Фізико-хімічний інститут ім. О.В. Богатського

Пихтєєва Олена Гераклітівна

УДК 577.15.08:577.152.34:541.128.135 (043.8)

Біокаталітичні ансамблі на основі протеолітичного фермента, який включено до різноманітних ліотропних мезофаз

02.00.10. - біоорганічна хімія

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата хімічних наук

Одеса-2001

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана у Фізико-хімічному інституті ім. О.В.Богатського НАН України

Науковий керівник: доктор хімічних наук, професор

Шапіро Юрій Євгенович,

Університет Бар-Ілан, факультет природознавчих наук, Ізраїль

Офіційні опоненти: доктор хімічних наук, професор,

чл.-кор. НАН України

Камалов Герберт Леонович,

Фізико-хімічний інститут ім. О.В. Богатського НАН України, завідувач відділу каталізу

кандидат хімічних наук

Станкевич Олена Олексіївна,

Одеський національний університет

ім. І.І.Мечникова, ПНДЛ-5,

старший науковий співробітник

Провідна установа: Інститут біоколоїдної хімії ім. Ф.Д.Овчаренка

НАН України, м. Київ

Захист відбудеться “25” травня 2001 р. о 1000 годині на засіданні спеціалізованої ради
Д 41.219.02 Фізико-хімічного інститутуі ім. О.В.Богатського НАН України (65080, м. Одеса, Люстдорфська дорога, 86)

З дисертацією можна ознайомитись у науковій бібліотеці Фізико-хімічного інституту ім. О.В.Богатського НАН України, м.Одеса, Люстдорфська дор., 86.

Автореферат розісланий “20” квітня 2001 р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради,

кандидат хімічних наук, с.н.с. Литвинова Л.О.

Загальна характеристика роботи

Актуальність теми. В останні десятиліття активно розвивається новий напрямок біоорганічної хімії — міцелярна ензимологія. Вона вивчає механізм дії та активність ферментів, які включено у різноманітні ліотропні мезофази: звернені міцели, моно— або багатошарові ліпосоми, ламелярні або кубічні структури. У таких колоїдних структурах фермент захищений від впливу органічного розчинника, що викликає його денатурацію, і має можливість функціонувати в умовах, близьких до умов живої клітини.

Незважаючи на значну кількість робіт в галузі міцелярної ензимології, дотепер не запропоновано способу одержання біокаталітичних частинок, що зберігають свою активність у водному й органічному середовищі. Назріла необхідність одержання біокаталітичних частинок, у яких фермент термостійкий, спроможний до роботи в широкому діапазоні рН та захищений від впливів органічного розчинника, який викликає його денатурацію. З іншого боку, біокаталітичні частинки повинні легко утворюватися в стандартних умовах, зберігатися в готовому вигляді та після закінчення реакції ви-ділятися з реакційного середовища.

Актуальність цієї проблеми обумовлена ще і тим, що дослідження такого роду істотно доповнюють сучасні уявлення про функціонування ферментів усередині і на поверхні клітинних мембран, а також відчиняють нові можливості біотехнології.

Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Робота виконана у відділі молекулярної структури та спектроскопії Фізико-хімічного інституту ім. А.В.Богатського НАН України відповідно до плану фундаментальних науково-дослідних робіт “Просторова структура біокаталітичних ансамблів, які застосовуються в міцелярній ензимології” (1991-1993 р., номер держреєстрації 0193U041880), “Пошук способів молекулярного конструювання кардіотропних препаратів на основі клатратних сполук за участю кавітандів і мікрокапсул” (1993-1997 р., номер держреєстрації 0193U041893) та програми ДКНТ України “Створення кардіологічних і нейротропних фармацевтичних препаратів пролонгованої дії” (1994-1997 р., номер держреєстрації 0194U001496). Автор двічі в 1994/1995 і 1996/1997 навчальних роках одержувала гранти Міжнародного фонду “Відродження”.

Мета і завдання дослідження. Робота присвячена розробці умов одержання, вивченню будови і властивостей нових біокаталітичних ансамблів на основі синтетичних поверхнево-активних речовин (ПАР) різноманітної природи, водорозчинного ферменту й органічних розчинників. Для досягнення цієї мети необхідно було розв’язати такі завдання:

· розробити умови одержання біокаталітичних ансамблів (вибрати ПАР, органічний розчинник, температурний режим, умови опрацювання системи ультразвуком і т.інш.) таким чином, щоб досягти максимальної відповідності розмірів водних порожнин і лінійних розмірів ферменту;

· вивчити будову отриманих систем на молекулярному рівні;

· встановити активність отриманих біокаталітичних ансамблів;

· вивчити молекулярну самодифузію в отриманих колоїдних системах.

Наукова новизна отриманих результатів. a-Хімотрипсин був іммобілізований у полімерні капсули, що мають розміри в нанометровому діапазоні. Будову отриманих систем на молекулярному рівні було вивчено сучасними методами спектроскопії ЯМР 13С і 1Н. Встановлено, що водорозчинний фермент розташовується у внутрішній водній порожнині колоїдної частинки. Фермент у такій системі захищений від впливу органічних розчинників, має підвищену термостійкість, достатньо високу активність. Активність біокаталітичної частинки залежить від дифузії субстрату до активного центру ферменту і продукту реакції від останнього. Показано, що при використанні нанокапсульованого a-хімотрипсина активність залежить від типу та концентрації поверхнево-активної речовини, яка формує зовнішній моношар везикули. Вперше синтезовано біокаталізатор на основі водорозчинного ферменту, який включено до кріогелю полівінілового спирту (ПВС).

Практичне значення отриманих результатів. Запропоновано новий спосіб одержання біокаталітичних ансамблів на основі різних водорозчинних ферментів. Вивчені полімерні нанокапсули полі-N,N-дідодецил-N,N-діаліламоній броміду (ДДАБ), що містять фермент, мають каталітичну активність у водних і органічних середовищах, підвищену термостійкість (до 60-80°С) і стабільність при збереженні.

Кріогель ПВС з включеним водорозчинним ферментом має високу операційну стабільність. Подібні біокаталітичні системи можуть знайти застосування у фармацевтичній промисловості, у косметології і тонкому органічному синтезі, наприклад, для синтезу пептидів. Широкий вибір водорозчинних ферментів сприяє широким можливостям практичного використання подібних біокаталізаторів.

Особистий внесок автора. Аналіз літературних даних, синтез біоката-літичних систем та інші експериментальні дослідження (за винятком дослідження самодифузії), а також аналіз усіх спектральних даних, опрацювання й аналіз отриманих результатів проведені безпосередньо здобувачем. Постановка задач дослідження проводилася за участю дисертанта. Обговорення результатів і формулювання висновків дисертації проведені разом з науковим керівником д.х.н., професором Ю.Є.Шапіро.

Апробація результатів роботи. Основні результати дисертаційної роботи докладалися і обговорювалися на XVII Українській конференції з органічної хімії, 1995 р., Харків;12-th Conference “Physical Methods in Coordination and Supramolecular Chemistry”. Chishinau, Moldova, 1996; 12-th International Symposium of Surfactants in solution. Stockholm. Sweden. 1998.

Публікації. За темою дисертації опубліковано 4 статті, 2 статті депоновані і опубліковані тези 3 доповідей на міжнародних та українських конференціях.

Обсяг і структура роботи. Дисертаційна робота викладена на 137 сторін-ках друкованого тексту, включає 16 таблиць, 34 малюнка, складається зі вступу, 3 розділів, загальних висновків та додатку (21 стор.). Список цитованої літератури містить 158 джерел.

У вступі обґрунтовано вибір теми і визначена мета дисертаційної роботи, наведено наукову новизну і практичну доцільність отриманих результатів. У першому розділі розглянута будова міцелярних систем, що застосовуються в даний час для іммобілізації ферментів. Оцінено переваги і недоліки різних способів і методів включення ферментів різноманітної природи в колоїдні структури. Підкреслено, що незважаючи на великі успіхи в розвитку міцелярної ензимології, дотепер не вдалося створити способу іммобілізації, у якому б поєднувалися переваги каталізу іммобілізованими ферментами (багаторазове використання, термостійкість, стабільність до впливу органічних розчинників, що денатурують фермент) із перевагами гомогенного каталізу. Розглянуто параметри, які характеризують різноманітні властивості біокаталітичних систем (кінетичні, технологічні) і придатність їх для аналізу отриманих біокаталітичних ансамблів. У другому розділі наведені результати роботи із створення нових біокаталізаторів та проведено їх аналіз. У третьому розділі описані оптимізовані способи приготування колоїдних систем, котрі містять і не містять фермент, умови полімеризації нанокапсул ДДАБ в органічному розчиннику і переведення нанокапсул полі-ДДАБ у водний буферний розчин за допомогою різних ПАР, та отримання кріогелю ПВС з іммобілізованим a-хімотрипсином, а також методи виміру ферментативної активності з використанням різних субстратів (п-нітрофенілацетату та етилового естеру N-ацетил-L-тирозину (ЕЕАТ)). Наведено умови спектрофотометричних визначень, ЯМР 1Н і 13С{1H} експериментів, ІЧ-спектроскопії та нефелометрії.

Основні результати роботи

Розглянуті особливості будови та включення білків різної молекулярної ваги (a-хімотрипсину і бичачого сироваткового альбуміну) у колоїдні структури —

в потрійній системі Брідж-96/вода/циклогексан;—

полімерних нанокапсулах ДДАБ (покритих аніонним ПАР АОТ (натрієва сіль ді(ізооктилового) ефіру сульфоянтарної кислоти (Аерозоль ОТ)) та неіоногенним Брідж-96 (олеоілполі-10-етиленоксид) ;—

кріогелі ПВС.

У цих системах вивчені міцелярний і ферментативний гідроліз ЕЕАТ та п-нітрофенілацетату.

Включення a-хімотрипсину і альбуміну до колоїдних

структур в потрійній системі Брідж-96/вода/циклогексан

Виявлено, що деякі колоїдні структури, утворені Брідж-96 у циклогексані, являють собою зручні матриці для іммобілізації ферментів різних класів, в які білок включається спонтанно.

Найбільше інформативними ЯМР-методами дослідження щільності упакування молекул ПАР і стабільності колоїдних структур (виміри часів спін-ґраткової релаксації Т1 різноманітних ядер 13С і гідрофільного парамагнітного зондування) встановлено морфологію мікрооточення молекул білка при його включенні до ліотропних структур, які утворює Брідж-96 у циклогексані. Спектри ЯМР 13С різних колоїдних структур наведено на мал. 1. Вся сукупність даних про фрагментарну рухливість молекул Брідж-96 у звернених міцелах дозволяє припустити їхнє упакування у виді фібрилярних структур, як показано на мал. 2 а. Відповідно до даних релаксометрії ЯМР 13С можна припустити, що олігооксиетиленові фрагменти щільно упаковані і комплементарно покладені на поверхні фібрили. Гідроксильні групи звернені усередину міцели і зв’язані між собою водневим зв’язком за відсутністю води або гідратовані.

Фаза, що вважалась раніше кубічною, є пакетом паралельно розташованих циліндричних мікрофібрил. У ламелярній структурі спостерігається ріст щільності упаковування оксиетиленових ланцюгів при зменшенні кривизни ламелярних структур (мал. 2, б). Збільшення фрагментарної рухливості алкільних ділянок молекул ПАР обумовлено формуванням рідкокристалічного бішару, у якому спосте-рігається кооперативний рух вуглеводневих ланцюгів. Зменшення їхньої фрагментарної рухливості в напрямку до кінцевого метилу свідчить про те, що в бішарі вуглеводневі ланцюги знаходяться в контакті. Розрахунковими методами і експериментально при використанні даних релаксометрії 13С із парамагнітним зондом з,ясовано значення середнього діаметру внутрішньої порожнини міцели D = 0,63-0,67 нм (експериментальне) і 0,64 нм (розрахункове).

Сучасними методами ЯМР показано, що водорозчинний білок включається до водної порожнини звернених міцел та водного прошарку ламелярної мезофази. Включення білка призводить до незначної деформації колоїдних структур.

міцелярний каталіз в системі

звернених міцел Брідж-96 в циклогексані

Експериментально встановлено, що в звернених міцелах, утворених Брідж-96 у циклогексані, спостерігається міцелярний каталіз (мал. 3). Він проявляється в тому, що максимальна швидкість гідролізу ЕЕАТ у 2,5 рази перевищує швид-кість спонтанного гід-ро-лізу цього субстрату у водному буферному розчині. Це можна пояснити, з одного боку, сорбцією субстрату на поверхні зверненої міцели. З іншого боку, підвищенню швидкості гідролізу сприяє також висока хімічна активність води у зверненій міцелі.

Каталітичні характеристики a-хімотрипсину, який включено

в звернені міцели Брідж-96 в циклогексані

Для аналізу кінетичних параметрів при ферментативному гідролізі обробку експериментальних даних проводили з використанням інтегральної форми рівняння Міхаеліса-Ментен в координатах Фостера-Німанна з урахуванням інгібування продуктом реакції:

де s0 — початкова концентрація субстрату, s — моментальна концентрація субстрату, Кm — константа Міхаеліса-Ментен, KP — константа інгібування продуктом реакції, t — час з початку реакції, v - максимальна швидкість.

Виходячи з експериментальних даних, будували первинні анаморфози в координатах (s0-s)/t =f{ln(s0/s)/t}, для кожної початкової концентрації s0 (від 1,0.10-4 до 1,4.10-3 М), при t и s, які вимірюються експериментально (мал. 4). Для кожного значення початкової концентрації субстрату вимірювали кутовий коефіцієнт. Значення кутового коефіцієнта цих анаморфоз:

дають після перетворення лінійне рівняння:

Вторинні анаморфози, які побудовані для кожної експериментальної серії, представляють собою прямі (мал. 5), з яких легко розраховуються значення Km та KP; Vmax знаходиться як середнє значення для експериментальної серії із первинних анаморфоз при використанні Km та KP.

При включенні a-хімотрипсину у водну порожнину звернених міцел Брідж-96 у циклогексані, не дивлячись на те, що константа інгібування продуктом реакції майже в 8 разів більше, ніж для ферменту у воді (це пов’язано з утрудненою дифузією продукту реакції через поверхню міцели і накопиченням його у водній фазі), каталітична константа для іммобілізованого ферменту, перевищує таку для a-хімотрипсину у водному буферному розчині в 15 разів. Це можна пояснити концентруванням реагентів на поверхні міцели поблизу активного центру ферменту.

синтез та вивчення активності біокаталітичної системи

на основі нанокапсул, які містять a-хімотрипсин

Біокаталітична система на основі нанокапсул, які містять a-хімотрипсин, являє собою заполімеризовані на межах поділу фаз звернені міцели ДДАБ ([(H2C=CH-CH2)2N+{(CH2)11CH3}]Br-) у циклогексані, які містять молекули ферменту у внутрішній водній порожнині. Після УФ-ініційованої полімеризації ДДАБ навколо ферментної кулі формується сітка полі-ДДАБ (мал. 6). Судячи по змінах, які від-буваються в ІЧ— та 13C-ЯМР спектрах дисперсій ДДАБ, що піддані УФ-опроміненню, сту-пінь по-лі-меризації складає близь-ко 60%.

Такі біокаталітичні системи спроможні до функціонування як у неполярних (органічних) розчинниках при використанні органорозчинних субстратів, так і у водній фазі при водорозчинних субстратах (мал. 6). Для переведення полімерних нанокапсул у водний розчин необхідно осадити їх ацетоном із дисперсії в циклогексані. Отриманий після центрифугування і висушування осад легко переводиться у водну фазу при додаванні ПАР (наприклад, аніонного АОТ або неіоногенного Брідж-96). При цьому у воді формуються бішарові везикули, внутрішній моношар яких складається здебільшого з полі-ДДАБ, зовнішній — з АОТ або Брідж-96, а молекула ферменту знаходиться у внутрішній водній капсулі везикули.

Вивчено активність a-хімотрипсину, який включено до полімерних нанокапсул в органічній фазі. З’ясовано (табл. 1), що ефективна константа в нанокапсулах полі-ДДАБ в органічній фазі на порядок нижче, ніж у звернених міцелах Брідж-96. Це можна пояснити утрудненістю дифузії субстрату до активного центру ферменту та зарядженого продукту реакції через полімерну сітку та подвійний електричний прошарок, утворений катіонним ПАР, у порівнянні з неіоногенним Брідж-96.

Каталітична константа при іммобілізації a-хімотрипсину в нанокапсулах полі-ДДАБ знижується вдвічі в порівнянні з a-хімотрипсином у водному буферному розчині. Можливо, це пов’язано зі значним конкурентним інгібуванням активного центру ферменту продуктом реакції. N-ацетил-l-тирозин, що утворюється під час реакції, є водорозчинною сполукою і тому його локальна концентрація поблизу активного центру a-хімотрипсину в нанокапсулах значно вище, ніж у водному розчині. Про це ж свідчить переважаюча у вісім разів константа інгібування продуктом реакції й у 3 рази вище значення Км у порівнянні з водним розчином.

З огляду на можливість виділення полімеризованих нанокапсул із реакційної суміші після закінчення реакції та їхнього повторного використання, що неможливо для a-хімотрипсину, який включено до звернених міцел Брідж-96, іммобілізація ферменту в полімерні нанокапсули є достатньо перспективною.

Таблиця 1.

Кінетичні параметри гідролізу етилового ефіру N-ацетил-L-тирозину під дією різних каталітичних систем (рН 7.2, 25 С)

№ | Каталітична система | Кm.104

моль/л | Vmax.107,

моль/(лс) | kкат ,

с-1 | Kеф. .10-3,

с-1 | КР.106,

моль/л

1 | -Хімотрипсин у вод-ному буферному розчи-ні | 2,20,2 | 16,51,5 | 0,250,03 | 7,50,7 | 5,00,3

2 | -Хімотрипсин у нано-капсулах полі-ДДАБ в органічній фазі | 6,20,7 | 2,370,3 | 0,120,01 | 0,390,03 | 40,61,7

3 | -Хімотрипсин у звер-нених міцелах Брідж-96 в циклогексані | 17,521,8 | 37,84,1 | 3,80,8 | 2,20,3 | 38,91,3

4 | -Хімотрипсин у біша-рових везикулах полі-ДДАБ/АОТ | 4,10,3 | 9,840,9 | 0,970,13 | 2,40,3 | 36,31,1

5 | -Хімотрипсин у біша-рових везикулах полі-ДДАБ/Брідж-96 (10:1) | 31,23,4 | 22024 | 22,01 ,9 | 7,00,9 | 15,60,8

6 | -Хімотрипсин у біша-ро-вих везикулах полі-ДДАБ/Брідж-96 (5:1) | 15,91,6 | 16814 | 4,20,4 | 10,50,3 | 36,51,2

7 | -Хімотрипсин у біша-рових везикулах полі-ДДАБ/Брідж-96 (1:1) | 16,41,7 | 718 | 1,80,2 | 4,330,1 | 121,66,9

При переведенні нанокапсул, котрі містять a-хімотрипсин, у водний буферний розчин формуються бішарові везикули, внутрішній моношар яких в основному складається з полі-ДДАБ, а зовнішній — із молекул обраного ПАР. Вивчено вплив природи і концентрації ПАР (аніонного АОТ і неіоногенного Брідж-96) на каталітичну активність біокаталітичного ансамблю (для ЕЕАТ і п-нітрофенілацетату).

Експеримент із п-нітрофенілацетатом як субстратом проведений для відпрацювання методики одержання біокаталітичних систем, вивчення включення ферменту. Оскільки механізм взаємодії цього субстрату з a-хімотрипсином добре вивчений у водній фазі, удалося виділити ефекти, пов’язані з нанокапсулюванням. Для зменшення впливу спонтанного гідролізу п-нітрофенілацетату вимір кінетичних параметрів ферментативного гідролізу проводили при зниженій температурі (19 °С) (табл.2). Для доказу локалізації a-хімотрипсину усередині заполімеризованих нанокапсул при формуванні біокаталітичної системи, стабільності подібних частинок і оптимізації умов їхнього створення, зроблена спроба включення ферменту в заполімеризовані звернені міцели в циклогексані або в готові полімеризовані везикули. Змішування буферного розчину a-хімотрипсина (система 1) із заполімеризованими порожніми везикулами дає каталітичну систему 3. Система 4 отримана при спробі вбудувати фермент у внутрішню водну порожнину попередньо заполімеризованих звернених міцел ДДАБ у циклогексані. Параметри ферментативного гідролізу наведені в табл. 2.

Таблиця 2.

Кінетичні параметри гідролізу п-нітрофенілацетату під дією різних каталітичних систем (рН 8.3, 19С)

№ | Каталітична система | Кm. 104, моль/л | Vmax . 108 моль/(л.с) | kкат. 102

с-1 | kеф. 105,

с-1 | КР . 105, моль/л

1 | -Хімотрипсин ім-мобілізований у бі-шарових везикулах полі-ДДАБ/АОТ | 3,90,3 | 3,40,5 | 1,00,1 | 8,61,0 | 0,690,05

2 | Суміш -хімотрип-сина у водному буферному розчині і бішарових везикул полі-ДДАБ/АОТ | 1,90,11 | 0,670,11 | 0,160,02 | 3,50,3 | 0,170,02

3 | -Хімотрипсин дода-ний до заполімери-зованих звернених мі-цел ДДАБ у цик-ло-гексані та переве-де-ний у водний роз-чин при додаванні АОТ | 2,60,3 | 0,0200,005 | 0,0130,002 | 0,80,1 | 5,40,5

З її аналізу випливає, що при інкапсуляції a-хімотрипсину усередині звернених міцел ДДАБ із наступною їхньою полімеризацією і переведенням на-но-капсул, які утворилися, у водну фазу за допомогою АОТ у вигляді бішарових везикул, молекули ферменту гарантовано знаходяться усередині нанокапсул. Спро-би вбудувати фермент у нанокапсули після по-лімеризації ДДАБ виявилися безуспішними. Розміри осередків полімерної сітки, яка утворилася, достатньо малі і не дозволяють білко-вій глобулі проникнути у внутрішню порожнину міцели або везикули точно так само, як і вийти назовні з везикулярних нанокапсул. Доказом цього може служити той факт, що при підвищенні температури до 60°С каталітична система, яка містить суміш везикул полі-ДДАБ/АОТ і ферменту, практично цілком втрачає активність, у той час, як іммобілізований усередині нанокапсул фермент зберігає 54% початкової активності (мал. 7). Термо-стійкість та каталі-тична активність залежать також від концентрації зовнішнього ПАР (мал. 8). Система має максимальну активність при низькому вмісті зовнішнього ПАР, нижня межа концентрації зовнішнього ПАР лімітується стабільністю колоїдної системи. Але відносне падіння активності після термостатування при 60 °С менше при співвідношенні ДДАБ/Брідж-96 = 1/1 (система зберігає 71,6 % активності, виявленої до термостатування).

Залежність кінетичних параметрів гідролізу ЕЕАТ від рН середовища

Активність вивчених біокаталітичних систем залежать від рН (мал. 9). Знайдений рН-оптимум для реакції ферментативного гідролізу етилового ефіру N-ацетил-L-тирозину під дією неіммобілізованого a-хімотрипсину у водному середовищі знаходиться в межах рН 7,5-8, що відповідає літературним даним. Плече на графіку в області рН 5,5-6 можна пояснити збільшенням швидкості спонтанного гідролізу ЕЕАТ. При формуванні нанокапсул полі-ДДАБ/Брідж-96 відбувається незначний зсув оптимального значення рН у лужну область. Оптимальне значення рН 8,5-9. При використанні АОТ для формування зовнішнього моношару зсув оптимуму рН у лужну область більш значний. a-Хімотрипсин, іммобілізований у нанокапсулах полі-ДДАБ/АОТ, виявляє мак-симальну активність при рН 10,5-11.

Цей зсув рН оптимуму в лужну область можна пояснити, використовуючи загальну форму рів-няння Хендерсона-Хассельбалха:

рН=рКs+lg([луга]/[кислота]), (1)

де pKs значення термодинамічної константи дисоціації для залишків амінокислот, розташованих в активному центрі a-химотрипсину, Ser-195, His -57 і Asp-102, рН — оптимальне значення pН для протікання ферментативного процесу. Інкапсуляція ферменту в сітку з катіонно-активного ПАР (ДДАБ) веде до появи відмінного від нуля ло-га-рифмічного збіль-шення. Неіонний Брідж-96 — дуже слабкий акцептор протонів. AOT — аніоноактивний ПАР, що містить у полярному фраг-менті залишок сульфоянтарної кислоти, більш активний. Тому, логарифмічна складова у рівнянні 1 більше при використанні AOT як зовнішнього моношару, ніж при використанні для цих цілей Брідж-96 у тій же самій молярній концентрації. У цьому випадку відбувається зсув оптимуму pН на 3,3 одиниці. Крім того, реально існуюче значення рН у внутрішній порожнині нанокапсули може не збігатися з рН зовнішнього буферного розчину. Згідно з літературними даними, локальний зсув рН може складати до декількох одиниць. З мал. 9 видно, що швидкість спонтанного гідролізу ЕЕАТ максимальна при рН 6. Це значить, що збільшення швидкості гідролізу субстрату іммобілізованим a-хімотрипсином при збільшенні рН не можна пояснити зростанням швидкості спонтанного гідролізу.

Кріогели ПВС як матеріали для іммобілізації ферментів

Нами вперше вивчені кріогелі ПВС як матеріали для іммобілізації ферментів. Кріогелі ПВС являють собою термооборотні полімерні гелі другого роду. Вони утворюються при таненні неглибоко заморожених концентрованих водних розчинів ПВС. Такі гідрогелі стабільні до температури 50-60 °С, а при більш сильному нагріванні розм’якшуються, а потім плавляться, даючи знову розчин ПВС. Морфологія гелю характеризується пористою структурою, що створюється беззупинною фазою ПВС-насиченого розчину, розташованого навколо численних крижаних кристалічних фаз, сформованих при заморожуванні. Гетерогенна пориста структура кріогелей стає більш досконалою при збільшенні часу заморожування і підвищенні концентрації ПВС. Добавка ДМСО як кріопротектора зменшує розміри мікрокристалітів льоду та робить кріогель більш щільним і менш розчинним у воді.

Нами встановлено, що самі крі-огелі ПВС теж можуть мати ка-та--літичні властивості. Це проявляється в тому, що максимальна швид-кість гідролізу ЕЕАТ під дією кріогеля ПВС значно перевищує швид-кість спонтанного гідролізу (Мал. 10).

Кріогелі ПВС, що містять як ро--зчинники ДМСО і воду, можуть бути зручними матрицями для іммобілізації ферментів. Умови одержання кріогелей ПВС не викликають денатурації біл-ків, тому що при цьому не ви-кори-с-товую-ться на---грівання до високих темпе-ра-тур, опромі-нен--ня УФ-, рент--ге-нівськими або g-про-меня-ми, обробка ультразвуком та інші прийоми, що застосовуються для ковалентної іммобілізації ферментів на полімерних носіях. Мікропориста структура кріогелей (мал. 11) може забезпечити транспорт молекул субстрату до активного центру ферменту і продукту реакції в розчин, а різноманітні умови одержання і добавки дозволяють регулювати розмір пір таким чином, щоб максимально знизити вимивання ферменту із зразка.

При іммобілізації a-хімотрипсину в кріогелі ПВС утворюються еластичні нерозчинні у воді біокаталітичні частинки, яким в процесі одержання можна надавати будь-яку форму. Ці біокаталітичні частинки, що містять іммобілізований фермент, можна використовувати в гетерогенному каталізі у водному середовищі при температурах не вище 40?45°С. Перевагою такого роду біокаталізаторів є легкість відділення каталітичної частинки, що містить коштовний фермент, від реак-ційної суміші та можливість його багаторазового використання. Такий біокаталізатор характеризується усталеністю при збереженні й операційною ста-бі-ль-ністю.

Концентрація a-хі-мо-трипсину в розчині ПВС у суміші вода/ДМСО складає 0,1 мг/моль. Загальний вміст a-хімотрипсину в зразку кріогеля ПВС складає 1 мг. Перед по-чат-ком кінетичних вимі-рів зразок кріогеля ПВС, що містить a-хімотрипсин, протягом 3 годин вимочують у 5 мл водного буферного розчину для вилучання незв’язаного a-хімотрипсину і золь-фракції кріогеля. Після видалення зразку в буферному розчині визначається 0,23±0,05 мг білку. Таким чином, зразок кріогеля ПВС містить під час кінетичних вимірів 0,77±0,05 мг зв’язаного ферменту. Як випливає з отриманих даних, при експлуатації протягом десятьох циклів відбувається падіння активності на 31% (тобто зразок зберігає 69% вихідної активності). Як показали дослідження, при збереженні таблетки в замороженому стані (-10°С) протягом трьох місяців, зберігається 94% початкової каталітичної активності (мал. 12).

Кінетичні параметри іммобілізованого ферменту значно відрізняються від параметрів ферменту у водному розчині. Як і очікувалося, Кр для іммобілізованого ферменту в 7 разів біль-ше, ніж для неіммобілізованого. Це можна пояснити утрудненістю дифузії продукту від ферменту, умонтованого в кріогель ПВС, внаслідок чого підвищується його локальна концентрація поблизу активного центру ферменту. Через це максимальна швидкість реакції, яка спостерігається для іммобілізованого ферменту, майже в 5 разів нижче. Проте через меншу концентрацію a-хімотрипсину у випадку іммобілізованого ферменту, ефективна константа усього втроє менше, ніж для неіммобілізованого a-хімотрипсину. Але не дивлячись на більш низькі показники каталітичної активності, іммобілізований у кріогелі ПВС a-хімотрипсин має свої переваги. При цьому головна перевага подібної біокаталітичної системи полягає в можливості її багаторазового використання. Імовірно, що подібні системи можна буде використовувати не тільки для цілей тонкого органічного синтезу, але і для пролонгування дії ферментних препаратів у медицині. Головне, що замість a-хімотрипсину за даних умов може бути іммобілізований будь-який інший водорозчинний фермент.

дифузія низькомолекулярного субстрату (ЕЕАТ)

при іммобілізації ферменту

Вивчена дифузія низькомолекулярних субстратів і продуктів реакції при іммобілізації ферменту. Кінетика реакції описується кінетикою Міхаеліса-Ментен з урахуванням дифузійних обмежень. Такі обмеження можуть обумовлюватися дифузійним опором при проникненні молекул субстрату і продукту через бішар у випадку везикули, або уздовж водяних каналів кріогеля. Дифузійні обмеження спостерігаються, при різних засобах іммобілізації ферментів. Вони змінюються в залежності від природи матеріалу матриці (везикула, пора), гідродинамічних умов, що оточують матеріал матриці, і розподілення компонентів системи реакції в об,єму або на поверхні мате-ріалу матриці.

Коли фермент іммобілізований у сферичні везикули, кінетика реакції також виражається кінетикою Міхаеліса-Ментен з урахуванням дифузійних обмежень. При дифузійних обмеженнях швидкість утворення продукту звичайно виражається з урахуванням показника ефективності h як

де Ss — концентрація субстрату біля поверхні ферментної глобули,

Vmax — максимальна швидкість реакції.

Встановлено, що гідроліз EEAT дифузійно обмежений, тому що h=0,90 (h<1).

Самодифузію молекул субстрату обмірювали після додавання 10 мМ EEAT до везикулярної системи, що містить a-хімотрипсин, і витримування протягом 2 годин для завершення каталітичного гідролізу. Коефіцієнти самодифузії EEAT при 20 °С: Dсвоб. =5.4 .10-10 м2/с (дифузія в об’ємі) і Dзв’яз. = 2.7.10-19 м2/с (дифузія через бішар).

Висновки

1. Доведено можливість використання різноманітних колоїдних систем, які утворює Брідж-96 у циклогексані в присутності води, для включення водорозчинних білків (на прикладі альбуміну). Дослідженнями методами спектроскопії ЯМР показано, що водорозчинний білок залучається у водний прошарок ламелярних і кубічних структур.

2. Показано, що білок залучається у водну порожнину зверненої циліндричної міцели. Відбувається незначна деформація мікрофібрили з циліндричної в еліпсоїдальну. Активність a -хімотрипсину максимальна при співвідношенні молярних концентрацій [вода]/[ПАР]=10. Отриманий біокаталізатор придатний до використання в органічному середовищі.

3. Запропоновано та оптимізовано для a -хімотрипсину новий спосіб іммобілізації водорозчинних ферментів у полімеризовані нанокапсули на основі N,N-дідодецил-N,N-діаліламонійброміду. Синтезована біокаталітична система виявляє активність у водному та органічному середовищі та має підвищену термостійкість.

4. Встановлено, що у водному середовищі активність нанокапсул, що містять фермент, залежить від концентрації та типу поверхнево-активної речовини, яка утворює зовнішній моношар. Активність вище в разі неіоногенної поверхнево-активної речовини Брідж-96 при молярному співвідношенні Брідж-96/ДДАБ=1/10, ніж при використанні аніонної АОТ при такому самому співвідношенні компонентів. Термостійкість залежить від кількості Брідж-96, який формує зовнішній моношар, та росте з ростом його концентрації.

5. Вивчено залежність активності від рН середовища. Активність нанокапсул полі-ДДАБ/Брідж-96, які містять фермент, максимальна при рН 8,5, а полі-ДДАБ/АОТ — при рН 10,5. Методами імпульсного градієнту спін-еха показано, що активність нанокапсульованого a-хімотрипсину залежить від швидкості дифузії низькомолекулярних компонентів реакції крізь полімерну стінку нанокапсул.

6. Доведено можливість одержання в м’яких умовах гетерогенного біокаталізатора, який містить водорозчинний фермент, на основі кріогелей ПВС із добавкою ДМСО. Методами ЯМР установлено їхню будову. Показано, що такий біокаталізатор зберігає свою активність протягом як мінімум 10 циклів використання та не втрачає її при збереженні у замороженому стані протягом декількох місяців.

7. Методами імпульсного градієнту спін-еха показано, що гідроліз ЕЕАТ у везикулярних нанокапсулах обмежується дифузією. Також визначено, що включення ферменту призводить до підвищення стійкості колоїдних структур до процесів деструкції (коалесценції та синерезиса).

Список праць, опублікованих за темою дисертації

1. Шапиро Ю.Е., Пыхтеева Е.Г., Левашов А.В., Клячко Н.Л. Морфология обращённых фибриллярных мицелл и лиотропных фаз Бридж-96 в циклогексане, инкапсулирующих альбумин // Биологические мембраны. - 1993. - Т.10, № 4. - С. 397-408.

2. Шапиро Ю.Е., Пыхтеева Е.Г., Фёдорова Г.В. Активность a-химотрипсина, иммобилизованного нанокапсулами поли(N,N-дидодецил-N,N-диаллиламмоний бромида // Биоорганическая химия. -1997. - Т. 23, № 3 - С. 174-182.

3. Yu.E. Shapiro, E.G.Pykhteeva. 1H NMR Self-Diffusion in Polymer-Surfactant Nanocapsules and Cryogels with Enzyme // Journal of Colloid and Interface Science. – 1998.— V.206 – P. 168-176

4. Yu.E. Shapiro, E.G.Pychteeva. Immobilization of a-Chymotrypsin into the Poly(N,N-Diallyl-N,N-Didodecyl Ammonium Bromide)/Surfactant Nanocapsules// Applied Biochemistry and Biotechnology .–1998. – V.74, N2 – P. 67-84.

5. Пыхтеева Е.Г. Коллоидно-химические свойства синтетических поверхностно-активных веществ (ПАВ), применяемых в энзимологии лиотропных мезофаз. Обзор - 18 с . Деп. в НИИТЭХим г. Черкассы 19.09.1997 № 58-хп97

6. Пыхтеева Е.Г. Строение и свойства свойства биокаталитических ансамблей на основе ферментов, ПАВ и органического растворителя. Обзор.— 28 с. Деп. в НИИТЭХИМ г. Черкассы 19.09.1997 № 59-хп97

7. Шапиро Ю.Е., Горбатюк В.Я., Пихтєєва О.Г. Аналiз структури бiокаталiтичних ансамблiв методом спектроскопiї ЯМР 13С // Тези доповiдей. XVII Украiнська конференцiя з органiчноi хiмiї. Ч. 2. - Харкiв. - 1995. - С. 509.

8. Yu.E.Shapiro, E.G.Pychteeva. Supramolecular complexes from the alpha-chymotrypsin immobilized by poly(N,N-didodecyl-N,N-diallyl ammonium bromide) nanocapsules // 12th Confer. “Physical Methods in Coordination and Supramolecular Chemistry”. Abstracts. - Chishinau, Moldova. - 1996. - Р. 71.

9. Yu.E.Shapiro, E.G.Pychteeva. Alpha-Chymotrypsin immobilized into poly(N,N-diallyl-N,N-didodecyl ammonium bromide)/surfactant nanocapsules. - 12th Intern. Symp. on Surfactants in solution. Book of Abstracts. - Stockholm, Sweden. -1998. - Р. 122.

Пихтєєва О.Г. Біокаталітичні ансамблі на основі протеолітичного ферменту, що включений в різноманітні ліотропні мезофази. — Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата хімічних наук за фахом 02.00.10. — біоорганічна хімія. Фізико-хімічний інститут ім. О.В.Богатського НАН України, Одеса, 2001.

Дисертація присвячена вивченню будови та каталітичних характеристик, а також оптимізації умов утворення біокаталізаторів на основі a-хімотрипсину, вбудованого в різноманітні ліотропні мезофази: звернені міцели Брідж-96 в циклогексані, нанокапсули полі-N,N-дідодецил-N,N-діаліламоній броміду (із зовнішнім моношаром, утвореним АОТ і Брідж-96) та кріогель ПВС. Вивчена залежність параметрів процесу від рН середовища и дифузії компонентів біокаталітичних систем и субстрату, а також термостабільність, операційна усталеність и усталеність до зберігання отриманих систем. Будова на молекулярному рівні вивчена сучасними методами спектроскопії ЯМР 13С та 1Н.

Ключові слова: a-хімотрипсин, активність, Брідж-96, N,N-дідодецил-N,N-діаліламоній бромід, полімерні нанокапсули, кріогель ПВС, спектроскопія ЯМР 13С и 1Н.

Пыхтеева Е.Г. Биокаталитические ансамбли на основе протеолитического фермента, встроенного в различные лиотропные мезофазы. — Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата химических наук по специальности 02.00.10 — биоорганическая химия. — Физико-химический институт им. А.В.Богатского НАН Украины, Одесса, 2000.

Работа посвящена изучению условий получения и функционирования биокаталитических ансамблей на основе a-химотрипсина, встроенного в коллоидные структуры различной сложности: обращенные мицеллы Бридж-96 в циклогексане; криогель поливинилового спирта и нанокапсулы, образованные при УФ-инициированной полимеризации N,N-дидодецил-N,N-диаллиламмоний бромида (в среде органического растворителя и в водной среде при добавлении различных типов ПАВ).

Методами ЯМР 13С и 1Н на молекулярном уровне изучено строение коллоидных систем, образующихся в тройной системе Бридж-96/циклогексан/вода. Показано, что в ламеллярную и кубическую мезофазы возможно встраивание водорастворимого белка без денатурации. При этом белок встраивается в водную прослойку ламеллярной фазы и водную полость обращенных мицелл. Выяснено, что обращенные цилиндрические мицеллы наиболее пригодны для целей мицеллярной энзимологии. Установлено, что активность a-химотрипсина при встраивании его в обращенные мицеллы снижается из-за роста константы ингибирования активного центра фермента продуктами реакции.

Доказана возможность принципиально нового способа получения биокатализатора на основе фермента, встроенного в полимерные нанокапсулы. Показано, что полученный биокатализатор способен к работе в водной среде и среде органического растворителя. Способ получения нанокапсул позволяет регулировать размеры внутренней полости путем добавления воды таким образом, чтобы достичь максимального ее соответствия линейным размерам фермента, что, как было показано до наших исследований, способствует проявлению максимальной активности.

Изучена зависимость активности биокатализатора от рН среды. Показано, что оптимум рН зависит от типа ПАВ, образующего внешний монослой искусственной везикулы. Активность частиц зависит от типа внешнего ПАВ и его концентрации. Активность выше в случае неионогенного Бридж-96 (и падает с ростом его концентрации), чем анионного АОТ.

Полученный нанокапсулированный a-химотрипсин проявляет повышенную термоустойчивость, сохраняя 54% первоначальной активности в системе поли-ДДАБ/АОТ и 71.6% — в системе поли-ДДАБ/Бридж-96 при их оптимальном соотношении после инкубирования в течение 20 мин. при 60°С, а также характеризуется устойчивостью к биодеградации и хранению.

Исследования показали, что криогель ПВС, полученный в присутствии небольшой добавки ДМСО, может быть использован как матрица для иммобилизации водорастворимых ферментов. Некоторое снижение активности фермента при иммобилизации по сравнению с водным раствором компенсируется легкостью извлечения фермента из реакционной среды после окончания реакции, достаточной операционной стабильностью, устойчивостью при хранении.

Методом ЯМР PGSE изучена трансляционная диффузия в биокаталитических системах. Установлено, что включение a-химотрипсина в нанокапсулы и криогель понижает коэффициенты самодиффузии для структурообразующих компонентов и сдвигает критическую температуру, при которой происходят необратимые структурные изменения. Измерения самодиффузии позволяют наблюдать молекулярное уплотнение бислоев в капсулах поли-ДДАБ/Бридж-96, а также системы водородных связей гидроксильных групп ПВС в криогеле при встраивании фермента в эти системы.

Доказано, что ферментативный гидролиз субстрата a-химотрипсина, этилового эфира N-ацетил-l-тирозина, в изученных биокаталитических системах диффузионно ограничен.

Ключевые слова: a-химотрипсин, активность, спектроскопия ЯМР 13С и 1Н, Бридж-96, N,N-дидодецил-N,N-диаллиламмоний бромид, криогель ПВС, полимерные нанокапсулы

Pykhteeva E. G. Biocatalytic Ensembles on the Base of the Proteolytic Enzyme Incorporated into the Various Liotropic Mesophases. – Manuscript.

Dissertation is for scientific degree of the candidate of chemical sciences (Doctor of Philosophy) by specialty 02.00.10 – Bioorganic Chemistry. A.V.Bogatsky Physico-Chemical Institute of the National Academy of Sciences of Ukraine, Odessa, 2001.

The dissertation has considered to investigations of a structure, catalytic properties and optimization of the preparing conditions of biocatalysts on the base of a-chymotrypsin incorporated into the various liotropic mesophases. The following mesophases have been under study: reversed micelles of Brij-96 in cyclohexane, bilayer nanocapsules formed from poly(N,N-diallyl-N,N-didodecyl ammonium bromide) as the inner monolayer and AOT or Brij-96 as the outer monolayer, and the PVA cryogels. Dependencies of the catalytic parameters of hydrolysis on рH of a medium, diffusion of components of the biocatalytic systems and substrate have been studied. Thermostability, operative stability and storage conditions have been estimated as well. The molecular structure and morphology of systems have been determined by the use of the 13C and 1H NMR spectroscopy.

Keywords: a-chymotrypsin, Brij-96, bilayer nanocapsules, N,N-diallyl-N,N-didodecyl ammonium bromide, PVA cryogels, 13C and 1H NMR spectroscopy.