УКРАЇНСЬКА АКАДЕМІЯ АГРАРНИХ НАУК

ІНСТИТУТ ТВАРИННИЦТВА

ТРОЦЬКИЙ Петро Анатолійович

УДК 636.2:591.453.5

КРІОКОНСЕРВУВАННЯ ООЦИТ-КУМУЛЮСНИХ КОМПЛЕКСІВ КОРІВ НА РІЗНИХ СТАДІЯХ МЕЙОТИЧНОГО ДОЗРІВАННЯ ТА ОЦІНКА ЇХ ЖИТТЄЗДАТНОСТІ ПІСЛЯ ДЕКОНСЕРВУВАННЯ

03.00.20 - біотехнологія

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата сільськогосподарських наук

Харків - 2001

Дисертацією є рукопис

Робота виконана в лабораторії генофонду порід сільськогосподарських тварин Інституту розведення і генетики тварин УААН.

Науковий керівник: кандидат біологічних наук, старший науковий співробітник Гузеватий Олег Євгенович, Українська академія аграрних наук (м. Київ), завідувач Сектора агробіотехнології.

Офіційні опоненти: доктор біологічних наук, старший науковий

співробітник Вишневський Валентин Йосипович, Інститут тваринництва, головний науковий співробітник

кандидат сільськогосподарських наук Медведовський Олександр Вікторович, Харківський біотехнологічний центр, директор.

Провідна установа: Державний науково-дослідний контрольний інститут ветеринарних препаратів та кормових добавок Міністерства аграрної політики України, м. Львів

Захист дисертації відбудеться 26.12.2001 року о 14 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 65.356.02 при Інституті тваринництва УААН, за адресою: 62404, Харківська обл., Харківський р-н., п/в Кулиничі.

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Інституту тваринництва УААН.

Адреса Інститута: 62404, Харківська обл., Харківський р-н., п/в Кулиничі.

Автореферат розісланий 17.11.2001 року.

Вчений секретар спеціалізованої

вченої ради, кандидат

біологічних наук Проніна В.В..

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. На сучасному етапі, завдяки прискореному розвитку фундаментальних досліджень, особлива увага в Україні надається пріоритетним напрямкам науково-технічного прогресу в тваринництві, зокрема розробці та опануванню ефективних методів біотехнології. За останні роки в світі, в тому числі й в нашій країні, досягнуто значних успіхів і впроваджено у виробництво метод трансплантації ембріонів великої рогатої худоби (Бугров О.Д. та ін., 1988, 1999; Яблонский В.А., 1988; Ruane J., 1988; Эрнст Л.К., Сергеев H.И., 1989; Christensen L.G., 1991; Seidel G., 1991; Осташко Ф.І., 1995; Шаловило С.Г., 1996; Мадісон В.В., Мадісон Л.В., 1998; Шеремета В.І., 1999), інтенсивно розвивається метод культивування і запліднення in vitro ооцит-кумулюсних комплексів сільськогосподарських тварин (Голубев А.К., 1988; Завертяев Б.П., 1989; Greve T., Madison V., 1991; Кузьмина Т.И., 1993; Trounson A. et al., 1994; Гузеватий О.Є., Безуглий М.Д., 1995; Зубець М.В., та ін., 1995; Кузнєцов В.Є., та ін., 1998; Bousquet D. et al., 1999), клонування зародків (Prather R.S., 1987; Foote R.H., Yand X., 1992; Wilmut I. et al., 1997; Безуглий М.Д. та ін., 1998; Kato Y. et al., 1998; Кузнєцов В.Є., 1999; Robl J.M., 1999; Зубець М.В. та ін., 2000), визначення їх статі (King W.A., 1984; Nibart M. et al., 1992; Hochman D. et al., 1994; Лиманский А.П. и др., 1998), отримання партеногенетичних ембріонів (Onodera M., Tsunoda Y., 1989; Кузнецов В.Е., Елизарова И.Б., 1992). Проблема тривалого збереження гамет і ембріонів сільськогосподарських тварин, особливо великої рогатої худоби, займає одне з головних місць у комплексі біотехнологічних методів. Сучасний розвиток репродуктології в союзі з кріобіологією відкриває великі можливості консервування, тривалого зберігання та практичного використання репродуктивних клітин і ембріонів залежно від потреб народного господарства. Одним з пріоритетних та перспективних методів збереження генетичних резервів порід є створення банків кріоконсервованих ембріонів шляхом їх глибокого заморожування в рідкому азоті при температурі – 196оС (Whittingham D.G., 1974; Безуглий М.Д. та ін., 1994; Schiewe M.C. et al., 1995; Ротт Н.Н., 1995, 1996). Не меншого значення, безумовно, набуває й проблема зберігання в замороженому стані ооцитів. Тривале зберігання гамет обох батьків припускає необмежені варіанти їх поєднання в майбутньому. Крім того, створення ооцитобанку та банку запліднених яйцеклітин не тільки дасть змогу різко знизити витрати на отримання ембріонів, а також сприятиме розв'язанню цілої низки наукових проблем, насамперед у розгортанні досліджень з клітинної та генної інженерії (Blercom J.V., 1991; Niemann H., 1991; Rall W.F., 1992; Гузеватый О.Е. и др., 1993; Протасов Б.И. и др., 1994; Зубець М.В. та ін., 1994; Le Gal F., Massip A., 1999; Papis K. et al., 2000; Vajta G., 2000).

Зв'язок роботи з науковими програмами. Дисертаційна робота виконувалась у лабораторії генофонду порід сільськогосподарських тварин Інституту розведення і генетики тварин Української академії аграрних наук як складова наукової теми: 03.09.02.02. "Розробити методи культивування ооцитів сільськогосподарських тварин, умови для заморожування ооцитів корів і створити ооцито- та ембріобанк великої рогатої худоби" (номер державної реєстрації 0196 UO 16325).

Мета і завдання досліджень. Метою досліджень була оцінка життєздатності деконсервованих ооцит-кумулюсних комплексів корів, що були заморожені методом вітрифікації на різних стадіях їх мейотичного дозрівання. Для досягнення поставленої мети вирішували такі завдання:

1. Порівняти життєздатність деконсервованих ооцит-кумулюсних комплексів корів, що були заморожені на диплотені, метафазі-1 і метафазі-2 мейозу.

2. З'ясувати особливості використання різних концентрацій кріопротекторів у вітрифікаційному розчині при заморожуванні ооцит-кумулюсних комплексів корів.

3. Встановити ефективність різних способів виведення кріопротекторів після розморожування ооцитів корів.

4. Вивчити вплив попереднього культивування перед заморожуванням різної чисельності гамет в групах на життєздатність і мейотичне дозрівання поза організмом ооцит-кумулюсних комплексів корів після їх розморожування.

5. Дослідити особливості використання для заморожування ооцитів корів, залежно від клітин кумулюсу, що їх оточують.

6. Оцінити життєздатність і повноцінність дозрівання поза організмом деконсервованих яйцеклітин корів шляхом їх запліднення in vitro.

Об`єкт дослідження: деконсервовані ооцит-кумулюсні комплекси корів різних стадій мейотичного дозрівання та ембріони великої рогатої худоби, що отримані з деконсервованих і дозрілих поза організмом гамет корів.

Предмет дослідження: ядерне і цитоплазматичне дозрівання поза організмом деконсервованих ооцит-кумулюсних комплексів корів, розвиток зигот великої рогатої худоби після запліднення in vitro деконсервованих і дозрілих поза організмом гамет корів.

Методи досліджень: при виконанні експериментальних досліджень з теми дисертаційної роботи використовували біотехнологічні (отримання ооцитів корів, їх дозрівання поза організмом, капацитація сперматозоїдів бугая, запліднення in vitro яйцеклітин, культивування поза організмом зигот і ембріонів великої рогатої худоби), кріобіологічні (обробка ооцит-кумулюсних комплексів еквілібраційним та вітрифікаційним розчином кріопротекторів, заморожування-розморожування гамет корів, виведення з них кріопротекторів), морфологічні (оцінка яєчників, фолікулів, жовтих тіл, ооцитів, яйцеклітин і ембріонів за морфологічними показниками) та цитогенетичні (аналіз хромосомного апарату ооцитів, яйцеклітин, зигот і ембріонів) методи.

Наукова новизна одержаних результатів. Встановлена різна чутливість ооцит-кумулюсних комплексів корів до дії низьких температур залежно від стадії їх

мейотичного дозрівання. Доведено, що найбільш перспективними для заморожування є ооцити корів з щільним багатошаровим кумулюсом. Проведений порівняльний аналіз різних способів виведення кріопротекторів після розморожування ооцитів корів і визначена їх ефективність. Проведений порівняльний аналіз застосування різних концентрацій кріопротекторів у вітрифікаційному розчині і виявлено, що збільшення концентрації гліцерину і пропандіолу з 50 до 70% у загальному об'ємі розчину не призводить до збільшення після заморожування- розморожування і культивування кількості життєздатних та дозрілих до метафази-2 мейозу гамет корів.

Практичне значення одержаних результатів. Практичне значення одержаних результатів полягає у використанні методу вітрифікації для заморожування ооцит-кумулюсних комплексів корів, що дає можливість скоротити процес кріоконсервування в порівнянні з програмним заморожуванням, в значній мірі зменшити його трудомісткість та виключити застосування дорогої апаратури для заморожування. Одержані експериментальні дані мають цінність для поглиблення знання і подальшого прогресу науково-технічних розробок в кріобіології репродуктивних клітин та можуть бути використані в біотехнологічних центрах і наукових лабораторіях, що займаються розробкою і впровадженням методів кріоконсервування гамет та ембріонів ссавців, а також в учбових курсах університетів з біотехнології, генетики, кріобіології, біології розвитку та відтворення сільськогосподарських тварин.

Особистий внесок здобувача. Аналіз літератури, експериментальні дослідження, їх біометрична обробка, аналіз і узагальнення отриманих результатів, висновки і пропозиції виробництву виконані автором особисто. Вибір напрямку, схема і опрацювання методики досліджень проведені разом з науковим керівником. Із спільних досліджень використано свою частину досліджень.

Апробація результатів дисертації. Основні положення дисертації доповідалися і обговорювалися на засіданнях вченої ради, лабораторії генофонду порід сільськогосподарських тварин і аспірантських сесіях (1996-1998 рр) Інституту розведення і генетики тварин УААН, на міжнародних конференціях:

- "Региональная конференция молодых ученых и специалистов".- Оренбург, 1997;

- "Біотехнологічні, селекційні та організаційні методи відтворення, зберігання і використання генофонду тварин".- Київ, 1997;

- "Интенсификация производства продукции животноводства в республике Беларусь".- Жодино, 1998;

- "Творческое развитие научного наследия академика М.Ф. Иванова".- Аскания-Нова, 1998;

- "Актуальные проблемы биологии в животноводстве".- Боровск, 2000;

- "Проблеми виробництва екологічно чистої сільськогосподарської продукції на межі 3-го тисячоліття".- Житомир, 2000.

- "Теоретичні основи і практичне використання методу штучного осіменіння та кріоконсервації гамет в селекції тварин".- Київ, 2001.

Публікації. За матеріалами досліджень, що подані в дисертації опубліковано 11 друкованих праць.

Об`єм і структура дисертації. Дисертація викладена на 152 сторінках машинописного тексту, складається із вступу, огляду літератури, матеріалу і методики досліджень, результатів досліджень і їх обговорення, висновків, практичних пропозицій, має 19 таблиць і 23 рисунки. Список використаних джерел включає 335 найменувань із них 152 іноземних авторів.

МАТЕРІАЛИ І МЕТОДИКА ДОСЛІДЖЕНЬ

Об'єктом експериментальних досліджень були ооцит-кумулюсні комплекси, які отримували з яєчників клінично здорових корів і телиць чорно-рябої породи. Загальна схема досліджень наведена на рис. 1. Яєчники привозили в лабораторію з

досліджень.

Київського м'ясокомбінату не пізніше 1,5-2 годин після забою тварин, у термосі з стерильним фізіологічним розчином (0,9% NaCl) і антибіотиками (100 од/мл пеніциліну і 100 мкг/мл стрептоміцину) при температурі +32 - +38?С. В лабораторії яєчники двічі промивали свіжовиготовленим фізіологічним розчином. Ооцити отримували шляхом надрізу лезом видимих антральних фолікулів, вимивали середовищем Дюльбекко (“Serva”) з 1 од/мл гепарину ("Biochemi") та 40 од/мл гентаміцину (“Reanal”), виловлювали пастерівською піпеткою та оцінювали за морфологічними ознаками під контролем мікроскопу МБС-9. Для заморожування і культивування використовували ооцити з гомогенною тонкозернистою ооплазмою, неушкодженою прозорою оболонкою, щільним або частково розпушеним кумулюсом. Заморожування ооцит-кумулюсних комплексів корів проводили методом вітрифікації. Перед заморожуванням гамети корів обробляли еквілібраційним розчином (10% гліцерин (“Sigma”) + 20% пропандіол (“Sigma”),

10 хв.), потім на 30 секунд переносили у вітрифікаційний розчин (25% гліцерин + 25% пропандіол), вміщували у пластикові пайєти і занурювали у рідкий азот. Після розморожування гамет виведення кріопротекторів з них проводили шляхом перенесення їх на 10 хвилин у розчин 1,0 М сахарози (“Sigma”). Потім їх тричі відмивали середовищем М-199 (“Sigma”), оцінювали за морфологічними ознаками і переносили в середовище для культивування.

Ооцит-кумулюсні комплекси корів культивували в чотирьохлункових планшетах ("Costаr") протягом 27 годин при температурі 38,5?С, 5% CO2 у повітрі, в краплях середовища 199 з 10% попередньо інактивованою сироваткою корів, 2,5 мкг/мл ФСГ ("Schering corporation"), 1,0 мкг/мл естрадіолу ("Serva"), 2,5 МОд/мл лютеінізуючого гормону ("Serva"), 2,0 мМ натрія пірувату ("Sigma"), 2,92 мМ кальція лактату ("Sigma"), 40 мкг/мл гентаміцину.

Після дозрівання поза організмом нативні та деконсервовані яйцеклітини підлягали заплідненню in vitro. Для запліднення in vitro яйцеклітин корів використовували заморожену сперму бугая "Матадор-109" із спермобанку Інституту розведення і генетики тварин УААН. Капацитацію сперматозоїдів здійснювали гепарином (100 од/мл) за методикою Parrish J.J. et al. (1988). Спільне інкубування яйцеклітин і сперматозоїдів проводили в термостаті при температурі 38,5?С, 5% CO2 в повітрі, в краплях середовища Fert.-TALP. Після 12-18 годин спільного інкубування яйцеклітини і зиготи відмивали від прилиплої сперми і переносили в краплі середовища CDM для подальшого культивування.

На різних етапах культивування ооцити та ембріони підлягали морфологічно- му і цитогенетичному аналізу. Цитогенетичні препарати готували за методом Tarcowski A.K. (1966) або Ushijima M. et al. (1988), забарвлювали 10%-ним розчином Гімза (”Fluka”) та досліджували під мікроскопом.

Отримані результати статистично обробляли за Плохинским Н.А. (1969) і Лакиным Г.Ф. (1990) з використанням критеріїв Стьюдента та Пірсона -“Хі-квадрат”.

РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ

Культивування деконсервованих ооцитів корів, що були заморожені на різних стадіях їх мейотичного дозрівання

Розробка методів отримання, морфологічної оцінки, кріоконсервування, дозрівання і запліднення in vitro – це прямий шлях до розширення можливостей використання гамет самиць, переважна більшість яких навіть у багатоплідних сільськогосподарських тварин протягом їх життя підлягає атрезії.

Для проведення досліджень з кріоконсервування гамет корів на різних стадіях їх мейотичного дозрівання потрібно попередньо отримувати відповідний біоло-гічний матеріал. В своїх експериментах ми вивчали динаміку зміни фаз мейотичного дозрівання ооцит-кумулюсних комплексів корів (n=495) в процесі їх 30 годинного культивування. Встановлено, що переважна більшість ядер ооцит-кумулюсних комплексів (35/42; 83,3%), що були отримані з антральних фолікулів яєчників корів, оцінені за морфологічними ознаками і відібрані для культивування знаходяться на диплотені мейозу. Всього 15 годин культивування виявилось достатньо, щоб всі гамети корів із загальної популяції клітин поставлених на культивування поновили своє мейотичне дозрівання. На цей період культивування спостерігали максимальну кількість клітин (23/37; 62,2%), що досягали стадії метафази-1 мейозу, а через 27 годин спостерігали максимальну кількість клітин (41/54; 75,9%) на метафазі-2 мейозу. Показник дегенерацій хромосомного матеріалу гамет корів через 27 годин культивування становив 8/54; 14,8% і вірогідно не відрізнявся від відповідного показника в попередніх групах культивування. Подальше збільшення терміну культивування до 30 годин не призводить до збільшення кількості гамет корів, що дозріли поза організмом, але значно збільшується показник кількості клітин з дегенерацією хромосом (12/41; 29,3%, P< 0,05)

Знання строків мейотичного дозрівання ооцит-кумулюсних комплексів корів до необхідної стадії дозволило нам провести серію експериментів із заморожування гамет на різних стадіях мейозу (табл. 1). Результати цитогенетичного аналізу, деконсервованих ооцит-кумулюсних комплексів корів з дослідних груп А, Б і В виявили, що в міру збільшення терміну попереднього культивування перед заморожуванням, збільшується (від 54,7 до 62,7%, P< 0,05) кількість гамет дозрілих до метафази-2 мейозу та зменшується (від 37,5 до 28,0%, P< 0,05) кількість клітин з дегенерацією хромосомного апарату.

Таким чином, результати експериментальних досліджень свідчать, що чутливість ооцит-кумулюсних комплексів корів до дії низьких температур залежить від стадії їх мейотичного дозрівання.

Таблиця 1

Вплив терміну попереднього культивування на життєздатність і подальший розвиток деконсервованих

ооцит-кумулюсних комплексів корів

Варі-анти дос-ліду Кіль-кість замо-роже-них клі-тин Термін попе-ред-нього куль-тиву-вання, год. Кількість морфоло-гічно нормальних клітин після розморо-жування Кіль-кість про-куль-тиво-ваних клітин Кількість морфоло-гічно нормальних клітин після культи-вування Термін куль-тиву-вання, год. Кількість клітин, що підлягали цитогене-тичному аналізу Кількість клітин:

на метафазі-2 на інших стадіях мейозу з дегенера-цією хромосом

n % n % n % n % n %

А 90 0 67 74,4 67 64 95,5 27 64 35 54,7 c 5 7,8 24 37,5e

Б 90 15 71 78,9 71 69 97,2 12 69 41 59,4 bc 6 8,7 22 31,9ef

В 90 24 77 85,5 77 75 97,4 3 75 47 62,7 b 7 9,3 21 28,0f

К - - - - 40 39 97,5 27 39 29 74,3 a 4 10,3 6 15,4d

b : c, e : f – P< 0,05; a : b, d : f – P < 0,01; a : c, d : e – P < 0,001

Порівняльний аналіз використання різних концентрацій гліцерину і пропандіолу у вітрифікаційному розчині при заморожуванні ооцит-кумулюсних комплексів корів

При проведенні експериментальних досліджень із кріоконсервування зародків і, особливо, гамет самиць сільськогосподарських тварин використовується широкий спекр кріопротекторів. Найбільш поширені з них - це гліцерин і пропандіол.

В табл. 2 наведені результати експериментальних досліджень використання різних концентрацій гліцерину і пропандіолу у вітрифікаційному розчині при кріоконсервуванні гамет корів.

Аналіз результатів досліджень свідчить, що немає вірогідної різниці між експериментальними варіантами С, D і E, за таких показників, як дозрівання ооцит-кумулюсних комплексів корів після розморожування до метафази-2 мейозу (відповідно 52,1; 49,2 і 46,3%) та кількості клітин з дегенерацією хромосомного апарату (відповідно 27,4; 27,0 і 29,6%). Зменшення концентрації кріопротекторів (гліцерину і попандіолу) до 40 і 30% (варіанти В і А) у загальному об`ємі вітрифікаційного розчину призводило до значного збільшення (відповідно 79,1 і 89,7%) кількості гамет корів з порушеннями хромосомного апарату. В контрольній групі (без заморожування) 68,6% клітин після 27 годин культивування досягали метафази-2 мейозу, а 15,7% гамет корів мали порушення хромосомного апарату.

Порівняльний аналіз різних способів виведення кріопротекторів після розморожування гамет корів

Наступним етапом наших досліджень було вивчення і порівняння різних способів виведення кріопротекторів після розморожування ооцит-кумулюсних комплексів корів (дані наведені в табл. 3).

Таблиця 3

Вплив різних способів виведення кріопротектору на життєздатність і дозрівання деконсервованих ооцит-кумулюсних комплексів корів

Варі-анти дос-ліду Кіль-кість замо-роже-них клітин Кількість клітин придатних для культивування після розморожу-вання Тер-мін куль-тиву-вання, год. Кількість клітин:

на метафазі-2 на інших стадіях мейозу з дегенера-цією хромо-сом

n % n % n % n %

А 70 54 77,1 27 26 48,2 a 8 14,8 20 37,0 f

Б 70 60 85,7 27 32 53,3 ab 10 16,7 18 30,0 fg

В 70 58 82,9 27 30 51,7 a 9 15,5 19 32,8 fg

Г 70 61 87,1 27 34 55,7 abс 10 16,4 17 27,9 fg

Д 70 66 94,3 27 40 60,6 bс 9 13,6 17 25,8 fg

Е 70 68 97,1 27 46 67,6 cd 7 10,3 15 22,1 g

К 70 - - 27 53 75,7 d 8 11,4 9 12,9 e

a : c, b : d, c : d, g : f - P < 0,05; a : d, e : f - P < 0,001

Таблиця 2

Використання різних концентрацій кріопротекторів у вітрифікаційному

розчині при заморожуванні ооцит-кумулюсних комплексів корів

Варіан-ти дос-ліду Склад кріопро-текторів у вітри-фікацій-ному розчині Термін куль-тиву-вання, год. Кількість прокуль-тиво-ваних клітин Кількість клітин на: Кількість клітин з дегенерацією хромосом

диплотені+ діакінезі+ метафазі-1 анафазі+ телофазі метафазі-2 всього з них на метафазі-2

n % n % n % n % n %

A 15%Г+ 15%ПД 27 78 5 6,5 3 3,8 - - 70 89,7 h - -

B 20% Г+ 20%ПД 27 67 6 9,0 1 1,5 7 10,4d 53 79,1h 3 5,7

C 25% Г+ 25%ПД 27 73 9 12,3 6 8,2 38 52,1 b 20 27,4 f 4 20,0

D 30% Г+ 30%ПД 27 63 11 17,5 4 6,3 31 49,2 b 17 27,0 f 2 11,8

E 35% Г+ 35%ПД 27 54 8 14,8 5 9,3 25 46,3 bс 16 29,6 fg 3 18,6

K - 27 51 6 11,8 2 3,9 35 68,6 а 8 15,7 e 3 37,5

Г – гліцерин, ПД – пропандіол

a : b – P<0,05; a : c, e : f, e : g – P < 0,01; a : d, b : d, c : d, e : g, e : h, f : h, g : h – P - < 0,001

В експериментальних групах А, Б, В для виведення кріопротекторів використовували одноступеневий спосіб із застосуванням відповідно 0,5; 0,75 і

1,0 М розчину сахарози. В дослідних групах Г, Д, Е після розморожування гамет корів для виведення кріопротекторів використовували відповідно 2-х, 4-х та 10-и ступеневий спосіб. Визначена різна ефективність цих способів виведення кріопротекторів. Показники дозрівання деконсервованих гамет корів до метафази-2 мейозу (55,7; 60,6 і 67,6% проти 48,2; 53,3 і 51,7%) і дегенерацій хромосомного матеріалу культивуємих клітин (27,9; 25,8 і 22,1% проти 37,0; 30,0 і 32,8%) свідчать про те, що ступеневий спосіб виведення кріопротекторів з деконсервованих гамет корів за допомогою розчину сахарози більш ефективний порівняно з варіантами (з використанням 1,0 М; 0,75 М; 0,5 М сахарози) одноступеневого способу.

Дозрівання деконсервованих ооцит-кумулюсних комплексів корів, що перед заморжуванням були прокультивовані в групах з різною чисельністю гамет

В природних умовах (in vivo) ооцит-кумулюсні комплекси корів дозрівають індивідуально у кожному окремому фолікулі. Але в практиці культивування поза організмом гамет корів дослідники використовують не тількі різні культуральні середовища, їх об'єми, але й різні варіанти кількісного групування в них культивуємих клітин. Результати з вивчення впливу попереднього культивування в групах з різною чисельністю гамет корів перед заморожуванням на їх життєздатність і мейотичне дозрівання поза організмом після розморожування наведені в табл. 4.

В групі А ооцит-кумулюсні комплекси корів перед заморожуванням попередньо культивували індивідуально в краплі об'ємом 200 мкл культурального середовища, в групі Б – по 3 клітини в краплі, в групі В – по 5, в групі Г – по 10, в групі Д – по 20 і в групі Е – по 30 клітин. Аналіз результатів досліджень свідчить, що попереднє 15 та 24-х годинне культивування ооцит-кумулюсних комплексів корів перед заморожуванням за умов використання 10 та 20 клітин у 200 мкл культурального середовища підвищувало кріорезистентність гамет корів, про що свідчить збільшення після розморожування кількості життєздатних і дозрілих до метафази-2 мейозу клітин порівняно з іншими варіантами співвідношення кількості гамет корів і мікрооб'єму культурального середовища. Подальше збільшення чисельності культивуємих клітин до 30 в мікрооб'ємі культурального середовища негативно впливало (P< 0,05) на рівень дозрілих до метафази- 2 мейозу деконсервованих ооцит-кумулюсних комплексів корів.

Життєздатність і дозрівання in vitro деконсервованих ооцитів залежно від клітин кумулюсу, що оточують гамети корів

Популяція ооцитів корів з антральних фолікулів гетерогенна за морфологічними ознаками і ця гетерогенність виявляється в особливостях структурованості ооплазми, наявності або відсутності клітин кумулюсу Таблиця 4

Дозрівання деконсервованих ооцит-кумулюсних комплексів корів, що перед заморожуванням попередньо культивували в групах з різною чисельністю клітин

Варіанти досліду Кількість заморо-жених клітин Термін поперед-нього культиву-вання, год. Кількість морфологічно нормальних клітин після розморожу-вання Термін подальшого культиву-вання після розморожу-вання, год. Кількість клітин, що підлягали цитогене-тичному аналізу Кількість клітин:

на метафазі-2 на інших стадіях мейозу з дегенера-цією хромосом

n % n % n % n %

А 60 15 50 83,3 12 50 24 48,0 ab 10 20,0 16 32,0

60 24 54 90,0 3 54 26 48,2 cd 10 18,5 18 33,3

Б 78 15 64 82,1 12 64 30 46,9 ab 14 21,9 20 31,2

60 24 52 86,7 3 52 28 53,8 cd 8 15,4 16 30,8

В 70 15 56 80,0 12 56 28 50,0 ab 10 17,9 18 32,1

60 24 50 83,3 3 50 26 52,0 cd 8 16,0 16 32,0

Г 80 15 66 82,5 12 66 36 54,6 b 8 12,1 22 33,3

60 24 50 83,3 3 50 28 56,0 de 6 12,0 16 32,0

Д 80 15 62 77,5 12 62 36 58,1 b 8 12,9 18 29,0

80 24 68 85,0 3 68 44 64,7 e 6 8,8 18 26,5

Е 60 15 44 73,3 12 44 18 40,9 a 7 15,9 19 43,2

60 24 52 66,7 3 52 22 42,3c 6 11,5 24 46,2

a : b, c : d – P< 0,05; c : e – P< 0,01 (яйценосного пагорбка), різної їх оптичної щільності. Така різноманітність гамет корів обумовлює їх різну здатність до дозрівання і запліднення in vitro та дозволяє проводити попередній відбір з метою підвищення ефективності їх використання.

Ооцити корів з гомогенною, тонкозернистою ооплазмою, неушкодженою прозорою оболонкою залежно від характеристики оточуючих їх клітин кумулюсу розподіляли на 3 дослідні групи: А - ооцити з щільним багатошаровим кумулюсом, доля таких за морфологічними ознаками клітин із загальної популяції ооцит-кумулюсних комплексів корів придатних для культивування, отриманих з 25 яєчників методом надрізу видимих антральних фолікулів, становила 19,5%, кількість ооцитів, що були отримані з одного яєчника становила від 2 до 12, в середньому - 5,8 ± 2,2 клітин/яєчник; В - ооцити з частково розпушеним кумулюсом, доля такого типу гамет корів із загальної популяції ооцит-кумулюсних комплексів придатних для культивування становила 32,6%, з одного яєчника отримували від 5 до 16 гамет, в середньому - 9,6 ± 1,9 клітин/яєчник; С - ооцити з декількома шарами щільного кумулюсу, кількість клітин цього типу, що були отримані з одного яєчника становила від 6 до 23, в середньому - 14 ± 2,9 клітин/яєчник, а доля таких гамет із загальної популяції ооцит-кумулюсних комплексів корів становила 47,9%.

Результати експериментів із заморожування гамет корів з різним кумулюсом наведені в табл. 5.

Таблиця 5

Результати заморожування ооцитів корів з різними типами кумулюсу

Варі-анти дос-ліду Кіль-кість замо-роже-них клітин Кількість клітин придатних для культивування після розмо-рожування Термін культи-вуван-ня, год. Кількість клітин:

на метафазі-2 на інших стадіях мейозу з дегенера-цією хромосом

n % n % n % n %

А 50 47 94,0 27 26 55,3 b 9 19,1 12 25,6 g

Ка 50 - - 27 39 78,0 cd 6 12,0 5 10,0 e

В 60 53 88,3 27 24 45,3 ab 13 24,5 16 30,2 gh

Кв 60 - - 27 44 73,3 cd 6 10,0 10 16,7 ef

С 70 57 81,4 27 25 43,9 a 12 21,0 20 35,1 h

Кс 70 - - 27 48 68,6 c 9 12,8 13 18,6 ef

a : b, f : g - P< 0,05; b : c, e : g - P< 0,01; a : c, a : d, b : d, e : g, e : h, f : h - P< 0,001

Встановлено, що найбільш перспективні для заморожування є ооцити корів з щільним багатошаровим кумулюсом. При заморожуванні/розморожуванні таких гамет порівняно з іншими варіантами досліду збільшується після 27 годинного культивування показник дозрівання ооцит-кумулюсних комплексів до метафази- 2 мейозу (55,3% проти 45,3 і 43,9%) та зменшується показник клітин з порушенням хромосомного матеріалу (25,6% проти 30,2 і 35,1%).

Запліднення in vitro деконсервованих яйцеклітин корів

Успішне запліднення in vitro яйцеклітин корів і подальший розвиток зародків після їх культивування є одним з об'єктивних критеріїв повноцінності мейотичного дозрівання поза організмом гамет самиць.

В трьох дослідних варіантах (табл. 6), в яких заморожували-розморожували

Таблиця 6

Результати запліднення in vitro деконсервованих яйцеклітин корів з різним кумулюсом

Варі-анти дос-ліду Кількість клітин, що підлягали заплід-ненню Термін культиву-вання після запліднення, год Кількість ембріонів на стадіях:

2-х клітин-них 3-4-х клітин-них 5-16 клітин-них всього

n % n % n % n %

А 91 96 4 4,4 5 5,5 5 5,5 14 15,4 c

Б 126 96 5 3,9 6 4,8 2 1,6 13 10,3 ab

В 137 96 6 4,4 4 2,9 2 1,5 12 8,8 a

b : c - P< 0,05; а : c - P < 0,001

і дозрівали поза організмом до метафази- 2 мейозу ооцити корів з щільним багатошаровим кумулюсом (варіант – А), частково розпушеним кумулюсом (варіант – Б) і декількома шарами щільного кумулюсу (варіант – В), після запліднення in vitro і 96-ти годинного подальшого культивування дроблення гамет спостерігали відповідно у 15,4; 10,3 та 8,8% випадках.

При використанні для кріоконсервування ооцитів корів з щільним багатошаровим кумулюсом, після дозрівання і запліднення in vitro деконсервованих гамет самиць було отримано вірогідно більшу не тільки загальну кількість зародків порівняно з іншими експериментальними варіантами досліду, але й вірогідно більшу кількість зародків, що мали більше 2-х бластомерів, відповідно 11,0% проти 6,4% (P< 0,05) та 4,4% (P< 0,001).

Результати із запліднення in vitro деконсервованих яйцеклітин корів, що були заморожені на різних стадіях мейозу наведені в табл. 7.

Аналіз результатів досліджень свідчить, що загальний показник дроблення клітин після запліднення in vitro, що були заморожені на метафазі-2 (21,1%, варіант В) виявився вищим ніж аналогічний показник у клітин, що були заморожені на диплотені (9,4%, P< 0,001 варіант А) і метафазі-1 (14,9%, P< 0,01 варіант Б). В свою чергу цей показник у гамет корів, що були заморожені на метафазі-1 переважав

(P< 0,05) аналогічний показник у клітин, що були заморожені на диплотені мейозу.

Таблиця 7

Результати запліднення in vitro деконсервованих яйцеклітин корів,

що були заморожені на стадіях диплотени, метафази-1 і метафази-2

Варі-анти дос-ліду Кількість клітин, що підлягали заплід-ненню Термін культиву-вання після запліднення, год Кількість ембріонів на стадіях:

2-х клітин-них 3-4-х клітин-них 5-16 клітинних всього

n % n % n % n %

А 139 96 5 3,6 5 3,6 3 2,2 13 9,4 a

Б 107 96 4 3,7 7 6,5 5 4,7 16 14,9 b

В 114 96 5 4,4 10 8,8 9 7,9 24 21,1 c

К 84 96 7 8,3 8 9,6 19 22,6 34 40,5 d

a : b - P < 0,05; b : c - P < 0,01; а : c, a : d, b : d, c : d - P < 0,001

Крім цього виявлено й той факт, що індекс подальшого дроблення зародків великої рогатої худоби (кількість ембріонів, що мають більше 2-х бластомерів/від загальної кількості ембріонів) був також вищим після 96 годинного культивування запліднених in vitro деконсервованих і дозрілих поза організмом яйцеклітин корів, що були заморожені на стадії метафази-2 (79,2%) порівняно з іншими дослідними варіантами, в яких для заморожування використовували клітини на стадії диплотени (61,5%) та метафази-1 (75,0%).

ВИСНОВКИ

1. Чутливість ооцит-кумулюсних комплексів корів до дії низьких температур залежить від стадії їх мейотичного дозрівання. Заморожування гамет корів на метафазі- 2 мейозу підвищує вихід життєздатних і дозрілих клітин після розморожування і короткочасного культивування на 8,0% (P< 0,05) порівняно з клітинами замороженими на стадії диплотени.

2. Рівень дроблення яйцеклітин корів після запліднення in vitro вищий при використанні для заморожування гамет на стадії метафази-2 порівняно з ооцит-кумулюсними комплексами замороженими на диплотені (P< 0,001) та метафазі-1 (P< 0,01) і становить 21,1%.

3. Найбільш перспективні для заморожування є ооцити корів з щільним багатошаровим кумулюсом. Доля таких за морфологічними ознаками клітин із загальної популяції ооцит-кумулюсних комплексів корів придатних для культивування складає 19,5% (5,8±2,2 клітин на яєчник), 55,3% з них після деконсервування і дозрівання поза організмом досягає метафази –2 мейозу, кількість отриманих зародків після запліднення in vitro становить 15,4%.

4. Збільшення концентрації кріопротекторів (гліцерину і пропандіолу) з 50 до 70% у загальному об'ємі вітрифікаційного розчину не призводить до збільшення після заморожування-розморожування і культивування кількості життєздатних та дозрілих до метафази-2 мейозу гамет корів.

5. Ступеневий спосіб виведення кріопротекторів з гамет корів після їх деконсервування за допомогою розчину сахарози більш ефективний (P< 0,05) порівняно з варіантами одноступеневого способу (з використанням 1,0 М; 0,75 М; 0,5 М сахарози) за такими показниками як життєздатність та дозрівання поза організмом ооцит-кумулюсних комплексів корів.

6. Попереднє культивування ооцит-кумулюсних комплексів корів перед заморожуванням за умов використання 10 і 20 клітин у 200 мкл культурального середовища підвищує кріорезистентність гамет, що проявляється у збільшенні на 4,6-22,4% після розморожування кількості життєздатних і дозрілих до метафази-2 мейозу клітин.

ПРАКТИЧНІ ПРОПОЗИЦІЇ

1. Для розробки біотехнологічних методів кріоконсервування гамет корів рекомендуємо використовувати для заморожування ооцити з щільним багатошаровим кумулюсом.

2. Для підвищення життєздатності деконсервованих гамет корів рекомендуємо для заморожування використовувати яйцеклітини на стадії метафази- 2 мейозу, а виведення кріопротекторів після розморожування клітин здійснювати за допомогою сахарози ступеневим способом.

3. Результати досліджень можуть бути використані при викладанні лекцій з біотехнології, генетики, криобіології, біології розвитку та відтворення сільськогосподарських тварин у ВУЗах країни.

СПИСОК ОПУБЛІКОВАНИХ ПРАЦЬ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ.

1. Троцький П.А., Гузеватий О.Є. Застосування різних концентрацій вітрифікаційного розчину при заморожуванні ооцитів корів //Вісник Білоцерківського державного аграрного університету: Зб. наук. праць.- 1997.- Вип.3.- Ч.1.- С. 291-294.

2. Оптимальний термін спільного інкубування гамет великої рогатої худоби при заплідненні in vitro /В.А. Яблонський, Е.А. Свідерська, О.Є. Гузеватий, П.А. Троцький //Тваринництво України.- 1998.- №7.- С. 13.

3. Гузеватий О.Є., Троцький П.А. Вплив різних способів виведення кріопротекторів після розморожування та їх вплив на дозрівання ооцитів корів //Вісник Білоцерківського державного аграрного університету: Зб. наук. праць.- 1999.- Вип.8.- Ч.2.- С. 60-63.

4. Гузеватий О.Є., Троцький П.А. Культивування і запліднення in vitro деконсервованих ооцитів корів, що були заморожені на різних стадіях їх мейотичного дозрівання //Вісник Білоцерківського державного аграрного університету: Зб. наук. праць.- 2000.- Вип.12.- С. 34-37.

5. Гузеватий О.Є., Троцький П.А. Оцінка розвитку деконсервованих ооцит-кумулюсних комплексів корів //Вісник агроекологічної академії.- Житомир, 2000.- С. 140-141.

6. Гузеватий О.Є., Троцький П.А. Кріоконсервування ооцитів корів з різним кумулюсом //Розведення і генетика тварин.- Київ, 2001.- Вип.34.-

С. 126-128.

7. Троцький П.А., Гузеватий О.Є. Порівняльний аналіз різних концентрацій вітрифікаційного розчину при заморожуванні ооцитів корів //Біотехнологічні, селекційні та організаційні методи відтворення, зберігання і використання генофонду тварин.- Київ, 1997.- С. 148-149.

8. Свидерская Э.А., Троцкий П.А., Гузеватый О.Е. Влияние времени совместного инкубирования сперматозоидов и яйцеклеток на получение эмбрионов крупного рогатого скота вне организма //Тезисы докладов региональной конференции молодых ученых и специалистов.- Оренбург, 1997.- Ч.2.- С. 107-108.

9. Троцкий П.А., Гузеватый О.Е. Влияние различных концентраций криопротекторов в витрифицирующем растворе при замораживании ооцитов коров //Интенсификация производства продукции животноводства в Республике Беларусь.- Жодино, 1998.- С. 114.

10. Гузеватый О.Е., Троцкий П.А. Некоторые особености криоконсервирования ооцит-кумулюсных комплексов коров //Актуальные проблемы биологии в животноводстве.- Боровск, 2000.- С. 394-396.

11. Троцький П.А. Вплив різних способів виведення кріопротекторів на життєздатність і дозрівання ооцит-кумулюсних комплексів корів //Молоді вчені – тваринництву.- Київ, 2000.- С. 92-93.

Троцький П.А. Кріоконсервування ооцит-кумулюсних комплексів корів на різних стадіях мейотичного дозрівання та оцінка їх життєздатності після деконсервування.- Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата сільськогосподарських наук за спеціальністю 03.00.20 – біотехнологія.- Інститут тваринництва УААН, Харків, 2001.

Викладено експериментальний матеріал з кріоконсервування ооцит-кумулюсних комплексів корів різних стадій їх мейотичного дозрівання. Запропоновані підходи підвищення життєздатності деконсервованих ооцит-кумулюсних комплексів корів з наступним їх дозріванням і заплідненням in vitro. Досліджено вплив різних концентрацій гліцерину і пропандіолу у вітрифікаційному розчині при заморожуванні ооцит-кумулюсних комплексів корів. Визначена ефективність різних способів виведення кріопротекторів за допомогою сахарози після розморожування гамет корів. Встановлена різна чутливість ооцитів корів до дії низьких температур в залежності від характеру оточуючих їх клітин кумулюсу. Проведено морфологічний і цитогенетичний аналіз незрілих і зрілих гамет корів, ранніх зародків великої рогатої худоби отриманих з деконсервованих, дозрілих і запліднених in vitro яйцеклітин корів.

Ключові слова: біотехнологія, кріоконсервування, яєчники, ооцит-кумулюсні комплекси, гліцерин, пропандіол, сахароза, дозрівання і запліднення in vitro, ембріони.

Троцкий П.А. Криоконсервирование ооцит-кумулюсных комплексов коров на различных стадиях мейотического созревания и оценка их жизнеспособности после деконсервирования. – Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата сельскохозяйственных наук по специальности 03.00.20 – биотехнология.- Институт животноводства УААН, Харьков, 2001.

Диссертационная работа посвящена изучению вопросов криоконсервирования ооцит-кумулюсных комплексов коров различных стадий их мейотического созревания, культивирования и оплодотворения in vitro деконсервированных гамет коров.

Данная работа основана на том факте, что современная биотехнология воспроизведения сельскохозяйственных животных, в том числе и крупного рогатого скота, предполагает интенсивное использование гамет самок на различных стадиях их мейотического созревания, а также зигот и эмбрионов различных стадий их развития, полученных при помощи технологии оплодотворения in vitro. Кроме того, создание криобанков гамет самок - это современный и перспективный путь сохранения генетических резервов пород.

В значительной мере успех замораживания гамет самок сельскохозяйственных животных, в том числе и коров, зависит от правильности выбора защитных веществ – криопротекторов. Нашими исследованиями изучено применение различных концентраций глицерина и пропандиола в витрифицирующем растворе при замораживании ооцит-кумулюсных комплексов коров и установлено, что увеличение концентрации данных криопротекторов с 50 до 70% от общего объема витрифицирующего раствора не приводит к увеличению количества жизнеспособных и созревших вне организма до метафазы-2 мейоза деконсервированых гамет.

Проведен сравнительный анализ использования различных способов выведения криопротекторов после размораживания ооцит-кумулюсных комплексов коров. Выявлено преимущество использования ступенчатого способа выведения криопротекторов из гамет коров при помощи раствора сахарозы по сравнению с вариантами одноступенчатого способа (с использованием 1,0 М; 0,75 M; 0,5 M сахарозы) по таким показателям как жизнеспособность и созревание вне организма.

Установлено, что наиболее перспективны для криоконсервирования ооциты коров с плотнным многослойным кумулюсом. Из общей популяции гамет, пригодных для культивирования, 19,5% (5,8 ± 2,2 клетки/яичник) ооцит-кумулюсных комплексов соответствует данному морфологическому типу, 55,3% из них после деконсервирования и созревания вне организма достигает метафазы-2 мейоза, количество полученых эмбрионов после оплодотворения in vitro cоставляет 15,4%.

Показано, что чувствительность ооцит-кумулюсных комплексов коров к воздействию низких температур зависит от стадии их мейотического созревания.