НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ

ІНСТИТУТ МІКРОБІОЛОГІЇ І ВІРУСОЛОГІЇ ім. Д.К.Заболотного

Сальник Віктор Павлович

ДК 579.262:631.811.98:633.31

ОСОБЛИВОСТІ ФОРМУВАННЯ ТА ФУНКЦІОНУВАННЯ

СИМБІОЗУ “RHIZOBIUM MELILOTI - ЛЮЦЕРНА” ТА ШЛЯХИ ПІДВИЩЕННЯ ЙОГО ПРОДУКТИВНОСТІ

Спеціальність: 03. 00. 07 - мікробіологія

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата сільськогосподарських наук

КИЇВ – 2001

Дисертацiєю є рукопис.

Робота виконана в лабораторiї бiологiчної трансформацiї азоту Інституту сільськогосподарської мiкробiологiї УААН.

Науковий керiвник: | доктор сільськогосподарських наук, ст.н.с.,

Волкогон Вiталiй Васильович,

Інститут сільськогосподарської мікробіології УААН

завiдувач лабораторiї бiологiчної трансформацiї азоту

Офiцiйнi опоненти: | доктор біологічних наук, ст..н.с.,

Іутинська Галина Олександрівна,

Інститут мікробіології і вірусології ім. Д.К.Заболотного НАНУ,

завідувач відділу загальної та грунтової

мікробіології;

кандидат сільськогосподарських наук, ст..н.с.,

Шерстобоєва Олена Володимирівна,

Інститут агроекології і біотехнології УААН,

завідувач лабораторії екології грунтових

мікроорганізмів

Провiдна установа: | Національний аграрний університет,

кафедра агромікробіології,

Кабінету Міністрів України, м.Київ

Захист вiдбудеться “19 “ грудня 2001 р. о 10 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.233.01 при Інституті мікробіології і вірусології ім..Д.К.Заболотного НАН України за адресою: м.Київ, вул.. Заболотного 154.

З дисертацією можна ознайомитись в бібліотеці Інституту мікробіології і вірусології ім..Д.К.Заболотного НАН України за адресою: м.Київ, вул.. Заболотного, 154.

Автореферат розісланий “ 16 “ листопада 2001 р.

Вчений секретар спецiалiзованої

вченої ради, к.б.н. Пуріш Л.М.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Передпосівна бактеризація насіння бобових культур біопрепаратами на основі селекціонованих активних штамів Rhizobium на сьогодні є заходом, що широко застосовується в рослинництві. Вважається, що утворений за рахунок інтродукованого штаму бобово-ризобіальний симбіоз активно функціонує протягом всього періоду життя рослин. Для однорічних бобових таке твердження не викликає сумніву. Стосовно ж багаторічних бобових культур, зокрема кормових трав, питання не є остаточно вирішеним.

Так, в дослідах з конюшиною (Т.В.Смирнова, 1983) на другий рік життя рослин відмічено зменшення кількості азотофіксувальних бульбочок, утворених інтродукованим штамом, з 68 до 50%, а на третій рік - до 10%. Невідомо, чи це унікальна особливість, притаманна лише конюшино-ризобіальному симбіозу, чи вона досить поширена. Якщо ця особливість поширена, то слід прийти до висновку, що ефективність симбіозу, утвореного за участю інтродукованого штаму та багаторічної бобової рослини, на другий та наступні роки вегетації може різко знизитись, оскільки для ефективного симбіозу необхідно утворення активним штамом не менше 50% бульбочок до їх загальної кількостіЛ.М.Доросинський, 1989).

У зв`язку з цим важливо встановити особливості функціонування інтродукованих штамів Rhizobium за роками вегетації рослин. Вивчення даного питання, крім теоретичного, має практичне значення, оскільки на основі його вирішення базується розробка заходів регуляції азотофіксувальних симбіозів бульбочкових бактерій з багаторічними рослинами.

В даній роботі особливості розвитку та функціонування бобово-ризобіального симбіозу, а також способи його регуляції, досліджували на прикладі взаємодії Rhіzobіm melіlotі з люцерною - культурою, яка займає провідне місце серед бобових за здатністю акумулювати молекулярний азот в симбіозі з бульбочковими бактеріями.

Зв`язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Робота виконана у відповідності з науково-технічною програмою УААН "Родючість грунтів" (підпрограмою "Розробити високоефективні технології підвищення родючості грунтів за допомогою мікробіологічних препаратів")U004584) ; державною програмою "Використання вуглеамонійних солей в сільському господарстві України"U00482).

Мета та завдання досліджень. Мета роботи - встановити закономірності формування та функціонування азотофіксувального симбіозу “R.іlotі - люцерна” за участю інтродукованих штамів і спонтанної мікрофлори та вивчити вплив стимуляторів росту рослин на симбіоз.

Виходячи з мети досліджень, вирішувались такі завдання:

- виявити особливості взаємодії інтродукованих штамів R.іlotі з люцерною на протязі трьох років вегетації рослин;

- визначити симбіозну ефективність бульбочкових бактерій люцерни під впливом синтетичних стимуляторів росту;

- дослідити розвиток азотофіксувального симбіозу “R.іlotі - люцерна” під впливом рістстимулятора триман-1;

- розробити шляхи активізації люцерно-ризобіального симбіозу.

Об’єкт досліджень: бульбочкові бактерії R. melіlotі та рослина-хазяїн люцерна посівна.

Предмет досліджень: азотофіксувальний симбіоз “R.іlotі - люцерна”, особливості його формування та функціонування за участю інтродукованих штамів і спонтанної мікрофлори та під впливом стимуляторів росту рослин.

Наукова новизна одержаних результатів. Вперше показано, що стан азотофіксувального симбіозу “R.іlotі-люцерна” зазнає суттєвих змін за роками життя рослин. Кількість азотофіксувальних бульбочок, утворених за рахунок активних інтродукованих штамів, на другий рік зменшується до рівня, коли вони не можуть бути відповідальними за азотонакопичення. На третій рік зустрічаються поодинокі бульбочки, утворені інтродукованим штамом R.іlotі. Азотофіксувальний симбіоз при цьому формується за участю спонтанної мікрофлори.

За допомогою методу ізотопного розбавлення показано збільшення ефективності азотофіксувального симбіозу при застосуванні біостимулятора триман-1.

Вперше методом електронної мікроскопії на ультратонких зрізах показано прискорений органогенез бульбочок під дією триману-1: більш ранній вихід клітин R.іlotі з інфекційної нитки та утворення бактероїдів; за рахунок зростання розмірів бактероїдів та їх більш щільного розміщення в тканинах змінюється ультраструктура бульбочок.

Показано, що формування азотофіксувального симбіозу з пролонгованою активністю можливе при поетапному застосуванні бактеризації і рістстимулятора.

Практичне значення роботи. Експериментально обгрунтовано та запропоновано заходи управління процесом азотофіксування в умовах люцерно-ризобіального симбіозу. Рекомендовано поетапне застосування передпосівної бактеризації люцерни активними штамами R.іlotі та обробки вегетуючих рослин розчином стимулятора росту триман-1 на другий та наступні роки користування травостоєм. Це дозволяє підтримувати симбіоз “R.іlotі -люцерна” в активному стані, що забезпечує додаткове надходження біологічного азоту в рослини, сприяє поліпшенню якості продукції та зростанню урожайності культури.

Результати досліджень були впроваджені в Дослідному господарстві Інституту сільськогосподарської мікробіології в 1999 та 2000 роках.

Особистий внесок здобувача Автор власноручно провів всі лабораторні експерименти, результати яких наведені в дисертації. Польові досліди проводились за участю інших співробітників лабораторії біологічної трансформації азоту. Постановка завдань та обговорення одержаних результатів проводились спільно з науковим керівником.

Електронно-мікроскопічні дослідження виконано автором в лабораторії фітовірусології Інституту с.-г. мікробіології під керівництвом ст.н.с. О.Є.Мамчура; визначення ізотопного складу азоту в зразках виконано в лабораторії радіології Інституту землеробства УААН під керівництвом інженера В.В.Гірника.

Апробація роботи. Матеріали дисертації були представлені на робочій нараді "Використання можливостей біологічної азотфіксації в сучасному ресурсозберігаючому землеробстві" (Ялта, 1997); на 7-й науково-практичній конференції "Нетрадиційне рослинництво, екологія, здоров`я" (Сімферополь, 1998); на Міжнародному симпозіумі ВПС МОББ "Промислові технології виробництва та застосування засобів біологізації землеробства. Моніторінг ентомофагів" (Одеса,1999); на 8-му Міжнародному симпозіумі "Нетрадиційне рослинництво, екологія та здоров`я" (Алушта, 1999); на конференції молодих вчених Інституту с.-г. мікробіології УААН (Чернігів, 1999); на II установчому з’їзді УМТ (Чернігів, 2000); на звітних сесіях Інституту с.-г. мікробіології УААН (1996-1999рр).

Публікації. За матеріалами дисертації опубліковано 12 робіт, в тому числі 3 статті в фахових виданнях.

Обсяг і структура роботи. Дисертація складається із вступу, огляду літературних джерел, основної частини, висновків, та списку використаної літератури, який включає 244 першоджерела (з них 80 іноземних), додатків А і Б.

Загальний обсяг роботи становить 146 сторінок. Робота ілюстрована 30 таблицями і 13 рисунками.

ЗМІСТ РОБОТИ

РОЗДІЛ 1. ОГЛЯД ЛІТЕРАТУРИ

Складається з трьох підрозділів, в яких представлено літературні дані щодо особливостей формування, розвитку та функціонування бобово-ризобіального симбіозу. Проаналізовано проблему сапрофітного та симбіотрофного етапів в життєдіяльності бульбочкових бактерій. Висвітлено роль бобових рослин в підвищенні родючості грунтів та антропогенні прийоми регуляції активності бобово-ризобіального симбіозу.

На основі аналізу наукової літератури обгрунтовано необхідність проведення досліджень по темі дисертації.

РОЗДІЛ 2. ОБ’ЄКТИ ТА МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ.

Об`єктами досліджень були бульбочкові бактерії люцерни: Rhizobiumіlotі шт. 425а та Rhizobium melіlotі шт.126. Дослідження проводили з районованими сортами люцерни Надєжда та Сінская, селекціонованими в Інституті зрошувального землеробства УААН, та сортом Зайкевича, який виведено Полтавською обласною сільськогосподарською дослідною станцією. Сорт Надєжда відноситься до виду люцерни посівної (Medіcagoіva L), синьогібридної групи сортотипів. Сорт Сінская відноситься до строкатогібридної групи. Сорт Зайкевича належить до люцерни мінливої (Medіcago varіa Mart.) синьогібридного сортотипу.

Для вивчення приживання бульбочкових бактерій R.іlotі на коренях люцерни та визначення частки бульбочок, утворених інтродукованим штамом за роками вегетації рослин, застосовували метод генетичного маркування популяцій (V.Obaton, 1971). Антибіотикостійкі мутанти одержували з використанням градієнту концентрації стрептоміцинуФ.Герхардт,1983).

Паралельно з використанням методу генетичного маркування проводили дослідження за допомогою серологічного методу. Преципітуючі антисироватки одержували за методикою Всесоюзного інституту с.-г. мікробіології (1981), в нашій модифікації. Реакцію преципітації в гелі проводили за Оухтерлоні (В.М.Никитин, 1982).

В дослідах вивчали вплив на люцерно-ризобіальний симбіоз стимуляторів росту рослин серії "Флора", синтезованих в Одеському сільськогосподарському інституті В.А.Седлецьким і В.Г.Страховим, та рістстимулятора триман-1, синтезованого в НІЦ "АКСО" Інституту біоорганічної хімії та нафтохімії НАН України П.Г.Дульнєвим.

Вплив різних концентрацій триману-1 на розвиток чистої культури R.іlotі вивчали в умовах періодичного культивування з подальшим мікроскопуванням (МБИ-6). Паралельно проводили дослідження з використанням методу дисків на агарі (Й.Сэги, 1983).

Вивчення активності азотофіксування в кореневій зоні рослин проводили у вегетаційних та польових дослідах безпосередньо в посудинах для вирощування рослин та в грунтово-рослинних монолітах ацетиленовим методом (Stewart W. et.al., 1967, Hardy R.W.F., 1968) в модифікації В.В.Волкогона (1984,1987). Вміст етилену в пробі аналізували на газовому хроматографі "Chrom-4" з полум`яно-іонізаційним детектором на колонці з b`-b`-оксидипропіонітрілом. Температура термостату - 50ОС, витрата газівмл/ хв): водень - 30, азот - 100, повітря - 500.

Активність азотофіксування люцерно-ризобіального симбіозу визначали також ізотопним методом з 15N (метод ізотопного розбавлення) при постановці модельних дослідів на промитому та прожареному при 800ОС річковому піску з сумішшю Прянишнікова в умовах люміностату, за методикою Інституту землеробства УААН). Підготовку зразків до масспектрометричного аналізу проводили за методикою, описаною в роботі Н.М.Мальцевої та В.М.Юрченко (1971). Ізотопний склад азоту в зразках визначали на масспектрометрі МИ-1305.

В електронномікроскопічних дослідженнях для заливки бульбочок використовували суміш смол: ЭПОН-812, DDSA, MNA і DMP-30. Ультратонкі зрізи одержували на ультрамікротомі B-S490A"Тesla" і проглядали на електронному мікроскопі В-S540 "Tesla".

Нітратредуктазну активність рослин під дією рістстимулюючих речовин визначали в надземній масі рослин (А.И.Ермаков, 1972).

Кількість хлорофілу А і хлорофілу Б в листках люцерни виявляли спектрофотометричноА.М.Гродзинский, Д.М.Гродзинский ).

Вміст азоту в рослинах розраховували за К`єльдалем.

Кількість білка в надземній масі люцерни визначали за Лоурі.

Загальну та активну поглинальну поверхні коренів визначали спектрофотометрично (Д.Г.Звягинцев, 1980).

Польові досліди проводили згідно з методикою проведення дослідів по кормовиробництву на дерново-підзолистому пилувато-супіщаному грунті дослідного господарства Інституту сільськогосподарської мікробіології УААН (рНсол - 5.10; вміст гумусу - 0.9-1.2 % ) та сірому лісовому крупнопилувато-супіщаному грунті (рНсол - 6.3; вміст гумусу - 1.6-1.9 %;) дослідного господарства Інституту кормів УААН. Площа дослідних ділянок на дерново-підзолистому грунті складала 21м2, а на сірому лісовому - 50м2. Повторність в дослідах - чотириразова. Розміщення ділянок рендомізоване.

Виробничий дослід на площі 30 га проводили на темно-сірому грунті в дослідному господарстві Інституту с.- г. мікробіології УААН (рНсол - 5.2; вміст гумусу - 2.74%).

Статистичну обробку даних проводили за Б.А.Доспєховим (1985).

Економічне обгрунтування запропонованого прийому активізації процесу симбіозного азотофіксування розраховували згідно методичних рекомендацій (А.М.Говорунов та ін., 1991).

Біоенергетичну оцінку проводили згідно з методикою Всесоюзної сільськогосподарської академії (Є.І.Базаров та ін., 1983).

РОЗДІЛ 3. ОСОБЛИВОСТІ ВЗАЄМОДІЇ ІНТРОДУКОВАНИХ ШТАМІВ RHIZOBIUM MELІLOTІ З ЛЮЦЕРНОЮ

Для вивчення ступеню приживання бульбочкових бактерій R.іlotі на коренях люцерни, та визначення частки бульбочок, утворених інтродукованим штамом, за роками вегетації рослин паралельно використовували два методи - генетичного маркування та серологічний.

Проведені дослідження (рис.1) свідчать, що інокуляція люцерни приводить до утворення інтродукованим штамом 60-70% бульбочок в перший-другий місяць розвитку рослин і ця кількість залишається майже незмінною в перший рік. На другий рік вегетації рослин їх чисельність знижується до 5-10%. На третій рік тільки поодинокі бульбочки містили штам-інокулянт. Їх кількість не перевищувала 1% від загальної кількості бульбочок. Дані, одержані стосовно штамів R. melіlotі 425а та 126 досить близькі.

Рис. 1 Частка бульбочок на коренях люцерни, утворених інтродукованим штамом Rhizobium melіlotі 425а, за роками життя рослин (польовий дослід):

1 - червень, 2 -серпень, 3 – вересень;

- дані, одержані за допомогою методу генетичного маркування;

- дані, одержані за допомогою серологічного методу.

Таким чином, ситуація з інтродукованими в кореневу зону люцерни штамами R.іlotі подібна до описаної Т.В.Смирновою (1983) щодо штамів бульбочкових бактерій конюшини. Отже, ця особливість не є унікальною і поширена в природі. Зменшення частки активних бульбочок в загальній їх масі призводить до зниження ефективності симбіозу. У зв`язку з цим виникає необхідність активізації функціонування бобово-ризобіального симбіозу на другий та наступні роки користування травостоєм.

Оскільки повторна бактеризація в умовах сформованого агробіоценозу недоцільна, необхідне проведення пошуку інших факторів впливу на розвиток та функціонування люцерно-ризобіального симбіозу.

РОЗДІЛ 4. СИМБІОЗНА ЕФЕКТИВНІСТЬ RHIZOBIUM MELІLOTІ ПІД ВПЛИВОМ СИНТЕТИЧНИХ СТИМУЛЯТОРІВ РОСТУ РОСЛИН

Одним із факторів підсилення активності азотофіксування в кореневій зоні бобових рослин можуть бути фітогормони. Дія природних регуляторів росту на активність процесу симбіозного азотофіксування вивчалась рядом дослідників (В.Д.Тагиев, 1965; Р.А.Кукайн, 1974), однак ці роботи не одержали належного розвитку. Однією з причин такого стану проблеми є та обставина, що фітогормони складно застосовувати у виробничих масштабах через високу вартість цих препаратів. Перспективними в такій ситуації можуть бути синтетичні регулятори росту.

Наші дослідження були спрямовані на скринінг стимуляторів росту рослин за їх впливом на розвиток та функціонування люцерно-ризобіального симбіозу та вивчення способів їх застосування (обробка насіння; обробка вегетуючих рослин).

Результати вегетаційних та польових дослідів свідчать, що всі досліджені рістстимулятори активно впливають на люцерно-ризобіальний симбіоз, підвищуючи в різній мірі нодуляційну здатність бактерій та азотофіксувальну активність бульбочок, утворених за участю спонтанної мікрофлори. Причому вплив окремих рістстимуляторів на дані показники проявляється навіть більшою мірою, ніж вплив інокуляції активними штамами R.іlotі (рис.2).

Рис. 2. Ефективність бобово-ризобіального симбіозу під впливом стимуляторів росту рослин (вегетаційний дослід):

А - кількість бульбочок, утворених на люцерні шт.425а або спонтанною мікрофлорою; Б - активність азотофіксування; 1 - контроль; 2 - бактеризація R. melіlotі шт. 425а;

варіантах 3-7 рослини обробляли розчинами рістстимуляторів в концентрації: 3 - триман-1, 0.001%; 4 - флора-1, 0.01%; 5 - флора-2, 0.01%; 6 - флора-3, 0.01%; 7 - флора-4, 0.01%.

Сумісне застосування рістстимулятора та штучної бактеризації не приводило до синергичного ефекту. Більш того, спостерігали навіть деяке зниження активності азотофіксування при поєднаному застосуванні обох факторів у порівнянні з використанням самої бактеризації чи рістстимулятора, що може свідчити про надмірну кількість рістстимулюючих речовин при цьому.

Крім вивчення впливу рістстимуляторів на ефективність люцерно-ризобіального симбіозу та продуктивність люцерни при передпосівній обробці насіння досліджували вплив розчинів рістстимуляторів на симбіозне азотофіксування при обробці ними вегетуючих рослин. Скринінг синтетичних стимуляторів росту дозволив вибрати для детальних досліджень стимулятор росту рослин ауксиново-цитокінінового типу дії триман-1. Ця сполука синтезована вітчизняними вченими, пройшла Держреєстрацію і дозволена до застосування. Оптимальна концентрація розчину триману-1(0.001%) була попередньо підібрана в умовах вегетаційного досліду.

Нами встановлено, що поверхнева обробка рослин триманом-1 приводить до суттєвого збільшення кількості бульбочок на коренях люцерни та підвищення азотофіксувальної активностірис.3).

Рис. 3. Вплив бактеризації R. melіlotі, шт. 425а та триману-1 на формування та активність люцерно-ризобіального симбізу в залежності від способів застосування стимулятора (вегетаційний дослід): 

А - кількість бульбочок; Б - активність азотофіксування кореневих бульбочок; 1 - контроль (без обробки); 2 - бактеризація R. melіlotі, шт. 425а; 3 - обробка насіння триманом-1; 4 - бактеризація + обробка насіння триманом-1; 5- обробка вегетуючих рослин триманом-1; 6 - бактеризація + обробка вегетуючих рослин триманом-1.

При цьому достовірно підвищується урожайність культури. Обробка вегетуючих рослин розчинами рістстимуляторів, безумовно, має значні переваги над передпосівною обробкою насіння, оскільки при цьому є можливості для господарчого маневру: кількість обробок буде залежати від їх необхідності, а можливості не обмежені часом (обробка як на другий рік вегетації рослин, так і в наступні роки).

еревірка триману-1 в умовах польового досліду підтвердила його ефективність при нанесенні на вегетуючі рослини. Застосування триману-1 підвищує нодуляційну здатність бульбочкових бактерій на рослинах люцерни, сприяє активізації процесу симбіозного азотофіксування. Під впливом триману-1 збільшується урожайність люцерни на 15-20% та поліпшується якість урожаю за рахунок підвищення вмісту білка в продукції.

РОЗДІЛ 5. РОЗВИТОК АЗОТOФІКСУВАЛЬНОГО СИМБІОЗУ “RHIZOBIUM MELІLOTІ – РОСЛИНИ ЛЮЦЕРНИ” ПІД ВПЛИВОМ ТРИМАНУ-1

Оскільки повторна бактеризація вегетуючих рослин недоцільна, а застосування стимуляторів росту рослин, зокрема триману-1, активно впливає на розвиток та функціонування симбіозу, виникає необхідність вивчення можливості поєднання бактеризації активним штамом R.іlotі та обробки рослин люцерни розчином стимулятора росту в перший рік вегетації та наступні роки користування травостоєм і вивчення функціонування симбіозу при цьому.

Дослідження, проведені в умовах багатофакторного польового досліду, підтвердили попередні висновки про те, що ефективність бактеризації на другий, а тим більше на третій роки життя рослин знижується.

Про це свідчать як дані щодо кількості азотофіксувальних бульбочок, утворених активним штамом, активності азотофіксування, так і дані, що стосуються урожаю рослин. На другий та третій роки прибавка урожаю від бактеризації в порівнянні з контролем не була статистично достовірною. Обробка ж вегетуючих рослин розчином триману-1 на другий рік вегетації сприяє підвищенню бульбочкоутворення на рослинах, азотофіксувальної активності симбіозу (табл.1) та урожайності. При цьому суттєво збільшується кількість білка в урожаї.

Слід відмітити, що поєднане застосування бактеризації і рістстимулятора в перший рік вегетації не приводить до синергичного ефекту. Отже й застосування триману-1 в перший рік життя недоцільне. Обробка ж рослин стимулятором росту на другий та наступні роки вегетації хоча й не приводить до зміни співвідношення між бульбочками, утвореними активним штамом та спонтанними бактеріями, але значно підвищує азотофіксувальну активність симбіозу.

Обробка вегетуючих рослин люцерни третього року життя розчином триману-1 підтвердила позитивний вплив цього прийому на продуктивність люцерно-ризобіального симбіозу - суттєво зросли показники нодуляційної та азотофіксувальної активності.

Таблиця 1.

Активність утворення бульбочок, індукованих R.melіotі шт.425а, та їх
нітрогеназна активність на другий рік життя рослин |

Кількість бульбочок | Нітрогеназна активність

N п/п | Варіант | Одиниць/
рослину | % до відпо-відних варіантів блоку А | Мкмоль С2Н4/(моноліт годину) | % до відпо-відних варіантів блоку А

Без обробки рослин триманом-1 (блок А)

1 | Контроль | 30 | 100 | 0.77 | 100

2 | Бактеризація R.melіlotі
| 29
| 100
| 1.05
| 100

3 | Обробка насіння триманом-1
| 29
| 100
| 0.66
| 100

4 | Бактеризація + обробка насіння триманом-1
| 34
| 100
| 1.38
| 100

5 | Бактеризація + обробка вегетуючих рослин триманом-1 в перший рік життя

| 45

| 100

| 0.99

| 100

Обробка вегетуючих рослин (блок Б)

6 | Контроль | 54 | 180.0 | 2.31 | 300.0

7 | Бактеризація R.melіlotі
| 50
| 172.4
| 2.42
| 230.5

8 | Обробка насіння триманом-1
| 48
| 165.5
| 2.37
| 359.1

9 | Бактеризація + обробка насіння триманом-1
| 92
| 270.6
| 3.03
| 219.6

10 | Бактеризація + обробка вегетуючих рослин триманом-1 в перший рік життя |

88 |

195.6 |

3.08 |

311.1

НІР05 по досліду 27 1.22

для внутрішньоблокових варіантів:

17 0.70

для обробки рослин триманом-1

12 0.58

Незважаючи на несприятливі кліматичні умови 1999 року приріст урожаю склав 8-16% в порівнянні з варіантами, де не проводили обробку вегетуючих рослин стимулятором. При цьому прибавки від передпосівної бактеризації насіння не одержали. Це стає зрозумілим, якщо врахувати, що кількість бульбочок, утворених інтродукованим штамом на третій рік життя рослин люцерни, склала менше 1% від загальної кількості бульбочок по всіх варіантах досліду.

Одержані результати дозволяють рекомендувати заходи управління процесом азотофіксування в агроценозах з люцерною, які забезпечують підтримку симбіозу в активному стані. Вони полягають в передпосівній бактеризації та обробці вегетуючих рослин триманом-1 на другий та наступні роки їх життя. Іншими словами, застосування цих агрозаходів повинно бути розділено в часі, тобто поетапне.

Апробація такого підходу в умовах виробничого досліду, підтвердила його перспективність. Економічна ефективність рекомендованих заходів склала 319 грн/га. При цьому суттєво зростає біоенергетична ефективність. Так, вміст енергії в додатковій продукції перевищує енергію витрат в 11.36 раз.

РОЗДІЛ 6. МЕХАНІЗМ ВПЛИВУ СТИМУЛЯТОРА РОСТУ РОСЛИН ТРИМАНУ-1 НА РОЗВИТОК ТА ФУНКЦІОНУВАННЯ ЛЮЦЕРНО-РИЗОБІАЛЬНОГО СИМБІОЗУ

Підвищення ефективності функціонування симбіозного апарату під впливом стимулятора підтверджують дослідження проведені при використанні методу мічених атомів (метод ізотопного розбавлення). Аналіз ізотопного складу азоту в біологічному урожаї показує, що підвищення урожайності під впливом стимулятора відбувається саме за рахунок біологічного азотутабл.2).

Триман-1 сприяє фіксуванню атмосферного азоту в тій же мірі, що й бактеризація насіння активним штамом ризобій. Одночасне застосування триману-1 та бактеризації не привело до сумарного ефекту. Це свідчить про недоцільність такого поєднання в перший рік вегетації рослин.

Дія рістстимулятора триман-1 обумовлена збільшенням кількості бульбочок на коренях люцерни та підвищенням їх нітрогеназної активності.

Вивчення впливу триману-1 на ріст R.іlotі (шт. 425а і 126) в умовах чистої культури (періодичне культивування) свідчить, що невисокі концентрації речовини в живильному середовищі (еквівалентні концентрації робочого розчину - 0.001%) не впливають на розвиток бактерій.

Разом з тим, електронномікроскопічне вивчення бульбочок, утворених на коренях рослин люцерни, що оброблялися триманом-1, показує більш ранній вихід бактерій з інфекційних ниток та утворення бактероїдів, в порівнянні з контрольними. Ультраструктура бульбочок змінюється за рахунок збільшення розмірів бактероїдів та їх більш щільного розміщення в рослинних клітинах.

Таблиця 2.

плив стимулятора росту триман-1 на азотне живлення рослин люцерни

Варіант | Вага

рослин

(надземна
| Азот, мг/посудину |

Прибавка біологічного азоту,

маса + корені), г/ посудину | загальний (А) | добрив (Б) | насіння

(В) | біоло-гічний
(А-Б-В) | % до контролю

Контроль | 1.01 | 18.57 | 2.70 | 0.67 | 15.20 | 0

Бактеризація R.melіlotі,
шт.425а
| 1.36
| 22.09
| 2.52
| 0.67
| 18.90
| 24.34

Триман-1 | 1.41 | 21.70 | 2.38 | 0.67 | 18.65 | 22.70

Бактеризація + триман-1
| 1.25
| 20.82
| 2.30
| 0.67
| 17.85
| 17.43

НІР05 | 0.16 | 1.42 | 0.17 | 1.31

Під впливом стимулятора можуть інтенсифікуватися енергетичні процеси в рослині, що в значній мірі забезпечить підвищення продуктивності люцерни. Дослідження, спрямовані на вивчення впливу рістстимулятора триман-1 на хлоропластогенез рослин люцерни підтверджують цей висновок. Під впливом триману-1 достовірно зростає кількість хлорофілу А. Крім того, що хлорофіл А є головним пігментом в хлоропластах, він є єдиним фотосинтетично активним пігментом. Роботу його можна охарактеризувати продуктивністю, тобто накопиченням сухої речовини на одиницю пігментуТ.С.Лебедева, К.М.Сытник, 1986). Збільшення вмісту хлорофілу А може вказувати на збільшення кількості фотосинтатів, що надходять до коренів. При цьому азотофіксувальні бульбочки будуть забезпечуватись більшою кількістю вуглецю та енергії.

Наші дослідження показали, що під впливом триману-1 зростає активність рослинної нітратредуктази - ключового ферменту азотного обміну, який каталізує перший етап відновлення нітратів до аміаку. При інтенсивному залученні сполук азоту в метаболізм рослини можна прогнозувати і більш інтенсивне збіднення прикореневої зони на зв`язані форми азоту, що в свою чергу може привести до активізації процесу азотофіксування.

ідвищення енергетичного статусу рослин та інтенсифікація конструктивного метаболізму потребують і більшої кількості інших, крім азоту, хімічних елементів та сполук, що надходять з грунту. На користь цього припущення свідчать результати досліджень, які показують, що під впливом триману-1 збільшується як загальна, так і активна поглинальна поверхні коренів. Збільшення кількості бульбочок на коренях люцерни під впливом стимулятора можна пояснити саме збільшенням загальної поверхні коренів (розширюється екологічна ніша для утворення нових бульбочок ).

Таким чином, позитивна дія триману-1 на стан азотофіксувального симбіозу є комплексною - через вплив на мікро- і макросимбіонти.

Одержані результати щодо складових механізму впливу триману-1 на розвиток та функціонування азотофіксувального симбіозу згруповані в схемірис. 4).

активізація азотасиміляторних ферментів рослин

(підвищення вмісту білка)

вплив на процес форму-вання азотофіксуваль-ного симбіозу

(збільшення загальної чисельності азотофік-сувальних бульбочок, підвищення активності азотофіксування, зміна ультраструктури бульбочок) |

хематичне зображення рослини люцерни |

розвиток

кореневої системи

збільшення абсорбційної активності коренів

(збільшення можливостей засвоєння поживних речовин)

Рис.4. Схема впливу стимулятора росту рослин триману-1 на ефективність азотофіксувального симбіозу “R. melіlotі - люцерна”

ВИСНОВКИ

1. Азотофіксувальна активність симбіозу “R.іlotі - люцерна” при інтродукції в кореневу зону активного бактеріального штаму знижується в часі за роками життя рослини. Частка азотофіксувальних бульбочок, індукованих активним штамом при інокуляції, становить 60-70% від загальної їх кількості в перший рік вегетації рослин; біля 10% на другий рік і знижується до 1% на третій рік життя рослин.

2. Активність люцерно-ризобіального симбіозу, утвореного за участю спонтанної мікрофлори, суттєво підсилюється під впливом стимуляторів росту рослин ауксиново-цитокінінового типу дії, зокрема триману-1, що вперше підтверджено методом мічених атомів.

3. Поєднане застосування бактеризації та триману-1 перед висівом насіння не приводить до синергичного ефекту. Поетапне застосування бактеризації перед висівом насіння та обробка рослин триманом-1 на другий та наступні роки вегетації сприяє реалізації потенціалу люцерно-ризобіального симбіозу.

4. Симбіозна азотофіксувальна система під впливом триману-1 зазнає суттєвої модифікації, що полягає в зростанні кількості бульбочок, їх нітрогеназної активності, інтенсивному розвитку фотосинтетичного апарату та активізації конструктивного метаболізму.

5. Методом електронної мікроскопії встановлено, що під дією триману-1 відбувається більш інтенсивний бульбочковий органогенез: прискорюється вихід бактерій з інфекційної нитки, змінюється ультраструктура бульбочок за рахунок збільшення розмірів бактероїдів та їх більш щільного розміщення в рослинних клітинах.

6. Розроблено заходи управління процесом азотофіксування в окремих агроценозах, що дозволяє підтримувати азотофіксувальний симбіоз “R. melіlotі - люцерна” в активному стані та забезпечує додаткове надходження біологічного азоту в рослини, поліпшення якості продукції при зростанні урожайності культури.

7. Економічна ефективність від поверхневої обробки вегетуючих рослин на другий та послідуючі роки життя розчином рістстимулятора складає 319.16 грн/ га; вміст енергії в додатковій продукції перевищує енергію витрат в 11.36 рази.

СПИСОК РОБІТ, ОПУБЛІКОВАНИХ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

1. Волкогон В.В., Ковтун Е.П., Дедов А.В., Сальник В.П., Носовец Е.И., Шевчук Е.Н. Влияние синтетических стимуляторов роста растений на активность азотфиксации в корневой зоне люцерны посевной// Микробиол. журн.-1997.-Т.59.N 1-С.47-53.

2. Сальник В.П., Волкогон В.В. Екологічні особливості функціонування люцерно-ризобіального симбіозу// Бюлетень Інституту с.-г. мікробіології УААН.-1999.-N3 5.- С.5-8.

3. Волкогон В.В., Гусєв О.В., Сальник В.П. Оптимізація азотного живлення рослин при застосуванні стимулятора росту// Вісник ХДАУ.- 2000.- N1.- С.190-196.

4. Сальник В.П., Волкогон В.В. Стимулятори росту рослин як фактор розвитку азотфіксуючого симбіозу// Бюлетень Інституту с.-г. мікробіології УААН.-2000.- N 6.- С.54-56.

5. Сальник В.П., Волкогон В.В. Вплив стимуляторів росту на нодуляційну здатність люцерни// Мат. міжнар. наук.-практ. конф. молодих вчених та спеціалістів.(Київ-Чабани,1996). Наслідки наукових пошуків молодих вчених-аграрників в умовах реформування АПК.- С.25.

6. Волкогон В.В., Сальник В.П., Гусев О.В. Стимуляторы роста растений как индукторы азотфиксации// Матер.7-й научно-практ. конф. “Нетрадиционное растениеводство, экология, здоровье” (Симферополь, 1998).- С. 437-438.

7. Сальник В.П., Волкогон В.В. Усиление азотфиксирующего потенциала в корневой зоне люцерны// Тр. 8-го междунар. симпоз. “Нетрадиционное растениеводство, экология и здоровье” (Алушта, 9-19 сент. 1999):Тез. докл.- Симферополь, 1999.- С. 594-595.

8. Сальник В.П., Волкогон В.В. Вплив бактеризації та стимулятора росту рослин на розвиток люцерно-ризобіального симбіозу//Тр. междунар. симпоз. ВПС МОББ “Промышленные технологии производства и применения средств биологизации земледелия. Мониторинг энтомофагов” (Одесса, 28 сент.-2 окт. 1999): Тез. докл.- Одесса, 1999.- С. 135.

9. Сальник В.П., Волкогон В.В, Мальцева Н.М. Вплив рістстимулятора на азотне живлення люцерни// Матер. наук.-практ. конф. “Наукове обгрунтування сталого розвитку агроекологічних систем Чернігівщини в ринкових умовах і обмеженого ресурсного забезпечення” (Чернігів, 1999).-Чернігів, 1999.-С. 8-10.

10. Рекомендації по ефективному застосуванню біопрепаратів азотфіксуючих та фосформобілізуючих бактерій в сучасному ресурсозберігаючому землеробстві// Київ.-1997.- 20 с.

11. Волкогон В.В., Сальник В.П. Увеличение продуктивности люцерны// Информационный листок.-Чернигов:ЦНТЭИ, N37-99.-1999.-2 с.

12. Патика В.П., Сальник В.П., Волкогон В.В. Технологія вирощування люцерни із застосуванням біостимулятора// Аграрна наука виробництву.- 2000.-N2.- C.19.

АНОТАЦІЯ

Сальник В.П. Особливості формування і функціонування симбіозу “Rhіzobіum melіlotі - люцерна” та шляхи підвищення його продуктивності.- Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата сільськогосподарських наук за спеціальністю 03.00.07 - мікробіологія, сільськогосподарські науки. Інститут мікробіології і вірусології ім. Д.К.Заболотного НАН України. Київ, 2001.

В дисертації викладено результати досліджень особливостей розвитку R. melіlotі в умовах азотофіксувального симбіозу.

Встановлено, що частка азотофіксувальних бульбочок на коренях люцерни, утворених при інтродукції активних штамів R. melіlotі, знижується за роками вегетації рослин. При цьому знижується азотонакопичувальна ефективність симбіозу.

Продуктивність азотофіксувального симбіозу значно підвищується при обробці вегетуючих рослин стимулятором росту рослин триманом-1. При цьому прискорюється вихід бактерій з інфекційної нитки та утворення бактероїдів. Змінюється ультраструктура бульбочок за рахунок збільшення бактероїдів та їх більш щільного розміщення в рослинних клітинах. Підвищується енергетичний статус рослин, інтенсифікується її конструктивний метаболізм, що позначається на функціонуванні симбіозу.

Запропоновано заходи управління процесом азотофіксування в агроценозах, сформованих за участю люцерни.

Ключові слова: Rhіzobіum melіlotі, люцерна, симбіоз, азотофіксування, нодуляційна здатність, рістстимулятор, триман-1.

АННОТАЦИЯ

Сальник В.П. Особенности формирования и функционирования симбиоза “Rhіzobіum melіlotі - люцерна” и пути повышения его продуктивности.- Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата сельскохозяйственных наук по специальности 03.00.07 - микробиология, сельскохозяйственные науки. Институт микробиологии и вирусологии им.Д.К.Заболотного НАН Украины. Киев, 2001.

В диссертации изложены результаты исследований особенностей развития R.melіlotі в условиях азотфиксирующего симбиоза с люцерной. Установлено, что доля азотфиксирующих клубеньков на корнях люцерны, сформированных при участии интродуцированных активных штаммов R.іlotі снижается во времени - по годам вегетации растений. Так, в первый год высокоэффективные штаммы формируют 60-70% клубеньков. На второй год их доля в общей численности клубеньков составляет 5-10%, а на третий год не превышает 1%. При этом снижается эффективность азотфиксирующего симбиоза.

Одним из возможных путей решения этой проблемы, когда повторная бактеризация (инокуляция вегетирующих растений) неоправданна, может быть использование стимуляторов роста растений ауксиново-цитокининового типа действия. В процессе проведенных исследований выявлено, что ряд изученных ростстимуляторов активно влияет на люцерно-ризобиальный симбиоз, повышая нодуляционную способность бактерий и азотфиксирующую активность клубеньков, образованных при участии спонтанной микрофлоры. При этом влияние отдельных ростстимуляторов на данные показатели проявлялось даже в большей степени, чем влияние инокуляции высокоэффективным штаммом R. melіlotі.

Скрининг биологически активных веществ, проведенный по степени влияния на эффективность азотфиксирующего симбиоза, позволил отобрать ростстимулятор триман-1.

Результаты исследований свидетельствуют, что поверхностная обработка триманом-1 вегетирующих растений приводит к существенному увеличению количества азотфиксирующих клубеньков на корнях люцерны, повышению азотфиксирующей активности и увеличению урожайности.

Стимуляторы роста растений не способствуют изменению соотношения доли клубеньков, образованных при участии интродуцированных штаммов и спонтанной микрофлоры. Однако, обработка вегетирующих растений их растворами способствует существенному увеличению эффективности симбиоза.

Совмещение предпосевной бактеризации и обработки семян триманом-1 не приводит к синергическому эффекту. Поэтапное применение этих приемов (предпосевная бактеризация + обработка триманом-1 вегетирующих растений на второй и последующие годы вегетации) способствует значительной реализации потенциала азотфиксирующего симбиоза “R.melіlotі - люцерна”.

Выявлены некоторые составляющие действия тримана-1 на формирование симбиоза. Под его воздействием увеличивается численность клубеньков, изменяется их ультраструктура за счет увеличения размеров бактероидов и более полного заполнения ими растительных клеток. Активизируются метаболические процессы макросимбионта: хлоропластогенез, нитратредуктазная активность, увеличивается общая и поглотительная поверхности корней.

Предложены приемы управления процессом азотфиксации в агроценозах, сформированных при участии люцерны.

Ключевые слова: Rhіzobіum melіlotі, люцерна, симбиоз, азотфиксация, нодуляционная способность, стимулятор роста, триман-1.

ABSTRACT

Salnіk V.P. Peculіarіty of formatіon and functіonatіng of symbіosіs “Rhіzobіum melіlotі - alfalfa” and way for іncreasіng of іts productіvіty.- Manuscrіpt.

Thesіs for degree of Candіdate of Agricultural Scіence іn the specіalіty 03.00.07 - mіcrobіology.- Іnstіtute of Mіcrobіology and Vіrology of the NASU. Kyіv, 2001.

The dіssertatіon work presents the results of the іnvestіgatіons on ecologіcal peculіarіty of symbіosіs “Rhizobium melіlotі - alfalfa”.

Іt`s establіshed that parts of nodules whіch were formed by actіve straіns of R.melіlotі іs decreased at the tіme - at the years of plant vegetatіon.

Productіvіty of nіtrogen-fіxіng symbіosіs іs іncreased under surfase treatment of vegetatіon plants by growthstіmulator trіman-1. Іn thіs condіtіon way out of bacterіa from іnfectіon thread and formed of bacteroіd are accelerated. Іncreasіng of bacteroіd sіze and іt`s more іntіmate plased іn plant cells result іn ultrastructural change.

Іt`s proposed method of control for nіtrogen-fіxіng process іn agrocenose wіth alfalfa.

Key words: Rhizobium meliloti, alfalfa, symbіosіs, nіtrogen fіxatіon, nodulatіon, growthstіmulator, trіman-1.