НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ

ІНСТИТУТ ЕКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЇ ПАТОЛОГІЇ, ОНКОЛОГІЇ І РАДІОБІОЛОГІЇ

ІМ. Р.Є. КАВЕЦЬКОГО

СНІГИР НАТАЛІЯ ВАЛЕНТИНІВНА

УДК: 616.419-085.361.36.013

ЗАСТОСУВАННЯ ГЕМОПОЕТИЧНИХ КЛІТИН ЕМБРІОНАЛЬНОЇ ПЕЧІНКИ ЛЮДИНИ В ЛІКУВАННІ ЦИТОСТАТИЧНОЇ МІЄЛОДЕПРЕСІЇ У ОНКОЛОГІЧНИХ ХВОРИХ

14.01.07 – онкологія

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата медичних наук

Київ – 2001

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана в Національному медичному університеті ім.акад.О.О.Богомольця

МОЗ України

Науковий керівник – Офіційні опоненти: – Провідна установа – кандидат медичних наук, доцент Смикодуб Олександр Іванович, доцент кафедри поліклінічної підготовки та сімейної медицини Національного медичного університету ім. Акад.. О.О.Богомольця доктор медичних наук, професор Шляховенко Володимир Олексійович, завідувач відділу ензимології Інституту експериментальної патології, онкології та радіобіології ім.Р.Є.Кавецького НАН України, Доктор медичних наук, Сівкович Світлана Олексіївна, завідувач науково-дослідного відділення системних пухлинних захворювань Інституту онкології АМН України. Київська медична академія післядипломної освіти ім.. П.Л. Шупика МОЗ україни, кафедра онкології, м.Київ.

Захист відбудеться ” 14" березня 2001 року о 13 годині 30 хвилин на засіданні спеціалізованої вченої ради Д. 26.155.01 в Інституті експериментальної патології, онкології і радіобіології ім. Р. Є. Кавецького НАН України (03022, м. Київ, вул. Васильківська, 45).

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці ІЄПОР ім. Р. Є. Кавецького НАН України

Автореферат розісланий " 14 " лютого 2001 р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради,

доктор медичних наук Н.В. Бородай

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність проблеми зумовлюється широким використанням хіміопрепаратів та опромінення в сучасному лікуванні злоякісних новоутворень. Проведення високодозної, а в багатьох випадках і стандартної хіміотерапії, обмежується мієлотоксичною дією цитостатичних препаратів. Пошкоджуючи здорові органи та тканини, насамперед кістковий мозок, вони сприяють розвитку ускладнень інфекційного, геморагічного, токсичного характеру. Інфекції на тлі індукованої цитостатиками гіпоплазії кровотворення - одна з основних безпосередніх причин смерті хворих, що отримують протипухлинну терапію (Воdеy G.P.,1986, Girmenia C., 1997, Homsi J., 2000).

Найсучаснішими методами лікування гострих депресій кровотворення у онкологічних хворих є трансплантації стовбурових клітин різного походження: аутологічного та алогенного кісткового мозку (Thomas E.D., 1998, Blume К.G, 1998, Forman S.J., 1998, Nichols C. R, 1998), клітин-попередників периферичної крові (Besinger W.J., 1996, Kцrbling M.,1998), кордової крові (Broxmeyer Hal.E., 1998). Проте використання цих методів у широкого кола онкологічних хворих обмежене необхідністю застосовувати у реципієнтів кондиціонування мієлоаблативними режимами хіміотерапії чи опромінення та проблемами підбору гістосумісного донора у випадках алогенної трансплантації.

Протягом останніх десятиріч як можливе джерело гемопоетичних стовбурових клітин розглядається ембріональна печінка людини (Gale R.P., 1992, Торубарова Н.А., 1993). Ембріональна печінка людини терміном гестації від 5 до 28 тижнів є активним кровотворним органом, що містить стовбурові клітини та клітини-попередники. В ембріональній печінці виявлені колонієутворюючі клітини з високим проліферативним потенціалом, які мають переважно фенотип СD34+СD38- (Muench М.О., 1994). Саме серед СD34+-клітин знаходяться клітини, що можуть відновлювати гемопоез у пацієнтів після хіміотерапії (Collins R.H., 1994, Link H., 1996). Дослідження на сублетально опромінених мишах лінії NOD/SCID показали, що після трансплантації їм гемопоетичних клітин ембріональної печінки людини утворюється в 6 та 30 разів більше CD34+CD38- клітин і в 7 та 300 разів більше LTC-IC, клітин, які можуть забезпечити довготривалий гемопоез в культурі, ніж після пересаджування їм гемопоетичних клітин пуповинної крові та кісткового мозку (Xolyoake T.L., 1999). На клітинах ембріональної печінки ранніх термінів гестації не експресуються чи слабо експресуються антигени cистеми НLA I та II класів. При трансплантації цих клітин не розвивається реакція “трансплантат проти господаря”, так як ембріональна печінка містить незначну кількість зрілих Т-лімфоцитів (Fain A., 1993).

Клітинні суспензії з печінки ембріона людини 7-12 тижнів гестації використовуються при лікуванні деяких станів, що проявляються недостатністю кісткового мозку, а саме: при апластичній анемії (Смикодуб О.І., 1994), спадкових комбінованих імунодефіцитах (Bacchetta R., 1993, Тouraine J.L., 1993), анемії при хронічній нирковій недостатності у хворих на цукровий діабет (Новицька А.В., 2000). Тому є підстави вважати, що гемопоетичні клітини ембріональної печінки (ГКЕП) людини можуть бути використані і при лікуванні глибокої цитостатичної мієлодепресії у онкологічних хворих, особливо у випадках недостатньої ефективності загальновживаної терапії (замісні трансфузії компонентів крові, симптоматичні засоби) та високому ризику розвитку важких інфекцій або геморагічного синдрому. Даний метод лікування також може бути застосовано при лікуванні стійких депресій кровотворення, що заважають дотриманню проведення курсів хіміо- чи хіміопроменевої терапії. Досвід використання кріоконсервованих ГКЕП при лікуванні гемодепресій у онкологічних хворих майже відсутній (Логінський С.О., 1995).

Зв`язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертаційна робота є складовою частиною науково-дослідної теми “Оцінити ефективність застосування трансплантації стовбурових клітин ембріональної печінки в комплексному лікуванні хворих на злоякісні новоутворення” Інституту онкології АМН України в 1997 – 1998 р.р. (№ держреєстрації 01974016202).

Мета дослідження: оцінити ефективність трансплантації гемопоетичних клітин ембріональної печінки людини в лікуванні цитостатичної мієлодепресії у онкологічних хворих.

Задачі дослідження:

1. Визначити покази та протипокази до транcплантації гемопоетичних клітин ембріональної печінки людини онкологічним хворим, що отримують стандартні режими хіміотерапії та опромінення.

2. Проаналізувати вплив трансплантації гемопоетичних клітин ембріональної печінки на клінічний перебіг ускладнень протипухлинної мієлодепресивної терапії (інфекційних ускладнень, геморагічного та анемічного синдромів, орального мукозиту, уражень шлунково-кишкового тракту) у хворих на лейкемію.

3. Дослідити динаміку показників периферичної крові після трансплантації гемопоетичних клітин ембріональної печінки у онкологічних хворих (хворих на лейкемію, хворих на рак шийки або тіла матки, хворих з іншими типами солідних пухлин).

4. Вивчити вплив трансплантації гемопоетичних клітин ембріональної печінки на вміст лімфоцитів різного фенотипу (CD3+, CD4+, CD8+, CD19+, CD16+) у периферичній крові хворих на рак шийки або тіла матки.

5. Оцінити найближчі результати лікування хворих на гостру лейкемію, хворих на рак шийки або тіла матки при використанні трансплантації гемопоетичних клітин ембріональної печінки як методу підтримуючої терапії.

Об`єкт дослідження: онкологічні хворі з цитостатичною мієлодепресією після хіміотерапії або опромінення.

Предмет дослідження: метод трансплантації гемопоетичних клітин ембріональної печінки людини; стан системи кровотворення онкологічних хворих після трансплантації гемопоетичних клітин ембріональної печінки.

Методи дослідження: для оцінки впливу гемопоетичних клітин ембріональної печінки на перебіг ускладнень мієлодепресивної хіміотерапії або опромінення використовували загальноклінічні методи дослідження; клініко-лабораторні методи визначення показників периферичної крові, включаючи дослідження вмісту лімфоцитів різного фенотипу, та кісткового мозку; для вивчення впливу гемопоетичних клітин ембріональної печінки на перебіг пухлинного процесу – дослідження найближчих результатів протипухлинної терапії; для оцінки достовірності отриманих результатів – статистичні методи.

Наукова новизна. Вперше застосовано метод лікування цитостатичної мієлодепресії шляхом трансплантації кріоконсервованих гемопоетичних клітин ембріональної печінки людини у хворих з солідними пухлинами.

Встановлено протекторну дію гемопоетичних клітин ембріональної печінки на кровотворення у хворих на рак шийки або тіла матки під час проведення поєднаної променевої терапії. Вперше вивчено вплив гемопоетичних клітин ембріональної печінки на вміст у периферичній крові лімфоцитів з фенотипом CD3+, CD4+, CD8+, CD19+, CD16+. Визначено, що, незважаючи на продовження опромінення, ці показники утримуються на рівні, який було зареєстровано до трансплантації. Виявлено зменшення кількості рецидивів раку шийки матки протягом двох років. Доведено, що у онкологічних хворих трансплантація гемопоетичних клітин ембріональної печінки є ефективною при лікуванні депресії кровотворення, яка виникла під дією хіміопрепаратів. Встановлено, що використання цього методу лікування під час чи після індукції ремісії у хворих на гостру лейкемію з глибокою цитостатичною мієлодепресією (абсолютною кількістю нейтрофілів менше 0,5 Г/л) призводить до зменшення частоти клінічно підтверджених та важких інфекцій (сепсис, пневмонія) за рахунок скорочення тривалості періоду мієлотоксичного агранулоцитозу, зменшення вираженості нейтропенії, супутніх тромбоцитопенії та анемії.

Вперше обгрунтовані покази та протипокази до введення гемопоетичних клітин ембріональної печінки онкологічним хворим з мієлодепресією, зокрема хворим на гостру лейкемію та хворим на рак шийки матки.

Практичне значення роботи. Проведені клініко-лабораторні дослідження дозволяють рекомендувати трансплантацію гемопоетичних клітин ембріональної печінки людини для більш широкого впровадження в клінічну практику з метою лікування глибокої мієлодепресії, що розвивається у хворих на гостру лейкемію під час індукції ремісії, особливо при неефективності загальновживаної підтримуючої терапії. На підставі проведеної роботи продемонстровано клінічний ефект гемопоетичних клітин ембріональної печінки при лікуванні променевої лейкопенії та/або анемії, що перешкоджають дотриманню запланованих режимів поєднаної променевої терапії у хворих на рак шийки або тіла матки.

Отримані результати та практичні рекомендації впроваджені в практику гематологічної клініки для дорослих Інституту гематології та трансфузіології АМН України, гематологічного відділення Головного військового госпіталю МО України, відділення променевої терапії Інституту онкології АМН України, клініки клітинної терапії Національного медичного університету ім. академіка О.О.Богомольця та Центру ембріональних тканин “EmCell”. Результати досліджень використовуються у матеріалах практичних занять на кафедрі поліклінічної підготовки та сімейної медицини Національного медичного університету ім. академіка О.О.Богомольця.

Особистий внесок здобувача. Автор особисто брала участь у біотехнологічному процесі виготовлення кріоконсервованих гемопоетичних клітин ембріональної печінки людини, формувала клінічні групи хворих, проводила трансплантації ембріональних клітин та клінічне спостереження за хворими. Самостійно проведений аналіз отриманих результатів та статистична обробка даних. Сформульовані висновки, розроблені практичні рекомендації.

Апробація роботи. Матеріли дисертації були представлені на VІІІ міжнародному конгресі товариства Мінімальної інвазивної терапії (Мілан, Італія, 1996), науково-практичній конференції "Хіміотерапія в комплексному лікуванні онкологічних хворих (Чернівці, 1996), ІХ міжнародному конгресі товариства Мінімальної інвазивної терапії (Kіото, Японія, 1997), Х міжнародному симпозіуму з підтримуючої терапії в онкології (Сан Антоніо, США, 1998), ІV міжнародному конгресі товариства Клітинної трансплантології (Монтро, Швейцарія, 1999).

Публікації. Основний зміст дисертаційної роботи викладений у 19 публікаціях, серед яких 3 статті у провідних фахових виданнях, 1 заявка на винахід, 1 методичні рекомендації, 14 матеріалів та тез вітчизняних і міжнародних конгресів, конференцій, з`їздів,

Структура та обсяг дисертації. Дисертація викладена на 126 сторінках машинописного тексту, складається з вступу, огляду літератури, трьох розділів власних досліджень та їх обговорення, висновків, практичних рекомендацій, списку використаних джерел. Текст ілюстровано 19 таблицями та 14 рисунками. Список використаної літератури включає 239 джерел (106 вітчизняних та 133 закордонних).

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Матеріали та методи дослідження. Ефективність трансплантації ГКЕП при лікуванні цитостатичної мієлодепресії досліджували в умовах токсичної лейкопенії ІІ – ІV ступеня (за критеріями ВООЗ, 1979 р.), яка виникла під час проведення хіміо- чи хіміопроменевої терапії, в групі з 73 хворих. Вік хворих становив від 15 до 78 років, у середньому 45,7±2,1 років. За період із 1993 по 1996 рік було проведено 82 трансплантації ГКЕП на наступних клінічних базах: у гематологічній клініці для дорослих Інституту гематології та трансфузіології АМН України – 21 хворий; гематологічному відділенні Головного військового госпіталю МО України – 7 хворих; гематологічному відділенні Київської обласної лікарні №2 – 1 хворий; відділеннях променевої терапії та гінекології Інституту онкології АМН України – 37 хворих; клініці клітинної терапії Національного медичного університету ім. академіка О.О. Богомольця та Центру ембріональних тканин “ЕmCell” – 6 хворих.

За типом злоякісних новоутворень та режимами цитостатичного лікування хворі були розподілені на три основні групи. До першої групи увійшли 30 хворих з глибокою мієлодепресією: 11 хворих на гостру мiєлобластну лейкемію (ГМЛ) (М1, М2, М4, М5 варіанти), 15 хворих на гостру лімфобластну лейкемію (ГЛЛ), 1 хвора на хронічну мієлобластну лейкемію в стадії бластної кризи, 2 хворих із лейкемізацією неходжкінської лімфоми та 1 хвора на гостру мієлосанову аплазію. Діагноз лейкемії встановлювали на підставі даних морфологічного та цитохімічного дослідження кісткового мозку та периферичної крові згідно ФАБ-класифікації. Трансплантацію ГКЕП проводили хворим під час чи після індукційної хіміотерапії при неефективності загальновживаної підтримуючої терапії (трансфузії еритроцитарної маси, плазми, симптоматичні засоби). Хворим на ГМЛ ГКЕП вводили після першого чи другого курсу індукції ремісії за програмами “7+3”, “ТАД 9”, “5+2”, хворим на ГЛЛ – під час чи після 4-х тижневої фази індукції базовими препаратами (вінкрістіном, рубоміцином, преднізолоном, в деяких випадках L- аспарагіназою). Сім хворих на резистентні форми лейкемії, рецидиви ГЛЛ та лейкемізацію лімфоми отримували програми, загальноприйняті для лікування таких випадків. Перед трансплантацією кількість лейкоцитів становила 1,37±0,16 Г/л, нейтрофілів – 0,43±0,10 Г/л (мінімальна кількість лейкоцитів була 0,1 Г/л, нейтрофілів – 0,01 Г/л). Трансплантацію проводили у різні строки від останнього дня хіміотерапії (від 1 до 30 доби), в середньому через 14,1±2,3 доби. Контрольну групу складали 30 хворих на ГЛ (16 хворих на ГЛЛ, 14 хворих на ГМЛ) із спонтанним відновленням кровотворення під час індукційної хіміотерапії. Групи були репрезентативні за віком, статтю, режимами цитостатичного лікування, рівнем лейкопенії (нейтропенії).

До другої групи увійшли 27 хворих на рак шийки матки (22 – ІІІ Б, 1 – ІІІ А, 4 – ІІ Б стадія за класифікацією FIGO) та троє хворих на рак тіла матки (І, ІІІ, ІУ стадії) у віці від 31 до 70 років (у середньому 52,6±2,4 років). Діагноз був верифікований гістологічно. Хворі отримували поєднану променеву терапію (ППТ) в два етапи. На 1-му етапі ППТ проводили дистанційне опромінення ділянки малого таза в статичному режимі до СОД 30 Гр. Перед кожним сеансом опромінення у якості радіомодифікатора вводився 5-фторурацил (сумарна доза 3,5 – 5,0 г). Через 7-10 днів починали 2-й етап ППТ, що включав внутрішньопорожнинну гамма-терапію на апараті “АГАТ-ВY” до СОД у точці А 50-70 Гр (РОД в точці А 10 Гр, режим опромінення 1 раз на тиждень). В дні, вільні від цього лікування, продовжували дистанційне опромінення у ротаційному режимі до СОД у точці В – 55-60 Гр. Трансплантацію ГКЕП проводили після 1-го етапу опромінення для лікування лейкопенії та/чи анемії, що заважали подальшому опроміненню в запланованому режимі. Кількість лейкоцитів на момент трансплантації становила 2,94±0,23 Г/л. Хворі були розподілені на дві підгрупи: 22 хворих з вихідним рівнем лейкоцитів менше 3,5 Г/л (2,49±0,11 Г/л) та 14 хворих з вихідною анемією (рівень гемоглобіну – 89,08±3,78 г/л). Контрольну групу склали 30 хворих на рак шийки матки (26 – ІІІ Б , 4 – ІІ Б стадія). Основна та контрольна групи були репрезентативні за віком, режимом ППТ та рівнем лейкопенії після 1-го етапу (3,02±0,11 Г/л, p>0,05).

До третьої групи увійшли 13 хворих з різними типами солідних пухлин (раком молочної залози, хоріонепітеліомою, раком тіла або шийки матки, раком піхви, раком мозочка) та лейкопенією І-ІY ступеня після хіміо- чи хіміопроменевого лікування в стандартних режимах. Середній вік хворих – 42,8±3,3 роки. Зважаючи на невеликий досвід використання ГКЕП у онкологічних хворих, ми проаналізували також ці клінічні випадки. У 7 випадках трансплантацію ГКЕП проводили для лiкування гострої депресії кровотворення (кількість лейкоцитів – 1,46±0,52 Г/л, мінімальна кількість – 0,3 Г/л), яка перешкоджала проведенню хіміотерапії або була небезпечною для життя. У 9 випадках ГКЕП вводили для лікування стійкої лейкопенії (2,26±0,32 Г/л).

Для трансплантації використовували кріоконсервовані ГКЕП, які були приготовлені з печінки ембріона людини терміном гестації від 7 до 12 тижнів. Ембріони отримували від здорових жінок під час проведення медичних абортів за соціальними показаннями в гінекологічних відділеннях м.Києва. ГКЕП готували в умовах стерильного боксу за стандартною методикою, яка включає наступні етапи: виділення печінки, гомогенізацію, фільтрацію через фільтри систем для переливання крові, пасаж через ін'єкційні голки що разу меншого діаметру. Кріоконсервування ГКЕП здійснювали за програмою в камері програмного заморожувача КRYO 10/III фірми <<Messer Griesheim>> до температури -196°С з кріопротектором (5% розчин диметилсульфоксиду). Поліетиленові контейнери з клітинними суспензіями об'ємом від 0,5 до 1,5 мл зберігали в банку ембріональних тканин у рідкому азоті при температурі -196°С.

Пренатальна діагностика включала дослідження донора на сифіліс, ВІЛ-інфекцію та вірусні гепатити. Суспензії ГКЕП проходили бактеріальний контроль та фетальну діагностику на наявність ВІЛ-інфекції, вірусних гепатитів В та С, токсоплазмозу, цитомегаловірусу, вірусів краснухи та герпесу. Кров донорів досліджувалась також на ВІЛ-інфекцію через 90 днів після проведеної операції переривання вагітності. Контролі проводились Українським центром державного санепіднагляду та лабораторією Центру ембріональних тканин “EmCell”. Для контролю за функціональною активністю кріоконсервованих ГКЕП в розмороженій порції (0,5 мл) визначали кількість ядровмісних клітин в 1 мл та кількість CD34+ клітин (за допомогою тесту непрямої флюоресценції з моноклональним антитілом до поверхневого антигену CD34 cерії Leu фірми <<Becton Dickinson>>, США). Відсоток живих клітин визначали методом фарбування трипановим синім.

Для трансплантації відбирали ГКЕП від одного ембріону з кількістю ядровмісних клітин в 1 мл від 0,5 до 2,5х108, об'єм суспензії – 1-4 мл, кількість живих клітин – не менше 70%. У хворих на рак шийки або тіла матки загальна кількість введених ядровмісних клітин одному хворому становила в середньому 3,0±0,2х108, вік ембріона 9-12 тижнів гестації, у хворих на лейкемію – 2,6±0,5х108, вік ембріона 7-12 тижнів гестації, у хворих на різні типи солідних пухлин – 2,1±0,4х108, вік ембріона – 8-12 тижнів гестації. Кількість введених СД34+ -клітин коливалась від 0,15 до 0,35х108.

Трансплантацію ГКЕП проводили одноразово внутрішньовенно крапельно. Ефект трансплантації оцінювали за змінами суб'єктивного та об'єктивного стану хворих (частоті та вираженості інфекційних ускладнень, геморагічного синдрому, анемії, уражень шлунково-кишкового тракту). Для визначення ступеня токсичності хіміотерапії використовували критерії ВООЗ (1979 р.). Дослідження показників периферичної крові (кількість лейкоцитів, еритроцитів, тромбоцитів, концентрація гемоглобіну, визначення еритроцитів, що містять фетальний гемоглобін за методом Кleinhauer E., Betke K.) проводили у строки, передбачені протоколом трансплантації. У хворих на лейкемію досліджували показники кісткового мозку на 14-30-ту добу після трансплантації. У хворих на рак шийки або тіла матки визначали загальну кількість лімфоцитів, клітинний склад лімфоцитів, а саме, кількість лімфоцитів з фенотипом СД4+, СD8+, CD3+, CD16+, CD19+. Аналіз суб- популяційного складу лімфоцитів проводили за допомогою непрямого імунофлюоресцентного тесту з панелями моноклональних антитіл фірми <<Сорбент>> (Росія), які визначають поверхневі антигени кластерів CD3, CD4, CD8, CD19, CD16. Дослідження проводили на лазерному проточному цитофлюориметрі FACSТar plus фірми <<Becton Dickinson>> (CША) до трансплантації ГКЕП, на 10-14-ту добу після неї, а також після завершення курсу ППТ, тобто через 30-60 діб після введення ГКЕП. Дані норми надані імунологічною лабораторією Наукового центру радіаційної медицини АМН України, де обстежували здорових людей. Крім загальноприйнятих біохімічних досліджень, при необхідності, застосовували бактеріологічні, рентгенологічні та ультразвукові методи обстеження.

Статистичну обробку результатів виконували за методом варіаційної статистики з використанням статистичного пакету СSS (Complete Statistical System). Статистичну вірогідність відмінностей оцінювали за t-критерієм Ст'юдента.

РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ ТА ЇХ ОБГОВОРЕННЯ

Трансплантація гемопоетичних клітин ембріональної печінки людини в лікуванні цитостатичної мієлодепресії у хворих на лейкемію. Всі хворі на лейкемію та хвора на мієлосанову аплазію знаходились у важкому стані внаслідок вираженої цитостатичної мієлодепресії (таблиця 1). Рівень нейтропенії менше 0,5 Г/л (у середньому 0,19±0,03 Г/л) мали 65% хворих. На момент введення ГКЕП у 53% хворих визначали збільшення температури тіла, у 35% хворих – геморагії, у 31% – прояви орального мукозиту. Проведення трансплантації ГКЕП не супроводжувалось розвитком сторонніх реакцій, 20% хворих вже на першу добу після введення суспензії відмітили покращення загального стану, підвищення апетиту, зменшення слабкості.

Спостереження за хворими після трансплантації ГКЕП показало, що даний метод лікування сприяє ліквідації чи зменшенню вираженості інфекційного процесу, який розвинувся на тлі цитостатичної нейтропенії. Клінічне покращення (зменшення чи нормалізація температури тіла, зменшення проявів інтоксикаційного синдрому) спостерігали у 75% хворих у середньому з 1-3-ї доби після введення клітин. Виявлено, що проведення трансплантації ГКЕП призвело до зменшення частоти важких інфекцій (пневмонія, сепсис) в основній групі (17%) в порівнянні з контрольною (40%, p<0,05). Також меншою була частота клінічно підтверджених інфекційних ускладнень (20% проти 63% у контрольній групі, p<0,001). Загальна частота інфекцій, включаючи випадки гарячки з невиявленим вогнищем інфекції, не відрізнялась (53% проти 68% в контрольній групі). Протягом строку дослідження у хворих основної групи не зареєстровано виникнення нових інфекційних ускладнень. Відмічали зміни в структурі інфекційних ускладнень: співвідношення між кількістю випадків гарячки без виявленого вогнища інфекції та підтвердженими інфекційними ускладненнями становило 1,7 у хворих з трансплантацією проти 0,42 у контрольній групі. Позитивні зміни зареєстровані у 75% хворих з виразково-некротичними змінами слизової оболонки порожнини рота на 2-5-ту добу після трансплантації.

У всіх хворих з геморагічним синдромом спостерігали клінічне покращення на 1-3-ю добу після трансплантації. Частота геморагічного синдрому в групі з трансплантацією ГКЕП не відрізнялась від контрольної групи (35% проти 38%, p>0,05), проте небезпечні для життя геморагії у вигляді крововиливу в головний мозок розвинулись у 14% хворих на ГМЛ контрольної групи і у жодного з хворих основної групи.

Позитивний гематологічний ефект (збільшення кількості лейкоцитів) був отриманий у 77% хворих після введення ГКЕП. У 13% хворих трансплантація була неефективною і вони загинули під час індукції ремісії від інфекційних ускладнень. Із представлених у таблиці 1 даних видно, що введення ГКЕП призвело до того, що з 11-ї доби кількість лейкоцитів збільшилась до 4,21±0,69 Г/л (приріст 207±50%), кількість нейтрофілів до 2,09±0,53 Г/л (приріст 386±123%). Кількість бластних клітин в периферичній крові протягом місяця вірогідно не змінювалась. У хворих на ГЛ контрольної групи відновлення кровотворення (кількість лейкоцитів – 4,10±0,48 Г/л та гранулоцитів – 1,98±0,04 Г/л) зареєстровано тільки з 30-ї доби перебігу цитостатичної лейкопенії.

Таблиця 1

Динаміка показників периферичної крові у гематологічних хворих після трансплантації ГКЕП

Тривалість періоду з абсолютною кількістю нейтрофілів менше 0,5 Г/л після введення ГКЕП у хворих на лейкемію становила 7,5±1,3 діб і коливалась від 2 до 21 доби. Своєчасне проведення трансплантації ГКЕП (в перші 5,4±0,4 діб від останнього дня хіміотерапії) призвело до скорочення тривалості періоду глибокої нейтропенії (11,45±0,8 діб у порівнянні з 14,4±1,2 добами в контрольній групі, p<0,05). У хворої на хронічну мієлобластну лейкемію кількість нейтрофілів не перевищувала 0,5 Г/л, а у хворої на гостру мієлосанову аплазію період глибокої нейтропенії тривав 25 діб після 1-ї та 7 діб після 2-ї трансплантації ГКЕП.

Для диференційної оцінки ефективності трансплантації ГКЕП в залежності від різних факторів (ступеня лейкопенії, варіанту лейкемії, тривалості мієлодепресії до трансплантації) був проведений аналіз у наступних підгрупах: 1) у 15 хворих на ГЛЛ та у 9 хворих на мієлобластну лейкемію; 2) у 12 хворих з вихідним рівнем лейкоцитів менше 1,0 Г/л (у середньому 0,63±0,08 Г/л), у 14 хворих з рівнем лейкоцитів більше 1,0 Г/л (у середньому 1,99±0,14 Г/л) та у 17 хворих з рівнем нейтрофілів менше 0,5 Г/л (у середньому 0,19±0,03 Г/л); 3) у 11 хворих з тривалою лейкопенією (24,3±2,9 діб до трансплантації) та у 15 хворих, яким ввели ГКЕП на 5,4±0,4 добу після хіміотерапії. Виявили, що трансплантація ГКЕП була ефективною у всіх цих підгрупах. Відновлення кількості лейкоцитів за рахунок нейтрофілів спостерігали з 11-ї доби у хворих, яким трансплантацію проводили у перші дні після хіміотерапії (6,23±3,52 Г/л, p<0,05) (рис.1), у хворих на ГЛЛ (5,49±1,14 Г/л, p<0,05), у хворих з глибокою лейкопенією та нейтропенією (3,55±1,22 Г/л, p<0,05). У хворих з тривалою лейкопенією та у хворих з лейкопенією ІІ-ІІІ ступеня кількість лейкоцитів збільшилась вже з 7-ї доби до 2,69±0,51 Г/л та 3,68±0,53 Г/л (p<0,05), а відновлення спостерігали також з 11-ї доби до 4,00±0,85 Г/л (p<0,01) та 4,78±0,73 Г/л (p<0,001) відповідно.

У хворих на ГЛЛ спостерігали високу варіабельність коливань вмісту лейкоцитів та нейтрофілів після введення ГКЕП (від 1,9 Г/л до 16,8 Г/л та від 0,3 Г/л до 10,9 Г/л відповідно). Відновлення кровотворення після трансплантації ГКЕП у хворих на ГМЛ відбувалося значно повільніше, ніж у хворих на ГЛЛ (рис 2), що є закономірним для перебігу мієлобластної лейкемії. У хворих на ГМЛ кількість лейкоцитів на 11-ту добу після введення ГКЕП збільшилась до 2,54±0,40 Г/л (приріст 110±42%, p<0,05), а відновилась до 5,97±2,45 Г/л тільки з 30-ї доби за рахунок нейтрофілів (p<0,01). У хворих на ГМЛ із спонтанним відновленням кровотворення вміст нейтрофілів периферичної крові збільшується до рівня 0,85±0,22 Г/л тільки з 30-ї доби проти нейтропенічного фону 1,86±0,42 Г/л на 30-ту добу після трансплантації (p<0,05).

Відновлення чи збільшення кількості лейкоцитів після трансплантації дозволило 9 хворим на ГЛ, яким індукційна хіміотерапія була припинена внаслідок мієлодепресії, продовжити її в запланованому режимі через 11,5±2,3 діб після введення ГКЕП.

Рис.1 Динаміка вмісту лейкоцитів у периферичній крові хворих на лейкемію після трансплантації ГКЕП та хворих контрольної групи.

Рис.2 Динаміка вмісту нейтрофілів у периферичній крові хворих на ГМЛ та хворих на ГЛЛ після трансплантації ГКЕП

У досліджуваній групі хворих трансплантація ГКЕП позитивно впливала на перебіг цитостатичної тромбоцитопенії та анемії. У хворих на ГЛ кількість тромбоцитів, еритроцитів та концентрація гемоглобіну збільшувалась з 11-13-ї доби після введення ГКЕП, а в контрольній групі тільки з 30-ї доби (p<0,05). Найбільш демонстративний вплив ГКЕП на перебіг тромбоцитопенії виявлено у хворих на ГМЛ (приріст на 13-ту добу 198±81%, p<0,05).

Дослідження кісткового мозку виявило ознаки відновлення кістково-мозкового кровотворення на 14-30-ту добу після трансплантації ГКЕП. Кількість мієлокаріоцитів збільшилась у 6 разів (29,75±5,66 Г/л проти 5,22+2,23 Г/л до трансплантації); кількість мегакаріоцитів – у 5 разів (15,50±2,23 проти 2,79±1,46 тисяч в 1 мкл). Зменшився відносний лімфоцитоз з 60,55±5,2% до 17,2±3,55% за рахунок збільшення як проліферуючих форм (15,2±2,05% проти 2,1±1,0%), так і зрілих форм гранулоцитів (33,0±4,3% проти 10,4±2,3%).

Повну гематологічну ремісію отримали у 62% хворих на ГЛ і у однієї хворої з неходжкінською лімфомою основної групи проти 60% хворих на ГЛ контрольної групи. Повну ремісію ГЛЛ досягли у 73% хворих, що менше ніж в контрольній групі (93%) за рахунок 5 хворих на рецидиви та резистентні форми лейкемії. Повну ремісію ГМЛ отримали у 45% хворих основної групи проти 21% хворих контрольної групи.

Таким чином, проведення трансплантації ГКЕП хворим на ГЛ у вибрані строки, при неефективності загальновживаної підртримуючої терапії, сприяло клінічному покращенню перебігу цитостатичної мієлодепресії, проте не впливало на частоту досягнення повних ремісій ГЛ.

Трансплантація гемопоетичних клітин ембріональної печінки людини в лікуванні цитостатичної гемодепресії у хворих на солідні пухлини. Після введення ГКЕП 60% хворих на рак шийки або тіла матки відмітили покращення загального стану. У деяких хворих спостерігали зменшення проявів ентеропатії, що виникала при проведенні опромінення. Під час трансплантації ГКЕП не зареєстровано будь-яких сторонніх реакцій.

Після трансплантації ГКЕП у хворих на рак шийки або тіла матки кількість лейкоцитів збільшувалась з 15-ї доби до 3,48±0,21 Г/л проти вихідного рівня 2,94±0,23 Г/л (приріст 18±7%, p<0,05). В підгрупі із 22 хворих, що мали більш глибоку лейкопенію, кількість лейкоцитів збільшувалась з 7-ї доби до 3,34±0,34 Г/л проти вихідного рівня 2,49±0,11 Г/л (приріст 34±14%) за рахунок нейтрофілів (2,01±0,25 Г/л, p<0,05). В обох групах зареєстровано підвищення вмісту моноцитів на 7-му добу після трансплантації (p<0,05). Позитивний гематологічний ефект після введення ГКЕП спостерігали у 82% хворих з вихідною променевою лейкопенією, що сприяло продовженню опромінення в запланованому режимі.

Виявлено протекторний ефект ГКЕП на стан кровотворення під час 2-го етапу ППТ (рис.3). Незважаючи на продовження опромінення, у хворих основної групи, а також у підгрупі з більш глибокою лейкопенією, кількість лейкоцитів зберігалась на рівні, який перевищував передтрансплантаційний. В контрольній групі хворих змін вмісту лейкоцитів протягом 2-го етапу ППТ не зареєстровано (p>0,05). Після завершення променевої терапії рівень лейкоцитів як у хворих основної групи (3,50±0,19 Г/л), так і у хворих підгрупи з більш глибокою лейкопенією (3,28±0,18 Г/л) був більшим, ніж у хворих контрольної групи (2,76±0,13 Г/л, p<0,05).

Рис 3 Динаміка вмісту лейкоцитів периферичної крові після першого етапу поєднаної променевої терапії у хворих із трансплантацією ГКЕП та у хворих контрольної групи.

У 14 хворих на рак шийки матки, що мали вихідну анемію, з 15-ї доби після введення ГКЕП відмічали збільшення кількості еритроцитів з 2,92±0,13 Т/л до 3,60±0,26 Т/л (p<0,05), концентрації гемоглобіну з 89,08±3,78 г/л до 99,54±2,68 г/л (p<0,05). Протягом 2-го етапу ППТ ці показники продовжували збільшуватись, а у 43% хворих нормалізувались. В мазках периферичної крові в ці строки визначали еритроцити, що містять фетальний гемоглобін.

Дослідження субпопуляцій лімфоцитів за методом лазерної проточної цитофлюориметрії після 1-го етапу ППТ виявило зменшення, у порівнянні з показниками здорових людей, абсолютної кількості лімфоцитів (p<0,001), абсолютної кількості CD3+-лімфоцитів (p<0,001), CD4+-лімфоцитів (p<0,001), CD8+-лімфоцитів (p<0,001), НК-клітин (CD16+-лімфоцитів) (p<0,001) та CD19+-лімфоцитів (p<0,05).

На 7-15-ту добу після трансплантації ГКЕП в основній групі хворих на рак шийки або тіла матки зареєстрована тенденція до збільшення абсолютної кількості лімфоцитів (p<0,1). В ці строки дослідження в підгрупі хворих з більш глибокою лейкопенією виявили тимчасове збільшення абсолютної кількості лімфоцитів (0,75±0,12 Г/л проти 0,49±0,05 Г/л, p<0,05). Після введення ГКЕП та завершення 2-го етапу ППТ лімфоцитопенія зберігалась на вихідному рівні (p>0,05). У хворих контрольної групи в ці строки зареєстрована тенденція до подальшого зниження загальної кількості лімфоцитів (0,44±0,03 Г/л у порівнянні з 0,54±0,05 Г/л після 1-го етапу опромінення, p<0,1).

Зміни кількості субпопуляцій лімфоцитів на 10-14 добу після трансплантації, а також після завершення ППТ невірогідні. Однак привертає увагу загальна тенденція до деякого підвищення на 10-14-ту добу абсолютної кількості CD3+-, CD4+-, CD8+- лімфоцитів (в середньому на 23%) та НК-клітин на 43±29% (p>0,05). Імунорегуляторний індекс після 1-го етапу лікування не відрізнявся від цього показника у здорових людей (p>0,05). За даними літератури (Кузьміна Е.Г. та співав., 1996) після другого етапу ППТ імунорегуляторний індекс знижується до 1,0 за рахунок зменшення рівня хелперів та підвищення супресорів. У проведеному дослідженні співвідношення CD4+/CD8+ -лімфоцитів після завершення лікування не відрізнялось від цього показника у здорових людей (1,91±0,20, p>0,05). Після трансплантації ГКЕП та завершення ППТ спостерігали тенденцію до збільшення абсолютної кількості НК-клітин на 71±29% (p<0,1) та збільшення їх відносної кількості на 54±25% (p<0,05), вміст CD3+-, CD4+-, CD8+-, CD19+- лімфоцитів утримувався на вихідному рівні. Дослідження клітинного складу лімфоцитів у окремих хворих через 6-12 місяців після введення ГКЕП та ППТ показали, що він мало змінився порівняно з попередніми етапами обстеження.

За два роки спостереження ми не відмічали негативного впливу ГКЕП на перебіг пухлинного процесу у хворих на рак шийки або тіла матки. Рецидиви в основній групі хворих через 6 місяців були відсутні, а в контрольній групі вони з'явились у 13% хворих (p>0,05). До двох років після лікування рецидиви виникли у 10% основної та у 23% хворих контрольної групи (p<0,01). Трансплантація ГКЕП сприяла збільшенню тривалості безрецидивного періоду на 6 місяців (p<0,05). За час спостереження в основній групі померла 1 хвора (3%) проти 3 хворих (10%) в контрольній групі. Без ознак рецидиву та метастазів живуть 72% хворих основної та 53% хворих контрольної групи (результати відділення променевої терапії Інституту онкології АМН України, керівник відділення – к.м.н. В.С. Іванкова).

Позитивний вплив ГКЕП на перебіг гемодепресії після хіміо- чи хіміопроменевої терапії підтверджують також результати, які одержані при лікуванні окремих хворих з іншими типами солідних пухлин. Синдром раннього післятрансплантаційного покращення спостерігали у 6 (46%) із 13 досліджених хворих. Збільшення чи відновлення вмісту лейкоцитів відмітили у 80% хворих. З 7-ї доби після трансплантації кількість лейкоцитів збільшилась з 1,95±0,30 Г/л до 5,08±1,08 Г/л (приріст 161±52%) за рахунок нейтрофілів (3,23±0,71 Г/л, p<0,01). На 7-му добу після трансплантації зареєстровано також підвищення абсолютної кількості моноцитів на 123±54% (p<0,05). У 7 випадках гострої депресії кровотворення вміст лейкоцитів нормалізувався вже на 3-ю добу – 4,58±1,17 Г/л (p<0,05). Трансплантація ГКЕП виявилась ефективною у 2 хворих з лейкопенією ІY ступеня, які мали клінічні прояви інфекції (температура тіла 39°С), оральний мукозит ІІІ-ІY ступеня, токсичний гепатит, діарею ІІІ ступеня. Клінічне покращення спостерігали вже з 1-ї доби після введення ГКЕП. У випадках стійкої гемодепресії, яка розвинулась після повторних курсів хіміотерапії, в деяких випадках опромінення та лікування радіоактивним фосфором, зареєстрована тільки тенденція до збільшення кількості лейкоцитів з 30-ї доби після трансплантації (p<0,1). Ці результати, можливо, пояснюються невеликою кількістю спостережень та значним загальним цитостатичним навантаженням. Привертає увагу наявність кращого клінічного ефекту від введення ГКЕП у хворих після хіміотерапії, ніж у хворих, які отримували хіміопроменеве лікування (приріст 161±52% та 34±14% відповідно, p<0,05).

Ці дані свідчать, що трансплантація ГКЕП є єфективною компонентою при лікуванні цитостатичної мієлодепресії в онкологічних хворих, насамперед, при неефективності загальновживаної підтримуючої терапії та високому ризику ускладнень, обумовлених ураженням кровотворення. Результати, що отримані в проведеному дослідженні, дозволяють рекомендувати цей метод для більш широкого впровадження в клінічну практику, зокрема, при лікуванні хворих на ГЛ або хворих на рак шийки матки.

ВИСНОВКИ

1. Розроблено метод застосування гемопоетичних клітин ембріональної печінки людини в лікуванні цитостатичної мієлодепресії у онкологічних хворих та визначено покази і протипокази до його призначення.

2 ГКЕП, введені хворим на ГЛ після чи наприкінці індукційної хіміотерапії, призводять до збільшення з 11-ї доби після трансплантації вмісту лейкоцитів за рахунок нейтрофілів на 207±50%, вмісту тромбоцитів на 107±37%, концентрації гемоглобіну на 23±4% та скорочують тривалість періоду з абсолютною кількістю нейтрофілів менше 0,5 Г/л (11,5±0,8 діб проти 14,4±1,2 діб в контрольній групі, p<0,05)

3. У хворих на ГЛ з глибокою нейтропенією під час індукції ремісії трансплантація ГКЕП сприяє ліквідації інфекційних процесів, зменшенню частоти важких інфекцій (сепсис, пневмонія) (17% проти 40%, p<0,05) та частоти клінічно підтверджених інфекцій (20% проти 63%, p<0,001).

4. ГКЕП, введені хворим на рак шийки або тіла матки після 1-го етапу поєднаної променевої терапії, мають протекторний ефект, що проявляється у збільшенні кількості лейкоцитів з 7-ї доби, меншому ступені лейкопенії після завершення опромінення (3,28±0,18 Г/л проти 2,76±0,13 Г/л в контрольній групі, p<0,05), утриманні загальної кількості лімфоцитів, абсолютної кількості СД4+ -, СD8+ -, CD3+ -, CD19+ - лімфоцитів на передтрансплантаційному рівні, збільшенні кількості еритроцитів на 23±9% з 15-ї доби.

5. Застосування ГКЕП для лікування цитостатичної мієлодепресії сприяє дотриманню режимів індукційної хіміотерапії у хворих на ГЛ та дотриманню режимів ППТ у хворих на рак шийки або тіла матки. У останніх це призводить до зменшення кількості рецидивів протягом 2 років (10% проти 23% в контрольній групі, p<0,05).

ПРАКТИЧНІ РЕКОМЕНДАЦІЇ

1. При призначенні трансплантації ГКЕП хворим на ГЛ треба враховувати варіант лейкемії, стадію захворювання, отримані дози хіміопрепаратів, адекватність та ефективність проведеної хіміотерапії та терапії супроводження.

2. При використанні стандартних режимів хіміотерапії показанням до трансплантації ГКЕП у хворих на ГЛ є 1) перший гострий період, після чи під час проведення індукційної хіміотерапії при розвитку глибокої нейтропенії (менше 0,5 Г/л), неефективності загальновживаного підтримуючого лікування та високому ризику виникнення важких інфекцій; 2) перший гострий період, після чи під час проведення індукційної хіміотерапії при тривалій (більш 7 діб) глибокій нейтропенії (менше 0,5 Г/л), що поєднується з тромбоцитопенією (менше 30 Г/л), та високому ризику важких інфекційних ускладнень і геморагічного синдрому; 3) перший гострий період, оральний мукозит III – IY ступеня на тлі мієлотоксичного агранулоцитозу внаслідок індукційної хіміотерапії.

3. У хворих на рак шийки матки трансплантація ГКЕП показана при розвитку стійкої променевої лейкопенії та (чи) анемії, що не піддається лікуванню стандартними засобами і перешкоджає проведенню подальшого опромінення в запланованому режимі.

4. У онкологічних хворих протипоказами до введення ГКЕП треба вважати гострі тромбози, гострі васкуліти, виражену легеневу гіпертензію, яка пов`язана з васкулітом, тромбозом, з розвитком гострого чи підгострого легеневого серця, важкий геморагічний синдром (крововилив у головний мозок, шлунково-кишкова кровотеча, крововиливи у середовища ока) на тлі цитостатичної тромбоцитопенії, термінальні стадії захворювання.

СПИСОК ОПУБЛІКОВАНИХ ПРАЦЬ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

1.Снігир Н.В. Лікування гемопоетичними ембріональними суспензіями цитостатичної мієлодепресії у хворих на гострий лейкоз // Український науково-медичний молодіжний журнал . - 1997. - № 1-2. - С.48-51.

2. Гриневич Ю.А., Смикодуб О.І., Бендюг Г.Д., Храновська Н.М., Снігир Н.В.,