фізико-хімічний інститут ім. о.в.богатського

нан україни

ТЕСЛЮК ОЛЬГА ІВАНІВНА

УДК 546.65:541.49:543.8

Комплекси Eu(III) та Tb(III) з похідними хінолонкарбонової кислоти та застосування їх в аналізі

02.00.02. — аналітична хімія

автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата хімічних наук

Одеса - 2001

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана у відділі аналітичної хімії та фізико-хімії координаційних сполук Фізико-хімічного інституту ім. О.В.Богатського НАН України

Науковий керівник: доктор хімічних наук, професор

Бельтюкова Світлана Вадимівна,

Фізико-хімічний інститут

ім. О. В. Богатсько--го НАН України,

старший науковий співробітник відділу

аналітичної хімії та фізико-хімії

координаційних сполук

Офіційні опоненти: доктор хімічних наук, професор

Шевчук Іван Олексійович,

Донецький державний університет,

завідувач кафедри аналітичної хімії

кандидат хімічних наук, доцент

Герасименко Галина Іванівна,

Одеський гідрометеорологічний інститут

доцент кафедри фізики та хімії

Провідна установа: Український державний хіміко-технологічний

університет (м. Дніпропетровськ)

Захист відбудеться “ 16 березня 2001 року о 1400 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д41.219.01

в Фізико-хімічному інституті ім. О. В. Богатсько--го НАН України за адресою: 65080,м. Одесса, Люстдорфська дорога, 86, ФХІ НАН України

З дисертацією можна ознайомитисьв науковій бібліотеці Фізико-хімічного інституту ім. О. В. Богатсько--го НАН України

Автореферат розісланий “ 12 лютого 2001 року

Вчений секретар спеціалізованої

вченої ради, к.х.н. Назаренко Н.О.ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність проблеми. Широке застосування в медичній практиці нового класу антибактеріальних препаратів ряду хінолонкарбонової кислоти і її фторованих аналогів обумовлює необхідність розробки простих, експресних, високочутливих методик для вивчення фармакокінетики цих препаратів і їхнього терапевтичного моніторингу. Перспективними в цьому напрямку є люмінесцентні методи аналізу з використанням характеристичної f-f люмінесценції європію, тербію та інших лантанідів. Метод рідкісноземельного зонду (РЗ) дуже ефективний в імуно-флуо-ресцентному аналізі і для високочутливого визначення широкого кола біологічно - активних речовин, у тому числі і лікарських препаратів. Розвиток і удосконалення методу РЗ зв'язано з дослідженням комплексоутворення іонів лантанідів з органічними сполуками, процесів передачі енергії від ліганду до центрального іону, розробкою експресних високочутливих методик визначення лікарських препаратів і продуктів їх біотрансформації в біологічних рідинах. Актуальна також проблема пошуку нових проявляючих реагентів в імуно-флуоресцентному аналізі на основі лантанідних комплексів з хелатоутво-рюючими речовинами, у тому числі і лікарськими.
Зв'язок роботи з науковими темами: Робота виконана у відділі аналітичної хімії і фізико-хімії координаційних сполук Фізико-хімічного інституту ім. А.В.Богатського НАН України відповідно до держбюджетної теми № 0197V008690 (шифр 2.1.6.226) “Пошук нових комплексних сполук лантанідів з високим кван-товим виходом для люмінесцентного, у тому числі імунофлуоресцентного аналізу” (1997-1999) і № 0100V001136 (шифр 2.1.6.242) “Дослідження можливостей використання сорбції лантанідів на цеолітах з метою пошуку нових ефективних фотолюмінофорів” (1999-2001).

Мета і задачі дослідження: пошук нових аналітичних форм для створен-ня методик високочутливого люмінесцентного визначення антибактеріальних препа-ратів хінолонового ряду в біологічних рідинах по сенсибілізованій люмінесценції іонів лантанідів.

Для досягнення поставленої мети необхідно було вирішити такі задачі:

Дослідити кислотно-основні властивості і деякі оптичні характеристики похідних хінолонкарбонової кислоти і її фторованих аналогів.

Установити умови утворення і вивчити спектрально - люмінесцентні характе-ристики комплексів Eu (III) і Tb(III) з похідними хінолонкарбонової кислоти в розчинах і на твердій матриці.

Показати можливість застосування отриманих аналітичних форм для цілей імунофлуоресцентного і біофармацевтичного аналізу.

Наукова новизна одержаних результатів. Дано кількісну оцінку комп-лек------со---утворення іонів Ln(III) з новим класом лігандів - похідними хіно-лон-карбонової кислоти, які є слабкими одноосновними кислотами і виявляють дентатність, яка дорівнює трьом, реалізовану за рахунок додат-кової координації атома азоту піперазинового циклу. Установлено утворення катіонних форм комплексів зі співвідношенням компонентів метал : ліганд = 1:2, показана можли-вість утворення біядерних сполук для лігандів, що містять у своїй структурі незамі-щений піперазиновий фрагмент. Методом ІЧ - спектро-скопії встановлений також спосіб координації лігандів по -кето-карбоксильній групі. Розраховано константи стійкості комплексів Ln(III) з похідними хінолонкарбонової кислоти.

Установлено, що взаємодія комплексів Ln(III) з похідними хінолон-карбонової кислоти й аніонними ПАР відбувається у передміцелярних асоціатах. Входження молекул АПАР у внутрішню координаційну сферу комплексної сполуки у якості другого ліганду збільшує час життя комплексу. У результаті утворення іонного асоціату і перерозподілу електронної щільності усередині органічної молекули в присутності АПАР знижується величина триплетних рівнів лігандів, що приводить до значного збільшення інтенсивності люмінесценції комплексів.

Практичне значення одержаних результатів. На основі нових аналі-тичних форм - комплексів європію і тербію з похідними хінолонкарбонової кислоти - розроблені методики люмінесцентного визначення піпемідієвої кислоти, ломефлок-сацину, норфлоксацину, пефлоксацину і ципрофлоксацину в біологічних рідинах з межею виявлення 0,1 - 0,003 мкг/мл. Комплекси Tb з норфлоксацином і ципрофлоксацином запропоновані для тест - визначення зазначених лікарських препаратів. Показана можливість використання оксолінієвої, налідиксової кислот та норфлоксацину у якості проявляючих реагентів для цілей імунофлуоресцентного аналізу.

Особистий внесок здобувача. Основний обсяг експериментальних дослід-жень, обробка експериментальних даних виконані безпосередньо автором. Поста-новка мети і задач дослідження, а також аналіз отриманих результатів проводилися разом з науковим керівником.

Апробація результатів дисертації. Матеріали дисертаційної роботи доповідалися і обговорювалися на 8th Europian Conference of Spectroscopy of Biological Molecules (1999, Enschede, Netherlands ), матеріалах V Національного з'їзду фармацевтів України (1999, Харків), Argus-99 (1999, Odessa), II Конференції молодих вчених і студентів-хіміків південного регіону України (1999, Одеса), Всеукраїнської конференції з аналітичної хімії, присвяченої 100-річчю з дня народження проф. Н.П.Комаря (2000, Харків)

Публікації. Матеріали дисертаційної роботи опубліковані в 6 статтях і 3 тезах доповідей.

Структура й обсяг роботи. Дисертація викладена на сторінках машинописного тексту, містить 32 рисунки і 24 таблиці. Робота складається з вступу, чотирьох розділів, загальних висновків. Список цитованої літератури включає 219 джерел.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

У вступі обґрунтовано вибір теми і визначена мета дисертаційної роботи, викладено наукову новизну і практичну цінність отриманих результатів.

У першому розділі наведені літературні дані по застосуванню іонів РЗЕ як люмінесцентних зондів. Систематизовано матеріали по застосуванню рідкіснозе-мельної мітки в імунофлуоресцентному аналізі. Відзначено, що для Tb-мітки є обмежене коло проявляючих розчинів. В галузі аналізу лікарських препаратів розглянутий люмінесцентний метод визначення останніх по сенсибілізованій люмінесценції іонів РЗЕ .

На підставі критичного аналізу літературних даних визначені основна мета та етапи виконання дисертаційної роботи.

В другому розділі наведені результати вивчення взаємодії іонів ланта-нідів з рядом нових високоефективних антибактеріальних лікарських препа-ратів - похідних хінолонкарбонової кислоти. Перелік вивчених кислот приведений у табл. 1. Загальна структурна формула для цих речовин має такий вигляд:

, де R - різні замісники.

Як слідчить з табл. 1., всі розглянуті ліганди містять карбонільну і карбоксильну групи. Більшість лігандів містять у положенні 7 хінолінового ядра незаміщений (L3, L5, L7) або заміщений (L4, L6, L8) піперазиновий цикл, а в положенні 6 - атом фтору (L4 - L8). Наявність у структурі хінолонкарбонових кислот - кетокарбоксильного фрагменту зумовлює можливість даних лігандів утворювати комплексні сполуки з іонами Ln(III). Як видно з таблиці 1, спектри поглинання розглянутих лігандів характеризуються наявністю 2-х або 3-х смуг в ультрафіолетовій (УФ) області спектра з досить високими значеннями молярних коефіцієнтів поглинання (). Най-біль-шими значеннями характеризуються ліганди L1, L4, L8, що свідчить про інтенсивне поглинання цими лігандами УФ випромінювання.

Енергія три-плет-них рівнів (Ет) вивчених лігандів вище енергій рівнів першого збудженого стану іонів Tb(III) (20500 см-1), Eu(III) (17300 см-1), Sm (III) (17900см-1), Dy (III) (21000см-1), що дозволяє здійснюватися ефективному перено-су енергії збудження від органічної частини молекули до іону лантаніда в комп-лексних сполуках.

Таблиця 1.

Деякі оптичні характеристики похідних хінолонкарбонової кислоти.

L | Назва речовини і її структурна формула | ET , см-1 | погл., нм | , л.моль-1.см-1

L1 | Налідиксова кислота |

22420 |

205

257

326 |

53500

22500

7500

Оксолінієва кислота |

20620 | 205

263

320 | 22500

54500

12500

L3 | Піпемідієва кислота |

22350 |

275

325 |

90000

28000

L4 | Пефлоксацин |

21280 |

210

283 |

18000

51000

L-5 | Норфлоксацин |

21280 |

210

286 |

13300

42000

L6 | Офлоксацин |

21050 |

210

301 |

18000

38000

L7 | Ципрофлоксацин |

21280 |

208

283 |

8700

27000

L8 | Ломефлоксацин |

21050 |

285

325 |

67000

27000

Методом рН - потенціометричного титрування визначені величини констант кислотної дисоціації лігандів. Згідно даним титрування, досліджені сполуки є слабкими одноосновними кислотами, значення pК яких знаходиться в інтервалі 7,3-8,8 логарифмічних одиниць (табл.2).

Таблиця 2.

Константи кислотної дисоціації похідних хінолонкарбонової кислоти (рК ) і стій-кість тербієвих хелатів ( lg Kn ).

N | Назва речовини | pК | lg Kn

n=1 | n=2 | n=3

1 | Налідиксова кислота | 7,560,02 | 6,80 | 5,93 | 4,75

2 | пефлоксацин | 7,360,04 | 6,14 | 5,25— |

3 | ломефлоксацин | 7,470,03 | 6,20 | 4,97— |

4 | Ципрофлоксацин | 8,100,03 | 6,78 | 5,85— |

5 | Офлоксацин | 7,890,05 | 3,55 | 3,04— |

6 | Піпемідієва кислота | 8,340,04 | 3,18 | 2,64— |

7 | Норфлоксацин | 8,780,05 | 3,27 | 2,80— |

Як видно з таблиці, найбільш кислотний характер мають налідиксова кислота, пефлоксацин та ломефлоксацин. Для інших лігандів характерні більш високі значення pК ( від 8,10 до 8,78) і вони виявляють більш слабкі кислотні властивості. Це зумовлено особливістю будівлі цих лігандів, що містять у своїй структурі незаміщений піперазиновий цикл з високоосновними атомами азоту. Високі значення рК дисоціації похідних хінолонкарбонової кислоти погоджуються з припущенням, що протон локалізований на атомі азоту піперазинового циклу, а не на карбоксильній групі.

Методом рН - потенціометричного титрування визначені константи стій-кості комплексів іонів Ln (III) з похідними хінолонкарбонової кислоти. Установ-лено, що комплекси піддаються ступінчастій дисоціації і характеризу-ються помір-ною стійкістю.

Похідні хінолонкарбонової кислоти утворюють з іонами Tb(III) білі-ганд-ні хелати, за винятком налідиксової кисли, що виявляє дентатність, яка дорівнює двом. На відміну від останньої, розглянуті ліганди містять піперазиновий фрагмент з високоосновними атомами азоту. Це сприяє утворенню цвітер - іонної форми, що згоджується з низькою розчинністю зазначених кислот у ізоєлектричній точці. Витисненню протона, локалізованого на аміногрупі, сприяє її координація, тому можна припустити, що такі ліганди як L3 , L5 , L7 , L8, які містять у своїй структурі незаміщений піперазиновий фрагмент, виявляють дентатність, рівну трьом. У такому випадку стає зрозумілим, чому в координаційну сферу іона тербію входять тільки дві молекули кислоти, тоді як для бідентатних лігандів співвідношення Ln(III) : ліганд звичайно складає 1:3. Координація двох молекул лігандів з дентатністю, яка дорівнює трьом, дозволила зробити припущення, що в даному випадку можливе утворення біядерних комплексних сполук. Під-тверд--женням цього припущення є наявність різницевої кри для комплексів іону Nd(III) з лігандами L3 , L5 , L7 , L8, записаної відносно цих же комплексів, але в присутності Y(III). Для налідиксової, оксолінієвої кислот, пефлоксацину та офлок-сацину, що містять третинний атом азоту в піпера-зиновому циклі, характер спектру Nd(III) у присутності Y(III) не змінюється.

Аналіз значень ступінчастих констант стійкості комплексів тербію, наведених у табл.2, дозволив виділити дві групи лігандів. Одна з них утворює міцні сполуки (lg16), а друга, до якої належать офлоксацин, нор-флоксацин і піпе-мідієва кислота, утворює хелати, стійкість яких приблизно на три порядки нижче. Для першої групи кислот спостерігається задовільна кореляція їхніх констант кис-лот-ної дисоціації зі стійкістю тербієвих хелатів, тоді як для другої групи очікувати подібної закономірності некоректно внаслідок структур, що розрізняються.

Комплекси Ln(III) з хінолонкарбоновими кислотами виділені у твер-дому стані, проведене їх ІЧ дослідження. Для сполук Ln(III) з даними ліган-дами спосте-рігається зсув смуг поглинання у бік зменшення частот, звязаних з валентними коливаннями карбоксильної і карбонільної груп на 100 - 37 см-1 відносно тих же смуг у спектрах відповідних лігандів, що свідчить про координацію зазначених груп. Поява широкої смуги при =3600 - 3100 см-1, що відповідає поглинанню ОН - груп, звязаних водневим звязком, робить скрутним рішення питання про участь аміногруп у комплексоутворені.

У третьому розділі знайдені оптимальні умови люмінесценції комплек-сних сполук іонів Ln(III) з похідними хінолонкарбонової кислоти, вивчені їх спектрально - люмінесцентні характеристики.

На користь передачі енергії збудження від органічної частини молекули до іона лантаніду свідчить той факт, що по мірі додавання до розчину ліганда розчину лантаніду в різній концентрації, спостерігається зниження молеку-лярної люмінес-ценції ліганда (Рис.1).

Рис.1. Гасіння молекулярної люмі-нес-ценції норфлоксацину в при-сут-ності Tb (III):

Ctb3+ = 0 моль/л (I), Ctb3+ = 10-7 моль/л (II), Ctb3+ =10-6 моль/л (III), Ctb3+ =10-5 моль/л (IV), Ctb3+=10-4 моль/л (V), Ctb3+ =10-3 моль/л (VI).

Для вибору оптимальних умов комплексоутворення були досліджені залеж-ності Iлюм комплексів від кислотності середовища, роду розчинника, кількості ліган-да, присутності поверхнево - активних речовин (ПАР). Знайдено, що найбіль-ша інтенсивність люмінесценції комплексів спостері-гається в інтервалі значень рН 6,9 - 7,5 у водних і водно - етанольних розчинах. Аналіз діаграм розподілу моль-них часток компонент рівноваги в залежності від величини рН дозволив зіставити області існування окремих форм комплексів з умовами прояву оптимальних люмінесцентних властивос-тей тербієвих хелатів (Рис.2).

Рис.2. Діаграми розподілу моль-них часток (f) фрагментів ступінчастої дисоціації комплексів тер-бію з налідик-совою кисло-тою (а), ципро-флоксацином (б) і офлокса-цином (в) у залежності від рН. 1 - f(Tb3+), 2 - f(Tb2+), 3 - f(Tb2+), 4 - f(Tb3).

Установлено, що основними формами, що люмінесцирують, як у випадку налідиксової кислоти, так і ципрофлоксацину, є комплекси з максимальним числом координованих лігандів. Для тербієвого хелату з офлоксацином, що входить у групу "слабких" комплексів, у зазначеній області рН існує пере-важно монолігандна форма комплексу ML, що погодиться з украй низькою інтенсивністю лю-мі-нес-ценції офлоксацинату тербію в порівнянні з відповід-ними комплексами з ципро-флок-сацином та налідиксовою кислотою.

Досліджено вплив катіонних (КПАР), аніонних (АПАР) і неіоногенних (НПАР) поверхнево - активних речовин на люмінесцентні характеристики комп-лексів. Установлено, що КПАР і НПАР практично не змінюють, або незначно га-сять Iлюм комплексів Ln (III) з розглянутими лігандами. Тільки у випадку оксо-лінієвої кислоти спостерігається зростання Iлюм Tb(III) у присутності цетілтри-ме-тиламоній броміду (ЦТМА) у 4 рази. У присутності КПАР, здатного зменшувати сту-пінь гідролізу металу і збільшувати його координаційне число, співвідношення компонентів у комплексній сполуці Tb(III) з оксолінієвою кислотою змінюється. Ме-то-дом граничного логариф-мування встановлено, що в присутності ЦТМА Tb(III) координує 4 ліганди (крива II, Рис.3), тобто утворюється аніонний комп-лекс зі співвідношенням компонентів Ln : Lig=1:4, що взаємодіє з КПАР з утво-ренням різнолігандно-го комплексу складу Ln : Lig : КПАР = 1:4:1 (крива III, Рис.3).

Рис.3. Визначення співвідно-шен-ня компонентів у комплек-сі Tb(III) - оксолінієва кислота у відсутності (I) і присутності (II) ЦТМА і чис-ла молекул ЦТМА в комплек-сній сполуці Tb(III) - оксолі-ніє-ва кислота - ЦТМА(III);

(Ctb3+=110-5 моль/л,

СЦТМА=110-3 моль/л,

СL=210-4 моль/л)

Найбільшу зміну Iлюм викликають АПАР - натриєві солі алкілсульфатів, що збільшують Iлюм від 1,5 до 290 разів. Комплекс Eu(III) з налідиксовою кислотою є винятком, тому що інтенсивність люмінесценції Eu(III) у присутності АПАР не змінюється. Максимальне збільшен-ня інтенсивності люмінесценції Ln(III) у присутності АПАР (у водних розчинах) спостерігається в комплексних сполуках з пефлоксацином, норфлоксацином і ципрофлоксацином - від 180 до 290 разів. У випадку біядерних комплексів (L3, L5, L7, L8 ) аніонні ПАР розривають донорно - акцептор-ний зв'язок іону Tb(III) з ато-мом азоту піперазинового циклу і координуються в якості другого ліганду до іона лантаніду. Підтверд-женням цього служить відсут-ність різницевої кривої в спектрах поглинання комплексу Nd(III) з лігандами L3, L5, L7, L8 і АПАР у присутності іону Y(III). Методом граничного логарифмування знай-дено, що співвідношення компо-нентів у комплексах, що утворюються, складає Ln : Lig : АПАР = 1:2:1. Руйнування біядерних комплексних сполук сприяє збіль-шен-ню Iлюм іону Ln(III). Для комп-лексів Tb(III) з лігандами L4, L6, які мають у своїй структурі заміщений піпера-зиновий фрагмент, аналогічним методом установ-ле-но, що у внутрішню коорди-наційну сферу сполуки також входить 1 молекула АПАР.

Інтенсивність люмінесценції комплексів залежить також від концентрації ПАР і визначається величиною критичної концентрації міцелоутворення (ККМ). Для визначення даної величини був використаний кондукто-метричний метод. Порівняння величини ККМ із концентрацією АПАР, при якій інтенсивність люмінесценції максимальна, показує, що значення ККМ перевищують оптимальну концентрацію ПАР.

Аналіз отриманих даних дозволяє зробити висновок, що взаємодія комплексів Tb(III) з похідними хінолонкарбонової кислоти й аніонними ПАР відбувається в передміцелярних асоціатах.

Установлено, що в присутності АПАР відбувається значне зниження енергії три-плетних рівнів лігандів на 550 - 1850 см-1 , при цьому енергія три-плетних рівнів хінолонкарбонових кислот стає однаковою і складає 20500 см-1. Цей факт поясню-єть-ся утворенням гідрофобно-гідратованих іонних асоціатів між моле-кулами реа-ген-ту і АПАР. У випадку налідиксової кислоти величина енергії триплет-ного рівня не змінюється, тому що ПАР на цей ліганд не впливають. Близькість енерге-тичних рів-нів лігандів і першого збудженого рівня тербію 5D4 (20500 см-1) у присутності АПАР, безумовно сприяють зменшенню безвипромінювальних втрат енергії збуджен--ня і більш ефективній передачі енергії на іон лантаніда. Про це свідчить і зростан-ня часу життя комплексів (у 2,5 - 15 разів) у присутності аніонного ПАР (табл.3.).

Таблиця 3.

Константи швидкості загасання люмінесценції (, мкс) комплексів Ln(III) з деякими похідними хінолонкарбонової кислоти в присутності і відсутності АПАР

Комплекс | у прис. АПАР | у відсут. АПАР | у прис. АПАР/ у відсут. АПАР

Tb - пефлоксацин | 483 | 43 | 11

Tb - норфлоксацин | 637 | 43 | 15

Tb - ципрофлоксацин | 425 | 72 | 6

Eu - піпемідієва кислота | 362 | 150 | 2,5

Таким чином, отримані дані підтверджують висновок, що молекули аніон-ного ПАР входять у внутрішню сферу комплексу, сприяють його дегідратації і тим самим зменшенню безвипромінювальних втрат енергії збудження.

У четвертому розділі викладене аналітичне застосування отриманих нових аналітичних форм. Показана можливість застосування оксолінієвої, налідиксової кислот та норфлоксацину як основних компонентів проявляючих розчинів для цілей імунофлуоресцентного аналізу. Межа детекції іону Tb(III) при цьому складає 410-14, 210-11 , 110-10 моль/л відповідно.

Для експресного визначення деяких фторованих похідних хінолон-карбонової кислоти (ципрофлоксацину та норфлоксацину) запропо-новані методики їх визначення в біологічних рідинах з використанням методу твердофазної люмі-несценції. У якості твердої матриці був обраний природний сорбент - цеоліт типу СаА. Сорбцію лігандів з розчину, що аналізується, проводили на носій з попередньо сорбованими на нього іоном Tb(III) або Eu(III). Оптимальна концентрація європію та тербію становить 63 та 66 мг на 1 г цеоліта відповідно. Максимум інтенсивності люмінесценції сорбатів дося-га-ється при проведені сорбції з водно - діме-тіл-сульфоксидних (ципро-флоксацин) та водно - діметілформамідних (нор-флоксацин) розчинів при рН 6 - 7. Час сорбції ліганду з розчину, що аналізується, становить 15 хвилин. Межі виявлення ципрофлоксацину та норфлоксацину, розра-ховані за 3-критерієм, становлять 1 мкг/мл.

На підставі проведених досліджень розроблені високочутливі методики визначення похідних хінолонкарбонової кислоти в біологічних рідинах без попе-реднього вилучення препаратів. Дослідження впливу основних компонентів сечі показало, що хлориди (25-30 мг/мл), сечовина (5-8 мг/мл), фосфати (26-30 мг/мл), оксалати (0,3 - 0,6 мг/мл) зменшують інтенсивність люмінесценції комплексів на 11-50%. Сульфати в кількості до 28 мг не гасять люмінесценцію (рис.4).

Рис.4. Вплив основних компонентів сечі на Iлюм - іона Tb(III) у комплексах із похідни-ми хінолонкарбоно-вої кислоти

Усунення заважаючого впливу складових компонентів сечі і плазми крові проводили за методом добавок. Результати визначення препаратів у біологічних рідинах за методом добавок наведені у таблиці 4. Точність і правильність результатів перевірена методом “уведено-знайдено”, методом добавок і методом статистичної обробки результатів.

Таблиця 4.

Результати визначення похідних хінолонкарбонової кислоти в сечі методом
добавок (мкг/мл) (n=5, P=0,95)

Препарат | Добавка, мкг/мл | Знайдено в пробі з добавкою, мкг/мл | Знайдено в пробі, мкг/мл | Sr

Ципрофлоксацин | 0,1 | 0,259 | 0,1590,006 | 0,04

0,2 | 0,358 | 0,1580,003 | 0,02

Пефлоксацин | 0,1 | 0,211 | 0,1110,004 | 0,03

0,2 | 0,303 | 0,1030,003 | 0,03

Норфлоксацин | 0,1 | 0,310 | 0,2100,006 | 0,03

0,2 | 0,414 | 0,2140,004 | 0,02

Ломефлоксацин | 0,1 | 0,207 | 0,1070,008 | 0,07

0,2 | 0,309 | 0,1090,005 | 0,04

Піпемідієва кислота | 0,1 | 0,212 | 0,1120,008 | 0,06

0,2 | 0,311 | 0,1110,007 | 0,05

Межі виявлення похідних хінолонкарбонової кислоти в біологічних рідинах наведені у таблиці 5. Використання сенсибілізованої люмінесценції іонів Eu(III) та Tb(III) дозволяє знизити межі виявлення цих препаратів на 1 -2 порядки величини у порівнянні з відомими літературними даними

Таблиця 5.

Межі виявлення похідних хінолонкарбонової кислоти в біологічних рідинах .

Препарат | Межі виявлення препарату, мкг/мл

У сечі | У плазмі крові | Літературні дані

Піпемідієва кислота | 0,003— | | 0,2

Ломефлоксацин | 0,035 | 0,100— |

Ципрофлоксацин | 0,010 | 0,050 | 0,09

Норфлоксацин | 0,005 | 0,010 | 0,4

Пефлоксацин | 0,0034 | 0,006 | 0,05

ВИСНОВКИ

1. Установлено, що спектрально - енергетичні характеристики похідних хінолон-карбонової кислоти (наявність смуг поглинання в УФ - області, високі молярні ко-ефі-цієнти поглинання, відповідні значення енергії триплетних рівнів), від-повідають умовам, необхідним для здійснення ефективного переносу енергії від орга-нічної молекули до іону лантаніда з наступним збудженням f - f люмі-несценції.

2. Показано, що іони лантанідів утворюють з досліджуваним класом лігандів каті-онні форми комплексів зі співвідношенням Ln(III) : ліганд = 1:2 (за винятком налі-диксової кислоти), причиною існування яких є висока дентатність ліганду, реа-лі-зована за рахунок координації атома азоту піперазинового циклу. За дани-ми ІЧ - спектроскопії в координації також бере участь кето-карбоксильний фраг-мент ліганда.

3. Вперше дана кількісна оцінка комплексоутворення Ln(III) з новим класом ліган-дів - похідними 4 - хінолону. Установлено, що досліджувані сполуки є слаб-кими одно-ос-новними кислотами. Високі значення рК дисоціації похідних хінолон-карбонової кислоти погоджуються з припу-щенням, що протон локалізо-ваний на атомі азоту піперазинового циклу, а не на карбоксильній групі. Відзначено, що налідиксова кислота, на відміну від інших (тридентатних) лігандів, виявляє дентатність, рівну двом. Розра-ховано константи стійкості комплексів іонів Ln(III) з похідними хінолонкарбонової кислоти.

4. Показано, що молекули АПАР входять у внутрішню сферу комплексів, тим самим сприяючи їх дегідратації і зниженню безвипромінювальних втрат енергії збудження. Входження АПАР у внутрішню сферу біядерних комплексів (L3, L5, L7, L8) викликає розрив донорно - акцепторного звязку іону Tb(III) з атомом азоту піперазинового циклу. На підставі порівняння ККМ натрієвих солей алкілсульфатів і концентрації АПАР, при якій спостерігається максимальна інтенсивність люмінесценції, зроблений висновок про те, що взаємодія комплексів Ln(III) з похідними хінолон-карбонової кислоти та АПАР відбувається в передміцелярних асоціатах.

5. На модельних системах показана можливість використання у якості нових про----яв--ляючих реагентів оксолінієвої, налідиксової кислот та норфлоксацину в іму--но-флу-оресцентному аналізі. Межа детекції тербію при цьому складає 4 10-14, 110-11 і 110-10 моль/л відповідно.

6.

Основні результати досліджень викладені в таких роботах:

1. Антонович В.П., Егорова А.В., Бельтюкова С.В., Теслюк О.И. Люминесцентное опре-де-ление ломефлоксацина в виде его комп-лекса с европием (III) //Віст. Фарма-циї. - 1999. - Т.20,№2. - С.88 - 91.

2. Egorova A.V., Beltyukova S.V., Teslyuk O.I. Fluorimetric determination of pipe-nic acid using the europium chelatte //J. Pharm. Biomed. Anal. - 1999. - V.21. - P. 585 - 590.

3. Beltyukova S.V., Egorova A.V., Teslyuk O.I. Application of sensitized luminesof terbium for determination of norfloxacin. Spectroof Biological MoNew Directions. Kluwer Academic Publi-shers. - Enschede (Netherlands). -1999. - P.553-554.

4. Бельтюкова С.В., Егорова А.В., Теслюк О.И. Хелаты европия (III) и тербия (III) с производными хинолонкарбоновой кислоты как метки для иммунофлу-оресцентного анализа // Журн. аналит. хим. - 2000. - Т.55,№7. - С. 760 - 763.

5. Бельтюкова С.В., Егорова А.В., Теслюк О.И. Использование f - f люми-несценции ионов Eu(III) и Tb(III) в анализе лекарственных препаратов // Укр. хим. журн. - 2000. - Т.66, №10. - С. 115 - 121.

6. Beltyukova S.V., Egorova A.V., Teslyuk O.I., Tselic E.I. Application of f-f lumiof lanthanides in bioanalysis // ARGUS - 99. Abstracts. - Odessa. - p.14-15.

7. Теслюк О.И., Бельтюкова С.В., Егорова А.В. Хелаты лантани-дов с производ-ными хинолонкар-боновой кислоты как метки для иммуно-флуоресцент-ного анализа // Тез. докл. II конференции молодых ученых и студентов-химиков южного региона Украины. - Одесса. - 1999. - С.15.

8. Бельтюкова С.В., Егорова А.В., Теслюк О.И. Определние неко-торых производных нафтиридина после их хроматогра-фического выделения //Всеукраинская (с международным участи-ем) конфе-ренция по аналити-ческой химии, посвященная 100-летию со дня рождения профессора Н.П.Комаря. - Харьков. - 2000. - С. 262.

9.Теслюк О.И., Бельтюкова С.В., Егорова А.В., Желтвай И.И. Устойчивость комп-лексов лантанидов с производными хинолон-карбо-новой кислоты //Журн. неорган. химии. - 2000. - Т.45, №12. - С. 2103 - 2107.

АНОТАЦІЯ

Теслюк О.І. Комплекси Eu(III) та Tb(III) з похідними хінолонкарбонової кислоти та застосування їх в аналізі. - Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата хімічних наук за спеці-альністю 02.00.02. - аналітична хімія . - Фізико-хімічний інститут ім. О.В.Бо-гат-ського НАН України, Одеса, 2001.

Дисертацію присвячено дослідженню комплексоутворення іонів ланта-нідів з похідними хінолонкарбонової кислоти. Встановлено оптимальні умови люмінес-ценції комплексних сполук Eu(III) та Tb(III) з хінолонкарбоновими кислотами, знайдено залежність спектрально - люмінесцентних характеристик комплексів від величини рН, природи розчинника, присутності поверхнево-активних речовин. Встановлено механізм дії аніонних ПАР на досліджені комп-лекси. Розраховано конс-танти іонізациї кислот та константи стійкості комп-лексних сполук. Показана можливість використання у якості нових про-явля-ючих реагентів в імунофлуорес-центному аналізі деяких похідних хіно-лон-карбонової кислоти. Запропано-ва-но екс-пресний тест - метод для визначення цип-рофлоксацину і норфлоксацину та висо-кочутливі методики визначення хіно-лонкарбонових кислот у сечі і плазмі крові без попереднього вилучення препарату.

Ключові слова: аналіз, лантаніди, люмінесценція, лікарські препарати, сенсибілізація, имуноаналіз.

SUMMARY

Teslyuk O.I. Complexes of Eu(III) and Tb(III) with quinolonecarbonic acid derivatives and their application in analysis. - The manuscript.

Thesis for a candidate degree by speciality 02.00.02. - analytical chemistry - A.V.Bogatsky Physico - chemical institute of the National Academy of Sciences of Ukraine, Odessa, 2001.

The thesis is devoted to studing the lanthanide ions complexation with quinolonecarbonic acid derivatives. The optimum conditions of luminescence of Eu(III) and Tb(III) complexes with quinolonecarbonic acid have been established and dependence of spectral - luminescence characteristics of the complexes on pH value, solvent nature, presence of surfactants was found. The mechanism of action of the anionic surfactants on the complexes investigated has been established. The ionization constant of acid and stability constants of complexes were calculated. The possibility of using some quinolonecarbonic acid derivatives as new developing reagents in immunofluorescence assay has been shown. The express test-method for determination of cyprofloxacine and norfloxacine as well as the high sensitive methods for determination of quinolonecarbonic acid in urine and blood plasma without preliminary isolation of the preparation has been supposed.

Key words: analysis, lanthanides, luminescence, drugs, sensitization, immunoassay.

АННОТАЦИЯ

Теслюк О.И. Комплексы Eu(III) и Tb(III) с производными хинолон-карбоновой кислоты и использование их в анализе. - Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата химических наук по специальности 02.00.02. - аналитическая химия. - Физико - химический институт им. А.В.Богатского НАН Украины, Одесса, 2001.

В настоящей работе исследована возможность использования сенсиби-ли-зи---рованной люминесценции ионов Ln(III) для определения лекарственных препара-тов - производных хинолонкарбоновой кислоты и применения полу-чен-ных но-вых аналитических форм в иммунофлуоресцентном и биофармацевтическом анализе.

Методом ИК-спектроскопии установлен способ координации лигандов по -кетокарбоксильной группе. Лиганды, содержащие в своей структуре неза-ме--щенный пиперазиновый фрагмент (L3 , L5 , L7 , L8) проявляют дентат-ность, рав-ную трем, которая реализуется за счет дополнительной коорди-нации атома азота пиперазинового цикла с образованием биядерных комп-лексных соединений.

Изучены кислотно-основные свойства производных хинолокар-боновой кис-лоты. Показано, что они являются слабыми одноосновными кислотами. Рассчи-та-ны константы устой-чи--вос-ти комплексов Ln(III) с хинолон-кар-бо-новыми кислотами.

Исследовано влияние кислотности среды, природы растворителя и присутствия поверхностно - активных веществ на спектрально - люминес-центные характеристики комплексов. Показано, что молеку-лы анионных ПАВ, вызы-вающие наибольшее увеличение интенсив-ности люминесценции, входят во внут--реннюю сферу комплексов, тем самым способствуя их дегид-ратации, снижению безызлучательных потерь энергии возбуждения и увели-чению времени жизни комплексов в 2,5 - 15 раз. В случае биядерных комп-лексов (L3, L5, L7, L8 ) анионные ПАВ разрывают до-норно - ак-цепторную связь иона Tb(III) с атомом азота пиперазинового цикла и ко-ор-ди-нируются в качес-тве второго ли-ган-да к иону лантанида. Методом предель-но-го логариф-мирования найде-но, что во внутреннюю сферу комплекса входит 1 мо-лекула АПАВ. Разруше-ние биядер-ного комплексного соединения способствует уве-ли-че-нию Iлюм иона Ln(III). Для комплексов Tb(III) с лигандами L4, L6, содержа-щими в своей струк-туре третичный атом азота, анало-гичным методом установлено, что во внутрен-нюю координацион-ную сферу также входит 1 молекула АПАВ. На ос-новании сравнения величин ККМ и концентрации АПАВ, при которой Iлюм мак-симальна сделано заключение, что взаимо-действие комплексов ионов Ln(III) с хи-но-лон-карбоновыми кислотами и АПАВ происходит в предмицеллярных ассоци-атах.

С целью применения комплексов Tb(III) с производными хинолонкар-боновой кислоты в иммунофлуоресцентном анализе, изучено влияние комплексо-нов на Iлюм данных аналитических форм. На модельных системах пока-зана возмож-ность использования оксолиниевой, налидиксовой кислот и норфлок--сацина в качестве основных компонентов усиливающих раст-воров. Пре-дел детек-ции тербия при этом составляет 410-14, 110-11 и 110-10моль/л соот-вет---ственно.

На основании проведенных исследований предложены экспресный тест - ме-тод определения ципрофлок-сацина и нор-флок-сацина в биологических жид-костях (мо-че) с преде-лом обна-ружения 1 мкг/мл и высокочувстви-тельные методики опре-де-ления произ-водных хинолон-карбоновой кислоты (пипеми-диевой кислоты, ломе-флок-сацина, пеф-лок-сацина, норфлоксацина, ципро-флок-сацина) в моче и плазме крови без предвари-тельного выделения препа-рата. Предел обнаружения препара-тов составил 0,01 - 0,003 мкг/мл, что на несколь-ко порядков ниже по сравнению с известными литературными данными.

Ключевые слова: анализ, лантаниды, люминесценция, лекарственные препа-раты, сенсибилизация, иммуноанализ.