ІНСТИТУТ ПРОБЛЕМ КРІОБІОЛОГІЇ І КРІОМЕДИЦИНИ

НАН УКРАЇНИ

ПАШИНСЬКИЙ Павло Петрович

УДК 57.043:57.089.36:616.36-002

ВПЛИВ КРІОКОНСЕРВОВАНИХ ФЕТАЛЬНИХ ПРЕПАРАТІВ НА ФУНКЦІОНАЛЬНИЙ СТАН ГЕПАТОЦИТІВ ПАЦЮКІВ IN VITRO І IN VIVO

03.00.19 - кріобіологія і кріомедицина

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

Харків 2001

Дисертацією є рукопис

Робота виконана в Інституті проблем кріобіології і кріомедицини НАН України

Науковий керівник:

Офіційні опоненти:

Доктор біологічних наук, професор Каліман Павло Авксентійович, Харківський національний університет ім. В.М. Каразіна, завідувач кафедри біохімії

Доктор біологічних наук, професор Жегунов Геннадій Федорович, Харківський державний медичний університет, завідувач кафедри загальної біології, цитології і генетики

Провідна установа:

Інститут біохімії ім. О.В. Палладіна НАН України, м. Київ

Захист відбудеться "__16__" __жовтня_ _2001 року о __1330__ годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 64.242.01 при Інституті проблем кріобіології і кріомедицини НАН України за адресою 61015, м. Харків, вул. Переяславська, 23.

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці ІПКіК: 61015, м. Харків,

вул. Переяславська, 23.

Автореферат розісланий "_15_" ___вересня___ 2001 року.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради

доктор мед. наук, професор Гольцев А.М.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Однією із задач сучасної кріобіології поряд із вивченням особливостей кріопошкоджень і кріозахисту об'єктів різного рівня біологічної організації, є розробка ефективних біотехнологій, що включають одержання, кріоконсервування і тривале зберігання ембріональних та плодових (фетальних) тканин, клітин і отриманих з них препаратів, що мають перспективи використання в медицині, біології, фармакології, сільському господарстві й інших галузях (Грищенко В.І., 1991, Сухих Г.Т., 1994, Субота Н.П., 1998, Гольцев А.М., 2000, Geyer S.J., 1985, Fine А., 1994, і ін).

Це обумовлено тим, що ряд біологічних особливостей, властивих їм, наприклад, імунологічна індиферентність, могутня антиоксидантна дія, високі біосинтетичні можливості дозволяють розглядати їх як унікальні біопрепарати клінічного застосування (Рєпін В.С.1989, Троцький Дж., 1993, Акопян А., 1995, Брюховецький О.С., Кулаков В.І., 1996 і ін.).

Одним із перспективних аспектів використання фетальних тканин є їхнє застосування в гепатології, особливо при лікуванні захворювань, що супроводжуються гострою печінковою недостатністю (ГПН), летальність від якої, незважаючи на розвиток методів інтенсивної терапії, є великою. Вирішення проблеми багато дослідників убачають не тільки в застосуванні з цією метою трансплантації фетальної печінки, фрагментів тканини, але й отриманих з них гомогенатів, екстрактів, клітин, цитозольних чи пептидних фракцій і ін. (Бруслик В.Г., 1984, Маргуліс М.С. 1985, Субота Н.П., 1986, Єрин А.Н., 1996 і ін.) .

Препарати печінки плодів різних термінів гестації можуть бути використані як унікальні біологічні добавки до середовища гіпотермічного зберігання гепатоцитів та дифузійних розчинів при проведенні "клітинних діалізів", у біосистемі "штучна печінка" чи в консервуючих розчинах при гіпотермічному збереженні печінки (Онищенко М.О., 1990, Субота Н.П., Грищенко В.І., 1996).

Не менш важливою задачею гепотологів є дослідження механізмів дії фетальних препаратів, введених в організм при різних патологічних станах. Вирішення цього питання вимагає вивчення якісного складу і кількісного вмісту сполук біологічно активних речовин, зокрема – білків, гормонів, що входять у препарати та обумовлюють їхній сумарний ефект при клінічному використанні.

Нетривалий час зберігання біопрепаратів, у тому числі і фетальних, після виділення з тканин, обмежує їхнє широке використання в медицині, біології і фармакології і вимагає розробки надійних біотехнологій одержання й консервування із збереженням біологічних властивостей.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами: Робота виконана у відділі кріобіології системи репродукції і біохімії холодової адаптації в рамках планових тем ІПКіК НАН України: "Вивчення механізмів підвищення фертильності гамет і стійкості фетальних клітин людини і тварин при дії низьких температур у поєднанні з фізичними й хімічними факторами" (1996-2000 рр.), державна реєстрація № 0100U000408 і "Дослідження біологічних властивостей консервованих фетальних кріоекстрактів (8-12 тижнів гестації)" (2000-2001 рр.), державна реєстрація № 0101U003475.

Мета і задачі дослідження. Метою роботи було порівняльне дослідження впливу кріоконсервованих фетальних препаратів, одержаних з печінки (КП), мозкової тканини (КМ), плоду (ТФП) і хоріона (КХ) людини на функціональні властивості ізольованих гепатоцитів при гіпотермічному зберіганні та у складі органа при отруєнні пацюків CCl4.

У задачі роботи входило:

1.

2.

3.

Об'єкт дослідження – циклічне заморожування-відігрівання фетальних тканин, тривале гіпотермічне зберігання ізольованих гепатоцитів щурів у розчинах з вмістом кріоконсервованих фетальних препаратів, відновлювальні процеси у печінці щурів з отруєнням ССl4 під впливом кріоконсервованих фетальних препаратів.

Предмет дослідження. Якісний і кількісний вміст білків і гормонів у кріоконсервованих (-196 0С) препаратах, отриманих з фетальних тканин різного гістогенезу після циклічного заморожування-відігрівання.

Функціональний стан гепатоцитів у присутності різних фетальних кріоконсервованих препаратів в умовах гіпотермічного зберігання.

Біохімічні показники в печінці і плазмі крови пацюків при отруєнні CCl4 і дії кріоконсервованих (–196 0С) препаратів (гомогенати, екстракти, гепатоцити, цитозольні і пептидні фракції), отриманих із плодів людини 10 чи 24-х тижнів гестації.

Наукова новизна. Уперше проведене порівняльне вивчення дії низьких температур на здатність кріоконсервованих препаратів, виділених з фетальних тканин різних термінів гестації плоду (10 і 24 тижня), відновлювати функціональні властивості гепатоцитів з різним вихідним статусом.

Уперше в порівняльному аспекті досліджено вплив циклічного заморожування-відігрівання фетальних тканин різного гістогенезу на вміст біологічно активних сполук - білків і гормонів, в отриманих з них екстрактах.

Уперше проведене порівняльне вивчення поєднаної дії гіпотермічних умов зберігання і кріоконсервованих препаратів, отриманих із плодів людини 10 тижнів гестації (печінка, мозкова тканина, тотальний препарат, хоріон) на функціональний стан ізольованих гепатоцитів у динаміці й показано, що при апробованих умовах біодобавки у вигляді екстрактів фетальних тканин пролонгують зберігання їхньої життєздатності. При цьому інтенсивність виключення суправітального барвника, включення міченої амінокислоти в сумарні білки і флуоресценції потенціалзалежного зонду ДСМ в ізольованих гепатоцитах є максимальними у випадку присутності в середовищі біодобавки у вигляді екстракту фетальної печінки. Виділені з екстракту печінки фракції, що містять низько- чи високо молекулярні речовини, у тому числі білки, виявились малоефективними.

Вперше в порівняльному аспекті вивчена ефективність дії кріоконсервованих препаратів печінки в залежності від термінів гестації плодів (10 і 24 тижня), із яких їх одержали, на біохімічні показники, що є індикаторами функціонального стану гепатоцитів in vivo, а також термінів їхньої низькотемпературної консервації і введення в організм на відновлювальні процеси в печінці реципієнта при отруєнні CCl4. Показано, що найбільш виражене зниження показників активності процесів перекисного окислення ліпідів, ступеня цитолізу гепатоцитів, накопичення токсичних продуктів обміну пігментів і активація антиокисної активності відбуваються при введенні тваринам кріоконсервованого препарату у вигляді екстракту печінки плоду 10 тижнів гестації.

Показано, що використана біотехнологія одержання препаратів, що включає одним з етапів кріоконсервування на протязі 2,5 років при -196 0С, дозволяє зберігати їхні біологічні властивості, що виражається в пролонгуванні життєздатності ізольованих гепатоцитів при гіпотермічному зберіганні і прискоренні відновлювальних процесів у печінці після отруєння CCl4. Ефективність препаратів більш виражена на етапах, що випереджають розвиток ГПН.

Практичне значення отриманих результатів. Розроблена біотехнологія одержання фетальних препаратів, що включає циклічне заморожування-відігрівання в середовищі з 0,9 % NaCl дозволяє екстрагувати з фетальних тканин біологічно активні сполуки, що містяться в них згідно гістогенезу і зберігати їхні властивості після тривалого низькотемпературного зберігання при -196 0С.

Отримані експериментальні дані про динаміку виключення трипанового синього, стан системи біосинтезу білка і біоенергетики гепатоцитів при гіпотермічному зберіганні при наявності фетальних препаратів можуть бути використані для удосконалення існуючих консервуючих розчинів клітинних суспензій [4], у трансплантології на етапі гіпотермічного зберігання донорської печінки, а також як компоненти біосистеми "штучна біопечінка" чи біологічних дифузійних розчинів при проведенні діалізів, у тому числі і клітинних.

Експериментальні дані про біологічну дію кріоконсервованих фетальних препаратів [5], у тому числі при експериментальній ГПН, можуть бути взяті за основу для подальших розробок щодо їх клінічного використання.

Показаний різний якісний склад і кількісний вміст досліджених біологічно активних сполук у складі фетальних екстрактів дозволяє прогнозувати можливий механізм їхньої дії при клінічному використанні. Наприклад, препарати з високим вмістом низькомолекулярних речовин переважно використовуються з метою детоксикації, а з високим вмістом стероїдних гормонів - при хронічних запальних процесах різної етіології і т.д.

Включення фетальних препаратів, що містять гормони, у курс комплексної терапії пацієнтів з ендокринною патологією, дозволить, очевидно, значно знизити ефективне дозування основного гормонального засобу.

Збереження біологічних властивостей фетальних препаратів після тривалого (2,5 роки) низькотемпературного зберігання (-196 0С) дає можливість рекомендувати розроблену біотехнологію одержання препаратів з фетальних тканин різного гістогенезу, що включає одним з етапів циклічне заморожування-відігрівання, як надійну й економічно вигідну при створенні низькотемпературного банку препаратів клінічного профілю "до запитання" в гепатології.

Розроблено рекомендації з одержання, низькотемпературного зберігання і застосування фетальних препаратів.

Теоретичні положення і практичні рекомендації, отримані при виконанні дисертаційної роботи, введені в навчальний процес кафедр Харківського державного медичного університету і Харківської медичної академії післядипломної освіти.

Особистий внесок здобувача. Автором дисертаційної роботи самостійно проаналізовані дані літератури щодо дослідженої проблеми, сформульовані мета і задачі дослідження, а також способи їх розв'язання. Автором особисто отримані експериментальні дані з усіх розділів досліджень, проведена їхня статистична обробка і зроблені попередні висновки. Автором роботи разом з науковим керівником були інтерпретовані отримані результати і зроблені остаточні висновки.

Апробація результатів дисертації. Матеріали дисертаційної роботи доповідались та обговорювались на VII Укр. біохім. з'їзді, (м. Київ, Україна, 1997 р.), 34 Міжнародному конгресі з кріобіології (м. Барселона, Іспанія, 1997), Міжнародній конференції "Криопротектори в медицине" (м. Градець-Кралов, Чехія, 1997), спільному засіданні Європейської асоціації тканинних банків і асоціації з трансплантації кісткових м'язів (м. Турку, Фінляндія, 1998), 1 конгресі гепатологів України (м. Київ, Україна, 1998), 36 Міжнародному конгресі з кріобіології (м. Марсель, Франція, 1999), науковой конференції "Научное наследие академика И.Н. Буланкина и его развитие в современной биохимии", присвяченої 100-річчю з дня народження академіка І.М. Буланкіна (2000, Харків), науково-практичної конференції "Клеточная и тканевая трансплантология" (Запорожжя, 2001), V Міжнародній медичній конференції молодих учених (Тернопіль. 2001).

Публікації. За матеріалами дисертаційної роботи опубліковано 7 статей у провідних фахових журналах, 11 тез, отримано 2 патенти України, видані методичні рекомендації.

Обсяг і структура роботи. Дисертаційна робота викладена на 145 сторінках, складається з вступу, огляду літератури, опису матеріалів і методів дослідження, з трьох глав власних досліджень, аналізу й узагальнення отриманих результатів, висновків і списку використаних джерел (130 найменувань на 14 сторінках), містить 12 таблиць, 14 рисунків.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

У вступі обґрунтована актуальність обраної теми роботи, сформульовані цілі і задачі досліджень, визначені наукова новизна і практичне значення отриманих результатів, приведена загальна характеристика дисертаційної роботи.

У розділі 1 дано огляд літератури за темою досліджень. За структурою він містить два підрозділи.

У першому підрозділі детально розглянуті біологічні властивості, кріочутливість, а також експериментальні і клінічні дослідження ефективності застосування фетальних тканин людини і тварин при різних патологічних станах. Проаналізовано літературні дані щодо залежності біологічної активності тканин різного гістогенезу й отриманих з них препаратів (гомогенати, екстракти, клітини, цитозольні чи пептидні фракції) від наявності різних біоактивних сполук (цитокіни, тканинні гормони, олігонуклеотиди, диференційні антигени, проміжні продукти циклу трикарбонових кислот і т.д.).

У другому підрозділі літературного огляду розглянуто дію низьких температур і біологічно активних сполук на функціональні властивості гепатоцитів. Проведено аналіз композиційного складу середовища, використаного для інкубації, гіпотермічного і низькотемпературного зберігання гепатоцитів.

Показано, що біостимулююча, антиоксидантна, гепатопротекторна і протизапальна дія фетальних препаратів може бути реалізована не тільки при лікуванні цілого ряду патологічних станів організму, але і при їхньому використанні як ефективних біодобавок при формуванні композиційного складу регенеруючих та консервуючих середовищ.

Розділ 2 містить характеристику об'єктів і методик дослідження.

Методи дослідження. З метою поділу фетальних екстрактів на фракції речовин різних молекулярних мас, використовували метод гель-проникної хроматографії (сефадекс G-100).

Вміст білка визначали за методом Лоурі (Lowry O. et al, 1951), а також Варбурга і Крістіана (1941).

Спектральні характеристики білкових фракцій в екстрактах оцінювали, досліджуючи власну флуоресценцію, а також - у присутності флуоресцентного зонда - 4-(n-діметил-аміностирил)-1-метилпірідінію (ДСМ) з наступним комп'ютерним аналізом спектрів флуоресценції на ЕОМ (Горбєнко Г.П., 1998).

Вміст статевих стероїдних гормонів прогестерону та естрадіолу визначали радіоімунологічним методом, а пролактину і хоріонічного гонадотропіну – імуноферментним методом.

Функціональний стан ізольованих гепатоцитів у динаміці при гіпотермічному зберіганні в присутності кріоконсервованих фетальних препаратів (стандартизованих за вмістом білка) оцінювали за виключенням клітинами барвника трипанового синього (Seglen P.O. 1976), за інтенсивністю включення міченої амінокислоти 14С-лейцину в сумарні білки гепатоцитів і накопичуванню потенціалзалежного флуоресцентного зонда-катіона ДСМ (Добрєцов Г.Є., 1981).

Інтенсивність процесів ПОЛ у печінці після отруєння пацюків CCl4 і введення кріоконсервованих фетальних препаратів і гепатоцитів (вміст життєздатних клітин - 2106 в 1,0 мл) контролювали за накопиченням ТБК-активних продуктів (малоновий діальдегід - МДА) (Стальная І.Д., 1977), а стан антиокисної системи - по вимірі активності ферментів супероксиддисмутази (СОД) і каталази (Дісордисеску П., 1963). Про накопичення токсичних продуктів обміну пігментів судили за вмістом у плазмі крові білірубіну (В.В. Меншиков,1987). Активність ферментів аланін- і аспартатамінотрансфераз (АлАт і АсАт) у плазмі крові визначали за Рейтманом і Френкелем, активність лужної фосфатази (ЛФ). - як описано у роботі (В.В. Меншиков,1987).

Контрольним тваринам вводили 1,0 мл фізіологічного розчину.

Кріобіологічна постановка експерименту включала: використання швидкого одноетапного заморожування фетальних тканин у середовищі з 0,9 % NaCl, з наступним застосуванням декількох циклів заморожування-відігрівання, відповідно до розробленої біотехнології одержання фетальних екстрактів [1], гіпотермічне (+2?4 0С) зберігання (до 72 годин) гепатоцитів у присутності кріоконсервованих екстрактів фетальних тканин і фракцій речовин різних молекулярних мас, отриманих з них.

Для консервування гепатоцитів використано комбінований режим заморожування в присутності 10% ДМСО, для консервування фетальних препаратів – швидкий одноетапний режим заморожування в середовищі без кріопротектора. Усі кріоконсервовані препарати зберігалися в умовах низькотемпературного банку (–196 0С) від 0 до 2,5 років.

Статистичну обробку результатів досліджень проводили параметричним методом з використанням t-критерію Ст’юдента на ЕОМ IВМ АТ 486. Для розрахунків використовували комп'ютерну програму Excel (Microsoft, USA).

У 3 розділі наведені порівняльні результати впливу кріотехнологічного циклу одержання препаратів у залежності від гістогенезу фетальних тканин на вміст у них біологічно активних сполук - білків і гормонів.

По сумарному вмісту білка (табл. 1) кріоконсервовані екстракти, отримані з фетальних тканин різного гістогенезу, можна розташувати в такий спосіб: КХ > КМ > ТФП > КП.

Кількісний і якісний вміст білків та їхній розподіл у фракціях речовин різних молекулярних мас, виділених із кріоконсервованих екстрактів, отриманих після циклічного заморожування відігрівання, є різним (рис 1).

Рис.1. Вміст білка у фракціях різних молекулярних мас, одержаних із фетальних препаратів

Отримані препарати характеризувалися також різним якісним складом і кількісним вмістом стероїдних статевих гормонів та гормонів, що містять білок (табл. 1).

Таблиця 1

Вміст білків і гормонів у кріоконсервованих екстрактах фетальних тканин

n=7

Вид | Склад білка

мг/мол | ХГ,

МО/л | Пролактин,

МО/л | Прогестерон

нмоль/л | Естрадіол,

нмоль/л

КХ | 1,20±0,08 | 60 200±6 250 | 124,90 ± 11,62 | 77,70 ± 6,43 | 6,28 ± 0,58*

ТФП | 0,53±0,03* | 96 600±9 400* | 1104,00±102,42** | 92,60±8,50## | 40,8±3,91**

КП | 0,39±0,01* | --- | --- | 5,40 ± 0,67** | 10,4 ± 1,07*

КМ | 0,74±0,04* | --- | 100,6 ± 10,33# | --- | 3,34±0,31**

* - р < 0,05; ** - р < 0,001; # - р < 0,05; між вмістом гормонів і білків певного виду в зразках у порівнянні з КХ

Для з'ясування в порівняльному аспекті якісних особливостей препаратів, а також отриманих з них фракцій різних молекулярних мас, були досліджені їхні спектральні характеристики. Порівнювали показники власної флуоресценції, а також у присутності зонда ДСМ фракцій з низьким, середнім і високим вмістом білка (рис. 2), що були отримані з кріоконсервованих екстрактів печінки і хоріона.

Рис. 2. Спектри власної флуоресценції білка у фракціях 4, 7, 9, 12 КХ при ?возб = 280 нм

Особливості сумарного білкового і гормонального складу, а також спектральних характеристик білків фракцій різних молекулярних мас у фетальних препаратах, можуть бути використані при стандартизації біогенних стимуляторів і сертифікації їх видової і тканинної приналежності.

При цьому можна припускати, що кожний із препаратів, володіючи специфічністю у відношенні складу біологічно активних сполук, при введенні в організм буде по різному впливати на інтенсивність метаболічних процесів.

У розділі 4 наведені експериментальні результати дослідження впливу умов гіпотермічного зберігання (+2?4 0С) і кріоконсервованих фетальних екстрактів із тканин різного гістогенезу на зберігання ізольованих гепатоцитів in vitro у динаміці: 0-24-48 і 72 годин (табл. 2).

Показано, що при апробованих умовах гіпотермічного зберігання гепатоцитів здатність виключати трипановий синій, включати мічену амінокислоту і накопичувати потенціалзалежний зонд ДСМ були найбільш високими у середовищі, що містить біодобавки у вигляді КП і ТФП. Використання КМ як компоненту середовища було не ефективним, також як і низько - чи високомолекулярних фракцій з екстрактів фетальних тканин. Це доводить, що дія фетальних препаратів обумовлена всім спектром біологічно активних сполук, що входять до їх складу.

Таблиця 2

Динаміка включення мічених амінокислот у сумарні білки гепатоцитів при гіпотермічному зберіганні в середовищах різного композиційного складу

n=7

Середовище зберігання | Час зберігання, год

0 | 24 | 48 | 72

імп/хв

Контрольне середовище (1) | 48 068 ± 2000 | 38 090 ± 1600 | 24 037 ± 1600 | 18 500 ± 1600

Середовище (1) + ТФП | 48 430 ± 2200 | 40 504 ± 1800 | 39 230 ± 1300 | 26 184 ± 1450

Середовище (1) + КП | 48 500 ± 2100 | 39 600 ± 1800 | 39 500 ± 1840 | 25 600 ± 1500

Середовище (1) + КМ | 48 100 ± 2100 | 32 300 ± 1500 | 28 000 ± 1660 | 18 000 ± 1400

Середовище (1) + КХ | 48 070 ± 2150 | 40 070 ± 1680 | 40 420 ± 1400 | 22 270 ± 1600

Розходження є достовірними у порівнянні з 0 ч, р < 0,05

Розходження є достовірними у порівнянні з контрольним середовищем, р < 0,05

Таблиця 3

Вплив кріоконсервованих фетальних препаратів різного рівня біологічної організації на біохімічні показники у плазмі крові і печінки пацюків через 72 години після отруєння тварин CCl4

n=12

Вид препарату | Плазма крові | Печінка

Білірубін, мкмоль/л | ЛФ,

ОД/л | СОД,

мкмоль/

год на мг білка | МДА,

мкмоль/г

Отруєння CCl4 без введення препаратів | 30,562,8 | 623,0044,8 | 0,180

0,010 | 282,00

8,60

Препарати печінки плоду 24 тижнів гестації

Гомогенат | 20,001,50* | 302,4015,12** | 0,368

0,029* | 181,20

9,06*

Гепатоцити | 19,300,97** | 280,6014,03** | 0,364

0,029* | 172,70

10,16*

Цитозольна фракція | 19,000,95* *# | 260,0013,5**## | 0,402

0,032*# | 184,50

14,76*##

Препарати печінки і плоду 10 тижнів гестації

Екстракт печінки | 17,500,88** | 220,2011,45** | 0,430

0,034* | 141,25

9,83*

Високомолекулярні фракції з екстракту печінки | 28,001,40# | 580,0029,00# | 0,230

0,018** | 260,00

13,94*

Низькомолекулярні фракції з екстракту печінки | 30,001,50# | 560,0028,00# | 0,204

0,016 | 227,00

11,27*

Тотальний екстракт плоду | 18,301,01**# | 228,0011,88**# | 0,360

0,029*# | 152,20

12,33*#

*-р < 0,01 у порівнянні з даними при отруєнні CCl4 без введення препаратів

**-р < 0,001 у порівнянні з даними при отруєнні CCl4 без введення препаратів

# - р > 0,05 у порівнянні з екстрактом печінки

## - р < 0,05 у порівнянні з екстрактом печінки

Таким чином, в умовах гіпотермічного зберігання гепатоцитів кріоконсервовані біологічні добавки, отримані з фетальних тканин людини у вигляді екстрактів, дозволяють пролонгувати їх функціональне зберігання до 72 годин. Найбільш ефективним було композиційне середовище, що містить біодобавку у вигляді екстракту фетальної печінки плоду 10 тижнів гестації.

У 5 розділі в порівняльному аспекті наведені експериментальні дані про здатність кріоконсервованих препаратів, одержаних із фетальної печінки плодів 10 і 24 тижнів гестації, відновлювати біохімічні процеси в печінці реципієнта при отруєнні CCl4 (табл. 3).

Показано, що при отруєнні тварин відбувається збільшення в плазмі крові активності ферментів АлАТ і АсАТ (показники цитолізу), ЛФ (глибина холестазу), концентрації білірубіну (накопичення продуктів обміну пігментів), а також зниження антиокисної активності (зниження активності СОД і каталази) і збільшення інтенсивності процесів ПОЛ (концентрація МДА) у печінці, що свідчить про глибокі зміни структури і функції гепатоцитів.

Як випливає з табл. 3, відновлювальний ефект введених кріоконсервованих фетальних препаратів залежав не тільки від їхнього виду, але і термінів розвитку плоду, із тканин якого їх одержували (10 і 24 тижні гестації).

Як і в модельних системах in vitro, високо- і/чи низькомолекулярні фракції, введені тваринам з отруєнням ССl4, були мало ефективними.

Представлені дані свідчать, що напевно, речовини які відповідають за відновні процеси в клітинах реципієнта при отруєнні ССl4 є однаковими: ефект не залежить від зберігання структурно-функціональної організації тканинних чи клітинних препаратів.

При цьому використання препаратів печінки у вигляді кріоконсервованих екстрактів було більш ефективним, ніж, наприклад, кріоконсервованих у середовищі з 10 % ДМСО ізольованих гепатоцитів. Препарати печінки плоду 10 тижнів гестації швидше відновлювали біохімічні процеси в організмі тварин з отруєнням ССl4, ніж отримані з печінки плоду 24 тижнів, а ефективність їхньої дії залежала від термінів введення (табл. 4).

Показано також, що тривале низькотемпературне зберігання протягом 2,5 років (табл. 5) не впливає на здатність фетальних екстрактів, отриманих з печінки плоду 10 тижнів гестації, відновлювати метаболізм ушкоджених клітин печінки реципієнта.

Таким чином, представлені дані свідчать про перспективність розробок в галузі нових кріобіологічних технологій, що дозволяють зберігати біологічні властивості препаратів, отриманих на основі фетальної сировини і прогнозувати, виходячи з розшифровки якісного і кількісного складу біоактивних речовин, які входять до них, механізм їхньої дії і розширити арсенал засобів, що використовуються у практичній медицині для реабілітації і лікування різних патологічних станів людини, у тому числі – захворюваннях печінки.

Таблиця 4

Вплив "фармакологічної підготовки" кріоконсервованими екстрактами фетальної печінки на біохімічні показники в плазмі крові та печінці через 72 години після отруєння тварин СCl4

n=7

Плазма крові | Печінка

АлАТ,

Мкмоль/год на 1 мл | АсАТ,

мкмоль/год на 1 мл | СОД,

мкмоль/год

на 1 мг білка | МДА,

Мкмоль/г

Тотальний екстракт плоду

2,10 0,15 | 1,40 0,08 | 0,43 0,027 | 145,2 7,5

Екстракт печінки

1,75 0,08 | 1,26 0,10 | 0,48 0,03 | 134,4 7,3

* р < 0,05 у порівнянні з показниками при введенні препаратів через 24 години після отруєння тварин ( див. табл. 3).

Таблиця 5

Вплив термінів низькотемпературного зберігання екстракту печінки плоду 10 тижнів гестації на біохімічні параметри крові та печінки пацюків з отруєнням CCl4

n=7

Терміни зберігання,

година/рік | Активність АлАТ у плазмі крові,

мкмоль/год на 1 мл | Активність СОД у печінці,

мкмоль/год на 1 мг білка

0,5 години | 2,00 0,10 | 0,430 0,034

1,0 рік | 1,90 0,08 | 0,390 0,040

2,5 роки | 1,92 + 0,09 | 0,400 0,038

р>0,05 у порівнянні з показниками в 0,5 години

Проведенні дослідження дозволяють вважати обґрунтованим необхідність створення банку тривалого зберігання кріоконсервованих фетальних екстрактів печінки з метою клінічного використання.

ВИСНОВКИ

Проведено комплексне порівняльне експериментальне дослідження дії кріоконсервованих фетальних препаратів, отриманих із тканин плоду людини 10 і 24 тижнів гестації з використанням нових кріобіологичних технологій на функціональні параметри гепатоцитів пацюків in vivo при отруєнні пацюків CСl4 і in vitro при гіпотермічному зберіганні.

1.

2.

3.

4.

5.

6.

СПИСОК ОПУБЛІКОВАНИХ РОБІТ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

1.

2.

3.

4.

5.

6.

7.

8.

9.

10.

АНОТАЦІЇ

Пашинський П.П. Вплив кріоконсервованих фетальних препаратів на функціональний стан гепатоцитів пацюків in vitro і in vivo. - Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 03.00.19 - кріобіологія і кріомедицина. - Інститут проблем кріобіології і кріомедицини НАН України, Харків - 2001.

У роботі вивчався вміст біологічно активних сполук (білків і гормонів), у фетальних препаратах, отриманих з плодів людини 10 тижнів гестації за допомогою розробленої кріобіотехнології, а також їх дія на функціональний стан гепатоцитів пацюків у модельних системах in vitro (при гіпотермічному зберіганні) та in vivo (при отруєнні тварин CCl4) в порівнянні с препаратами отриманими із печінкі плоду 24 тижнів гестації.

Показано, що кріоконсервовані екстракти, вилучені із фетальних тканин мають специфічність складу білків і гормонів, що дозволяє ідентифікувати і сертифікувати препарати, відповідно до їх тканинної і видової приналежності. Найбільш вираженою гепатопротекторною дією володіє препарат у вигляді екстракту, отриманий з фетальної печінки. Ефективність кріоконсервованих препаратів залежить від термінів гестації плоду. Екстракт, виділений з печінки плоду 10 тижнів гестації, має більш виражену відновлювальну та регулюючу дію на печінку, ніж препарати (гомогенат, гепатоцити, цитозольна фракція), отримані з печінки плоду 24 тижнів гестації, про що свідчать показники інтенсивності процесів ПОЛ, цитолізу (активність ферментів АлАт та АсАт) та антиокисної системи (активність ферментів СОД і каталази)

Препарати, що зберігаються протягом 2,5 років при низьких (-196 0С) температурах зберігають свої гепатопротекторні властивості, стимулюючи антиоксидантну і знижуючи цитолітичну активність ферментів.

Ключові слова: фетальні препарати, вміст білків і гормонів, кріоконсервування, гіпотермічне зберігання, ізольовані гепатоцити, функціональний стан.

Пашинский П.П. Влияние криоконсервированных фетальных препаратов на функциональное состояние гепатоцитов крыс in vitro и in vivo. - Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.19 - криобиология и криомедицина. - Институт проблем криобиологии и криомедицины НАН Украины, Харьков - 2001.

В работе изучалось содержание биологически активных соединений (белков и гормонов), в фетальных препаратах, полученных из плодов человека 10 недель гестации с помощью разработанной криобиотехнологии. Показано, что криоконсервированные экстракты, выделенные из фетальных тканей обладают специфичностью состава белков и гормонов, что позволяет идентифицировать и сертифицировать препараты, согласно их тканевой и видовой принадлежности.

Проведен сравнительный анализ сочетанного действия гипотермических условий хранения и криоконсервированных препаратов, полученных из плодов человека 10 недель гестации (печень, мозговая ткань, тотальный препарат, хорион) на функциональное состояние изолированных гепатоцитов в динамике и показано, что при апробированных условиях биодобавки в виде экстрактов фетальных тканей пролонгируют сохранение их жизнеспособности. При этом исключение суправитального красителя, включение меченой аминокислоты в суммарные белки и флуоресценция потенциалзависимого зонда ДСМ в изолированных гепатоцитах максимальны в случае присутствия в среде биодобавки в виде экстракта фетальной печени. Выделенные из экстракта печени фракции, содержащие низко- или высоко молекулярные вещества, в том числе белки, - малоэффективны.

Исследована эффективность действия криоконсервированных препаратов печени в зависимости от сроков гестации плодов (10 и 24 недели), из которых их получали, на биохимические показатели, являющиеся индикаторами функционального состояния гепатоцитов in vivo, а также сроков их низкотемпературной консервации и введения в организм на восстановительные процессы в печени реципиента при отравлении CCl4.

Наиболее выраженным гепатопротекторным действием обладает препарат в виде экстракта, полученный из фетальной печени. Эффективность препаратов зависит от сроков гестации плода. Экстракт, выделенный из печени плода 10 недель гестации, оказывает более выраженное восстанавливающее и регулирующее действие на печень, чем препараты (гомогенат, гепатоциты, цитозольная фракция), полученные из печени плода 24 недель гестации, о чем свидетельствуют показатели интенсивности процессов ПОЛ, цитолиза гепатоцитов (активность ферментов АлАт и АсАт) и антиокислительной системы (активность СОД и каталазы).

Показано, что введение криоконсервированных препаратов фетальной печени плода 10 недель гестации при отравлении животных CСl4 более эффективно на этапах, предшествующих развитию ОПН, позволяя в большей мере снизить в плазме крови активность ферментов цитолиза, активировать работу естественных антиокислительных систем, снизить интенсивность процессов перекисного окисления липидов.

Разработанная биотехнология получения фетальных препаратов, включающая циклическое замораживание-отогрев в среде с 0,9 % NaCl позволяет экстрагировать из фетальных тканей биологически активные соединения, содержащиеся в них согласно гистогенеза и сохранять их свойства после длительного низкотемпературного хранения при -196 0С.

Ключевые слова: фетальные препараты, содержание белков и гормонов, криоконсервирование, гипотермическое хранение, изолированные гепатоциты, функциональное состояние.

Pashinsky P.P. Effect of cryopreserved fetal preparations on functional state of rat hepatocytes in vitro and in vivo. - Manuscript.

Thesis for obtaining the degree of candidate of biological sciences (PhD equivalent) on the specialty of 03.00.19 – cryobiology and cryomedicine. - Institute for Problems of cryobiology and cryomedicine of the National Academy of Sciences of the Ukraine, Kharkov – 2001.

Content of biologically active compounds (proteins and hormones) in fetal preparations, derived from human fetuses of 10 gestation weeks by elaborated cryobiotechnology, as well as their effect on functional state of rat hepatocytes in model systems in vitro (under hypothermic storage) and in vivo (under animal poisoning with CCl4) in comparison with the preparations, obtained from the fetus liver of 24 weeks of gestation, were investigated in the work.

It was demonstrated, that cryopreserved extracts, isolated from fetal tissues, possessed the specificity of protein and hormones composition, that allowed to identify and certify the preparations according to their origin on tissue and species. The preparation, which is an extract, obtained from a fetal liver, possesses a manifested hepatoprotecting effect. Preparation efficiency depends on the gestation term of a fetus. The extract, isolated from a fetal liver of 10-weeks’ gestation term showed more manifested recovering and regulating effect on a liver in comparison with the preparations (homogenate, hepatocytes, cytosol fraction), obtained from the liver of 24-weeks’ embryo, the indices of LPO processes intensity, hepatocytes cytolysis (AlAT and AsAT enzyme activity) and antioxidative system (SOD and catalase activity) testified to this fact.

Preparations, stored within 2,5 years under low temperatures (-196 0C) kept their hepatoprotecting characteristics, stimulating by this antioxidative activity and reducing cytolytic enzymes one.

Key words: fetal preparations, content of proteins and hormones, cryopreservation, hypothermic storage, isolated hepatocytes, functional state.

Відповідний за випуск Г.О. Бабійчук

______________________________________________________________________________

Підписано до друку 11.09.2001 р. Формат 6090 1/16

Тираж 100 прим. Авт. арк. 0,9.

Надруковано в ПП ЦЕПП "Райдер", вул. Артема, 4,

Тел. 47-19-46, 43-17-57