ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ
МІНІСТЕРСТВО ОСВІТИ І НАУКИ УКРАЇНИ
ЧЕРНІВЕЦЬКИЙ НАЦІОНАЛЬНИЙ УНІВЕРСИТЕТ
імені ЮРІЯ ФЕДЬКОВИЧА
СОРОЧАН Ольга Олександрівна
УДК 577.12+581.142+633.15
ВІЛЬНІ АМІНОКИСЛОТИ ЗЛАКІВ НА ПЕРШИХ ФАЗАХ ПРОРОЩУВАННЯ ПІД ВПЛИВОМ ДЕЯКИХ ФАКТОРІВ
03.00.04 – біохімія
Автореферат на здобуття наукового ступеня
кандидата біологічних наук
Чернівці 2001
Дисертацією є рукопис
Робота виконана в Дніпропетровському національному університеті, Міністерство освіти і науки України
Науковий керівник:
доктор біологічних наук
Штеменко Наталія Іванівна
Дніпропетровський
національний університет,
зав. каф. біофізики і біохімії
Офіційні опоненти:
Доктор біологічних наук, професор, Мусатенко Людмила Іванівна, Інститут ботаніки ім. М.Г. Холодного НАНУ, завідувач відділом фітогормонології
Кандидат біологічних наук, Шелифіст Антоніна Євгенівна, Чернівецький національний університет імені Юрія Федьковича, асистент кафедри біохімії і експериментальної екології
Провідна установа: Львівський Національний університет імені Івана Франка, кафедра фізіології і екології рослин, Міністерство освіти і науки України, м.Львів
Захист відбудеться “20” червня 2001 р. о 12 годині на засідані
спеціалізованої вченої ради Д 76.051.05 при Чернівецькому національному університеті імені Юрія Федьковича за адресою: 58012, м. Чернівці, вул. Коцюбинського, 2.
З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Чернівецького національного університету імені Юрія Федьковича (58012, м. Чернівці, вул. Л. Українки, 23)
Автореферат розісланий “15” травня 2001 р.
Вчений секретар спеціалізованої вченої ради Г.П.Копильчук
ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ
Актуальність теми. Відомо, що жива клітина містить певну кількість амінокислот у вільному стані. Незважаючи на те, що роль амінокислотного пулу вважається мультифункціональною [Колупаєв, 1995, Ізмайлов, 1986], вона вивчена недостатньо. Особливо маловідомим аспектом є вибіркове накопичення окремих амінокислот в умовах екзогенного впливу, яке описане тільки для проліну [Бритиков, 1975], ГАМК [Землянухин, 1974, 1979], аспарагіну і глутаміну [Штеменко, 1993]. До питань, які потребують більш детального дослідження, відносяться також: формування амінокислотного пулу в умовах стимуляції ростових процесів із застосуванням перспективних стимуляторів росту, що розглядається як важливий механізм управління потенціалом рослинництва [Бахтенко, 1995, Пономаренко, 1995, Шамрай, 1998, Безвенюк, 1995, Троян, 1993, Бобейкэ, 1995, Савінський, 1995, Сакало, 1995]; амінокислотний склад кореневих виділень рослин, що останнім часом привертають увагу в зв’язку з появою серії робіт, присвячених алелопатичним взаємодіям [Mackova, 2000, Jones, 1998, Hawes, 1998], і процесу фіторемедіації [Salt, 1998, Seidel, 2000, Schmoger, 2000, Pence, 2000, McCully, 1999], що є особливо актуальним в умовах екзогенного забруднення навколишнього середовища.
Серед кластерних сполук ренію з амінокислотами знайдені антиканцерогенні, антигемолітичні, цитостабілізуючі препарати [Shtemenko, 2000]. Отже, актуальним напрямком є з’ясування можливості отримання аналогів таких сполук, використовуючи як ліганди вільні амінокислоти з рослинної сировини.
Перші фази розвитку злаків характеризуються значною кількістю і незвичайним складом вільних амінокислот [Штеменко, 1993], що робить їх зручним об’єктом для дослідження вищезгаданих проблем і сприятиме вирішенню низки важливих питань біохімії рослин.
Мета роботи і задачі дослідження. Метою даної роботи було встановити склад вільних амінокислот кукурудзи і диких злаків на перших фазах пророщування під впливом стимуляторів росту, важких металів, а також отримати кластерні сполуки ренію (ІІІ) з природними амінокислотами.
Для досягнення цієї мети були поставлені такі задачі:
1) визначити склад вільних амінокислот насіння, первинних листків і кореневих виділень диких і культурних видів злаків різних генетичних форм на перших фазах пророщування;
2) визначити вплив нового перспективного стимулятора росту FeSuc на склад вільних амінокислот злаків і підібрати його ефективну концентрацію;
3) вивчити склад вільних амінокислот первинних листків диких видів злаків в умовах моделі фіторемедіації;
4) встановити можливість використання вільних амінокислот, вилученних із рослинної сировини, як ліганди в кластерних сполуках ренію (ІІІ).
Наукова новизна одержаних результатів. Знайдено значну кількість ароматичних амінокислот (фенілаланіну, тирозину) і серину у вільному стані в зернівці та первинних листках диких злаків, які вивчали. Амінокислотний склад кореневих виділень злаків на перших фазах пророщування є генотипово обумовленим і кількісно значно зростає при стимуляції росту. Показано, що під впливом деяких факторів зовнішнього середовища відбуваються якісні перебудови пулу вільних амінокислот, які найчастіше стосуються дикарбонових амінокислот та їх амідів у кукурудзи, та ароматичних амінокислот у диких видів злаків. Обговорено можливі біосинтетичні шляхи, що відповідають за вибіркове накопичення вільних амінокислот. Застосування хроматографічних і спектрофотометричних методів дозволило вивчити процес комплексоутворення ренію (ІІІ) з амінокислотами із рослинної сировини і визначити їх кількісний і якісний склад.
Практичне значення одержаних результатів. Робота вносить певний вклад у розуміння ролі вільних амінокислот в процесах життєдіяльності рослинної клітини і механізмів адаптації рослин до факторів зовнішнього середовища.
Результати роботи показують доцільність використання стимулятора росту FeSuc – комплекса заліза з сукцинатними залишками етилендиаміндиянтарної кислоти – при передпосівній обробці насіння злаків, у тому числі, і в умовах моделі фіторемедіації.
Розроблено метод отримання кластерних сполук ренію (ІІІ) з амінокислотами рослинної сировини, як ліганди.
Результати роботи використовуються на кафедрі біофізики і біохімії Дніпропетровського національного університету при викладанні спецкурсів “Біохімічна адаптація” та “Вибрані глави біохімії рослин”, в роботі науково-дослідних лабораторій і при виконанні курсових і дипломних робіт студентів кафедри.
Зв’язок роботи з науковими темами. Дисертаційна робота виконувалась в рамках бюджетних тем відділу молекулярної біології НДІ біології і кафедри біофізики і біохімії Дніпропетровського національного університету – “Дослідити механізм стійкості рослин до антропогенних впливів, які приводять до мутаційного стресу” (01.90.0039931), “Дослідження адаптивних фізіолого-біохімічних закономірностей стійкості рослин до комплексної дії антропогенного забруднення” (0194U028108) та лабораторії біохімії НДІ біології ДНУ – “Розробка біотехнології одержання речовин ліпідної природи з рослинної сировини для практичного використання” (0196U000259), “Дослідження процесів формування ліпідного та білкового комплексів рослин” (0199U001291), “Дослідження біологічної активності кластерних сполук ренію з органічними лігандами” (0100U005660).
Особистий внесок здобувача. Особистий внесок здобувача у виконанні поданої роботи полягав у підготовці і проведенні експериментальних досліджень, інтерпретації одержаних результатів. Всі експериментальні матеріали, використані в дисертації, отримані при безпосередній участі автора.
Апробація результатів дисертації. Матеріали, викладені в дисертаційній роботі, були представлені на міжнародній конференції “Устойчивое развитие: загрязнение окружающей среды и экологическая безопасность” (Дніпропетровськ, 1995), на 23 зборах Європейського біохімічного суспільства (Швейцарія, 1995), на міжнародній конференції з Біоремедіації “ISEB’97” (Німеччина, 1997), на VII Українському біохімічному з’їзді (Київ, 1997), на 8 симпозиумі “Handling of Environmental and Biological Samples in Chromatography” (Іспанія, 1997), на 5 міжнародній конференції “France et Ukraine, Experience Scientifique et Pratique Dans le Contexte du Dialogue des Cultures Nationales” (Дніпропетровськ, 1998), на міжнародній конференції “Питання біоіндикації і екології” (Запоріжжя, 1998), на I міжнародній конференції “Наука і Освіта’98” (Дніпропетровськ, 1998), на міжнародній конференції “SECO TOX’ 98” (Туреччина, 1998), на 6 міжнародному конгресі з амінокислот “Amino Acids” (Німеччина, 1999), на 7 міжнародній конференції “Contaminated Soil 2000” (Німеччина 2000).
Публікації. За матеріалами дисертації опубліковано 15 робіт, серед яких 5 статей надрукованих, у провідних фахових виданнях і за кордоном.
Структура та обсяг дисертації. Дисертаційна робота складається з вступу, огляду літератури, матеріалів і методів досліджень, результатів роботи та їх обговорення, узагальнення результатів дослідження, висновків, списку літератури (160 робіт, в т.ч. 84 іноземними мовами). Дисертація викладена на 126 сторінках, має у своєму складі 25 рисунків та 33 таблиці.
ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ
У вступі обгрунтована актуальність теми і сформульована мета дослідження.
У першому розділі, який складається з п?яти підрозділів, розглядаються відомі на цей час дані про склад амінокислот зерна, вегетативних органів, кореневих виділень кукурудзи, а також обговорюється можлива функціональна роль вільних амінокислот в процесах адаптації рослин до факторів зовнішнього середовища та висвітлено перспективність використання амінокислот як ліганди в кластерних сполуках ренію (ІІІ), що відкриває нові перспективи в галузі біонеорганічної біохімії.
У другому розділі наведені експериментальні методики екстракції та визначення вільних амінокислот рослин, а також метод отримання комплексних сполук ренію (ІІІ).
У третьому розділі наведені результати експериментальних досліджень та їх обговорення.
У четвертому розділі наведено узагальнення результатів дослідження.
МАТЕРІАЛИ І МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕННЯ
Матеріали досліджень. Матеріалом досліджень було зерно, первинні листки та кореневі виділення інбредних ліній кукурудзи (Zea mayz L.): високолізинових ліній А 204 о2/о2, ДЛ 203 ВЛ, ДЛ 205 ВЛ, ДЛ 293 ВЛ, ліній А 204 +/+, F2, гібриду Піонер 3978, отриманих в Інституті зернового господарства УААН, і диких видів злаків (Festuca rubra L., Lolium perenne L.).
Екстракцію вільних амінокислот із зерна злакових проводили за [Плешков, 1968], з вегетативних органів рослин – за [Вінниченко, 1975].
Амінокислотний аналіз вільних амінокислот проводили: методом іонообмінної хроматографії на автоматичному амінокислотному аналізаторі Biotronik LC-5001 (Німеччина) у режимі фізіологічних рідин; методом газо-рідинної хроматографії на газовому хроматографі Chrom 5 (Чехія) за [Хроматография, 1986]; методом тонкошарової хроматографії за [Филиппович, 1975]. Визначення амінокислот на виявленій хроматограмі проводили за допомогою денситометру ДО-1М (Україна). Вимір проводили із використанням світлофільтра з пропусканням в області 510 - 640 нм; загальний вміст амінокислот визначали за допомогою нінгідринового тесту за [Sung, 1983].
Аналіз білкових амінокислот проводили на амінокислотному аналізаторі ААА 339 (Чехія) у режимі гідролізатів.
Кореневі виділення збирали в стерильних умовах. Іонообмінна смола (катіоніт марки Q-2-8C) була підготовлена за [Плешков, 1968].
Моделювання процесу фіторемедіації проводили за [Кораблева, 1997]. Дослідження процесу накопичення амінокислот рослинами, вплив стимулятора росту FeSuc (розробленого Інститутом Неорганічної Хімії ім. В.І.Вернадського НАНУ під керівництвом проф. Мазуренко Є.А. і люб’язно наданого нам) – комплексу заліза з етилендиаміндиянтарною кислотою– на цей процес проводили при кімнатній температурі в умовах грунтових культур з використанням чорнозему (рН=7,55, вміст гумусу 1,95).
Процес комплексоутворення фізіологічно активних природних речовин – вільних амінокислот проростків та зерна кукурудзи з похідним ренію (октагалогенідом диренію) проводили за [Коттон, 1985]. Вимірювання оптичних густин та електронного спектру поглинання здійснювали на приладі Specord М-40 (Німеччина).
Аналіз вмісту металів проводили на атомно-абсорбційному cпектрофотометрі AAS-30 (Німеччина), підготовку проб – за [Хавцов, 1983].
Статистичну обробку результатів проводили за [Лакин, 1980].
РЕЗУЛЬТАТИ РОБОТИ ТА ЇХ ОБГОВОРЕННЯ
1. Вільні амінокислоти насіння злаків. У вільному стані в насінні пажитниці багаторічної і костриці червоної знаходиться невелика кількість амінокислот (12 – 18 мг %) порівняно з кількістю вільних амінокислот зернівки кукурудзи (400 – 1500 мг %). Найбільш цікавою відмінністю амінокислотного пулу зерна диких злаків є велика кількість вільних тирозину і фенілаланіну, які в амінокислотному складі зерна кукурудзи не перевищують, звичайно, 0,5 – 1 %, а іноді й взагалі відсутні.
Індекси невключення (відношення кількості амінокислоти у вільному стані до кількості цієї ж амінокислоти в зв’язаному стані) (табл.1) для всіх амінокислот диких злаків приблизно на порядок (для деяких амінокислот на два порядки) нижче, ніж такі для кукурудзи.
Порівняння індексів невключення амінокислот у середені кожного виду показало, що найбільші їх величини належать ароматичним амінокислотам для диких злаків. Причому цей показник перевищує величини для транспортних форм амінокислот (Асп+Асн, Глу+Глн), які переважають у культурних форм.
Таблиця 1
Індекси невключення (%) деяких вільних амінокислот зерна кукурудзи і диких злаків,
n = 4, P=0,05
Вид Poaceae | Індекси невключення вільних амінокислот
Асп | Глу | Про | Ала | Фен | Тир
Zea mays L.
Піонер 3978
А 204 +/+
А 204 о2/о2 |
11,50+
0,57 |
0,20+
0,01 |
1,50+
0,07 |
6,00+
0,30 |
0,23+
0,01 |
0,27+
0,01
13,50+
0,67 | 11,50+
0,57 | 21,00+
1,05 | 11,50+
0,57 | 2,19+
0,10 | 5,05+
0,25
18,00+
0,90 | 39,00+
1,95 | 37,50+
1,87 | 28,50+
1,42 | 4,50+
0,22 | 10,29+
0,51
Festuca rubra L | 0,59+
0,02 | 0,03+
0,001 | 0,06+
0,001 | 0,35+
0,01 | 0,35+
0,01 | 0,79+
0,03
Lolium perenne L. | 0,17+
0,01 | 0,01+
0,001 | 0,07+
0,001 | 0,15+
0,01 | 0,24+
0,01 | 0,45+
0,02
2. Вільні амінокислоти первинних листків злаків. Первинні листки диких злаків за амінокислотним складом білків практично не відрізняються від таких для відомих рослин: переважаючими амінокислотами в них є аспарагінова, глутамінова, аланін і лейцин.
Дикі види злаків характеризуються значно меншою загальною кількістю вільних амінокислот порівняно з культурними, особливо з гібридом Піонер 3978 (в середньому майже вдвічі) [Штеменко 1993].
В первинних листках диких злаків знайдено значну кількість вільних фенілаланіну і тирозину (74,38 – 266,65 мг %). За індексом невключення (табл.2) вони перевищують всі останні.
Таблиця 2
Індекси невключення (%) деяких вільних амінокислот первинних листків кукурудзи і диких злаків, n = 4, P=0,05
Вид Poaceae | Індекси невключення вільних амінокислот
Асп | Глу | Про | Ала | Фен | Тир | Сер
Zea mays L.
Піонер 3978
А 204 +/+
А 204 о2/о2 |
0,98+
0,04 |
0,54+
0,02 |
0,13+
0,01 |
0,70+
0,03 |
0,14+
0,01 |
0,26+
0,01 |
9,49+
0,47
1,02+
0,05 | 0,12+
0,01 | 2,18+
0,11 | 6,67+
0,33 | 1,40+
0,07 | 4,67+
0,23 | 3,23+
0,16
0,49+
0,02 | 1,14+
0,05 | 3,49+
0,17 | 8,70+
0,43 | 1,90+
0,09 | 3,84+
0,19 | 3,02+
0,15
Festuca rubra L | 3,01+
0,15 | 2,94+
0,14 | 2,63+
0,13 | 8,07+
0,40 | 18,17+
0,90 | 14,43 +
0,72 | 11,01+
0,55
Lolium perenne L. | 1,69+
0,08 | 0,60+
0,03 | 1,88+
0,09 | 4,29+
0,21 | 17,14+
0,85 | 17,78 +
0,88 | 15,69+
0,78
Отже, можна говорити про знайдене нами вибіркове накопичення ароматичних амінокислот у первинних листках диких злаків. Фенілаланін і тирозин в рослинах утворюються внаслідок послідовних реакцій фосфорилювання шикімової кислоти, елімінування фосфошикімової та ортофосфата з утворенням ароматичного кільця, декарбоксилювання і дегідратації [Гудвин, 1986].
Нашими дослідженнями виявлено, що для амінокислотного пулу первинних листків диких злаків характерна висока кількість серину. Подібних даних в доступній нам літературі не знайдено. Серин відноситься до групи амінокислот, які в рослинах утворюються за циклом Кальвіна, і займає центральне місце серед них. Відомо три шляхи утворення серину, однак для проростків найбільш характерний шлях фосфорилювання [Гудвин, 1986].
Оскільки в білках первинних листків всіх форм злаків вільні фенілаланін, тирозин і серин знаходяться в звичайних кількостях, підвищена їх кількість у вільному стані, на нашу думку, може бути пов’язана з більш інтенсивною роботою вищезгаданих біосинтетичних шляхів у диких злаків порівняно з культурними.
3. Вільні амінокислоти у складі кореневих виділень злаків. Виділення амінокислот в зовнішнє середовище починається з моменту замочування насіння і може бути зафіксовано вже з перших годин набрякання зернини [Берестецкий, 1981]. Отже, термін “кореневі виділення”, який ми вживаємо для загальної суми амінокислот, які виділяються за 15 діб пророщування, є досить умовним, оскільки не враховує відсутність диференціації тканин зернівки на початку пророщування. Найбільша сумарна кількість вільних амінокислот в перерахунку на вагу однієї зернини (рис.1, в), виявлена для диких злаків. Оскільки вони мають набагато меншу вагу насіння, цей перерахунок показує їх більш суттєву видільну активність.
Рис. 1. Сумарна кількість вільних амінокислот в кореневих виділеннях різних видів
Poaceae (Zea mays L.: 1 – Піонер 3978, 2 – ДЛ 203 ВЛ, 3 – ДЛ 205 ВЛ, 4 – ДЛ 293 ВЛ,
5 – А 204 +/+, 6 – А 204 о2/о2; 7 – Festuca rubra L., 8 – Lolium perenne L.) , в мг% (а),
в мг% на одне зерно (б) і в мг% на вагу 1 зернини (в)
Для всіх форм характерна значна кількість лізину, фенілаланіну, триптофану. Проте, можна чітко визначити відмінності між кукурудзою і дикими формами злаків. Для всіх форм кукурудзи на відміну від диких форм характерне переважання у кореневих виділеннях тирозину, проліну, аланіну, лізину, фенілаланіну, триптофану. Для диких видів характерна значна кількість цистеїну, глутамінової і аспарагінової кислот, серину, основних амінокислот. Таким чином, показано генотипову обумовленість процесу виділення амінокислот. Взагалі, для кореневих виділень всіх злаків притаманний досить рівноцінний вміст всіх амінокислот, тобто нами не знайдено вибіркове накопичення певних амінокислот в пулі кореневих виділень, як це виявлено для вільних амінокислот рослинних тканин.
Амінокислоти здатні до утворення комплексів з іонами металів, оскільки вони є амполідентатними сполуками, тобто сполуками, що містять різні за природою функціональні групи, здатні до утворення координаційних сполук. Так, наявність a-амінокарбоксилатного фрагменту робить можливим утворення п’ятичленного гетероциклу іону металу з будь-якою амінокислотою. Проте, амінокислоти, що мають ще
одну іоногенну, або полярну групу, тобто більш дентатні, можуть бути більш активними у процесі утворення хелатів. Якщо прийняти за одиницю дентатність однієї іоногенної або полярної групи амінокислоти, то сумарна дентатність кореневих виділень складає для Festuca rubra L. – 272,30, Lolium perenne L. – 274,80, Піонер 3978 – 243,09, ДЛ 203 ВЛ – 238,42, ДЛ 205 ВЛ – 245,71, ДЛ 293 ВЛ – 242,82. Тобто, амінокислоти, що містяться у кореневих виділеннях диких злаків, мають більшу сумарну дентатність, ніж для кукурудзи і, відповідно, більшу здатність до комплексоутворення.
Звичайна і високолізинова лінії кукурудзи А 204 +/+, А 204 о2/о2 характеризуються значними величинами індексів невключення фенілаланіну і тирозину в зернівці в процесі пророщування.
Існує певна якісна єдність між пулом амінокислот зернівки, яка проростає, і складом кореневих виділень, а саме – наявність фенілаланіну. Ця амінокислота присутня в значній кількості в кореневих виділеннях. На 15-у добу проростання в зернівці звичайної лінії знаходиться майже вчетверо більше фенілаланіну, ніж в опейковій, а в кореневих виділеннях навпаки, знаходиться в 1,5 рази менше цієї амінокислоти. Такі ж закономірності виявлені і для лізину.
Отже, склад вільних амінокислот проростаючої зернівки за кількісним співвідношенням не відповідає вмісту пулу вільних амінокислот кореневих виділень, що свідчить про більш складний механізм виділення амінокислот, ніж просто дифузія через поверхневі тканини.
4. Підбір ефективної концентрації комплексу заліза із сукцинатом (FeSuc) для стимуляції ростових процесів. Застосування препарату FeSuc, для передпосівної обробки кукурудзи, призводить до стимуляції ростових процесів в середньому на 36 %. Особливо ефект стимуляції проявляється на лініях кукурудзи, де він досягає 46 %. Концентрація 4,5 % діючої речовини FeSuc є достатньо ефективною, подальше збільшення є не доцільним.
Дія стимулятору росту FeSuc генотипово обумовлена і виявляє вплив на ростові процеси близький до гетероауксину. Однак, слід відмітити, що стимуляція FeSuc є значнішою, ніж природного стимулятора росту. Вважається, що, оскільки FeSuc є комплексом заліза з двома сукцинатними залишками етилендиаміндиянтарної кислоти, одним із ймовірних механізмів його стимулюючої дії є інтенсифікація циклу трикарбонових кислот.
5. Вплив стимуляторів росту FeSuc і гетероауксину на склад вільних амінокислот злаків. Встановлено, що пул вільних амінокислот первинних листків злаків під дією стимуляторів росту підвищується в середньому у 1,5 рази (табл.3).
Таблиця 3
Вміст вільних амінокислот у первинних листках злаків в умовах стимуляції росту,
в % до контролю, n = 4, P=0,05
Вид Poaceae | ГА | FeSuc
Zea mays L.
Піонер 3978
А 204 +/+
F2 |
122,8+6,1 |
131,4+6,6
105,2+5,2 | 152,4+7,6
129,8+6,5 | 134,6+6,7
Festuca rubra L. | 108,3+5,4 | 110,0+5,5
Lolium perenne L | 112,4+5,6 | 111,0+5,6
Найсуттєвіша зміна пулу вільних амінокислот під дією стимуляторів росту відбувається в листках кукурудзи, в листках диких злаків цей показник кількісно практично не змінюється.
Найбільш суттєвим напрямком зміни пулу амінокислот первинних листків кукурудзи, попередньо обробленої FeSuc і вирощуваної в контрольних умовах є поява значної кількості глутаміну і глутамінової кислоти (рис.2).
Висока інтенсивність ростових процесів супроводжується накопиченням основної транспортної форми азотвмісних сполук – глутаміну. Якщо для первинних листків кукурудзи в звичайних умовах вирощування властиве переважання аспарагінової кислоти і аспарагіну (до 43 % амінокислотного пулу), то за дії FeSuc відбувається збільшення кількості глутамінової кислоти і глутаміну. Особливо яскраво це явище спостерігається для лінії А 204 +/+. Така перебудова амінокислотного пулу характерна для кукурудзи і не спостерігається у диких злаків, що підтверджує раніше описаний висновок про генотипову обумовленість перебудови пулу вільних амінокислот первинних листків за дії різноманітних факторів. Значна кількість вільних глутамінової кислоти та глутаміну в тканинах первинних листків кукурудзи, що з’являється як
Рис. 2. Газо-хроматографічне розділення вільних амінокислот первинних листків
кукурудзи А 204 +/+, вирощеної в контрольних умовах (а), за умов стимуляції FeSuc (б)
та гетероауксином (в)
відповідь на обробку FeSuc, підтверджує запропоновану нами гіпотезу про механізм дії цього регулятору росту. Якщо FeSuc значно прискорює цикл трикарбонових кислот, то логічно пояснити появу амінокислот глутамінової групи більш інтенсивною роботою a-кетоглутарат-глутаматного шунта в реакції трансамінування, а також їх транспортною функцією. Вона повинна реалізуватися в період інтенсивного росту і накопичення (оверпродукція) полівалентної (поліфункціональної) сполуки в тканинах рослин (пролін, g-аміномасляна кислота, глутамін, аспарагін), що необхідне для забезпечення різноспрямованих біосинтетичних процесів.
Нами виявлено суттєве підвищення загальної кількості вільних амінокислот в складі кореневих виділень злаків за дії стимуляторів росту (табл. 4), що досягає 300 % як для диких форм злаків, так і для деяких ліній кукурудзи.
Таблиця 4
Кількість вільних амінокислот в кореневих виділеннях злаків за умов стимуляції росту,
в % до контролю, n = 4, P=0,05
Вид Poaceae | ГА | FeSuc
Zea mays L.
Піонер 3978
ДЛ 203 ВЛ
ДЛ 205 ВЛ
ДЛ 293 ВЛ |
147,11+7,35 |
131,24+6,56
241,84+12,09 | 392,60+19,63
119,77+5,98 | 166,17+8,31
119,95+5,99 | 191,65+9,58
Festuca rubra L. | 145,95+7,29 | 154,16+7,71
Lolium perenne L | 168,75+8,44 | 260,38+13,02
Основною відмінністю формування збільшеного пулу амінокислот у кукурудзи від диких злаків під дією стимулятора росту є значна кількість основних амінокислот. Якщо в пулі кореневих виділень кукурудзи, особливо ліній, основні амінокислоти – лізин і аргінін складають 25 %, то у диких злаків він представлений досить рівнозначним внеском всіх амінокислот. Таке значне підвищення кількості вільних амінокислот у кореневих виділеннях злаків в умовах стимуляції знайдено нами вперше.
6. Склад вільних амінокислот первинних листків злаків в умовах моделі фіторемедіації. Вплив передпосівної обробки FeSuc, надлишком важких металів та сполученням цих факторів на ростові процеси костриці червоної та пажитниці багаторічної досліджувався в експериментах з використанням чорноземного грунту.
Показано, що стимулятор росту FeSuc на фоні забруднення грунту важкими металами збільшує енергію проростання насіння на 12 – 13 % порівняно з контролем. Також помітним є прискорення ростових процесів диких злаків: застосування FeSuc збільшує довжину листків проростків у середньому на 27 – 33 %. Слід відмітити, що це прискорення супроводжується підвищеною інтенсивністю поглинання рослинами солей важких металів у середньому на 59 % та їх накопиченням.
Зафіксовано зміни у вмісті важких металів, особливо для верхніх шарів грунту в експериментах із застосуванням стимулятора росту. На нашу думку, однією з причин такого явища може бути, описана вище, інтенсифікація виділення амінокислот, що відбувається за дії регулятора росту і яка теж може внести вагому частку в ефективність процесу фіторемедіації.
Дослідження пулу вільних амінокислот в первинних листках диких злаків в цих експериментах продемонстрували його значну варіабельність. Зокрема, в деяких випадках загальна кількість вільних амінокислот за дії солей важких металів і стимулятора росту збільшувалась майже вп’ятеро.
Під впливом стимулятора росту FeSuc на фоні надлишку солей металів у грунті різко збільшується кількість (і відповідно, індекс невключення) аспартату (рис.3).
Таке явище характерне для обох досліджених рослин і є дуже помітним особливо для костриці червоної, де вплив стимулятора росту призводить до майже десятикратного збільшення вказаної амінокислоти (криві а, б). Це явище може бути пояснено: 1) інтенсифікацією FeSuc транспорту в тканинах рослин в умовах пристосування до несприятливих факторів зовнішнього середовища; 2) інтенсивними гідролітичними процесами, які можуть каталізуватися іонами металів, а аспартат входить у склад білків вегетативних органів у значній кількості, і безпосереднім впливом FeSuc на цей процес; 3) поліфункціональністю аспарагінової кислоти та аспарагіну і інтенсифікацією FeSuc оксалоацетат-аспартатного шунта і таке інше. Отже, пояснення можуть торкатися безлічі біохімічних шляхів, залучених до процесу адаптації рослин до несприятливих умов.
Zn Pb Cd Cd+Zn
Рис.3. Індекс невключення вільного аспартату в первинних листках Festuca rubra L.: а – (_____), б – (__ __) і Lolium perenne L.: в – (_ _ _ -), г – (__ _ _ __) в умовах моделі фіторемедіації із застосуванням FeSuc: (__ __), (_ _ _ _) і без застосування FeSuc (____), (__ _ _ __)
В усіх експериментах в рослинах набагато більше, ніж інших металів накопичується цинку. В експериментах із солями цинку знайдено значну кількість вільних ароматичних амінокислот, що особливо характерно для тканин пажитниці багаторічної, де індекс невключення для фенілаланіну досягає 40 %, а для тирозину – близько 28 % (рис. 4). Отже, ймовірно, іони цього металу каталізують ферменти, що приймають участь в біосинтезі ароматичних амінокислот [Гудвін, 1986].
Рис. 4. Індекси невключення вільних тирозину (1, 3) та фенілаланіну (2, 4) в первинних листках Lolium perenne L. в експериментах із солями цинку без застосування (1, 2) і застосуванням FeSuc (3, 4)
За звичай, в тканинах рослин співвідношення вільних фенілаланін:тирозин більше одиниці. В наших експериментах зустрічаються зразки, де спостерігається протилежне явище, тобто вміст тирозину був більшим, ніж фенілаланіну (стимуляція FeSuc, експерименти з цинком).
Слід відзначити генотипову обумовленість реакції рослин на екзогенний вплив солей важких металів: якщо для костриці червоної характерна перебудова амінокислотного пулу за рахунок здебільшого аспартату і незначних його кількісних змін, то для пажитниці багаторічної виявлено суттєве збільшення кількості вільних амінокислот (майже в п’ять разів) з перебудовою пулу амінокислот у бік збільшення ароматичних амінокислот.
7.Дослідження можливості утворення координаційних сполук ренію (ІІІ) із сумішшю природних амінокислот. Наявність смуг поглинання в електронному спектрі поглинання в зоні 16 –18 kK (рис.5) свідчить про утворення кластерних сполук ренію (ІІІ)
з амінокислотними лігандами. Це можуть бути дикарбоксилати ( 16 kK) та трикарбоксилати ( 18 kK) диренію (ІІІ).
Рис. 5. Електронний спектр поглинання похідного ренію (ІІІ) – октагалогеніду диренію
(1) і реакційної суміші октагалогеніду диренію з природними амінокислотами (2)
Найбільш суттєвими комплексоутворювачами є аспарагінова і глутамінова кислоти, а мінорними – амінокислоти з полярними або позитивно зарядженими групами (табл.7).
Таблиця 7
Амінокислотний склад кластерних комплексів ренію (ІІІ), в %,
n=4, P=0,05
Амінокислота | Кількість амінокислот, % | Амінокислота | Кількість
амінокислот, %
Асп | 35,32+1,76 | Мет | 0,99+0,04
Тре | 5,46+0,27 | Гіс | 5,29+0,26
Сер | 14,31+0,71 | Ліз | 0,64+0,03
Глу | 23,75+1,18 | Арг | 14,22+0,71
На рисунку 6 представлені гіпотетичні структури комплексів, які отримані.
X O H
Re C – C – CH2 – COOH
X O NH2
X O Н
Re C – С – СН2 – СООН
X O NH2
Цис-дикарбоксилат Х O H
диренію (ІІІ) Re C – C – CH2 – COOH
O О NH2
Н X O Н
HOOC – CH2 – C – C Re С – С – СН2 – СООН
NH2 NH2
O О
X
Трикарбоксилат
диренію (ІІІ)
Доведена можливість отримання комплексів ренію (ІІІ) із використанням як ліганди природні амінокислоти, вилученні з рослинної сировини, що відкриває нові перспективи в галузі біонеорганічної біохімії, спрямовані на пошук напівштучних – напівприродніх лікарських препаратів.
ВИСНОВКИ
1.
Визначено склад вільних амінокислот насіння, первинних листків і кореневих виділень пажитниці багаторічної, костриці червоної і кукурудзи різних генетичних форм на перших фазах пророщування під впливом стимуляторів росту і в умовах моделі фіторемедіації. Отримані кластерні сполуки ренію (ІІІ) з амінокислотами, вилученими із рослинної сировини.
2.
Пул вільних амінокислот диких злаків пажитниці багаторічної і костриці червоної, на відміну від культурних злаків, містить значну кількість вільних фенілаланіну, тирозину і серину, для яких індекс невключення складає в первинних листках від 11 до 18 %.
3.
Кількісний і якісний амінокислотний склад кореневих виділень злаків генотипово обумовлений і характеризується відсутністю вибіркового накопичення окремих амінокислот; для кореневих виділень диких злаків знайдено більшу кількість амінокислот з полярними і іоногенними групами.
4.
Вплив синтетичного стимулятора росту – комплексу заліза з сукцинатними залишками етилендиаміндиянтарної кислоти (FeSuc) – за ефективністю подібний до гетероауксину; підібрані ефективні концентрації, розроблено схему передпосівної обробки і показано доцільність її використання для очищення грунтів від важких металів.
5.
Під дією стимулятора росту FeSuc відбуваються значні зміни вмісту вільних амінокислот злаків на перших стадіях пророщування, які виявляються в підвищенні (в 1,5 – 3 рази) їх сумарної кількості та вмісту глутамату (глутаміну) в первинних листках кукурудзи; в значному підвищенні кількості вільних амінокислот в складі кореневих виділень (в 2-3 рази) всіх вивчених форм злаків.
6.
Перебудова пулу вільних амінокислот в первинних листках диких злаків в умовах моделі фіторемедіації супроводжується вибірковим накопиченням фенілаланіну і тирозину. Вплив стимулятора росту FeSuc в цих умовах призводить до статистично достовірного підвищення аспартату (аспарагіну).
7.
Доведена можливість введення природних амінокислот, як лігандів, до складу кластерних сполук ренію (III), що є перспективними лікарськими препаратами. Переважаючими амiнокислотами у складi комплексів є аспартат (до 36 %) і глутамат (до 24 %).
СПИСОК ОПУБЛІКОВАНИХ РОБІТ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ
1.
Штеменко Н.І., Мороз Ю.Л., Пишна О.А. Вільні і зв’язані амінокислоти зерна кукурудзи різних генетичних форм при вирощуванні на пестицидному фоні // Физиология и биохимия культ.растений - 1999. - Т.31, № 4. - С.270-275.
2.
Пишна О.О., Штеменко Н.І. Вивчення впливу ростстимулюючого препарату на вміст амінокислот паростків кукурудзи// Питання біоіндикації та екології. Запоріжжя. – 2000. - 5, № 2. - С.40-47.
3.
Пишна О.О., Штеменко Н.І. Вільні амінокислоти кореневих виділень злаків за умов ростостимуляції// Вісник Дніпропетровського університету. Біологія. Дніпропетровськ. - 2000. - випуск 7. - С. 222- 226.
4.
Shtemenko N., Pyshnaya O., Mazurenko E., Pakhomov A., Misiura A. Free amino acids in root exudates of cereals during the process of growth stimulation and phyto-remediation //Proc. of the 7th International FZK/TNO Conf. on Contam. Soil. – Leipzig Germany. - 2000. - P.1270-1271.
5.
Штеменко Н.І., Сорочан О.О., Пупченко Г.А. Вільні амінокислоти первинного листя Lollium perenne L. в умовах моделі фіторемедіації // Вісник Дніпропетровського університету. Біологія. Дніпропетровськ. - 2000. - випуск 8. - С.90-94.
6.
Shtemenko N.I, Pyshnaya O.A. Role of free amino acids in adaptive functions of plants // Устойчивое развитие: загрязнение окружающей среды и экологическая безопасность. Днепропетровск. - 1995. - С.23.
7.
Pyshnaya O.A., Shtemenko N.I., Filonik I.A. Free amino acids of plants under toxic influence of radiation// 23rd Meeting of the Federation of European Biochemical Societies. Basel, Switzerland. - 1995. - P.156.
8.
Shtemenko N.I., Pyshnaya O.A., Lyholat U.V. Physico-chemical interactions between germinating cereal and contaminated soil// ISEB’97 – Meeting Bioremediation. Leipzig, Germany. - 1997. - P.133.
9.
Пишна О.О., Штеменко Н.І. Вивчення ролі вільних амінокислот в процесах адаптації рослин до різних типів стресу// VII Український біохімічний з’їзд. Київ. - 1997. - С.93
10.
Pyshnaya O.A., Shtemenko N.I. Analysis of individual free amino acids in plant tissues// 8th Symposium on Handling of Environmental and Biological Samples in Chromatography. Almeria, Spain. - 1997. - P.B6.
11.
Pyshnaya O.A., Shtemenko N.I., Petrenko I.V. Ecophisiological aspects of interaction between plants and contaminated soils// Питання біоіндикації і екології. Запоріжжя. -1998р. - С.114.
12.
Штеменко Н.И., Пышная О.А., Мороз Ю.Л., Диуф Мамаду. Изучение биохимических характеристик злаков в связи с некоторыми экологическими проблемами// Матеріали I Міжнародної конференції “Наука і Освіта’98”. - 1998. - С.77.
13.
Pychnaya O.A., Chtemenko N.I., Mazourenko E.A. Etudes des mecanismes de stimulation de la croissance par des metaux de transition avec des ligands organiques// V-e Conference Internationale. France et Ukraine, Experience Scientifique et Pratique Dans le Contexte du Dialogue des Cultures Nationales. Dnepropetrovsk, Ukraine. - 1998. - P.77.
14.
Shtemenko N.I., Pyshnaya O.A., Moroz U.L., D.Mamadu. Biochemical characteristics of cereals concerning some environmental problems// “SECO TOX’ 98” Antalya, Turkey. -1998. - P.94.
15.
Kozura O.V., Pyshnaya O.A., Shtemenko N.I., Shtemenko A.V. Amino Acids from Maize Grain in Reactions of Rhenium Clusters Formation// 6-th International Congress the Amino Acids. Bonn, Germany. - 1999. - P.105.
Сорочан О.О. Вільні амінокислоти злаків на перших фазах пророщування під впливом деяких факторів – Рукопис.
Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 03.00.04. – біохімія. – Чернівецький національний університет імені Юрія Федьковича, Чернівці, 2001 рік.
Захищається дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук, основні положення якої викладені в 15 наукових публікаціях. Дисертація присвячена вивченню впливу різних факторів зовнішнього середовища на склад вільних амінокислот злаків на перших фазах пророщування. Встановлено явище вибіркового накопичення ароматичних амінокислот і серину у тканинах диких злаків. Знайдено високий стимулюючий ефект нового стимулятора росту – FeSuc. В умовах стимуляції відбувається значне підвищення сумарних кореневих виділень, а також перебудова вільних амінокислот у первинних листках злаків. В умовах моделі фіторемедіації перебудови пулу вільних амінокислот в первинних листках диких злаків стосуються здебільшого амінокислот аспарагінової кислоти та її аміда аспарагіну, фенілаланіну і тирозину. Вперше показано можливість отримання комплексів ренію (ІІІ) з амінокислотами рослинного походження.
Ключові слова: вільні амінокислоти, вівсяниця червона, райграс пасовищний, кукурудза, перші фази розвитку, стимулятор росту, кластерні комплекси ренію (ІІІ) з амінокислотами.
Сорочан О.А. Свободные аминокислоты злаков на первых фазах прорастания под влиянием некоторых факторов – Рукопись.
Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук по специальностью 03.00.04. - биохимия. - Черновицкий национальный университет имени Юрия Федьковича, Черновцы, 2001 год.
Защищается диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук, основные положения которой изложены в 15 научных публикациях. Диссертация посвящена изучению влияния различных факторов внешней среды на состав свободных аминокислот злаков на первых фазах прорастания. Установлено явление избирательного накопления ароматических аминокислот и серина в тканях диких злаков, что может быть объяснено повышенной интенсивностью биосинтетичних путей именно этих аминокислот. Показана генотипическая обусловленность процесса выделения аминокислот корнями, в частности для всех форм кукурузы характерно превалирование тирозина, пролина, аланина, лизина, фенилаланина, триптофана, а для диких злаков – значительное количество цистеина, глутаминовой и аспарагиновой кислот, серина и основных аминокислот. Показан высокий стимулирующий эффект FeSuc на ростовые процессы всех исследованных растений, что в среднем составляет 36 %. Отмечено появление значительного количества глутамина и глутаминовой кислоты в аминокислотном пуле первичных листьев для всех образцов кукурузы. Найдено существенное повышение количества свободных аминокислот в составе корневых выделений злаков под действием стимуляторов роста: общая дентатность аминокислотного эксудата возрастает на 3,55 %, или не изменяется. В условиях загрязнения почвы тяжелыми металлами под влиянием стимулятора роста: 1) значительно увеличивается энергия проростания семян (в среднем на 13 %), а также интенсивность их ростовых процессов (в среднем на 30 %), 2) резко увеличивается количество аспартата в первичных листьях овсяницы красной (индекс невлючения достигает 14 %), 3) у райграсса пастбищного происходит характерная существенная перестройка состава ароматических аминокислот, 4) повышается количество тяжелых металлов, которые поглощаются растениями, в среднем на 59 %, 5) зафиксированы изменения в содержании тяжелых металлов в верхнем слое почвы. Впервые показана возможность получения комплексов рения (III) с аминокислотами, выделенными из растительного материала.
Ключевые слова: свободные аминокислоты, овсяница красная, райграсс пастбищный, кукуруза, первые фазы развития, стимулятор роста, кластерные комплексы рения (III) с аминокислотами.
Sorochan O.A. Free amino acids of cereals on the first stages of germination under influence of some factors – Manuscript.
The thesis for the scientific degree of candidate of biological sciences by specialisation 03.00.04 – biochemistry. – Fedkovitch Chernivtsi National University, Chernivtsi, 2001.
The presented Candidate’s is based on main principles published in 15 scientific papers. The thesis is devoted to the investigation of influence of different invironmental factors on free amino acid content in cereals on the first stages of germination. Electoral accumulation of aromatic amino acids and serine in tissues of wild cereals was shown. Genetical dependence of the process of exudation was found. Essential effect of a new growth regulator – FeSuc was demonstrated. Under growth stimulation large increase in exudation and rebuilding of free amino acids in primary leaves of cereals was shown. In condition of the model of phytoremediation rebuilding of free amino
