НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ

ІНСТИТУТ МІКРОБІОЛОГІЇ І ВІРУСОЛОГІЇ ІМ. Д.К. ЗАБОЛОТНОГО

ПОЛІШКО ТЕТЯНА МИКОЛАЇВНА

УДК 579.222.6

ВПЛИВ ТРАНСПОРТУ ФАГОВОЇ ДНК

НА СТРУКТУРНО – ФУНКЦІОНАЛЬНІ ПОКАЗНИКИ БАКТЕРІАЛЬНОЇ КЛІТИНИ

03.00.07 –мікробіологія

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

КИЇВ - 2001

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана на кафедрі мікробіології і вірусології Дніпропетровського національного університету.

Науковий керівник: доктор біологічних наук, професор Вінніков Альберт Іванович, Дніпропетровський національний університет, завідувач кафедри мікробіології і вірусології

Офіційні опоненти: доктор біологічних наук, старший науковий співробітник Варбанець Людмила Дмитрівна, Інститут мікробіології і вірусології ім. Д.К. Заболотного НАН України, завідувач відділу біохімії мікроорганізмів

доктор медичних наук, професор Кременчуцький Геннадій Миколайович, Дніпропетровська державна медична академія, завідувач кафедри мікробіології, вірусології і імунології

Провідна установа: Інститут епідеміології та інфекційних хвороб ім. Л.В. Громашевського МОЗ України, м. Київ

Захист відбудеться “19” грудня 2001 р. о 1000 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д26.233.01 в Інституті мікробіології і вірусології ім. Д.К. Заболотного НАН України (03143, м. Київ, вул. Заболотного, 154)

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Інституту мікробіології і вірусології ім. Д.К. Заболотного НАН України (03143, м. Київ, вул. Заболотного, 154)

Автореферат дисертації розіслано "_19_" листопада 2001 р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради,

кандидат біологічних наук Пуріш Л.М.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Проблема стійкості до антибіотиків є актуальною як для теоретичної, так і для практичної мікробіології та медицини. Незважаючи на велику кількість досліджень у даній галузі, проблема ще не вирішена, тому що необхідне глибоке вивчення і розуміння механізмів виникнення і передачі антибіотикостійкості в популяціях мікроорганізмів. Відкриття і впровадження нових антибіотиків цілковито не вирішує проблему. Необхідні дослідження, пов`язані з пошуком і підбором факторів, які б знижували антибіотикостійкість, що у свою чергу створить нові можливості в раціональній терапії інфекційних захворювань. Особливу значимість це має стосовно патогенних штамів стафілокока, одного з основних збудників внутрішньолікарняної інфекції.

Як відомо, існують біохімічні механізми і генетичні фактори антибіотикостійкості. Виникнення стійкості до антибіотиків зв'язують або з мутаційними процесами, або з процесами генетичної рекомбінації. Установлено, що у стафілококів провідним процесом передачі генетичних детермінант антибіотикостійкості у природних умовах є загальна і специфічна трансдукція (Зуєва, 1980). Необхідно відзначити, що істотною стадією процесів генетичної рекомбінації є транспорт ДНК через цитоплазматичну мембрану бактеріальної клітини. Для пояснення механізму такого транспорту висувається кілька гіпотез. Найбільш доказовою вважається концепція Грінюса про векторальний переніс ДНК по градієнту електрохімічного потенціалу іонів водню при рівній участі двох компонентів протонрушійної сили: трансмембранної різниці електричних потенціалів і градієнта протонів. У той же час існують і інші припущення, наприклад про участь лише градієнта протонів у забезпеченні транслокації ДНК.

Що стосується стафілококів, то можна відзначити лише одиничні роботи, присвячені з'ясуванню механізмів і рушійних сил транслокації нуклеїнових кислот усередину клітин, і тому проблема вимагає глибокого системного вивчення.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами

Представлені дослідження є частиною роботи, проведеної на кафедрі мікробіології та вірусології Дніпропетровського національного університету в рамках програми НДР держбюджетної теми 01-11-97 “Дослідження особливостей метаболічних процесів мікроорганізмів і розробка технічних умов виробництва нових біологічно активних препаратів”, що координується планом науково-дослідних тем Міністерства освіти і науки України.

Мета і задачі досліджень

Метою нашої роботи було вивчення процесів, що відбуваються на мембранах лізогенних штамів стафілококів у ході транспорту фагової ДНК. Для досягнення мети необхідно було виконати такі завдання:

- вивчити основні параметри системи енергозабезпечення у досліджуваних лізогенних штамах стафілококів;

- визначити взаємозв'язок процесів транспорту фагової ДНК та енергетичної системи досліджуваних штамів стафілококів;

- дослідити зміни структурно - функціональних показників мембранного апарату стафілококів у ході фагової інфекції.

Об'єктом дослідження були штами Staphylococcus aureus, що містять плазміди стійкості до тетрацикліну і хлорамфеніколу, із музею культур кафедри мікробіології і вірусології Дніпропетровського національного університету та з колекції Інституту мікробіології і епідеміології ім. Гамалеї РАМН. У роботі також використаний стафілококовий бактеріофаг 52А з Міжнародного набору бактеріофагів.

Предметом досліджень були процеси, що відбуваються в мембранному апараті лізогенних штамів стафілококів у ході транслокації фагової ДНК усередину клітини.

Матеріали і методи досліджень. У роботі застосований ряд мікробіологічних і біохімічних методів досліджень, зокрема методи ідентифікації досліджуваних штамів стафілококів, одержання препаратів суспензії “спочиваючих” клітин, мембранних везикул, концентрованої суспензії бактеріофагів, визначення ефективності фаголізису. Енергетичні процеси і транспорт іонів вивчали на цілих клітинах та мембранних везикулах із застосуванням методу синтетичних проникаючих зондів, іон-селективних електродів і полярографічного методу. Внутрішньоклітинну концентрацію АТФ визначали методом Хемплінга, усі дані перераховувались на 1 мг білка. Отримані результати піддавалися статистичній обробці.

Наукова новизна одержаних результатів. Установлено, що лізогенні по фагу 52А штами стафілококів NT-1 (Tcr) і NC-1 (Cmr) утворюють у ході роботи дихального ланцюга і Н+–АТФази трансмембранну різницю електрохімічних потенціалів з орієнтацією електричного поля “мінус” усередині клітини і “плюс” усередині мембранних везикул стафілококів. Утворення АТФ відбувається ензиматичним шляхом у ході окисного і субстратного фосфорилування і при неензиматичній генерації при “іонному” фосфорилуванні.

Уперше показано, що транспорт фагової ДНК у клітини лізогенних штамів стафілокока залежить від енергії електрохімічного потенціалу іонів водню і внутрішньоклітинного пула АТФ.

Уперше встановлено, що у досліджуваних лізогенних штамах стафілокока транспорт ДНК залежить в основному від енергії трансмембранної різниці електричних потенціалів і, меншою мірою, від градієнта протонів.

Отримано експериментальне підтвердження, що транспорт фагової ДНК приводить до зміни мембранних ферментних систем: зняття трансмембранної різниці електричних потенціалів, роз'єднання окислювання і фосфорилування, підвищення проникності мембрани для протонів і ряду одновалентних катіонів.

Уперше встановлено, що в ході транслокації ДНК відбувається індукція потоків іонів водню, калію, натрію. Установлено, що динаміка транслокації фагової ДНК подібна динаміці транспорту канал-формуючого антибіотика граміцидину, що свідчить про формування каналу для транспорту ДНК через цитоплазматичну мембрану усередину клітини.

Практична значимість. Результати проведених досліджень можуть бути підставою для цілеспрямованого пошуку з'єднань, здатних вибірково пригнічувати транслокацію фагової ДНК у ході процесів трансдукції у стафілококів. Це один з напрямків підвищення ефективності антибіотикотерапії інфекційних захворювань стафілококової етіології, оскільки створює можливості для зниження ймовірності поширення генетичних детермінант стійкості до антибіотиків у популяціях стафілококів у природних умовах.

Особистий внесок здобувача. Робота виконана автором особисто на кафедрі мікробіології та вірусології Дніпропетровського національного університету під керівництвом доктора біологічних наук, професора А.І. Віннікова. Дослідження, проведені здобувачем при виконанні дисертаційної роботи, є продовженням тема-тики, яка виконується співробітниками кафедри мікробіології та вірусології ДНУ.

Експерименти по вивченню компонентів протонрушійної сили та електрогенних характеристик мембран стафілококів були виконані на кафедрі клітинної фізіології та імунології Московського державного університету за консультативною допомогою професора кафедри, доктора біологічних наук В.Д. Самуілова.

Особистий внесок автора у дисертаційну роботу полягав у визначенні методичних підходів та проведенні експериментальних досліджень, у статистичній обробці даних, аналізі та узгодженні отриманих результатів і в порівнянні їх з літературними матеріалами, у підготовці публікацій за результатами досліджень і їх представленні на наукових конференціях. Крім того, разом із науковим керівником проведено аналіз результатів, їх узагальнення та інтерпретацію.

Апробація результатів дисертації. Матеріали дисертації були представлені на X Міжнародному Біофізичному конгресі (Ванкувер, Канада, 1990), Міжнародній науковій конференції “Мембранна біоенергетика” (Москва, 1994), науково-практичній конференції Дніпропетровського держуніверситету за підсумками науково-дослідної роботи в 1996 р, (Дніпропетровськ, 1996), VII Українському Біохімічному з'їзді (Київ, 1997), II з'їзді Українського біофізичного товариства (Харків, 1998), II Міжнародній конференції “Біоресурси та віруси” (Київ, 1998), V Міжнародній конференції “Альянс Франсез” (Дніпропетровськ, 1998),

I Міжнародній конференції “Наука й освіта-98” Дніпропетровськ, 1998).

Матеріали дисертації також увійшли до ряду навчальних програм загальних і спеціальних курсів кафедри мікробіології і вірусології Дніпропетровського національного університету: “мікробіологія”, “вірусологія”, “біотехнологія”, “медична мікробіологія”, “фізико-хімічні методи досліджень”, “антибіотики”, “прикладна ензимологія”.

За темою дисертації опубліковано 10 наукових праць.

Структура та обсяг роботи. Дисертаційна робота викладена на 150 сторінках машинописного тексту і складається з розділів: “Вступ”, “Огляд літератури”, “Матеріали і методи досліджень”, “Результати досліджень та їх обговорення” (включає три розділи власних досліджень), “Висновки”, “Список використаних джерел”, який містить 225 посилань (з них 155 іноземних авторів). Роботу доповнюють 10 таблиць і 25 рисунків.

ОГЛЯД ЛІТЕРАТУРИ

Огляд літератури складається з 3 підрозділів, які містять сучасну інформацію про енергетичний обмін у стафілококів, зокрема аналіз катаболічних процесів, склад дихального ланцюга, особливості процесів трансформації енергії. Також розглядається хеміосмотична концепція транспорту нуклеїнових кислот у мікроорганізмів у процесах генетичної рекомбінації: трансформації, кон'югації, трансдукції. Здійснено аналіз біохімічних і генетичних механізмів стійкості бактерій до антибіотиків.

МАТЕРІАЛИ ТА МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ

Об'єктами досліджень були культури лізогенних штамів Staphylococcus aureus: NT–1 (Tcr) і NC–1 (Cmr), що містять фаг 52А як профаг і плазміди стійкості, відповідно до тетрацикліну і хлорамфеніколу. Штами отримані з музею культур кафедри мікробіології і вірусології Дніпропетровського національного університету і з колекції НДІ мікробіології і епідеміології ім. Гамалеї РАМН.

Застосований стафілококовий бактеріофаг 52А належить до сіркогрупи В, фагогрупи (літичної групи) I, морфогрупи 2.1, входить до складу Міжнародного набору бактеріофагів; серійні препарати отримані з НДІМЕ ім. Гамалеї РАМН.

Вивчення обмінних процесів проводилося на цілих клітинах стафілококів і фракції мембранних везикул.

Для культивування стафілококів використовували рідкі і тверді поживні середовища: бульйон Хоттінгера, м‘ясопептонний бульйон, м‘ясопептонний агар. При роботі з фагами до складу середовищ уводили СаСl2 у кінцевій концентрації 0,04 М. У ряді експериментів застосовували спеціальний фаговий буфер.

Клітини стафілококів вирощували до кінця логарифмічної фази росту при 37°С у стаціонарних умовах, потім клітини відокремлювали центрифугуванням при 5000 об/хв протягом 20 хвилин, двічі промивали і ресуспендували в буферному розчині.

Безклітинний гомогенат одержували в результаті ультразвукової обробки. Фракцію мембранних везикул отримували диференційним центрифугуванням. Інтенсивність дихання вивчалася полярографічним методом із застосуванням закритого платинового електрода Кларка.

Генерацію трансмембранної різниці електричних потенціалів вивчали за методом Liberman, Skulachev (1970) із застосуванням синтетичних проникаючих іонів: тетрафенілфосфонію (ТРР+) і тетрафенілборату (ТБ-). Калібрування величини, що реєструвалася, проводили за поглинанням іонів відповідно до рівняння Нернста.

При вивченні величини компонентів протонрушійної сили і рН на цілих клітинах стафілококів як зонди використовували іони ТРР+ і саліцилової кислоти (SAL-) та електроди, селективні по цих іонах, виготовлені в лабораторії Грінюса (1986). Інкубаційне середовище містило 40 мМ трис-НCl буфер чи 40 мМ МЕS буфер, залежно від мети експерименту. Розрахунок величин трансмембранної різниці електричних потенціалів () і градієнта концентрації протонів (рН) проводили згідно з рівняннями, запропонованими Грінюсом (1986), на підставі даних по розподілу ТРР+ і SAL– відповідно.

Інтенсивність флуоресценції АНС– вимірювали на флуориметрі Hitachi MPF-4 і спектрофотометрі Specord M-40.

Градієнтний потік К+ на цитоплазматичній мембрані клітин створювали додаванням валіноміцину, градієнт рН – внесенням у середовище НСl або трис- лугу. Транспорт К+, Na+ і Н+ у стафілококах вимірювали з застосуванням відповідних селективних електродів фірми Крітур. Вимірювальна схема включала іономер ЭВ-74 і самопис КСП-4 з вбудованою схемою компенсації.

Для визначення кількості АТФ, синтезованого при формуванні трансмембранного потенціалу чи градієнта рН, проводили екстракцію клітин 30%-ю трихлороцтовою кислотою за методом Коля і співавт. (1967). Кількість АТФ в екстрактах визначали за методом Хемплінга (1970) з використанням додаткової ферментативної системи, що містить гексокіназу і глюкозо-6-фосфатдегідрогеназу. Кількість АТФ розраховували за кількістю вимірюваного при 340 нм відновленого NАДФН. Концентрацію АТФ виражали в молярних одиницях, беручи за основу при розрахунках кількість внутрішньоклітинної води для стафілокока 1,55 мкл на 1 мг сухої ваги клітин, установленої Niven, Hamilton (1972).

Концентрації внесених субстратів, інгібіторів дихального ланцюга, протонофорних роз‘єднувачів та іонофорних антибіотиків наводяться в підписах до рисунків і таблиць.

Для вивчення транспорту фагової ДНК накопичення стафілококових фагів проводили шляхом їх розмноження на чутливих клітинах стафілококів при інкубуванні фагів у рідкому середовищі чи в м'якому 0,7% агарі методом агарових шарів за Граціа. Концентрування фагової суспензії проводили центрифугуванням при 5000 і 10000g. Стерилізацію фаголізатів здійснювали шляхом фільтрування через міліпорові фільтри (діаметр шпар 0,30 і 0,45 мкм).

Ефективність фагової інфекції оцінювали методом Граціа за кількістю негативних колоній, що утворилися на індикаторному газоні з клітин, у які проникла фагова ДНК. Множинність інфікування складала 0,1. Експериментально було встановлено, що час адсорбції дорівнював 5 хв, за цей період адсорбується 95% фагів.

У дослідах по вивченню впливу інгібіторів, роз‘єднувачів та іонофорних антибіотиків на ефективність фагової інфекції зазначені з'єднання вносилися: за 10 хвилин до інфікування; у момент інфікування; після періоду адсорбції, що складав 5 хвилин.

Застосовували такі інгібітори: інгібітор ланцюга переносу електронів – ціанистий калій (KCN) – 10-3М; інгібітор Н+-АТФази N1N1– дициклогексилкарбо-диїмід (ДЦКД) – 10-4М; протонофорний роз‘єднувач m-хлоркарбонілцианідфенілгідразон (ХКФ) – 10-5М; інгібітори перетворення глюкози катаболічним шляхом Ембдена-Мейєргофа-Парнаса фторид натрію (NaF) і монойодацетат (CH2ICOOH), інгібітор синтезу АТФ арсенат натрію (Na3AsО4) у концентраціях

10-3М.

У контрольних дослідах вивчали вплив застосовуваних речовин на інфекційну активність фагових часток і життєздатність клітин. Час інкубації з досліджуваними з'єднаннями фагів і клітин дорівнював часу контакту в досліджених пробах. Після цього визначали інфекційний титр фагів і кількість колоній стафілококів.

У дослідах по вивченню впливу фагів на процеси трансформації енергії суспензії фагів вносили безпосередньо у вимірювальні комірки.

На рисунках наводяться усереднені дані декількох визначень. Статистичну обробку результатів 3 - 5 експериментів проводили із застосуванням t-розподілу Стьюдента на 5%-ному рівні значимості (з коефіцієнтом надійності 0,95).

У дослідженнях використовувалися реактиви “Reanal” (Угорщина), “Sigma” (США), “Serva” (Німеччина), виробництва Росії та України.

РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ І ЇХ ОБГОВОРЕННЯ

1.Джерела конвертованої енергії у досліджуваних штамах стафілококів

З метою оцінки основних етапів трансформації енергії у досліджуваних штамах було проведено визначення основних генераторів і величин протонрушійної сили і її компонентів ( і рН), а також динаміка змін концентрації внутрішньоклітинної АТФ у ході “іонного” фосфорилування. Для реєстрації генерації протонрушійної сили був застосований метод виміру флуоресценції 8-аніліно-1-нафталінсульфонату (АНС-) на цілих клітинах і фракції мембранних везикул.

Слід зазначити, що квантовий вихід флуоресценції АНС– є сумарним проявом дії трансмембранного потенціалу () і мембранного градієнта протонів рН.

Інтенсивність флуоресценції АНС– інтактних клітин падає при наведенні різниці електрохімічних потенціалів під час додавання глюкози і зростає при знятті потенціалу поля під впливом ХКФ і КСN (рис.1).

Зворотна картина спостерігається в експериментах з використанням мембранних везикул. Орієнтація поля на мембранних везикулах “плюс” усередині приводить до того, що внесення субстратів НАДН+ і малату викликає наведення протонного електрохімічного потенціалу, що проявляється в підвищенні квантового виходу флуоресценції АНС–. У випадку внесення ХКФ чи КСN квантовий вихід флуоресценції падає, що вказує на дисипацію трансмембранної різниці електрохімічних потенціалів (рис. 2).

Рис.1. Залежність виходу флуоресценції АНС– від наведення різниці протонного електрохімічного потенціалу в інтактних клітинах стафілокока шт. NC-1 (Cmr)

Інкубаційне середовище: 50 мМ трис-сульфата, рН 7,4; 5 мМ MgSO4; 0,1 мМ АНС– і 3,0 мг клітин на 1 мл.

Додатки: 10 мМ глюкоза; 10-5 М ХКФ; 1 мМ КСN.

Для підтвердження отриманих даних були проведені експерименти по визначенню трансмембранної різниці електричних потенціалів. Визначення генерації трансмембранної різниці потенціалів проводили на цілих клітинах з використанням проникного катіона тетрафенілфосфонію (ТРР+) і мембранних везикулах із застосуванням проникного аніона тетрафенілборату (ТБ-).

Інтактні клітини стафілокока поглинають катіони ТРР+, що свідчить про орієнтацію трансмембранної різниці потенціалів “–” усередині клітини. На енергозалежний характер транспорту ТРР+ указує прискорення поглинання катіона при додаванні субстрату – глюкози. Зворотний вихід із клітини катіонів спостерігається при дії специфічних інгібіторів: протонофорного роз‘єднувача ХКФ, інгібітора Н+-АТФази – ДЦКД і інгібітора дихального ланцюга – КСN. Спостерігалося також незначне поглинання аніонів ТБ- у концентраціях, приблизно в 10 разів менших, ніж поглинання катіонів ТРР+. На відміну від цього мембранні везикули поглинають аніони ТБ-, що вказує на напрямок поляризації трансмембранного електричного поля: “+” усередині мембранних везикул і “-” зовні. Додавання субстрату НАДН+ приводить до поглинання додаткової порції аніонів ТБ-. Вихід із мембранних везикул аніонів пов'язаний з деенергізацією мембранних везикул. Цей процес відбувається при додаванні інгібітора дихального ланцюга КСN і протонофорного роз‘єднувача ХКФ. Додавання АТФ запускає в хід Н+-АТФазний комплекс, що приводить до поглинання ТБ-, а внесення інгібітора ДЦКД – до виходу аніонів з мембранних везикул.

Рис.2. Залежність виходу флуоресценції АНС– від наведення різниці протонного електрохімічного потенціалу в мембранних везикулах стафілокока, шт. NC-1 (Cmr)

Середовище інкубації: 50 мМ трис-сульфата, рН 7,4; 5 мМ MgSO4; 0,1 мМ АНС– і 2,5 мг білка мембранних везикул.

Додатки: 1 мМ НАДН+; 5 мМ малат; 10 мкМ ХКФ; 1 мМ КСN.

Крім того, відзначено поглинання мембранними везикулами катіонів ТРР+ у концентраціях, на порядок нижчих, ніж це відбувалося з аніонами ТБ-.

Таким чином, флуоресценція АНС- і трансмембранний електрофорез проникних іонів ТРР+ і ТБ- показали, що присутні два генератори трансмембранної різниці електричних потенціалів: Н+-АТФаза і дихальний ланцюг. Трансгідрогеназний комплекс не виявлений. Орієнтація електричного поля “мінус” усередині клітин і “плюс” усередині мембранних везикул.

У вивчених штамах стафілококів синтез АТФ також можливий і в ході “іонного” фосфорилування. Це було встановлено експериментами, при яких на мембрані клітин створювалися іонні градієнти. В одному випадку - градієнт іонів К+ з наступним додаванням валіноміцину, що викликає градієнтний потік іонів К+ із клітини і приводить до генерації , що потім трансформується в енергію АТФ. Приріст АТФ у цьому випадку складав 0,245 мМ за 30 сек. Далі створювали градієнтний потік рН. Це приводило до синтезу АТФ: 0,1 мМ за 30 сек.

Визначена величина генерованої і градієнта протонів у сумі складових протонрушійної сили на мембрані у досліджуваних штамах.

На рис.3 представлений вимір трансмембранної різниці електричних потенціалів за допомогою ТРР+- селективного електрода. При внесенні визначеної кількості ТРР+ у середовище відбувається перерозподіл іонів і встановлення рівноважних концентрацій. Внесення клітин стафілококів зумовлювало поглинання іонів ТРР+. Додавання граміцидину спричиняло утворення каналів і швидкий вихід іонів ТРР+ у середовище.

Рис.3. Вимірювання трансмембранної різниці електричних потенціалів за допомогою ТРР+ - селективного електрода у клітин стафілококів шт. NC-1 (Cmr)

Середовище інкубації: 40 мМ трис-НCl буфер, рН 7,0; 3 мМ MgCl2. Додатки: 1 мкМ ТРР+; 3,0 мг по сухій вазі інтактні клітини (1) і прокип’ячені (2). a – зміна показників ТРР+ – електрода при калібруванні, b – різниця показників ТРР+ – електрода, коли клітини знаходятся у нативному енергізованому стані та після неспецифічного поглинання ТРР+ клітинами, інактивованими у ході кип’ятіння.

Таким чином, спостерігалося утворення на мембрані клітин градієнта протонів “-” усередині, “+” зовні.

У такий спосіб визначали електричну складову протонрушійної сили - , а рН визначали за тією ж схемою із застосуванням іона SAL- і селективного по ньому електрода. Розрахунок величин і рН проводили відповідно до рівняння Нернста в модифікації, що відповідає умовам експерименту (Грінюс, 1986).

При визначенні величини компонентів протонрушійної сили (р): трансмембранної різниці електричних потенціалів і градієнта протонів при різних значеннях рН середовища інкубації, установлено, що величина зростає від 102 до 157 мВ, а величина рН зменшується від 89 до 37 мВ при збільшенні рН середовища інкубації від 5,0 до 8,0. Сумарне значення протонрушійної сили залишається незмінним у межах 191-194 мВ у діапазоні рН 5-8, що відповідає основним постулатам теорії Мітчелла.

Таким чином, очевидно, що у вивчених лізогенних штамах стафілококів присутні генератори протонрушійної сили – дихальний ланцюг і Н+-АТФаза, крім того, можливе наведення і рН, а потім синтез АТФ неензиматичним шляхом створення іонних градієнтів.

2. Взаємозв'язок процесів енергозабезпечення і транслокації фагової ДНК

у лізогенних штамах стафілококів

З метою визначення взаємозв'язку процесів енергозабезпечення і транслокації фагової ДНК через цитоплазматичну мембрану стафілококів нами проведені експерименти щодо впливу інгібіторів, які пригнічують різні складові системи енергозабезпечення, на ефективність фаголізису. Для цього застосовували інгібітори: ДЦКД, ХКФ, КСN. Їх вносили до експериментальних сумішів на різних етапах взаємодії фаг-бактерія, а саме: до внесення фага, у момент внесення фага і після періоду адсорбції, що складав 5 хвилин. Паралельно в кожнім досліді ставили контроль на активність фагів і на життєздатність клітин, щоб виключити неспецифічний вплив на досліджувані процеси. Крім того, визначено, що внесення інгібіторів практично не впливає на процеси адсорбції бактеріофагів.

Додавання інгібіторів у період контакту бактерій і фага приводить до вираженого зниження ефективності фагової інфекції. Так, КСN знизив ефективність інфікування на 51,3 – 55,0%, ДЦКД – на 60,9 - 63,2%, ХКФ, викликаючи дисипацію , інгібує інфікування на 67,2-69,2% (табл. 1). При внесенні інгібіторів через 5 хвилин після впровадження ДНК фагова інфекція пригнічується несуттєво.

Вплив речовин, що інгібують, носить специфічний характер і знижує ефективність фагової інфекції, якщо вони внесені в період контакту клітин з бактеріофагами на стадії транслокації фагової нуклеїнової кислоти.

Таблиця 1

Вплив інгібіторів КСN, ДЦКД і ХКФ на ефективність інфікування фагом 52А S.aureus

шт. NT-1 (Tcr) і шт. NC-1 (Cmr) (число інфікованих центрів 105/мл, n = 5)

Використовано довірчі інтервали значень з коефіцієнтом надійності 0,95. |

Інгібітори

Варіант

експерименту |

Штам |

Контроль |

КСN | % інгібу-

вання |

ДЦКД | % інгібу-

вання |

ХКФ | % інгібу-

вання

Внесення інгібітора

в період контакту

бактерій і фага |

шт. NT-1 (Tcr)

шт. NC-1 (Cmr) |

48129

48038 |

23434

21662 |

51,3

55,0 |

17742

187 31 |

63,2

60,9 |

14834

15728 |

69,2

67,2

Внесення інгібітора

через 5 хв після

інфікування |

шт. NT-1 (Tcr)

шт. NC-1 (Cmr) |

48129

48038 |

42935

41854 |

10,8

12,9 |

41745

424 20 |

13,4

11,6 |

42753

41256 |

11,3

14,1

Крім того, визначено залежність ефективності фагової інфекції від внутрішньоклітинних запасів АТФ. Про це свідчить пригнічення ефективності фагової інфекції при додаванні таких речовин, як арсенат натрію, фтористий натрій і монойодацетат. Вони пригнічують фагову інфекцію: Na3AsО4 - на 43,8%, NaF – на 22,9% і CH2JCOOH на 10,6% (табл. 2).

Таблиця 2

Вплив інгібіторів NaF, Na3AsO4 и CH2ICOOH на ефективність інфікування

фагом 52A S.aureus шт. NC-1 (Cmr) (число інфікованих центрів 105/мл, n = 5)

Використовано довірчі інтервали значень з коефіцієнтом надійності 0,95. |

CH2ICOOH | NaF | Na3AsO4

Варіант

експерименту | Конт-роль | З додат-ком

інгібітора | % інгі-

бу-

вання | Конт-роль | З додат-ком

інгібітора | % інгі-

бу-

вання | Конт-роль | З додат-ком

інгібітора | % інгі-

бу-

вання

Внесення

інгібітора в момент інфіку-

вання |

380

51 |

33925 |

10,6

1,0 |

360

43 |

29210 |

22,9

2,5 |

330

33 |

18541 |

43,8

5,9

Внесення інгі-бітора через 5 хв після інфікування |

380

51 |

35738 |

6,1

0,73 |

360

43 |

31034 |

13,4

0,6 |

330

33 |

24326 |

16,3

2,4

Для вивчення рушійних сил транслокації ДНК через цитоплазматичну мембрану застосовували іонофорні антибіотики – валіноміцин і нігерицин. Оскільки валіноміцин знижує величину трансмембранної різниці електричних потенціалів, а нігерицин – величину градієнта протонів, то при їх роздільному і спільному додаванні до суміші фаг-бактерія можна оцінити ефективність фагової інфекції від двох складових електрохімічного потенціалу іонів водню.

При вивченні впливу іонофорних антибіотиків на процес інфікування фагом у період контакту бактерій і фага встановлено, що при роздільному внесенні антибіотиків нігерицин не справляє істотного інгібуючого впливу на процес інфікування, а валіноміцин істотно знижує ефективність інфікування на 32,5%. При спільному додаванні валіноміцину і нігерицину інгібуючий ефект досягає 42,2%.

Таблиця 3

Вплив іонофорних антибіотиків на ефективність інфікування фагом 52А клітин S.aureus

шт. NT-1 (Tcr) і NC-1 (Cmr) у період контакту (число інфікованих центрів 105/мл, n=5)

Використовано довірчі інтервали значень з коефіцієнтом надійності 0,95. |

NT–1 (Тcr) | NС–1 (Сmr)

Антибіотик | Концен-

трація,

мкМ | Контроль

(без анти-біотика) | Дослід | % інги-

бування | Контроль

(без анти-біотика) | Дослід | % інги-

бування

Валіноміцин | 0,1

0,5 | 120,010

116,09 | 95,47

80,910 | 20,5

30,2 | 125,09

121,19 | 98,310

81,710 | 21,4

32,5

Нігерицин | 2,5

12,0 | 171,07

172,03 | 151,15

148,08 | 11,7

14,0 | 184,06

180,13 | 163,32

153,24 | 11,9

15,3

Валіноміцин

+

Нігерицин | 0,1

2,5 |

120,09 |

69,98 |

41,7 |

128,02 |

42,2

Валіноміцин

+

Нігерицин | 0,5

12,0 |

110,09 |

28,13 |

74,5 |

117,24 |

73,93 |

75,3

При збільшенні концентрації валіноміцину до 0,5 мкМ і нігерицину до 12 мкМ пригнічення інфікування відбувається на 75,3%. Це свідчить про те, що тільки одночасне зниження величин і рН приводить до зменшення кількості інфікованих клітин стафілококів, але на досліджуваних штамах очевидна переважна роль трансмембранної різниці потенціалів у забезпеченні транспорту фагової ДНК (табл. 3).

Після введення фагової ДНК валіноміцин і нігерицин, як у випадку роздільного, так і спільного додавання, практично не впливають на процес інфікування. Пригнічення досягає 5,4%. Слід зазначити, що іонофорні антибіотики в застосовуваних концентраціях не справляли інгібуючого впливу на життєздатність клітин досліджуваних штамів та активність фагових часток.

Для обґрунтування специфічного характеру впливу валіноміцину і нігерицину на енергетичні параметри стафілококів, вивчався вплив іонофорних антибіотиків на трансмембранний потенціал і концентраційний градієнт протонів у клітин досліджуваних штамів. При вимірі різниці електричних потенціалів валіноміцин і нігерицин вносили в концентраціях, які при спільному додаванні антибіотиків пригнічували фагову інфекцію на 75,3%.

На рис. 4 представлені дані щодо впливу валіноміцина на поглинання іонів ТРР+ інтактними клітинами стафілококів. Додавання клітин викликає поглинання ТРР+ до встановлення рівноважного стану. Це вказує на наявність трансмембранної різниці електричних потенціалів. Дрібне й одномиттєве внесення валіноміцина в концентрації 0,5 мкМ викликає різке падіння величини , що виражається у виході іонів ТРР+ із клітини.

Рис.4. Вплив валіноміцину на поглинання іонів ТРР+ клітинами S.aureus

шт. NC-1 (Cmr )

Середовише інкубації: 40 мМ трис-HCI-буфер, pH 7,0; 4 мМ MgCl2; 100 мМ KCl;

2,0 мкМ ТРР+. Додатки: інтактні клітини стафілококів в концентрації 2,1 мг білка; валіноміцин:

А – дрібне внесення, Б – одномиттєве внесення; 1 – 0,1 мкМ;

2 – 0,2 мкМ; 3 – 0,2 мкМ; 4 – 0,5 мкМ.

Аналогічні результати були отримані з нігерицином.

Проведені експерименти вказують на специфічний характер впливу валіноміцину і нігерицину на енергетичні параметри клітин стафілококів і, певно, на те, що отримані дані узгоджуються з основною концепцією Грінюса про участь обох компонентів протонрушійної сили в транслокації фагової ДНК. Визначено також залежність транспорту фагової ДНК від внутрішньоклітинного пула АТФ. У той же час на лізогенних штамах стафілококів різниця електричних потенціалів є переважним компонентом у забезпеченні транспорту фагової ДНК. Ефективність фагової інфекції залежить від величини мембранного потенціалу.

3. Вплив фагової інфекції на структурно-функціональні показники бактеріальної клітини

Процеси транслокації ДНК є складними фізико-хімічними процесами, у яких активну участь повинні брати ферментативні системи цитоплазматичної мембрани бактеріальної клітини. Вважалося за необхідне визначити, яким чином транслокація фагової ДНК впливає на структурно-функціональні параметри мембрани клітин. Для цього вивчали вплив фагової інфекції на величину трансмембранної різниці електричних потенціалів клітин стафілококів при трансмембранному розподілі проникаючих катіонів ТРР+ (рис. 5).

Рис.5. Вплив фага 52А на різницю електричних потенціалів стафілококів

шт. NT-1 (Tcr)

Середовище інкубації: 40 мМ трис-HCl буфер, рН 7,4; 3 мМ MgCl2; 1 мкМ ТРР+.

Додатки: 5108 клітин в 1 мл; глюкоза 1мМ, фаг 52А при множинності інфікування 0,1 і 1,0.

Додавання глюкози енергізує клітини, величина мембранного потенціалу різко збільшується. При встановленні стаціонарної величини потенціалу внесення фага викликає оборотну деполяризацію клітин, при цьому трансмембранний потенціал знижується на 12-15 мВ. Більше значення множинності інфікування викликає більше зниження величини трансмембранного потенціалу. Таким чином, очевидно, що деполяризація і роз'єднувальний ефект, що спостерігається, обумовлені зниженням рівня внутрішньоклітинного АТФ і викликані специфічною взаємодією фага з мембраною клітини.

Оскільки роз'єднувальний ефект, викликаний протонофорними речовинами, приводить до стимуляції клітинного дихання, виникла потреба у вивченні впливу фагової інфекції на окисну активність клітин стафілококів. Первісне додавання клітин в експериментальну суміш забезпечує дихання зі швидкістю 10 нмолей О2 за хвилину на мг білка, подальше внесення фага приводить до оборотного зростання швидкості дихання в 3,2 рази, наступне додавання фага ще суттєвіше збільшує швидкість споживання кисню – у 3,5 рази (у порівнянні з початковою). При додаванні роз'єднувача ХКФ до внесення фага швидкість дихання різко збільшується, подальше внесення фага ефекту не викликає. Якщо ж ХКФ додавати після внесення фага, то відбувається досить сильна (у порівнянні з початковою) стимуляція дихання: у 1,7 рази. Це створює не лише протонофорний роз'єднувач ХКФ, але й інший представник класу протонофорних роз'єднувачів - -динітро-фенол. Його додавання після внесення фага викликає різку необоротну стимуляцію швидкості дихання клітин у 1,5 разів. Таким чином, показано, що вплив фагової інфекції і процеси, що відбуваються при цьому, стимуляція дихання і дисипація мембранного потенціалу, указують на подібність дії фага з ХКФ та -ДНФ.

Поряд зі стимуляцією клітинного дихання спостерігається стимуляція іонних потоків: вихід К+ із клітини, вхід Н+ і Na+ у клітину.

Для оцінки кількісної динаміки виходу протонів були проведені експерименти стосовно впливу фагової інфекції на електрогенний протонний насос.

Рис.6. Вплив фага 52А на мембранний потенціал і на протонний насос (Н+/O) клітин стафілокока шт. NT-1 (Tcr)

Середовище інкубації: 0,1 М MOPS - буфер, рН 6,5; 0,1 М KCl; 1 мкМ ТРР+. Концентрація стафілококів 5108 клітин в 1 мл; а – без фага; б – в присутності фага, при множинності інфікування 4.

Додатки: Н2О в об’ємі 20 мкл, який містить 5,5 нмоль О2.

На діаграмі а (рис.6) представлений контроль (без фага), на діаграмі б - з додаванням фага. Без додавання фага співвідношення Н+/О дорівнює 0,8. Це співвідношення характеризує як інтенсивність дихання, так і динаміку утворення , тому що визначається, скільки протонів вийшло з клітини. Очевидно, що при внесенні фага присутня стимуляція електрогенного протонного насоса - фаг індукує посилення електрогенного насоса від 0,8 до 3,0. Це дозволяє припустити думку про існування каналу, у який протони можуть виходити і збільшувати цим величину відношення Н+/О.

На підставі отриманих результатів вважалося за доцільне визначити динаміку транслокації протонів через ЦПМ у нормі та у присутності фага (рис.7). В анаеробних умовах до суспензії клітин додавали таку кількість соляної кислоти, щоб знизити рН середовища на 0,1 одиниці.

Рис.7. Вплив фага 52А на динаміку транслокації протонів через мембрану клітин стафілокока шт. NT–1 (Tcr).

Середовище інкубації: 0,3 м KCl і 50 мМ KSCN, клітини в концентрації 109 в 1 мл.

Додатки: HCl (для зниження рН на 110-1 од.): 1 - контроль; 2 - фаг, множинність інфікування 3;

3 – 10 мкМ ХКФ.

Після внесення НСl концентрація протонів у середовищі зростає, потім відбувається залуговування середовища за рахунок транспорту протонів усередину клітини. Як показали результати експерименту, у присутності фага проникність мембрани для протонів збільшується, що позначається на більш швидкій динаміці підвищення рН середовища. Найбільш високий рівень проникності спостерігається у присутності ХКФ, який, будучи протонофорним роз‘єднувачем, формує в мембрані канали транспорту протонів. Таким чином, очевидно, що характер експериментів з додаванням фага і з внесенням ХКФ схожий, і що дії фага і ХКФ теж подібні. При внесенні фага збільшення динаміки транслокації протонів, імовірно, відбувається за рахунок утворення в клітинній мембрані каналу.

Для визначення можливості утворення каналу чи присутності переносника проводили порівняльне вивчення дії мембранотропних антибіотиків і фага при різних температурах.

Канал здатний підвищувати іонну провідність мембрани при низьких температурах, рухливість же переносників при цьому різко зменшується, тому що збільшується в'язкість мембрани. Разом з тим враховується, що при дії переносника динаміка транслокації протонів залежить від температури і при зниженні температури менша кількість речовини транслокується через цитоплазматичну мембрану. Якщо ж утворюється канал, то динаміка транспорту речовини не залежить від температури.

Динаміка електрогенної транслокації протонів стафілококами під впливом фага і мембранотропних антибіотиків при температурних режимах 37°С та 10°С відтворена на рис.8.

Рис.8. Динаміка електрогенної транслокації протонів стафілококами шт. NC-1 (Cmr) під дією фага 52А та мембранотропних антибіотиків при різних

температурних режимах (а – 37 С, б - 10 С)

Середовище інкубації: 0,3 М MOPS- буфер, рН 6,5; 100 мМ KCl; кількість стафілококів 5108 клітин в 1 мл. Додаток: 20 мкл дист. Н2О, яка містить 5,5 нмоль О2. 1 – суспензія фагів 52А при множинності інфікування 3; 2 – граміцидин; 3 – валіноміцин.

При 37С (як і при 10С) в анаеробних умовах до суспензії клітин додавали фаг, і далі, при створенні “кисневого пульсу”, тобто при внесенні 20 мкл дистильованої води, що дає 5,5 нмоль кисню, починає роботу дихальний ланцюг, що веде до викиду протонів у середовище (рис.8, а, крива 1) і потім до повільного їх повернення в клітини. Це свідчить про здатність утворення фагом іон-провідних каналів у мембрані клітин стафілококів. У другому варіанті експерименту, при внесенні мембранотропного антибіотика граміцидину (рис.8, а, крива 2) спостерігається стимуляція роботи протонного насоса клітин, що значно підсилює вихід протонів із клітини і потім уповільнює їх повернення; очевидно, і граміцидин утворює у мембрані клітин канали. В третьому варіанті, при внесенні в клітинну суспензію антибіотика валіноміцину (крива 3), ми спостерігаємо ті ж процеси з великою інтенсивністю. Усе це свідчить, що і фаг, і граміцидин, і валіноміцин стимулюють роботу протонного насоса в клітинах, але кінетика цих процесів різна.

Цей же експеримент, проведений при 10°С, показав, що дія фага аналогічна дії граміцидину, який, як відомо, утворює у мембрані клітин канали, а активність валіноміцину, як переносника, не спостерігається. Отже, можна зробити висновок, що при внесенні фага в мембранах клітин утворюється і працює канал.

Таким чином, проведені дослідження свідчать, що в результаті впливу фага відбувається зміна структурно-функціонального стану мембранного апарата клітин стафілококів. Це виявляється у розсіюванні трансмембранного потенціалу, зміні окисної активності, індукуванні іонних потоків. У цілому вплив фага на клітину відбувається за типом утворення каналів і зв'язаних з цим процесів.

Підбиваючи підсумок, зазначимо, що транслокація фагової ДНК у стафілококів є енергозалежним процесом; рушійним механізмом транспорту ДНК є протонрушійна сила і транслокація фагової ДНК зв'язана з утворенням у мембрані іонних каналів.

ВИСНОВКИ

1.

2.

3.

4.

5.

6.

7.

8.

СПИСОК РОБІТ, ОПУБЛІКОВАНИХ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

1. Полишко Т.Н. Сравнительный анализ воздействия ингибиторов энергетических процессов на эффективность фаговой инфекции у стафилококков // Мікробіологічний журнал. – 1998. -Т. 60, №4. - С. 36-42.

2. Винников А.И., Полишко Т.Н. Источники конвертируемой энергии у стафилококков //Український біохімічний журнал. - 1996. - Т.68, №6. - С. 29-33.

3. Полишко Т.Н., Винников А.И.. Зависимость зффективности фаговой инфекции от энергетического состояния