утворення на їхній поверхні оптично менш щільних, ніж інша частина цитоплазми, ділянок, обмежених плазматичною мембраною. Очевидно, на цьому етапі і надалі осмотична регуляція клітинного об’єму відбувається за рахунок об’єму такого мембранного "міхура". Наступна експозиція клітин у даних розчинах призводить до зміни цитоплазматичного вмісту клітин у вигляді фрагментації з наступною втратою клітиною цитоплазматичних гранул. Такі клітини втрачають свій контраст при спостереженні у світловому мікроскопі.

Отримані експериментальні дані дозволили зробити висновок, що вирівнювання поза- і внутрішньоклітинних концентрацій ДМСО відбувається в межах хвилини. Теоретичне вивчення процесу двоступінчастого заморожування клітин кісткового мозку показало, що оптимальними умовами заморожування є: п'ятнадцятихвилинна експозиція в 1,5М розчині ДМСО з добавками 3% телячої сироватки і 0,2% цитрату натрію, при якій не відбувається внутрішньоклітинна кристалізація і бластні клітини мієлоїдного, еритроїдного, лімфоїдного типів, а також лімфоцити і нормобласти зберігають морфологічну структуру. Незначно ушкоджувалися лише гранулоцитарні клітини мієлоїдного ряду.

Після відтавання замороженої клітинної суспензії з неї, як правило, треба вилучити проникаючий у клітини кріопротектор, щоб мінімізувати можливу токсичну дію великих концентрацій кріопротекторів на організм реципієнта, а також попередити ушкодження клітин за рахунок постгіпертонічного лізису у руслі крові.

Рис.4 Залежність відносного об’єму у (а) клітин, що відмиваються, і зведеної внутрішньоклітинної концентрації кріопротектора n k in (б) від безрозмірного часу при

значеннях параметра: ^

nkin 1 – 7; 2 – 8; 3 – 9

Рис.5 Залежність відносного об’єму у (а) клітин, що відмиваються, і зведеної внутрішньоклітинної концентрації кріопротектора n k in (б) від безрозмірного часу при

значеннях параметра n d (0): ^

nkin 1 – 7,2; 2 –7,5; 3-10; 4-15

З поданих в роботі розрахунків (рис. 4, 5), найбільш сильний вплив на ефективність процесу відмивання спричиняють два параметри: ступінь розведення клітин розчином, що відмиває, і концентрація не проникаючого в клітини компоненту цього розчину. Зі збільшенням останнього з цих параметрів процес видалення кріопротектора з розмороженої клітинної суспензії стає більш оптимальним, тому що розмір клітин не досягає значення, достатнього для розриву клітинних мембран. Оптимізація процесу одноразового відмивання клітин від кріопротектора полягає у підборі оптимальних значень двох зазначених вище параметрів.

Клітинну суспензію розводили водним розчином хлориду натрію у 10 разів і витримували в ньому протягом 10 хв, після чого центрифугували при 1000 обертах протягом 5 хв. Далі надосад видаляли, а осад розводили фізіологічним розчином. Результати експериментів узгоджуються з теоретичними прогнозами про те, що відмивання клітинної суспензії від кріопротектора поліпшується зі збільшенням концентрації не проникаючої в клітини речовини в розчині, що відмиває. При одноразовому відмиванні клітин 1,5М розчином кількість клітин знижувалася на 16,402,30%, а збереження на 27,684,11 і 20,553,11% за даними світлової і люмінесцентної мікроскопії. І хоча ці показники вірогідно і відрізнялися від контрольних величин, але в процентному відношенні вони були вищими, ніж при відмиванні 0,75М розчином, де кількість клітин зменшувалась на 34,372,51%, а збереження на 57,033,1% і 53,084,1%.

При вивченні клітинного складу кісткового мозку показано, що молярність розчину, що відмиває, відіграє важливу роль у збереженні трьох основних ростків кровотворення .(табл.2)

Таблиця 2

Клітинний склад кісткового мозку до і після швидкого двоступінчастого заморожування, відтавання й одноразового відмивання від кріопротектору

Тип клітин | Нативний кістковий мозок

(контроль) | Відмивання 1,5М

NaCl | Відмивання 0,75М

NaCl

Мієлобласти | 5,12±0,23 | 5,62±0,73 | 2,74±1,22

Мієлоцити | 3,41±0,34 | 3,01±0,52 | 2,12±1,71

Метамієлоцити | 7,81±0,72 | 7,12±1,11 | 6,21±1,12

Гранулоцити | 30,42±2,23 | 25,63±2,74 | 18,74±3,23

Мієлоїдний росток | 47,72±2,52 | 41,22±2,90

Р10,05 | 29,72 ±3,32

Р10,05 Р20,05

Еритробласти | 4,33±0,31 | 4,01±0,53 | 4,80±0,73

Нормобласти | 26,02±2,74 | 27,21±2,91 | 30,6±3,84

Еритроїдний росток | 30,12±2,02 | 31,21±2,41

Р10,05 | 35,41±3,73

Р10,05 Р20,05

Лімфобласти | 1,82±0,24 | 2,01±0,13 | 1,23±0,51

Лімфоцити | 19,13±2,20 | 24,42±2,31 | 32,21±3,12

Лімфоїдний росток | 20,95±2,44 | 26,41±2,43

Р10,05 | 33,44±3,63

Р10,05 Р20,05

Голоядерні клітини | 1,310,08 | 1,130,05 | 1,520,07

Примітка: Р1 – вірогідність випадкових розходжень з даними до охолодження; Р2 вірогідність випадкових розходжень з даними після швидкого двоступінчастого заморожування та відмивання від кріопротектора

Найбільш стійкими виявилися клітини еритроїдного ряду – нормобласти, найменш – мієлоїдного – гранулоцити. Зменшення молярності розчину, що відмиває, до 0,75М призводило до більш вираженого зниження кількості клітин мієлоїдного типу, і в першу чергу - гранулоцитів, що сприяло відносному збільшенню лімфоїдних та еритроїдних клітин.

Проведені експерименти щодо вивчення фагоцитарної активності гранулоцитів після швидкого двоступінчастого заморожування кісткового мозку і одноразового відмивання від кріопротектору 0,75М і 1,5М водним розчином NaCl підтвердили теоретичні розрахунки, показавши, що вона залежить від молярності розчину, що відмиває. Так, при відмиванні 0,75М розчином NaCl відзначене пригничення даної функції гранулоцитів було вищим, ніж при відмиванні 1,5М розчином. І хоча ці показники вірогідно і відрізнялися від контрольних величин нативного кісткового мозку, було встановлено, що при відмиванні клітин 1,5М-ним розчином ФІ знижувався на 16,782,71%, ФЧ - на 29,752,81%, АЧГр – на 29,752,90%, а АПФАгр – на 49,282,61%. В той же час при відмиванні 0,75М розчином NaCl показники фагоцитарної активності знизилися ще більше: ФІ - на 26,462,72%, ФЧ – на 46,972,15%, АЧГр – на 59,642,53%, АПФАГр – на 70,442,32% (рис. 6).

Рис. 6 Фагоцитарна активність гранулоцитів після кріоконсервування і відмивання від кріопротектора

Збереження стовбурових і колонієутворюючих клітин кісткового мозку (КУОс) після кріоконсервування є інтегральним і найбільш важливим показником його ефективності. На цій підставі було вивчено вплив кріоконсервування методом швидкого двоступінчастого заморожування з наступним відмиванням від кріопротектору на колонієутворюючу здатність, проліферативну активність і диференціювання КУОс. Отримані експериментальні дані представлені в таблиці 3.

Таблиця 3

Колонієутворююча активність кісткового мозку до і після кріоконсервування

Кістковий мозок, що трансплантується | Макроколонії | Мікроколонії | Відношення колоній ер:гр

8 доба | 12 доба | 8 доба | 12 доба | 8 доба | 12 доба

Нативний кістковий мозок (контроль) | 14,411,12 | 16,021,81

Р20,05 | 15,851,33 | 18,071,42

Р20,05 | 2,2:1 | 2,3:1

Кріоконсервований кістковий

мозок | 8,930,90 Р10,05 | 12,851,62

Р10,05

Р20,05 | 9,640,52 Р10,05 | 14,761,71

Р10,05

Р20,05 | 3,8:1 | 2,2:1,5

Примітка: Р1 – вірогідність випадковості розходжень з даними до охолодження; Р2 – вірогідність випадковості розходжень з даними колонієутворюючої активності клітин кісткового мозку на 8-у добу

При трансплантації нативного кісткового мозку в селезінках мишей-реципієнтів на 8-у добу число макро- і мікроколоній було вірогідно вищим, ніж при трансплантації кріоконсервованого кісткового мозку. До 12-ої доби їхня кількість збільшувалася в обох випадках. Однак і в ці терміни в селезінці тварин із трансплантатом кріоконсервованого кісткового мозку, кількість макро- і мікроколоній було вірогідно нижчою, ніж у мишей, яким трансплантували нативний кістковий мозок. Порівнняльні показники колонієутворюючої здатності нативного і кріоконсервованого кісткового мозку на 8-у і 12-у добу, кількість колоній вірогідно збільшилася. У мишей із трансплантатом кріоконсервованого кісткового мозку даний показник був меншим, однак, на 12-у добу наближався до показників після введення нативного кісткового мозку (табл. 3).

Гістологічні дослідження селезінок показали, що при трансплантації нативного кісткового мозку на 8-у добу дослідження 93,521,57% колоній складалися з диференційованих клітинних елементів. У цей же час у мишей із кріоконсервованим трансплантатом відсоток диференційованих колоній складав тільки 55,142,26%. На 12-у добу у мишей з нативним трансплантатом цей показник склав 96,912,01%, а у мишей із кріоконсервованим трансплантатом хоча і збільшився до 86,423,17%, але, був вірогідно нижчим у порівнянні з нативним (табл. 3). Серед диференційованих колоній переважали еритроїдні. Співвідношення колоній еритроїдно-гранулоцитарного типу на 8-у добу складало 2,2:1 при трансплантації нативного кісткового мозку і 3,8:1 при трансплантації кріоконсервованого. До 12-ої доби дослідження співвідношення колоній вирівнювалося в селезінках мишей із кріоконсервованим трансплантатом у порівнянні з нативним і складало 2,2:1,5 (табл. 3).

Таким чином, отримані дані щодо збереження колонієутворюючої активності (КУОс) у селезінці летально опромінених мишей показали можливість збереження 81,681,52% стовбурових клітин кісткового мозку кріоконсервованого при швидкому двоступінчастому заморожуванні.

ВИСНОВКИ

1. Проведені дотепер теоретичні дослідження процесів масопереносу між клітинами і оточуючим їх кріозахисним середовищем при заморожуванні з постійною швидкістю охолодження і при швидкому двоступінчастому заморожуванні вказують на велику ефективність другого з них, але відповідні розрахунки для конкретних клітин, зокрема, клітин кісткового мозку миші, відсутні, що не дозволяє підтвердити справедливість цих загальних теоретичних уявлень шляхом зіставлення з конкретними експериментальними даними. У зв'язку з цим, у даній роботі проведено чисельне моделювання процесів заморожування-відігріву в клітинах кісткового мозку миші.

2. Розрахунковим шляхом визначені оптимальні з погляду запобігання внутрішньоклітинній кристалізації режими охолодження клітин кісткового мозку при швидкому двоступінчастому заморожуванні і при заморожуванні з постійною швидкістю під захистом диметилсульфоксиду.

3. Побудовано біофізичну кількісну модель процесу відмивання клітин від кріопротектору і на її основі визначені придатні умови одноразового відмивання відталих клітин кісткового мозку від диметилсульфоксиду.

4. Прогнози, що випливають з теоретичного аналізу, щодо оптимальних режимів заморожування клітин кісткового мозку і їхнього відмивання від диметилсульфоксида, експериментально підтверджені при роботі із суспензією кісткового мозку мишей у системі in vitro та in vivo.

5. Методом кріомікроскопії показано, що при оптимальному режимі швидкого двоступінчастого заморожування клітини кісткового мозку залишаються морфологічно цілісними.

6. Розроблений режим швидкого двоступінчастого заморожування клітин кісткового мозку миші забезпечує збереження основних трьох ростків кровотворення: еритроїдного, мієлоїдного і лімфоїдного.

7. При заморожуванні клітин кісткового мозку з постійною швидкістю охолодження різні типи клітин кісткового мозку ушкоджуються неоднаково; найменш стійкими є клітини мієлоїдного ряду.

ПЕРЕЛІК ОПУБЛІКОВАНИХ РОБІТ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

1)

2)

3)

4)

5)

6)

7)

8)

АНОТАЦІЇ

Останков М.В. Теоретичне обгрунтовування та експериментальна перевірка ефективності швидкого двоступінчастого заморожування. – Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 03.00.19 – кріобіологія і кріомедицина – Інститут проблем кріобіології і кріомедицини НАН України, Харків – 2001.

В роботі наведені теоретичні розрахунки процесів масопереносу між клітинами та оточуючим їх кріозахисним середовищем при швидкому двоступінчастому заморожуванні і при охолодженні з постійною швидкістю 1Со/хв і 10оС/хв для клітин кісткового мозку миші. Шляхом розрахунків визначені оптимальні з точки зору запобігання внутрішньоклітинній кристалізації режими охолодження клітин кісткового мозку при швидкому двоступінчастому заморожуванні і охолодженні з постійною швидкістю під захистом 1 і 1.5М диметилсульфоксиду.

Справедливість цих загальних теоретичних висновків про оптимальні умови кріоконсервування підтверджена шляхом зіставлення з одержаними експериментальними даними. Показано, що швидке двоступінчасте заморожування є більш ефективним для кріоконсервування клітин кісткового мозку миші, і забезпечує збереження основних трьох ростків кровотворення.

Побудовано біофізичну кількісну модель процесу відмивання клітин від кріопротектору, і на її основі визначено сприятливі умови одноразового відмивання відтаяних клітин кісткового мозку від диметилсульфоксиду.

Ключові слова: клітини кісткового мозку, чисельне моделювання, швидке двоступінчасте заморожування, переохолодження, внутрішньоклітинна кристалізація, диметилсульфоксид, постгіпертонічний кріолізис, фагоцитарна активність, колонієутворення.

Останков М.В. Теоретическое обоснование и экспериментальная проверка эффективности быстрого двухступенчатого замораживания. – Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.19 – криобиология и криомедицина. – Институт проблем криобиологии и криомедицины Национальной Академии наук Украины, Харьков, 2001.

В работе проведены теоретические расчеты и сопоставлены зависимости переохлаждения внутриклеточного раствора, объема клеток и концентрации, растворенных внутри них веществ от температуры при охлаждении клеток костного мозга мыши с постоянной скоростью 1оС/мин и 10оС/мин и при быстром двухступенчатом замораживании. Справедливость этих общих теоретических представлений подтверждена путем сопоставления с конкретными экспериментальными данными по криоконсервированию клеток костного мозга мыши. Показано, что экспоненциальное, в частности двухступенчатое, охлаждение, обеспечивало более высокую устойчивость консервируемых клеток к постгипертоническому лизису. Кроме того в случае быстрого двухступенчатого охлаждения путем подбора субнулевой температуры изотермической экспозиции можно снизить вероятность внутриклеточной кристаллизации, несмотря на то, что скорость охлаждения на начальном и конечном участках значительно превышает оптимальные с точки зрения двухфакторной теории криоповреждения значения. При быстром двухступенчатом замораживании клетки костного мозга мыши экспонировались в окружающем их растворе с повышенной концентрацией криопротектора в области околонулевой температуры значительно меньший промежуток времени, чем при линейном режиме. Количество ДМСО в деконсервированных клетках после быстрого двухступенчатого замораживания меньше, чем после линейного режима охлаждения, что обуславливало повышенную устойчивость клеток костного мозга к гипертоническому лизису. Кроме того, по данным криомикроскопии образование внутриклеточных кристаллов при быстром двухступенчатом замораживании, хотя и имело место в отдельных клетках, но не приводило к их гибели, так как к моменту “температурной остановки” количество внутриклеточного льда было недостаточным для разрушения. В процессе экспозиции при субнулевой температуре за счет эффекта рекристаллизации количество внутриклеточного льда уменьшалось, кристаллы, вероятно, плавились и, за счет выхода части воды из клеток, и превращались во внеклеточный лед. Таким образом, быстрое двухступенчатое замораживание, сохраняя все достоинства оптимального линейного режима охлаждения, имеет перед ним существенные преимущества. Методом криомикроскопии было показано, что выравнивание вне- и внутриклеточных концентраций диметилсульфоксида осуществлялось в пределах минуты и при оптимальном режиме быстрого двухступенчатого замораживания клетки костного мозга сохраняли свою структуру.

Расчетным путем определены оптимальные с точки зрения предотвращения внутриклеточной кристаллизации параметры охлаждения клеток костного мозга при быстром двухступенчатом замораживании и при постоянной скорости 1оС/мин и 10оС/мин под защитой 1М и 1,5М диметилсульфоксида.

Построена биофизическая количественная модель процесса отмывания клеток от криопротектора и на ее основе определены подходящие условия однократной отмывки оттаянных клеток костного мозга от диметил-сульфоксида. При использовании в качестве отмывающего вещества водного раствора хлорида натрия (NaCl) с молярностью 1,5М полученны результаты, которые оказались выше, чем при использовании отмывающего раствора с меньшей концентрацией – 0,75М.

Экспериментально в опытах in vitro и in vivo подтверждены вытекающие из теоретического анализа прогнозы относительно оптимальных режимов замораживания клеток костного мозга и их отмывания от диметилсульфоксида.

Быстрый двухступенчатый режим охлаждения обеспечивает высокую эффективность криоконсервирования костного мозга мыши. Он значительно сокращает продолжительность и трудоемкость процедуры замораживания-отогрева, что особенно важно для клеток, которые имеют малое поверхностно-объемное отношение и коэффициент проницаемости мембран для молекул воды. Для применения этого метода требуется значительно более простая аппаратура, чем при замораживании с постоянной скоростью охлаждения.

Разработанный режим быстрого двухступенчатого замораживания клеток костного мозга мыши обеспечивает сохранность основных трех ростков кроветворения, а при охлаждении с постоянной скоростью 1оС/мин и 10оС/мин различные пулы клеток костного мозга повреждаются неодинаково. Наименее устойчивыми оказались клетки миелоидного ростка – гранулоциты, а наиболее устойчивые клетки лимфоидного ростка – лимфоциты и эритроидного ростка – нормобласты.

Проведенные исследования функциональной активности клеток костного мозга в системе in vitro и in vivo подтвердили теоретические расчеты и морфологические тесты, показав, что быстрое двухступенчатое замораживание является более оптимальным режимом криоконсервирования костного мозга мыши. Данный метод криоконсервирования позволяет сохранить высокие показатели фагоцитарной активности гранулоцитов – наиболее криолабильной клеточной популяции костного мозга. В опытах in vivo была получена высокая сохранность стволовых клеток, что подтверждалось показателями пролиферативной активности колониеобразующих клеток (КОЕс) и дифференцировки их в эритроидный и миелоидный росток в селезенках летально облученных мышей-реципиентов при трансплантации им криоконсервирован-ного этим методом костного мозга.

Ключевые слова: клетки костного мозга, численное моделирование, быстрое двухступенчатое замораживание, переохлаждение, внутриклеточная кристаллизация, диметилсульфоксид, постгипертонический криолизис, фагоцитарная активность, колониеобразование.

Ostankov M.V. Theoretical substantiation and experimental checking of the efficiency of rapid two-stage freezing. – Manuscript.

The thesis on the obtaining the scientific degree of candidate of biological science (pHd equivalent) on the specialty 03.00.19 – cryobiology – Institute for Problems of cryobiology and cryomedicine of the National Academy of Sciences of the Ukraine, Kharkov 2001.

Theoretical calculations of the processes of mass transfer between the cells and surrounding them cryoprotective medium at a rapid two-stage freezing and under cooling with a constant rate of 10C/min and 100C/min for murine bone marrow cells were presented in the work. By means of calculations the optimum cooling regimens of bone marrow cells at a rapid two-stage freezing and cooling with a constant rate under the protection of 1 and 1,5M dimethyl sulfoxde, from the point of view of the prevention of intracellular crystallization.

Correctness of these general conclusions on optimum cryopreservation conditions has been confirmed by means of comparative study with the obtained experimental data. It was shown that rapid two-stage freezing is the most efficient for