АКАДЕМІЯ МЕДИЧНИХ НАУК УКРАЇНИ

ІНСТИТУТ ФАРМАКОЛОГІЇ ТА ТОКСИКОЛОГІЇ

ШУМЕЙКО Олена Володимирівна

УДК 615.2:615.9:567.311:577.161

ЕКСПЕРИМЕНТАЛЬНI ДОСЛIДЖЕННЯ З ФАРМАКОЛОГIЇ АДАПТОГЕННОГО ЗАСОБУ ГЕРМОГРАНУ

14.03.05 -- фармакологія

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата медичних наук

К И Ї В - 2 0 0 1

Дисертацією є рукопис

Робота виконана в Національному медичному університеті імені академіка О.О.Богомольця Міністерства охорони здоров'я України

Науковий керівник Член-кореспондент НАН та АМН України,

заслужений діяч науки та техніки України,

доктор медичних наук, професор

ЧЕКМАН Iван Сергійович, завідувач

кафедрою фармакології з курсом клінічної

фармакології Національного медичного

університету імені акад. О.О.Богомольця

Офіційні опоненти:

доктор медичних наук Соловйов Анатолій Іванович, Інститут фармакології та токсикології АМН України, головний науковий співробітник відділу експериментальної терапії;

доктор медичних наук, професор Туманов Віктор Андрійович, Київський медичний інститут Української асоціації народної медицини, завідувач кафедрою фармакології, ректор;

Провідна установа: Одеський державний медичний університет МОЗ України, кафедра фармакології.

Захист відбудеться " 23 " травня 2001 р. о 13 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д.26.550.01 при Інституті фармакології та токсикології АМН України (03057, м. Київ, вул. Ежена Потьє, 14).

З дисертацією можна ознайомитися у бібліотеці Інституту фармакології та токсикології АМН України ( 03057, м. Київ, вул. Ежена Потьє, 14).

Автореферат розісланий "___5___" __ квітня__2001 р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради

Д 26.550.01.

кандидат біологічних наук І.В. ДАНОВА

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Пошук нових лікарських засобів та вивчення механізмів їх дії є актуальним питанням вітчизняної фармакології. Саме тому в останні роки зростає зацікавленість до нових джерел отримання фармакологічних препаратів. Такими джерелами є лікарські рослини, метаболіти організму та тканини тварин (M.Negvar, 1986; H.Werrmeister, 1990; W.Scheef, 1990; Ф.П.Тринус, 1991; О.П.Іванов, 1994; І.П.Кайдашев, 1995; О.В.Стефанов, 1996). Важливою особливістю лікарських рослин є те, що їх складові компоненти за хімічною структурою подібні до фізіологічно активних речовин організму (вітамінів, амінокислот, ферментів тощо) і тому більш природньо включаються в біохімічні процеси людського організму (І.С.Чекман, 2000).

Зародки злакових культур містять значну кількість біологічно активних речовин, які вилучають з зерна. Проте вони довгий час залишались поза увагою вітчизняних дослідників, хоча було відомо, що у зародках пшениці, жита, рису, кукурудзи, вівса містяться: вітаміни, амінокислоти, жири, біометали, пектини, цукристі речовини тощо (G.Rehfels, 1964; Л.А.Касьянова, 1993; В.І.Мар'ян, 1996). Пшеничний зародок – найцінніший природний концентрат унікальних поживних сполук, до складу якого входить велика кількість токоферолiв, каротинів, незамінних амінокислот, мікроелементів. Фармакологічні та токсикологічні властивості жиророзчинних екстрактів з зародків пшениці, отриманих методом фракціонування, в науковій літературі вивчені недостатньо.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертаційна робота виконана у відповідності з планом науково-дослідних робіт кафедри фармакології Національного медичного університету ім. акад. О.О.Богомольця і є частиною досліджень, які традиційно виконувались за планами вивчення впливу субстанцій нових біологічно активних речовин на функціональний стан організму загалом і серцево-судинну систему зокрема (№ державної реєстрації 0186U003038).

Мета і задачі дослідження. Метою дослідження було експериментальне вивчення фармакологічних і токсикологічних властивостей жиророзчинного екстракту з зародків пшениці під назвою - гермогран, отриманого методом фракціонування.

Для досягнення поставленої мети, визначили основні завдання дисертаційної роботи:

1. Вивчити нешкідливість гермограну на підставі гострої та хронічної токсичності;

2. З'ясувати особливості загальнофармакологічної та специфічної дії гермограну;

3. Встановити адаптогенну дію гермограну за умов проведення експериментального психічного і фізичного навантаження тварин;

4. Визначити вплив гермограну на діяльність серця та стан гемодинаміки;

5. Провести порівняльне дослідження антиоксидантних властивостей гермограну з вітаміном Е;

6. З'ясувати ефективність протекторної дії гермограну при передозуванні серцевих глікозидiв;

Об'єкт дослідження – фармакологічні, токсикологічні, антиоксидантні та адаптогенні властивості гермограну.

Предмет дослідження – жиророзчинний олієподібний екстракт з зародків пшениці - гермогран.

Методи дослідження. В роботі використані: токсикологічні (встановлення параметрів токсичності), фармакологічні (вивчення адаптогенної та антиоксидантної дії), патофізіологічні (визначення наявності протекторної дії на моделях пітуітринового коронароспазму та при дії токсикантів), біохімічні (з'ясування детоксикуючої активності печінки, дослідження вмісту малонового діальдегіду у печінці, оцінка показників комплексоутворення), імунологічні (вивчення проліферативної активності лімфоїдних клітин), морфологічні (оцінка гістологічних змін у внутрішніх органах) та статистичні (обробка результатів, оцінка критеріїв) методи досліджень.

Наукова новизна одержаних результатів.

Запропоновано до впровадження новий лікарський засіб гермогран на основі олії з зародків пшениці. Експериментально встановлено, що гермогран незалежно від шляху введення відноситься до речовин 4-го класу небезпеки (мало токсичні речовини) при відсутності кумулятивної дії. Вперше доведені адаптогенні властивості гермограну: позитивний вплив на фізичну та психічну працездатність, стан серцево-судинної та дихальної систем; обгрунтована можливість застосування гермограну як засобу ефективної протидії розвитку інтоксикації серцевими глікозидами і пітуітрином. Вперше на підставі вивчення фармакологічних властивостей гермограну встановлена антиоксидантна, кардіотонічна та кардіозахисна активність у поєднанні з імуномодулюючою дією.

Практичне значення одержаних результатів:

1. Узагальнені експериментальні матеріали доклінічного вивчення гермограну подані до Державного Фармакологічного Центру МОЗ України, на підставі дозволу якого (Протокол №3 від 7.03.2000 року) успішно пройдена 1 фаза клінічної апробації.

2. Матеріали дисертаційної роботи використані при розробці Технічних умов (ТУ-У-46.15.054.-94., Київ, 1994) і Регламенту на впровадження препарату в медичну практику.

3. На підставі одержаних в даній роботі результатів експериментальних досліджень по вивченню загальнофармакологічних, токсикологічних і специфічних властивостей гермограну Міністерство аграрної політики України дозволило рекомендувати гермогран до застосування у ветеринарній медицині як адаптоген.

4. Результати проведених досліджень впроваджено в науковий та учбовий процеси кафедри фармакології з курсом клінічної фармакології Національного медичного університету ім. акад. О.О.Богомольця та кафедри епізоотології Національного аграрного університету.

Особистий внесок здобувача. Автором особисто було здійснено патентно-інформаційний пошук, проведено аналіз даних літератури за темою дисертації, означено цілі та задачі дослідження, методичні підходи, відпрацьовано моделі, згідно яких виконано експериментальні дослідження. Проведено аналіз, систематизацію та статистичну обробку отриманих результатів, сформульовано основні положення та висновки роботи.

Аналіз антиоксидантної активності проведено при консультації чл.-кор. АМН України, проф. Ю.І.Губського; аналіз впливу гермограну на діяльність серця та стан гемодинаміки – при консультації д.м.н., проф. С.Б.Французової та к.б.н. Л.І.Антоненко; дослідження впливу гермограну на морфологічну структуру внутрішніх органів проведено при консультації к.м.н. О.А.Писарева, за що автор висловлює їм глибоку подяку.

Апробація результатів дисертації. Матеріали дисертаційної роботи доповідались на наукових конференціях: Міжнародній науковій конференції студентів i молодих вчених "Клиническая и экспериментальная фармакология. Новые материалы и методы в медицине" (грудень 1992 р., Київ); Першому Національному з'їзді фармакологів України (жовтень, 1995 р., Полтава); проблемній комісії "Теоретична медицина" НМУ (12.03.96 р., Київ); Науково-практичній конференції "Досягнення сучасної фармації в медичну практику" (4.10.96 р., Харкiв); Українській науково-практичній конференції "Екологічна токсикологія на порозі ХХІ сторіччя" (червень, 1997 р., Київ); Міждисциплінарній конференції ''Нейробиология стессорного поведения человека и животных'' (28.01.2000 р., Київ).

Публікації. За матеріалами дисертації надруковано 12 наукових праць, з них 4 статті у фахових наукових журналах, 4 – в збірниках конгресів та конференцій, 2 статті у наукових журналах, 1 патент на винахід та ТУ-У-46.15.054-94.

Обсяг та структура дисертації. Дисертація викладена на 153 сторінках машинописного тексту i складається з вступу, огляду літератури, опису матеріалів та методів дослідження, 3-х розділів власних експериментальних досліджень, аналізу та узагальнення результатів дослідження, висновків, списку використаних джерел. Роботу ілюстровано 21 рисунком і 47 таблицями. Бібліографія містить 260 джерел, з яких 80 іноземні.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Матеріали та методи досліджень. Об'єктом експериментального дослідження був гермогран. Це жиророзчинний олієподібний екстракт, який виділяли з зародків пшениці методом фракціонування. Метод одержання, хімічний склад, фізико-хімічні властивості відповідають вимогам ТУ-У-46.15.054-94. Дослідження фармакологічних і токсикологічних властивостей гермограну проведено на статевозрілих лабораторних тваринах: 580 - білих мишах і 616 – білих щурах, 48 - морських свинках і 12 - кролях та 8 - котах (всього 1264 тварини), які знаходились в умовах звичайного утримання та стандартного раціону.

Гостру токсичність визначали шляхом однократного введення препарату в шлунок, нанесення на шкіру, внутрішньом'язово та інгаляційно. Досліди проводили на білих мишах та щурах по 6 тварин на дозу лікарського засобу. Період спостереження складав 14 діб. Токсичність гермограну, значення максимальної (ЛД99, LCt99), середньолетальної (ЛД50, LCt50), мінімальної (ЛДmin) дії концентрацій та доз розраховували методом Лічфілда та Вілкоксона. Розрахунки токсикометричних показників проводили на кінець першого та другого тижня спостереження.

Підгостру токсичність вивчали при пероральному введенні у дозах Limас (поріг однократної гострої дії, що викликає зміни на рівні фізіологічно-пристосувальних реакцій при мінімальній кількості введення біологічно активної речовини в організм тварини), ЛД0 (максимально переносима доза, що не викликає загибелі тварин) та ЛД16 на протязі 28 діб. Екстраполяцію отриманих результатів проводили за показником коефіцієнту видової чутливості (КВЧ), який розраховували як відношення середньолетальної дози для щурів до середньолетальної дози для мишей при одноразовому застосуванні та за методом Г.М.Красовського.

Вивчення кумулятивної дії проводили на білих щурах, яким внутрішньошлунково протягом 24 діб щоденно за схемою вводили гермогран. Перші 4 доби лікарський засіб вводили у дозі 0,1 ЛД50 (897,0 мг/кг), з 5 по 8 добу, з 9 по 12 добу, з 13 по 16 добу дозу препарату підвищували у 1,5 рази на кожний період досліду. Останні 4 доби тварини отримували перорально максимальний об'єм гермограну. Оцінку результатів проводили по розрахунку відношення середньолетальної дози при одноразовому введенні до аналогічного показника при багаторазовій аплікації (коефіцієнт кумуляції).

Хронічну токсичність вивчали на різних видах тварин (гризуни-щурі, негризуни-коти) при пероральному та інгаляційному введенях гермограну у величинах кратних 0,5; 0,1; 0,01 та 0,04 ЛД50 на протязі 30 діб. Спостереження за тваринами тривало чотири місяці. За умов хронічного досліду вивчали вплив гермограну на стан периферичної крові (вміст лейкоцитів та еритроцитів); функціональний стан ЦНС за характеристиками рефлекторних і поведінкових реакцій; стан дихальної і сурфактантної системи легенів; серцево-судинної системи за показниками ЕКГ і системного артеріального тиску.

Вивчення залежності проявів дії від доз (концентрацій) гермограну оцінювали за зовнішнім станом дослідних тварин, поведінковими реакціями на зовнішні подразнення (дотик, біль, фізичне навантаження), апетитом, відношенням до води, реакцією на ”конфліктні” ситуації.

Вплив лікарського засобу на детоксикуючу активність печінки вивчали в дослідах на підставі проведення гексеналової проби (80,0 мг/кг, внутрішньоочеревинно) та при визначенні жовчоекскреторної проби – реакція з сулемою (проба Шмідта ). Функціональну активність печінки вивчали на 1, 7 та 14 добу при введенні гермограну перорально (897,0 мг/кг) та на 7, 14 і 30 добу після завершення застосування лікарського засобу.

Антиоксидантні властивості гермограну досліджували за допомогою біохемолюмінісцентного методу (Ю.І.Губський, Т.М.Волошенюк, 1995) та визначенням вмісту малонового діальдегіду у гомогенаті печінки білих щурів при застосуванні гермограну (250,0 мкг, перорально) і вітаміну Е (препарат виробництва ”Польфа”, 250,0 мкг, перорально) протягом 7 діб.

Дослідження захисно-детоксикаційної функції легенів проводили у гострому експерименті за допомогою аерогенного впливу гермограну (CL50 – середньосмертельна концентрація, що свідчить про загибель тварин при аерогенному введенні) білим щурам. Відразу по завершенні інгаляції отримували трахеоальвеолярний лаваж (через розтин трахеї вводили канюлю, з'єднану з пристроєм для 5-разового нагнітання та відсмоктування фізіологічного розчину з розрахунку 5,0 мл на 200,0 г маси тіла) і вводили білим мишам (група 10 тварин з вагою 20,2±0,36 г) внутрішньоочеревинно (1мл/20,0г маси). За методом В.Б. Прозоровського вивчали середньолетальний ефект; захистний індекс; досліджували клітинні реакції і кількість макрофагів. Виділення сурфактанта здійснювали методом фракційного екстрагування (С.Wade, 1965; Г.А.Дидковський, Л.И.Дворецький, 1980) з подальшим дослідженням клітинної реакції легенів.

Експериментальну терапію передозування гермограну вивчали на моделях з використанням максимально можливих доз лікарського засобу при різних шляхах введення. З літератури відомо (Я.Я.Балткайтіс, В.А.Фатєєва, 1991), що під впливом холестераміну суттєво зменшується всмоктування токоферолів, які в великій кількості присутні у складі гермограну. В досліді холестерамін вводили (0,8 г/кг, перорально) за годину та через 4 години після введення гермограну (897,0 мг/кг, перорально) та аналізували значення захисного індексу.

Морфологічні дослідженя головного мозку і внутрішніх органів білих щурів проводили за загальною схемою досліджень при пероральному та внутрішньом'язовому введеннях гермограну.

За методом одержання, фізико-хімічними властивостями, вмістом a-токоферолу обліпихова олія наближається до досліджуванного лікарського засобу (М.Д.Машковський, 1997). Тому обліпихова олія була використана в якості препарату порівняння.

Віднесення гермограну до адаптогенних лікарських засобів проводили у відповідності до вимог "Методичних рекомендацій по представленню документації на лікарські засоби у Фармакологічний комітет Міністерства охорони здоров'я України" (Київ - 1993 р.). Так, з'ясування дії гермограну як адаптогену вивчали в умовах експериментального "психічного" навантаження у стресово-конфліктній ситуації між тваринами на статевозрілих білих щурах. Гермогран, а також обліпихову олію (зразок порiвняння) вводили тваринам перорально, iнгаляцiйно та внутрішньом'язово у кількості, кратній 0,5ЛД50, 0,1ЛД50, Limас (в якості контролю використовували інтактних тварин). Тварини змушені були вступати в ”конфліктну” боротьбу за право знаходитись на ”острові” в скляному басейні з водою. Реєстрували швидкість прийняття ”рішення” про заняття ”острову”, здатність займати та зберігати ”панівне” становище у конфліктній боротьбі. Зміни дiєспроможностi тварин при фізичному навантаженні вивчали з використанням: плавальної проби, проби з "підвішуванням", а також проби по підняттю наважок (О.Н.Єлізарова, Л.В.Жидкова, Т.А.Кочеткова, 1974).

Вплив гермограну (0,01ЛД50, внутрішньом'язово) на серцево-судинну систему вивчали за допомогою приладу "Мiнгограф-34" 4-х канальний, фірми "Ellеma" (Швейцарія) у щурів обох статей з масою тіла 195,5±9,3 г (наркотизованих етаміналом-натрію, 40,0 мг/кг, внутрішньоочеревинно), які знаходились на звичайному режимі харчування та утримання. Реєстрували наступні показники: ЧСС (частоту серцевих скорочень), системний артеріальний тиск (систолічний, дiастолiчний, середній); ЕКГ у II стандартному відведенні; тиск у порожнині лівого шлуночку серця; силу скорочення лівого шлуночка серця. Показники вивчали в гострому (після введення лікарського засобу) і динамічному (60-90 хв після введення) дослідах. Використовуючи датчики електромагнітної флуорометрiї МF-27-1 (Японія), реєстрували об'ємну швидкість кровообігу в аорті, сонній артерії та яремній вені, хвилинний об'єм крові (ХОК) і ударний об'єм крові (УОК).

Специфічну дію гермограну вивчали на моделі коронароспазму, який викликали внутрішньоочеревинним введенням пiтуiтрину. Дослідження проводили при парентеральному введенні статевозрілим щурам, що знаходились на стандартному утриманні у віварії. Тварини були поділені на чотири групи: контрольна; щурі з пітуітриновим коронароспазмом; тварини з коронароспазмом, який був викликаний пiтуiтрином на фоні однократного введення гермограну та щурі з пітуітриновим коронароспазмом на фоні щоденного (протягом 5 діб) введення гермограну. Лікарський засіб вводили внутрiшньом'язово в дозі 110,9 мг на 1,0 кг маси тіла. Також проведені досліди з пероральним введенням (555,0 мг на 1,0 кг маси тіла) гермограну (14 діб) та обліпихової олії (та сама доза) i введенням пiтуiтрину. Останній вводили в усіх випадках внутрішньоочеревинно однократно у вигляді ампульного розчину 1,0 мл (5 ОД) з розрахунку 1,0 ОД на 1,0 кг маси тіла щура через 60 хв після введення гермограну.

Антитоксичну дію гермограну досліджували на моделі гострої інтоксикації строфантином (Б.Е.Вотчал, М.Е.Слуцкий, 1973, І.С.Чекман, 1988). Гермогран вводили тричі внутрішньом'язово один раз на добу з розрахунку 110,9 мг на 1 кг маси тіла перед застосуванням токсичних доз строфантину (10 мг/кг маси тіла тварини). Реєстрацію показників ЕКГ та артеріального тиску здійснювали у динаміці.

Імунологічні властивості гермограну вивчали за допомогою тестів in vivo та in vitro, що дають уявлення про функціональний стан різних популяцій клітин імунної системи (О.Г.Алексієва, 1975; В.А.Фрадкін, 1980). Вивчали вплив гермограну на проліферативну активність лімфоїдних клітин, індукованих фітогемаглютинином (ФГА) та ліпополісахаридом Е. соlli (ЛПС), оцінювали шкірну реакцію гіперчутливості повільного типу на введення 0,5 мл (555,0 мг) засобу. Для оцінки рівня проліферації клітин, відсотка цитотоксичної активності in vitro використовували радіометричні мітки. Дослідження проліферативної активності імунокомпетентних клітин in vivo вивчали в умовах активації мітогенезу при дії гермограну на інтактні лімфоїдні клітини.

Вивчення впливу гермограну на процеси, які розвиваються при токсичному ураженні, проводили з використанням модельних експериментів. Розраховували значення захисного індексу та середньолетальної дії за умов спільного застосування токсиканта та гермограну (897,0 мг/кг перорально, протягом 7 діб). У якості токсикантiв використані азотнокисле срібло (перорально), ветазоль (біокисна метал-силікатна сполука) та аміак (інгаляційно). За кожною з груп тварин спостерігали на протязі 30 діб.

При вивченні ранозагоюючих властивостей у якості моделі були використані термічний, хімічний та радіологічний опіки. Ефект дії гермограну порівнювали з обліпиховою олією. Порівнювальні засоби наносили з розрахунку 0,5 мл на 2,0 см2 площі опіку. Місце опіку обробляли щоденно на протязі 14 діб при загальному терміні спостереження 45 діб контактним атравматичним термометром фірми Nicon Konden (Японія).

Кількісні показники комплексоутворення гермограну з біолігандами визначали in vitro методом спектрофотометричного титрування на спектрофотометрі "Specord М-40" розрахунком константи стійкості та зміни екстинцiї речовин (метод N.J.Rose i R.S.Drego, 1959, модифікований І.С.Чекманом та В.М.Бобковим, 1998). Були обрані слідуючі біоліганди: лецитин, гістамін, MgCl2Ч2H2O, холестерин, АТФ, серотонін, АТФ-Nа2. Про можливість утворення комплексу при взаємодії гермограну та біоліганду свідчило відхилення значення оптичної густини від правила аддитивностi. Для кожної пари речовин проводили вимір оптичної густини (^D) при різних співвідношеннях початкових концентрацій гермограну (від 19,5мг/28мл до 22,6мг/25мл) та біоліганда (від 1,2мг/12мл до 5,2мг/12мл) у спиртовому розчині. Константа стійкості визначає міру стабільності комплексу, а екстинція розглядається як міра перерозподілу електронної щільності між молекулами гермограну та ліганду. Подальші розрахунки Кст і ^E проводили на комп'ютері за допомогою програми ”Snatgraphics”. По п'яти експериментальним показникам концентрації гермограну і біоліганду та ^D програма підбирала оптимальні значення Кст і ^E за методом найменших квадратів. Отримані результати дозволяють констатувати характер комплексоутворення і визначити наявність одного чи двох центрів комплексоутворення.

Статистичну обробку результатів досліду проводили загальноприйнятими методами з визначенням критерію ”Т” Стьюдента (Р.Б.Стрелков, 1998) і коефіцієнту вірогідності ”Р”.

Результати досліджень та їх обговорення.

Гермогран є біологічно активною речовиною з високою біодоступністю. У гострому і підгострому експерименті на білих мишах, щурах, кролях та кішках встановлено, що гермогран відноситься до речовин з незначно вираженою токсичністю при значеннях ЛД50 при введенні y шлунок від 8970,0 ± 450,0 мг/кг (білі щурі) до більше, ніж 15000,0 мг/кг (коти), LСt50 від 653,4 ± 27,6 мг/кг (білі щурі) до 763,6 ± 66,3 мг/кг (білі миші), при внутрiшньом'язовому введенні ЛД50 на рівні від 10824,0 ± 118,8 мг/кг (білі миші) до 11088,0 ± 79,2 мг/кг (білі щурі). Значення порогу гострої дії при пероральному застосуванні складає від 129,7 до 134,9 мг/кг.

Дослідженнями дії гермограну на різних видах тварин (гризуни та негризуни) встановлена можливість екстраполяції результатів експериментального вивчення фармакологічних та токсикологічних властивостей цього лікарського засобу з тварин на людину. Значення коефіцієнту видової чутливості не перевищувало 1,0, а розрахункове значення перорально-летальної дії для людей складатиме @45000,0 мг/кг (@3150,0 мл), що фактично є неможливим. Токсикологічна характеристика в узагальненому вигляді наведена в табл. 1.

Таблиця 1

Токсикологічна характеристика дії гермограну визначена у відповідності з ГОСТом 12.1.007-76 (статевозрілі тварини, одноразова аплікація)

Показники Вид тварин Термін визначення ефекту дії

7 доба 14 доба

Середня летальна доза (ЛД50) при введенні Білі щурі Більше 5000,0 8970,0 ± 450,0

Білі миші Більше 5000,0 8993,0 ± 203,0

у шлунок, Морські свинки Більше 5000,0 Більше 10000,0

мг/кг Кролі Більше 5000,0 Більше 15000,0

Коти Більше 5000,0 Більше 15000,0

Середня летальна Білі щурі Більше 2500,0 Більше 2500,0

доза (ЛД50) при нашкірній Білі миші Більше 2500,0 Більше 2500,0

дії, мг/кг Кролі Більше 2500,0 Більше 2500,0

Середня летальна концентрація у повітрі: Білі щурі Більше 50000,0 52700,0 ±4571,3

Білі миші Більше 50000,0 Більше 52700,0

-статична (CL50), мг/м3; Коти - Більше 52700,0

-динамічна (LCt50),мг хв/л* Білі щурі - 763,6 ± 66,3

-динамічна (LCt50),мг хв/л* Білі миші - 653,4 ± 27,6

Середня летальна доза (ЛД50) при внутрішньо-м'язовому введенні, мг/кг Білі щурі 37884,0 ± 422,2 11088,0 ± 79,2

Білі миші 46992,0 ± 343,2 10824,0 ± 118,8

Клас небезпеки 4 4

Коефіцієнт видової чутливості (КВЧ) Перорально 1,0 0,997

Парентерально 0,799 1,024

Примітка: *- інгаляція апаратом ”Електрозоль-2м”, заряд негативний.

Отримані токсикометричнi показники мають значення не тільки для загального визначення безпечності речовини, але є регламентуючими при налагодженні виробництва лікарського засобу.

При вивченні кумулятивних властивостей встановлено, що гермогран відноситься до речовин з мінімальними проявами кумулятивної дії, без суттєвих ознак морфологічних чи функціональних змін у стані здоров'я дослідних тварин при пероральному та внутрішньом'язовому шляхах введення. За весь період спостереження стан тварин був задовільним. Пероральне введення лікарського засобу тварини переносили добре. Поведінкові та рефлекторні реакції на запах, біль, дотик були адекватними, акти дефекацiї не відрізнялись від фізіологічної норми. Спостереження за "інтегральними" показниками стану здоров'я тварин не дозволяють говорити про наявність ознак ураження у хронічному досліді. Приріст маси тіла та сталий характер термометрії свідчить про відсутність порушень при застосуванні гермограну на рівні 0,1ЛД50 чи 0,1LCt50.

Максимально переносима доза гермограну у хронічному досліді при пероральному застосуванні, яка не викликає загибелі тварин знаходиться на рівні 0,1ЛД50 (900 мг/кг), поріг хронічної пристосувально-фiзiологiчної дії відповідає 90,0 мг/кг.

Негативного впливу гермограну на систему крові (вміст лейкоцитів та еритроцитів, ШОЕ) у дослідах не зафіксовано. Визначена тенденція до підвищення функціональної активності печінки шляхом впливу на детоксикуючу активність i на жовчоекскреторну функцію (по визначенню стеркобіліну у фекаліях).

Дослідження антиоксидантних властивостей було обумовлене тим, що до складу гермограну входить значна кількість токоферолів. Дані антиоксидантної активності гермограну та зразку порівняння наведені на табл.2. Отримані результати дозволяють стверджувати, що гермогран є природнім антиоксидантом, використання якого є перспективним.

Таблиця 2

Вплив гермограну на вміст малонового дiальдегiду (МДА) у гомогенатi печінки статевозрілих білих щурів

Умови досліду Кількість препарату, мг МДА, нмоль/г печінки МДА, нмоль/г білку Антиоксидантна активність, %

Гермогран 250,0 78,5 ± 15,9* 0,70 ± 0,12 46,60 ± 5,54 **

Вітамін Е 250,0 66,7 ± 11,2* 0,57 ± 0,12 46,78 ± 3,81 **

Контроль - 137,5 ± 3,5 1,19 ± 0,11 -

Примітки: 1.* - Р<0,05 по відношенню до контролю;

2.** - за 100% прийнято показники інтактних тварин.

При дослідженні захисно-детоксикацiйної функції легенів у гострому експерименті загибелі тварин не зареєстровано. Введення гермограну на рівні ЛД50 чи LCt50 приводить до зменшення числа макрофагів у клітинній реакції легенів, а при зменшенні дози та концентрації (0,1ЛД50 чи 0,1LCt50) введеного засобу кількість альвеолярних макрофагів сурфактантної системи збільшується. Таким чином, гермогран позитивно впливає на захистно-пристосувальні механізми організму тварин.

Морфологічні дослідження свідчать, що гермогран не призводить до суттєвих патологічних змін головного мозку та внутрішніх органів (серця, печінки, селезінки, нирок, лімфатичних вузлів, органів травлення). Фактично мали місце лише вікові коливання у будові внутрішніх органів тварин.

В екстремальних умовах стресово-"конфлiктної" ситуації (табл.3) при введенні щурам перорально та інгаляційно препаратів, гермогран по відношенню до обліпихової олії проявляв більш виражений позитивний вплив на показники вищої "психічної" працездатності.

Таблиця 3

Вплив гермограну і обліпихової олії на “психічну” працездатність білих щурів

Доза препаратів Швидкість прийняття рішення, хв Здатність займати "панівне" становище, % Здатність У утримувати "панівне" становище, %

гермогран обліпихова олія гермогран обліпихова олія гермогран обліпихова олія

0,5ЛД50 1,25±0,2* 1,90±0,3 85±1,2* 10±1,1* 60±2,1* 40±2,6*

0,1ЛД50 1,20±0,1* 2,31±0,2 90±3,5* 15±2,2* 80±2,4* 20±1,4

Limac 1,33±0,3* 2,23±0,2 82±2,4* 18±2,2* 80±2,3* 20±1,5

Контроль 3,5±0,3 40±2,4 24±1,2

Примітка: * - Р<0,05 по відношенню до контролю.

Отримані експериментальні матеріали доводять, що гермогран, як i обліпихова олія, сприяє підвищенню дієздатності при фізичному навантаженні. Тварини добре переносять фізичне навантаження, суттєвих відмінностей у дії препаратів не спостерігається. При проведенні перерахунку значення м'язової сили на одиницю маси тіла дослідних тварин гермогран по відношенню до обліпихової олії проявляє більш виражений ефект. Особливо суттєвою перевага стає при тривалому застосуванні гермограну. Значне збільшення працездатності при використанні гермограну спостерігали у ранні терміни з початку застосування.

Дані щодо впливу гермограну на скоротливу активність міокарду у щурів показані на рис. 1. Препарат у дозі 0,01ЛД50 маси тіла тварини при внутрiшньом'язовому введенні стимулює скорочення міокарду. Зміна скоротливої активності відбувається за рахунок зростання швидкості скорочення та розслаблення міокарду. Покращення скорочувальних властивостей міокарду (при незмінному часі активації скорочення) обумовлено збільшенням часу розслаблення серцевого м'язу, що співпадає з законом Старлінга. Це є свідченням того, що гермогран у ефективних дозах виявляє кардiотонiчнi властивості.

% змін

90 швидкість розслаблення

* лівого шлуночка серця;

80 ?

70

60

?

50 максимальна швидкість

? ? скорочення лівого шлуночка;

40 ?

30 швидкість наростання тиску

? в лівому шлуночку dp/dt;

20 ?

тиск у лівому шлуночку

10 серця;

30 60 90 Спостереження, хв

- 10 ¦

¦

частота скорочень

Рисунок 1. Вплив гермограну на діяльність серця та стан гемодинаміки у щурів

Враховуючи хімічний склад гермограну, можна передбачити його позитивний вплив на функціональний стан серцевого м'яза. Кардіозахисну активність гермограну вивчали на моделі пітуітрінового коронароспазму. Пiтуiтрин безпосередньо впливає на мембрани клітин, у тому числі i на міокард (М.Д.Машковський, 1997). Така дія супроводжується значним підвищенням артеріального тиску та коронароспазмом, яке на ЕКГ позначається зменшенням висоти та збільшенням широти зубця Т, збільшенням комплексу QRS, зниженням зубця R. Загибель тварин складає від 40 % до 50 % в період з 20 хв по 50 хв з моменту застосування пiтуiтрину. Дослідження впливу гермограну на розвиток коронароспазму у експерименті показує, що лікарський засіб практично нівелює патогенну дію токсичних доз пiтуiтрину на міокард білих щурів.

Встановлено, що введення гермограну (табл.4) практично нормалізує значення показникiв зубця Т (по висоті та ширині) i комплексу QRS.

Таблиця 4

Вплив гермограну на показники ЕКГ білих щурів на фоні пiтуiтринового коронароспазму

Умови досліду Статистичні показники ЧСС, Зубець R Зубець Т QRS,

уд/хв висота, mV ширина, с висота, mV ширина, с с

Контроль M ±m 450,0 ±17,3 0,99 ±0,16 0,021 ±0,001 0,187 ±0,003 0,038 ±0,004 0,059 ±0,004

Пітуітрин, 1,0 ОД/кг, внутрішньоочеревинно M ± m % змін 325,0 ±51,3 -27,8 0,93 ±0,21 0 0,016 ±0,002 -23,9 0,151* ±0,007 -19,3 0,064* ±0,003 +68,8 0,083* ±0,002 +40,6

Гермогран, 0,01ЛД50, внутрішньом'язово M ± m % змін 444,0 ±33,6 -1,3 0,96 ±0,16 +3,9 0,018 ±0,001 -14,3 0,180 ±0,009 -3,8 0,042 ±0,006 +10,5 0,065 ±0,009 +10,1

Гермогран (6 доба, 0,01ЛД50) і пітуітрин (1,0 ОД/кг) через 10 хв та через 60 хв M ± m % змін 460,0 ±25,6 +2,2 0,85 ±0,09 -19,5 0,020 ±0,0013 -4,8 0,184** ±0,002 -1,7 0,041 ±0,006 +8,1 0,054** ±0,006 -9,5

M ± m % змін 443,0 ±36,6 -1,6 0,90 ±0,21 -10,5 0,024 ±0,006 +22.4 0,179 ±0,004 -3,8 0,038** ±0,005 0 0,062** ±0,004 +5,2

Примітки: 1. * - Р < 0,05 по відношенню до контролю;

2. ** - Р < 0,05 відносно групи тварин, яким вводили пітуітрин.

Навіть в умовах одноразового введення гермограну в зазначених у табл. 4 дозах через 60 хв після застосування препарату не відзначали зміни у ЕКГ, які обумовлені дією пітуітрину на гладку мускулатуру.

Таким чином, на моделі пітуітринового коронароспазму експериментально доведена позитивна дія гермограну у попередженні розвитку коронароспазму у білих щурів, що переважає за ефективністю дію обліпихової олії. Враховуючи кардiотропний та антиангінальний ефекти дії гермограну, досліджуваний засіб може бути запропонований у якості потенційного фармакотерапевтичного препарату.

Відомо, що до серцевих глiкозидiв відносять речовини, які мають вибірковий вплив на діяльність серця. Отруєння глiкозидами, як правило, виникають при пероральному та внутрішньовенному застосуванні (О.І.Черкес, 1970; І.С.Чекман, С.Б.Французова, 1988). В дослідах спостерiгали гострий розвиток процесу i в разі загибелі тварин, ЧЧС збiльшувалась на ” 45 %, а у тварин, що вижили, приріст складав ” +31 %. На ЕКГ реєстрували зниження інтервалу S-T, збільшення інтервалу P-Q, зменшення до негативного зубця Т, реєстрували також окремі шлуночкові екстрасистоли.

Вплив гермограну на показники ЕКГ наведено в табл.5.

Гермогран в дозі 110,9 мг на 1 кг маси тіла тварини при внутрішньом'язевому введенні попереджує токсичні ефекти серцевих глікозидів, нормалізуючи показники ЕКГ і артеріальний тиск у тварин та нівелює ознаки інтоксикації.

Таблиця 5

Вплив гермограну на розвиток строфантинової інтоксикації (2ЛД50) за показниками ЕКГ у динаміці

Умови досліду ЧСС, Висота зубців, mV Ширина зубцiв, с Інтервали, с

уд/хв P R T P R T P-Q Q-T R-R1 QRS

Контроль 442,0 0,20 0,521 0,29 0,017 0,016 0,070 0,056 0,092 0,165 0,020

M±m 23,5 0,01 0,001 0,02 0,002 0,002 0,006 0,007 0,021 0,001 0,001

Строфантин 60 хв M±m 322,9 35,3 0,18 0,01 0,670 0,06 0,07 0,02* 0,03 0,001 0,017 0,002 0,070 0,005 0,098 0,003* 0,105 0,006 0,240 0,018* 0,030 0,002*

15 хв M±m 389,6 0,13 0,666 0,23 0,015 0,013 0,062 0,061 0,084 0,170 0,021

36,6* 0,02* 0,009 0,02** 0,001** 0,001 0,009 0,006** 0,002 0,004** 0,003

30 хв M±m 391,8 0,13 0,694 0,24 0,014 0,016 0,064 0,062 0,090 0,190 0,022

43,1* 0,01* 0,001** 0,002** 0,002** 0,001 0,001 0,002** 0,016 0,002 0,002

45 хв M±m 405,5 0,15 0,657 0,25 0,015 0,020 0,068 0,058 0,106 0,.200 0,019

43,1* 0,01* 0,123* 0,04 0,002** 0,004 0,012 0,003** 0,003 0,037 0,003

60 хв M±m 399,8 0,17 0,550 0,23 0,019 0,021 0,069 0,055 0,095 0,200 0,23

23,6* 0,02 0,012** 0,03 ** 0,002** 0,003 0,004 0,001** 0,002 0,021 0,004

90 хв M±m 440,2 0,18 0,485 0,24 0,020 0,02 0,068 0,053 0,102 0,190 0,27

53,4 0,01 0,013** 0,02 ** 0,004 0,006 0,004 0,001** 0,005 0,015 0,004

120 хв M±m 421,7 0,18 0,602 0,21 0,021 0,021 0,066 0,54 0,106 0,200 0,28

21,6* 0,02 0,079 0,03 0,006 0,008 0,001 0,002** 0,004 0,021 0,003

Примітки: 1. * - Р < 0,05 по відношенню до контролю;

2. ** - Р < 0,05 відносно групи тварин, яким вводили строфантин.

Гермогран не викликає патологічних змiн в імунній системі тварин. Гермогран у дозі 0,1ЛД50 (897,0 мг/кг, перорально) стимулює функціональну активність мононуклеарних фагоцитів, клiтин-кiлерiв, що реалізують першу ланку імунного захисту організму шляхом збільшення кількості макрофагів у клітинній реакцiї сурфактантної системи легенів. Стимуляцiя фагоцитарної активності на фоні пригнічення пролiферативної активностi Т- та В-лiмфоцитiв, що індуковані ФГА та ЛПС, розглядається як імуномодулююча дія.

Доведена ефективність застосування гермограну (897,0 мг/кг) у екстремальних ситуаціях, викликаних дією токсикантів; препарат сприяє пом'якшенню ознак отруєння та проявляє антитоксичну активність. Зменшення концентрацій та доз токсикантiв забезпечує виживання усіх тварин при використанні гермограну з профiлактично-лiкувальною метою.

Спостереження за процесами загоювання шкіри при модельних опіках доводить перевагу застосування гермограну над обліпиховою олією. Незалежно від виду опіку в дослідах не спостерігали ознак вторинного ураження шкіри чи розвитку глибоких колоїдних рубців. Швидкість загоювання опіків перевищувала контроль на 55 %.

Аналіз експериментальних матеріалів свідчить про утворення комплексів гермограну з біолігандами. Лецитин, АТФ, MgCl2 мають один центр комплексоутворення, всі інші: CaCl2·2H2O, холестерин, гістамін, серотонін, АТФ-Na2 утворюють по 2 центри. Холестерин з гермограном утворює стабільний комплекс з здатністю виступати у вигляді донора електронiв при високій реакцiйнiй спроможності до взаємодії. Серотонін також вступає у реакцію з гермограном i утворює стабільний обмін електронами між двома центрами комплексоутворення. Зниження тиску у серцево-судинній системі при введенні гермограну значною мірою обумовлено саме такими донорно-акцепторними взаємовідносинами на рівні комплексоутворення, що впливає на стан міокарду та реакції органів на введення досліджуваного лікарського засобу.

В табл. 6 наведена узагальнена характеристика властивостей гермограну у порівнянні з обліпиховою олією.

Проведені дослідження дозволяють віднести гермогран до адаптогенних лікарських засобів. Гермогран (0,1ЛД50) сприяє перенесенню ”психічних” та фізичних навантажень в екстремальних ситуаціях. Гермогран виявляє антиоксидантні властивості. У дозі 0,01ЛД50 виявляє кардіотонічну дію та кардіопротекторну властивість при пітуітриновому коронароспазмі, запобігає розвитку ураження токсичними дозами строфантину; справляє ранозагоючу дію та протидіє виникненню ускладнень.

За загальнофармакологічною і специфічною дією гермогран не поступається обліпиховiй олії, яка за даними літератури (О.І.Черкес, В.Ф.Мельникова, 1970; М.Д.Машковського, 1985; Д.О.Муравьова, 1991) рекомендована для лікування опікової хвороби, уражень іонізуючим опроміненням як знеболюючий засіб, що підвищуює епітелізацію та регенерацію тканин.

Таблиця 6

Порівняльна характеристика властивостей гермограну та обліпихової олії

№ Показник Гермогран Обліпихова олія

1. Виробник Колективне пiдприємство "Бiлацерквахлiбопродукт", обсягом 15 т на рік Виробниче хіміко-фармацевтичне об'єднання (Росія, С.-Петербург)

2. Ступінь впровадження Дозволений до використання Мінагрополітики України для ветеринарної медицини, як адаптоген (ТУ-У-46.15.054-94); пройдена 1 фаза клінічної апробації ФС. СРСР. 42-1730-86.

3. Лікарська форма Флакони темного скла: 50 і 100 мл Флакони темного скла: 50 мл

4. Клас небезпеки 4 – мало небезпечні 3 – помірно небезпечні

5. Екстраполяція на людину ЛД50, мг/кг ” 45000,0 -

6. Кумулятивна дія Відсутня Не описана

7. Вплив на серцево-судинну систему 1. Кардіотонічна дія; 2. Знімає коронароспазм (антиангінальна дія) Впливає позитивно

8. Вплив на дихальну систему Позитивний, як на вентиляційну так і на недихальну функцію Не описаний

9. Вплив на "психічну" працездатність Позитивний, суттєвий вплив Позитивний, помірний вплив

10. Фізична працездатність Значно збільшується Помірно збільшується

11. Вплив на імунну систему Імуномодулятор з позитивним впливом на моноцитарно-макрофагальний компонент Вважається позитивним

12. Вплив на токсичні ефекти Нівелює негативну дію токсикантів (азотнокисле срібло, аміак, пітуітрин, строфантин) -

13. Загоювання опіків Прискорюється Прискорюється

Таким чином, встановлена специфічна кардіозахисна, антитоксична та виражена антиоксидантна активність препарату з зародків пшениці, в поєднанні з низькою токсичністю препарату, стимулюючим впливом на психічну та фізичну працездатність, імуномодулюючою дією обумовлює доцільність та перспективність клінічного використання гермограну як адаптогену в якості засобу, що підвищуює адаптацію організму до несприятливих факторів зовнішнього середовища (іонізуюче опромінення, екстремальні ситуації, токсичні ураження лікарськими засобами).

ВИСНОВКИ:

1. Гермогран, отриманий із зародків пшениці, відноситься до мало небезпечних речовин (4 клас - ГОСТ 12.1.007-76) з значенням ЛД50 при введенні y шлунок від 8993,0±203,0 (білі миші) до ?15000,0 мг/кг (коти), поріг гострої дії (Limас) становить 129,7@134,9 мг/кг. Препарат незалежно від виду тварин та шляху введення не виявляє кумулятивної, шкiрно-резорбтивної та подразнюючої дії.

2. Дослідженнями дії гермограну на різних видах тварин встановлена можливість екстраполяції результатів експериментального вивчення фармакологічних та токсикологічних властивостей препарату з тварин на людину. Значення коефіцієнту видової чутливості не перевищує 1,0, а розрахункове значення перорально-летальної дії для людей складатиме ~ 45000,0 мг/кг.

3. Гермогран у дозі 0,1ЛД50 (897,0 мг/кг, перорально, щурі) сприяє підвищенню психічної (прискорення прийняття рішень та здатність займати панівне становище) та фізичної (зростання термінів статичної роботи і показників м'язової сили) працездатності.

4. Гермогран виявляє антиоксидантну активність (вміст МДА у гомогенаті печінки у щурів зменшується на 57,1 % ніж у контролі) та утворює стабільні донорно-акцепторні комплекси з біолігандами (серотонін, гістамін, холестерин, лецитин).

5. При місцевому застосуванні у щурів з опіками шкіри (термічні, хімічні, рентгенівські) гермогран (0,5 мл/см2) прискорює загоювання ран (на 55 % у порівнянні з контролем) та протидіє виникненню ускладнень.

6. Гермогран у дозі 0,01ЛД50 (110,9 мг/кг, щурі) зменшує частоту серцевих скорочень на 26,3%, збільшує швидкість скорочення шлуночка на 54%, проявляє кардiозахиснi властивості при пiтуiтриновому (1,0 ОД/кг) коронароспазмi, запобігає розвитку кардіотоксичної дії строфантину (10 мг/кг).

7. При пероральному застосуванні гермогран у дозі 0,1ЛД50 стимулює функціональну активність мононуклеарних фагоцитів (індекс фагоцитозу підвищується на 41,9%), збільшує кількість альвеолярних макрофагів (на 27,3 %), пригнічує пролiферативну активність Т- та В-лімфоцитів, індуковану фітогемаглютинином або ліпополісахаридом.

8. Адаптогенні властивості гермограну проявляються позитивним впливом на психічну працездатність, фізичну дієздатність, репаративними властивостями, стимуляцією клітинної ланки імунітету та неспецифічної резистентності організму.

СПИСОК ОПУБЛІКОВАНИХ ПРАЦЬ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

1. Шумейко О.В., Французова С.Б., Антоненко Л.І., Чекман І.С. Вплив гермограну на діяльність серця і стан гемодинаміки // Український кардіологічний журнал. Випуск ІІ. Київ. – 1999- №2. - С. 81-84 (внесок здобувача - 70%).

2. Шумейко О.В. Вплив гермограну на серцево-судинну систему // Вісник фармації. – Харків, 1999.- №1(19). – С. 124-126.

3. Шумейко О.В. Фармако-токсикологічні властивості гермограну //Український науково-медичний молодіжний журнал. – Київ.-1999.- №3-2000.- №1. – С. 24-25.

4. Максимов Ю.М., Шумейко О.В., Аркадьєв В.Г. Вплив гермограну на нервово-психічну та фізичну працездатність// Таврический журнал психиатрии. – 2000. - Т.