МІНІСТЕРСТВО ОХОРОНИ ЗДОРОВўЯ УКРАЇНИ

ОДЕСЬКИЙ ДЕРЖАВНИЙ МЕДИЧНИЙ УНІВЕРСИТЕТ

УДК615.272.4:665.326.2:615.453.43:615.372

ТРОЩІНА ТЕТЯНА ЛЕОНІДІВНА

ФАРМАКОЛОГІЧНЕ ВИВЧЕННЯ НОВОГО РЕПАРАТИВНОГО

ЗАСОБУ З ТРАВИ ЗВІРОБОЮ

14.03.05 – фармакологія

А В Т О Р Е Ф Е Р А Т

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

Одеса, 2001

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана у Центральній науково-дослідній лабораторії Національної фармацевтичної академії України, Міністерство охорони здоровўя України.

Науковий керівник: доктор фармацевтичних наук, професор

ЯКОВЛЄВА Лариса Василівна

Національна фармацевтична академія

України, завідувачка Центральної науково-дослідної лабораторії

Офіційні опоненти: доктор біологічних наук,

старший науковий співробітник,

ФІЛІПОВА Тетяна Олегівна,

Одеський національний університет

ім. І.І.Мечнікова, кафедра мікробіології

і вірусології

доктор біологічних наук,

старший науковий співробітник,

МАСЛОВА Наталія Федорівна,

Державний науковий центр лікарських засобів, завідувачка лабораторією фармакології ферментних препаратів і інгібіторів

Провідна установа: Інститут фармакології і токсикології АМН України (м. Київ), відділ загальної токсикології

Захист відбудеться 29.01.2001 року о 14 год. на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 41.600.01 при Одеському державному медичному університеті за адресою: 65026 м.Одеса, пров. Валіховський, 2.

З дисертацією можна ознайомитися в бібліотеці Одеського державного медичного університету (65026 м.Одеса, пров. Валіховський, 3).

Автореферат розісланий 28.12.2000 р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради ГОДЛЕВСЬКИЙ Л.С.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Актуальним питанням сучасної хірургії і фармакології залишається регуляція процесу репаративної регенерації (РР). Важливість проблеми обумовлена збільшенням травматизму (А.П.Олекса, 1993; I.Pracovn, 1997), недостатнім асортиментом існуючих репаративних засобів, наявністю у них побічних ефектів та протипоказань (І.Р.Воронович, І.В.Ролевич, 1994; А.А.Сафронов, В.А.Лисков 1991), що призводить до виникнення ускладнень і збільшує тривалість лікування (В.Є.Григорьєв, 1995; С.М.Журавльов, К.А.Теодоридис, 1996; W.Schmitt, S.Kiener, 1991). Це достатньо обґрунтовує необхідність пошуку нових нетоксичних репаративних засобів з комплексною дією, без побічних ефектів (Ф.П.Тринус, 1993; Л.В.Пастушенков, 1994).

У сучасній медицині і фармакології перспективним напрямком є наукова апробація досвіду народної медицини з приводу використання рослин як потенційних лікарських засобів (С.І.Дихтярьов, 1996; В.В.Поканевич, 1998). Серед широкого спектру лікарських рослин з ранозагоюючими властивостями, перспективною сировиною є звіробій. Досвід народної медицини щодо використання цієї рослини для лікування ран різної етіології, широкий спектр фармакологічної активності БАР звіробою і наявність достатньої вітчизняної сировинної бази стали передумовою для розробки перорального препарату з репаративними властивостями – флагінату (М.Я.Ловкова, 1990; О.Ю.Маковецька, 1997).

Звўязок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертація виконана згідно з планом науково-дослідних робіт Національної фармацевтичної академії України з проблеми МОЗ України (№ державної реєстрації 0198U007008). Дисертант є співвиконавцем основних розділів дисертаційної роботи.

Мета і задачі дослідження. Метою даної роботи стало вивчення фармакологічної активності субстанції флагінату, препарату на її основі капсул флагінату у порівнянні з вітчизняними репаративними засобами метилурацилом і ацеміном.

Для досягнення поставленої мети необхідно було вирішити наступні задачі:

·

· дослідити репаративні властивості субстанції флагінату на моделях патологій різної локалізації і ступеня тяжкості, адекватних пошкодженням у людини, а саме на моделі лінійних різаних ран, закритого перелому і виразкового пошкодження слизової оболонки шлунка;

· вивчити особливості фармакодинаміки субстанції флагінату: протизапальну, анальгетичну, антиоксидантну, мембраностабілізуючу, антимікробну дію;

· дослідити репаративну активність і спектр фармакологічної дії капсул флагінату;

· вивчити токсичні властивості субстанції і капсул флагінату.

Об'єктом дослідження стали субстанція флагінату з трави звіробою і лікарська форма – капсули флагінату із вмістом діючої субстанції 150 мг. Розробки проводились на Борщагівському ХФЗ під керівництвом к.х.н. А.С.Шаламая.

Предметом дослідження стала фармакологічна активність субстанції і капсул флагінату.

Методи дослідження. При виконанні дисертаційної роботи були використані фармакологічні, біохімічні, мікробіологічні, гістологічні методи дослідження та методи математичної статистики.

Наукова новизна. Уперше проведено фармакологічне вивчення перорального препарату на основі трави звіробою, призначеного для стимулювання процесів репарації. Установлено широкий спектр фармакологічної активності капсул флагінату: ранозагоюючу, консолідуючу, противиразкову, протизапальну, анальгетичну, антиоксидантну, мембраностабілізуючу, антимікробну дію. Доведено, що флагінат належить до класу відносно нешкідливих речовин, не має алергізуючої, імунотропної, мутагенної, місцевоподразнюючої дії, позитивно впливає на хід вагітності. Зазначені властивості засобу підтверджують обґрунтованість розробки і дозволяють рекомендувати флагінат у практичну медицину для стимуляції репаративних процесів поряд з метилурацилом і ацеміном. Позитивною перевагою перед останніми є менша токсичність флагінату і більш широкий спектр фармакологічної активності.

Практична значимість роботи. Капсули флагінату пройшли доклінічне вивчення як перспективний репаративний засіб для прискорення загоювання ран. Пакет НТД щодо розробки і доклінічного фармакологічного вивчення субстанції і капсул флагінату представлений в ДФЦ МОЗ України, де отримано дозвіл на проведення першої фази клінічних випробувань. Препарат впроваджується в промислове виробництво на Борщагівському хіміко-фармацевтичному заводі.

Капсули флагінату розширюють арсенал вітчизняної фармацевтичної продукції новим репарантом рослинного походження, що дасть змогу задовольнити певною мірою потребу населення України в ефективному та доступному лікарському препараті для прискорення загоювання ран.

Особистий внесок здобувача. Робота виконана на базі ЦНДЛ НФАУ. Дослідження фармакологічної активності субстанції і капсул флагінату проведені у співробітництві з лабораторією патогістоморфології і експериментальної патології Харківського НДІ ортопедії і травматології ім.М.І.Ситенко та лабораторією мікробіології кишкових інфекцій інституту мікробіології і імунології ім.І.І.Мечнікова. Особисто проведені: патентно-інформаційний пошук, статистична обробка, аналіз та систематизація результатів експериментальних досліджень, зроблені висновки дисертації.

Апробація роботи. Результати досліджень експонувалися на Республіканській науково-практичній конференції "Досягнення та невирішені питання гастроентерології", м.Харків, 7-8 квітня 1998 року; на Міжнародній конференції, присвяченій 75-річчю проф. Сала Д.П. "Теорія і практика створення лікарських препаратів", м.Харків, 26 листопада, 1998 р.; на V Національному зўїзді фармацевтів України, м.Харків, 7-8 вересня, 1999 р.; на науково-практичній конференції молодих учених "Медицина на рубеже веков: открытия и перспективы", м.Харків, 21 грудня 1999 р.; на міжкафедральному засіданні ЦНДЛ та кафедр біологічного циклу НФАУ.

Публікації. Матеріали даної дисертації відображені у 5 статтях і 4 тезах.

Структура та обсяг дисертації. Робота викладена на 171 сторінці машинописного тексту, 14 сторінок займають таблиці і рисунки. Перелік використаних джерел містить 213 найменувань. Дисертація складається із вступу, огляду літератури, трьох глав власних досліджень, обговорення результатів, загальних висновків і списку використаних джерел.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

1. Матеріали та методи

Дослідження проводили на мишах, щурах, морських свинках і кроликах, вирощених у розпліднику ЦНДЛ НФАУ та утримуваних на стандартному раціоні (М.П.Западнюк та ін., 1983).

Препаратами порівняння слугували ацемін та метилурацил - стимулятори репаративних процесів з різним механізмом дії. Ацемін використовували у дозі 900 мг/кг, крім визначення консолідуючої активності, де доза складала 600 мг/кг. Метилурацил - у дозі 120 мг/кг і, відповідно, у дозі 180 мг/кг – при дослідженнях консолідуючої дії. Дози розраховані у перерахунку з терапевтичної дози для людини, враховуючи КВС (Ю.Р.Риболовлєв, Р.С.Риболовлєв, 1979).

Репаративну активність флагінату вивчали на моделі лінійних різаних ран у щурів (О.С.Кочнєв,1991; Л.І.Хаджай,1983; В.А.Ісаєв,1994). Інтенсивність репаративних процесів оцінювали тензіометрично, за показниками білкового обміну (Л.М.Вороніна, 1996) и проводили гістологічне дослідження морфоструктури рубця з напівкількісною оцінкою ступеня зрілості грануляцій (Г.Г.Автандилов, 1980, О.В.Волкова, 1982).

Дослідження консолідуючої активності проводили на моделі закритого перелому великогомілкової кістки у щурів (Е.Я.Дубров, 1973). Вплив на інтенсивність консолідації визначали тензіометрично (Н.В.Лазарев,1954) і за показниками білкового та електролітного обмінів (Л.М.Вороніна, 1996, В.Є.Предтеченський, 1960). Проводили гістологічний аналіз оперованої кістки (Г.Г.Автандилов, 1980, О.В.Волкова, 1982).

Противиразкову активність вивчали на моделі етанол-преднізолонової виразки у щурів (А.Д.Алієв, 1973), вимірюючи площу виразок і розраховуючи виразковий індекс (І.А.Зупанец, 1988).

Антиексудативну дію вивчали на моделі гострого карагенінового набряку лапи у щурів (Di Rosa M.,1974).

Антиальтеративну активність досліджували на моделі асептичного запалення шкіри і підшкірної клітковини у щурів (Методические рекомендации КНИФТ,1976). Показниками лікувальної дії препарату слугували: площа виразок, швидкість рубцювання (Л.Н.Попова,1942), динаміка маси тіла (М.П.Западнюк та ін.,1983) і гематологічні показники (В.В.Меншиков, 1987). Проводили дослідження ультраструктури клітин виразки за допомогою електронної мікроскопії (Г.Гайдер,1974).

Для визначення анальгетичної дії флагінату використовували модель оцтово-кислих "корчів" у щурів (K.Brune, P.Laur, 1984).

Антиоксидантну активність в умовах in vitro досліджували на модельних системах ферментативного і аскорбатзалежного ПОЛ мікросом печінки полярографічним методом (А.Д.Гордієнко, 1992). Антиоксидантні властивості флагінату в системі in vivo вивчали на моделі гострого тетрахлорметанового гепатиту у щурів (Методические рекомендации по экспериментальному изучению желчегонной, холеспазмолитической, холелитиазной и гепатопротекторной активности новых лекарственных средств, 1994). Інтенсивність процесу ПОЛ оцінювали за визначенням у гомогенаті печінки і сироватці крові рівня малонового діальдегіду (І.Д.Стальная, Т.Г.Гарішвілі,1977) і дієнових конўюгатів (І.Д.Стальная, 1977). Стан антиокислювальної системи, а саме рівень відновленого глутатіону (GSH) у печінці і сироватці крові оцінювали за методом E.D.Beutler et al. (1963). Функціональну активність печінки досліджували за швидкістю жовчовиділення (Н.П.Скакун, А.Н.Олійник, 1967) та вмістом у жовчі жовчних кислот та холестерину (Мірошніченко В.П. із співавт., 1978). Цитолітичну реакцію визначали за рівнем АлАТ і АсАТ у сироватці крові (S.Reitman, S.A.Frankel, 1957).

Мембраностабілізуючу дію вивчали, використовуючи методику визначення спонтанного гемолізу еритроцитів (F.C.Jager, 1968).

Дослідження протимікробної активності проводили по відношенню до Helicobacter pylori методом серійних розбавлень (Методичні рекомендації Харківського НДІ мікробіології та імунології, 1995) і по відношенню до основних представників мікрофлори гнійно-інфекційних ран методом "колодязів" (В.А Сілін, 1985).

Загальнотоксичні властивості вивчали за методами Т.В.Пастушенко (1975) і В.Б.Прозоровського (1962). Ступінь токсичності визначали за класифікацією К.К.Сидорова (1973).

Дослідження ембріотоксичної і ембріолетальної дії проводили згідно Методичних вказівок (Методические указания по изучению эмбриотоксического действия фармакологических веществ и влияния их на репродуктивную функцию, 1986).

Мутагенну активність вивчали за допомогою врахування хромосомних аберацій у клітинах кісткового мозку мишей линії Balb/C анателофазним методом за Методичними вказівками (Нарушение митоза как показатель общетоксического и цитотоксического действия пестицидов, 1983).

При дослідженні алергізуючої дії використовували тести in vitro - реакцію непрямої дегрануляції тучних клітин (Ішимова Л.М., 1971) і in vivo на моделі активної шкірної анафілаксії на морських свинках (Х.Амброзіус, 1987).

Визначення імунотропної дії включало оцінку впливу на Т-клітинну ланку імунної системи у реакції гіперчутливості сповільненого типу за методом Kitamura (1980) і на показники функціональної активності гуморальної імунної системи: кількість антитілоутворюючих клітин селезінки (K.N.Ierne, A.A. Nordin, 1963) і титр антитіл сироватки крові мишей лінії Balb/c (Е.Зигль,1987).

Місцевоподразнюючу дію досліджували згідно методичних вказівок (Методические рекомендации по представлению документации на лекарственные средства в ФК МЗ Украины, 1993).

Застосування препарату per os обумовило необхідність вивчення його впливу на секреторну функцію шлунка (Н.І.Андреєва, С.Д.Шарова,1978) і рухову активність ШКТ (I.S.Sticknay, 1951).

Обробка усіх результатів проведена методами математичної статистики (Ю.І.Іванов, Р.Н.Погорелюк, 1990).

2. Вивчення репаративної активності субстанції і капсул флагінату

Відомі з даних літератури ранозагоюючі властивості звіробою і широкий спектр БАР, основними з яких є флавоноїди, антраценпохідні і дубильні речовини (А.М.Гродзінський, 1991; М.І.Рильков,1993) дозволили передбачити репаративну активність субстанції флагінату. На моделі лінійних різаних ран у щурів було визначено умовно-терапевтичну дозу субстанції флагінату за репаративною активністю при пероральному введенні - 25 мг/кг.

За результатами дослідження репаративної активності на моделі різаних ран встановлена здатність флагінату в дозі 25 мг/кг активізувати репаративні процеси на внутрішньоклітинному рівні, що підтверджувалось вірогідним збільшенням рівня РНК у гомогенаті печінки і показника тензіометрії у порівнянні з тваринами групи патології. Важливо, що за показником міцності рубця флагінат не поступився метилурацилу, хоча останній виявив більш активний вплив на пластичні процеси, про що свідчить вірогідне збільшення рівня загального білка і показників РНК та ДНК у порівнянні з патологією

Стимулююча активність флагінату на процес дозрівання грануляцій підтверджена гістологічними дослідженнями морфоструктури рубця (табл.1). На відміну від тварин групи патології, у яких грануляції у кінці досліду мали незрілий характер, грануляційна тканина у щурів під дією флагінату мала ознаки волокноутворення із зрілими зорієнтованими фібробластами, а у частини тварин утворювалась рубцева тканина. Аналогічні зміни спостерігали і при лікуванні метилурацилом.

При лікуванні ацеміном також було зареєстровано прискорення репаративних процесів у пошкодженій тканині, що відбивалось на показниках міцності рубця і зрілості грануляцій, які вірогідно перевищували показники групи патології. Але вірогідних змін у рівні загального білка, РНК та ДНК виявлено не було, що свідчить про відсутність впливу ацеміну на пластичний обмін (табл.1) і складає різницю у механізмі репаративної дії у порівнянні з флагінатом і метилурацилом.

Одним із видів відновлення сполучної тканини є РР кісткової тканини. Скринінгові дослідження субстанції флагінату на моделі закритого перелому великогомілкової кістки у щурів показали, що найбільш ефективно прискорює процес консолідації субстанція у дозі 200 мг/кг.

Флагінат у дозі 200 мг/кг на цій моделі патології, як і метилурацил у дозі 180 мг/кг, сприяв вірогідному збільшенню показника загально-трофічних процесів - маси тіла тварин, тоді як у групі патології і тварин, що отримували ацемін у дозі 600 мг/кг, вірогідних змін маси тіла на протязі усього досліду зареєстровано не було. Зазначений факт підтверджує схожість механізму дії флагінату з метилурацилом.

Особлива увага при переломах надається змінам електролітного балансу, так як його регуляція дозволяє стимулювати процес консолідації на стадії мінералізації (Н.А.Шестерня, 1991; І.Р.Воронович, І.В.Ролевич та ін., 1994). На моделі закритого перелому встановлено, що флагінат у дозі 200 мг/кг і ацемін у дозі 600 мг/кг збільшували рівень іонізованого Ca2+ і K+ і зменшували рівень Na+ у сироватці крові на відміну від метилурацилу, який не виявляв суттєвого впливу на рівень досліджуваних електролітів (Рис.1).

Вплив флагінату і ацеміну на електролітний обмін обумовив більш виражену стимулюючу дію на процес зростання кісток у порівнянні з тваринами групи патології і тваринами, яких лікували метилурацилом, про що свідчать вірогідно більші результати тензіометрії (міцність оперованої кістки) (Рис.1).

Треба зазначити, що хоча метилурацил і поступився за консолідуючою активністю флагінату і ацеміну, але у порівнянні з нелікованими тваринами вірогідно стимулював процес зростання кісток, що можливо пов'язано з його позитивним впливом на загальнотрофічні процеси.

Встановлена здатність флагінату і ацеміну впливати на електролітний баланс обумовила схожість механізмів консолідуючої дії цих засобів на клітинному рівні, що підтверджено при гістологічних дослідженнях. У щурів групи патології утворення мозолі проходило за хондро-десмальним типом (D.J.Simmoms, Ph.D.Fracture, 1995; Г.І.Лаврищева, Г.А.Онопрієнко, 1996), шляхом утворення у грануляційній тканині первинних структур, які потім вторинно підлягали перебудові в кісткову тканину. Під впливом флагінату і ацеміну процеси осифікації проходили більш активно. Збільшувалась площа кісткової тканини разом із зменшенням площі з фіброретикулярною тканиною та хондроїдом, що дозволило віднести процес загоєння до типу енхондрального остеогенезу (D.J.Simmoms, Ph.D.Fracture, 1995; Г.І.Лаврищева, Г.А.Онопрієнко, 1996).

На основі отриманих результатів можна припустити, що більша активність флагінату і ацеміну при регенерації кісткової тканини пов'язана з впливом на електролітний баланс. Стимуляція метаболічних процесів, можливо, має певне значення на початку процесу консолідації, у період виражених катаболічних реакцій (метилурацил).

Стереотипність процесу РР передбачає проявлення ефекту репаранта, як стимулятора РР, незалежно від типу і локалізації пошкодження. Відомо, що стимулятори метаболічних процесів виявляють лікувальний ефект і при виразковій хворобі шлунка (М.Д.Машковський, 1997). Дослідження противиразкової активності на моделі спирто-преднізолонової виразки у щурів показали, що флагінат у дозі 25 мг/кг вірогідно зменшував кількість і вираженість виразкових ушкоджень слизової оболонки шлунка у порівнянні з тваринами групи патології і за противиразковою активністю не поступився метилурацилу і ацеміну.

Таким чином, проведені дослідження дозволили встановити, що за репаративною і противиразковою активністю флагінат не поступається препаратам порівняння, хоча застосовується у значно меншій дозі 25 мг/кг, тоді як доза метилурацила складає 120 мг/кг, а ацеміну - 900 мг/кг. За консолідуючою дією флагінат у дозі 200 мг/кг виявляє активність на рівні ацеміну у дозі 600 мг/кг і перевищує метилурацил у дозі 180 мг/кг. За механізмом дії флагінат має схожість як з метилурацилом, стимулюючи синтетичні процеси на клітинному рівні, так і з ацеміном, виявляючи вплив на електролітний обмін при переломі кісток.

3. Вивчення спектру фармакологічної активності субстанції

та капсул флагінату

Спектр фармакологічної активності флагінату досліджували на моделях патологій адекватних основним порушенням, які виникають в організмі людини у період протікання процесу РР. Першим етапом стало вивчення протизапальної активності.

З даних літератури відомі антиексудативні властивості флавоноїдів і дубильних речовин (Н.П.Скакун, 1995; Є.С.Товстуха, 1995; J.Robak, 1996), які є одними з основних діючих речовин флагінату. Це забезпечує флагінату в дозі 25 мг/кг виражену антиексудативну дію, про що свідчить його здатність пригнічувати набряк з 1-ої по 5-ту годину досліду на моделі карагенінового набряку у щурів. Збільшення дози флагінату до 200 мг/кг – умовно-терапевтична доза за консолідуючою активністю – супроводжувалось зменшенням антиексудативної активності, а саме вірогідним зниженням показника активності на 3-тю і 5-ту годину досліду у порівнянні з флагінатом у дозі 25 мг/кг. Зазначене можливо повўязане з негативною дією великих доз фенольних речовин на мембрани клітин.

Порівняння з метилурацилом і ацеміном дозволило визначити схожість динаміки антиексудативної активності флагінату в двох дозах 25 мг/кг та 200 мг/кг з метилурацилом, так як найбільшу активність ці засоби виявили на 5-ту годину набряку. Більш активну антиексудативну дію виявив флагінат у дозі 25 мг/кг, який вірогідно перевищував дію метилурацилу на 5-ту годину досліду. На відміну від флагінату і метилурацилу, ацемін виявив найбільшу активність на 1-у годину досліду, що свідчить про інший механізм антиексудативної дії препарату.

Регулюючий вплив на процес РР і, відповідно, на запалення полягає у попередженні руйнування здорових клітин і нормалізації функцій пошкоджених, тобто антиальтеративній активності, яку ми визначали на моделі асептичного запалення шкіри і підшкірної клітковини у щурів. У нашому досліді процес загоювання виразок у тварин, яких не лікували тривав протягом 27 днів. Лікування флагінатом у дозі 25 мг/кг, ацеміном і метилурацилом скорочувало цей термін на 8 днів і супроводжувалось вірогідним зменшенням площі виразок і збільшенням швидкості загоювання протягом усього терміну лікування.

Прискорення рубцювання виразок під дією препаратів позитивно відбивалось на загальному стані тварин і супроводжувалось збільшенням їх маси на 2-ий тиждень досліду в порівнянні з вихідними даними, тоді як у тварин групи патології збільшення маси тіла було зареєстровано тільки на 3-ій тиждень досліду.

Тривалий характер асептичного запалення затримував процес проліферації і викликав зміни у картині крові у вигляді підвищення показника ШЗЕ, збільшення кількості лейкоцитів і зниження концентрації гемоглобіну. Введення флагінату вже через 1 тиждень лікування нормалізовувало ці показники до рівня вихідних даних. Зазначений факт свідчить про здатність флагінату виявляти протизапальний ефект не тільки при гострому запаленні, обумовленому ексудативним компонентом, але і при тривалому запаленні з перевагою альтеративного процесу.

Лікувальна активність препаратів порівняння метилурацилу і ацеміну виявилась тільки в їх здатності підвищувати рівень гемоглобіну, відповідно, через 1 і 2 тижні лікування. Встановлену властивість усіх трьох препаратів збільшувати рівень гемоглобіну можна розцінювати як нормалізацію загальнотрофічних процесів, що підтверджено позитивною динамікою маси тіла тварин.

Відмінності у механізмах протизапальної активності досліджуваних засобів відбивались на якості репаративних процесів на внутрішньоклітинному рівні, що було встановлено при електронно-мікроскопічному дослідженні. Аналіз структури меланоцитів і епітеліоцитів базального та шиповатого шарів епідермісу показав, що у щурів групи патології на 2-й тиждень досліду зберігалися деструктивні зміни органел клітин. Спостерігався лізис оболонки ядра, мітохондрій, мембран гранулярної ендоплазматичної мережі і цитоплазматичної мембрани. Розвивався внутрішньоклітинний і внутрішньоядерний набряк.

Антиальтеративний ефект флагінату виявився у суттєвому зменшенні осередків деструкцій внутрішньоклітинних мембран та органел і стимуляції процесів внутрішньоклітинної репарації, що проявилось у зростанні кількості рибосом і гіперплазії гранулярної ендоплазматичної мережі. Під дією флагінату збільшувалась кількість гранул меланіну у меланоцитах. Активну дію на пластичні процеси виявив метилурацил, під впливом якого спостерігали гіперплазію мембран ендоплазматичної мережі, гіпертрофію комплексу Гольджі і збільшення кількості рибосом, що свідчить про активацію синтетичних внутрішньоклітинних процесів. При лікуванні ацеміном активність процесів реабілітації органел клітин залишалась на низькому рівні. Зберігалися деструкції мембранних систем епітеліоцитів і меланоцитів. Не виявлялось ознак активації процесів внутрішньоклітинного синтезу.

Таким чином, схожість динаміки маси тварин і показників загоювання асептичних виразок при лікуванні флагінатом, ацеміном і метилурацилом супроводжувалась відмінами у результатах клінічної картини крові і ультраструктурного дослідження. Встановлено, що флагінат прискорює рубцювання за рахунок зменшення запальної реакції і, як і метилурацил, відновлення ультраструктури клітин і активації в них репаративних процесів. Ацемін на цій моделі не виявляє вираженого протизапального ефекту і не забезпечує відновлювальної дії на внутрішньоклітинному рівні, але прискорює процес рубцювання, що можна пояснити наявністю некролітичної активності (М.Д.Машковський, 1997).

Позитивним доповненням репаративної дії флагінату в дозі 25 мг/кг, на відміну від препаратів порівняння ацеміну і метилурацилу, стала виявлена на моделі оцтово-кислих "корчів" анальгетична активність, обумовлена периферичним механізмом дії.

Наявні у складі субстанції флагінату флавоноїди і дубильні речовини, які є природними регуляторами рівня вільно-радикальних процесів у тканинах тварин і рослин (Л.В.Савченкова, 1991), обумовили антиоксидантні властивості препарату. Співставлення результатів антиоксидантної активності in vitro на інтактних мікросомах показало, що субстанція флагінату пригнічує процеси ПОЛ, перевищуючи активність стандартного антиоксиданта іонолу в 6,25 рази при ферментативному і 5,33 рази при аскорбатзалежному ПОЛ.

Встановлена антиоксидантна активність препарату була підтверджена у досліді in vivo на моделі гострого тетрахлорметанового гепатиту у щурів. Тетрахлорметан є мембранотропним токсином, який викликає посилення процесів ПОЛ і виснаження захисної антиоксидантної системи (АОС), що негативно відбивається на функціональному стані печінки розвитком цитолітичної реакції і порушенням екскреторної функції органу.

Під впливом флагінату в дозі 25 мг/кг динаміка показників ПОЛ і АОС була спрямована на відновлення їх початкового рівня. Антиоксидантний ефект флагінату забезпечував регресивні зміни у розвитку функціональних порушень печінки послабленням процесу цитолізу гепатоцитів і нормалізацією жовчовидільної функції. Аналогічні зміни у функціональній активності печінки спостерігали і при лікуванні ацеміном і метилурацилом, але за антиоксидантною активністю препарати порівняння поступилися флагінату, що вказує на відміни в механізмі гепатопротекторної дії цих засобів.

Більш виражені антиоксидантні властивості флагінату в дозі 25 мг/кг, у порівнянні з метилурацилом і ацеміном, підтверджені наявністю у нового препарату мембраностабілізуючої активності.

Встановлений багатокомпонентний вплив флагінату на життєдіяльність клітин дозволяє припустити, що механізм репаративної активності цього препарату реалізується за рахунок стимулюючої дії на синтетичні внутрішньоклітинні процеси, протизапальної, мембраностабілізуючої і антиоксидантної активності.

Наявність у траві звіробою антраценпохідних, фітонцидів і рослинних антибіотиків забезпечує субстанції флагінату антимікробну активність (О.Ю.Маковецька та ін.,1997; Г.А.Готенюк, 1997). Дослідження у системі in vitro дозволили встановити бактерицидну активність 25% розчину субстанції флагінату по відношенню до музейного і клінічного штамів Helicobacter pilory, а також до основних збудників інфекційних і гнійно-запальних процесів: Streptococcus speciosus, Staphylococcus aureus, Streptococcus pyogenes, Klebsiella pneumoniae, Proteus vulgaris, Clostridia perfringens, Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli, Bacilus subtilis, Candida albicans. Отримані дані дають можливість рекомендувати флагінат для лікування інфікованих ран, що є позитивною перевагою перед ацеміном, для якого гнійні і інфіковані рани є протипоказанням до застосування.

4. Деякі токсикологічні характеристики субстанції

та капсул флагінату

Дослідження загальнотоксичних властивостей препарату показало, що флагінат при пероральному введенні є "відносно нешкідливим" (ЛД50>15000 мг/кг), а при внутрішньочеревному введенні - "практично нетоксичним" (1001<ЛД50<3000 мг/кг) (К.К.Сидоров, 1973). Флагінат не має видової специфічності (КВЧ<3) і характеризується широким діапазоном умовно-терапевтичних доз (ТІ > 600).

Препарат порівняння ацемін є “відносно нешкідливим” при пероральному і внутрішньочеревному введенні, але за рахунок високої умовно-терапевтичної дози (900 мг/кг) має низький показник широти терапевтичної дії ТІ > 16 ніж флагінат. Метилурацил є більш токсичною речовиною у порівнянні з флагінатом, так як є “практично нетоксичним” при пероральному і внутрішньочеревному введенні і має відносно вузький діапазон умовно-терапевтичних доз ТІ = 124.

За даними дослідження ембріотоксичної і ембріолетальної дії встановлено позитивний вплив субстанції флагінату в дозі 25 мг/кг на протікання вагітності у щурів, що супроводжується вірогідним збільшенням кількості жовтих тіл, місць імплантації, плодів на одну самку і зниженням показника загальної ембріональної летальності у порівнянні з інтактними тваринами. Встановлена властивість флагінату дозволяє призначати його при вагітності, що є позитивною перевагою перед ацеміном, для якого це є протипоказанням.

При подальшому вивченні специфічної токсичності встановлено, що субстанція флагінату не має мутагенної і місцевоподразнюючої дії. У дозах 25 мг/кг та 200 мг/кг флагінат не виявляє алергізуючої і імунотропної активності на відміну від метилурацилу, який може викликати подразнюючу дію і алергічні шкірні реакції (М.Д.Машковский, 1997).

За результатами дослідження впливу препарату на функціональний стан ШКТ встановлено, що флагінат у дозі 200 мг/кг збільшує кислотність шлункового соку, що необхідно враховувати при призначенні препарата у великих дозах пацієнтам з хворобами ШКТ з гіперацидними станами. Флагінат у дозі 25 мг/кг і препарати порівняння ацемін і метилурацил не впливають на секреторну активність залоз шлунка. Флагінат у дозах 25 мг/кг і 200 мг/кг і ацемін не змінюють рухову активність ШКТ. У метилурацила виявлена здатність пригнічувати інтенсивність перистальтики ШКТ.

ВИСНОВКИ

1. У дисертації наведене теоретичне узагальнення і нове вирішення наукової задачі, що виявляється у фармакологічному дослідженні нового репаративного засобу з трави звіробою – флагінату. Препарат відповідає сучасним вимогам до регуляції процесу РР і має переваги перед репарантами метилурацилом і ацеміном, так як має більш широкий спектр активності і є менш токсичним.

2. Капсули флагінату в умовно-терапевтичній дозі 25 мг/кг виявляють виражену репаративну активність при ушкодженні мўяких тканин на рівні препаратів порівняння метилурацилу у дозі 120 мг/кг і ацеміну у дозі 900 мг/кг. Порівняння ефективних доз препаратів свідчить про перевагу флагінату перед метилурацилом у 4,8 рази, а перед ацеміном – у 36 разів. За консолідуючою активністю флагінат ефективний у дозі 200 мг/кг, що відповідає рівню ефективності ацеміну у дозі 600 мг/кг і перевищує активність метилурацилу у дозі 180 мг/кг.

3. Флагінат у дозі 25 мг/кг виявляє фармакодинаміку, яка забезпечує йому репаративні властивості та включає антиексудативну, антиальтеративну, антиоксидантну активність. На відміну від метилурацилу і ацеміну флагінат виявляє ще анальгезуючу, мембраностабілізуючу і антимікробну дію.

4. Установлено, що механізм репаративної дії флагінату подібний до метилурацилу і складається з активації синтетичних процесів на клітинному рівні. Механізм консолідуючої дії флагінату включає механізм дії як метилурацилу, нормалізуючи загальнотрофічні процеси, так і ацеміну, виявляючи вплив на електролітний обмін.

5. Капсули флагінату є відносно нешкідливими, не мають видової чутливості і характеризуються великою широтою терапевтичної дії, яка перевищує широту терапевтичної дії препаратів порівняння.

6. Субстанція флагінату не має мутагенних властивостей. У дозі 25 мг/кг субстанція флагінату позитивно впливає на протікання вагітності у щурів на відміну від ацеміну, який протипоказаний при вагітності.

7. Капсули флагінату не мають місцевоподразнюючої дії, в дозах 25 мг/кг і 200 мг/кг не виявляють алергізуючої, імунотропної дії, не впливають на рухову активність ШКТ та функціональний стан шлункових залоз за винятком дози 200 мг/кг, яка підвищує кислотність шлункового соку. Встановлені властивості позитивно відрізняють флагінат від метилурацилу, який має місцевоподразнюючу і алергізуючу дію.

8. Капсули флагінату можна рекомендувати як репаративний засіб для лікування ран, у тому числі інфікованих, тих, що тривало не загоюються, запальних процесів і трофічних виразок шкіри та слизових оболонок і для стимуляції зрощення кісток на рівні з такими стимуляторами метаболічних процесів, як метилурацил і ацемін.

Основний зміст дисертаційної роботи викладено в наступних

публікаціях:

1. Яковлєва Л.В., Ткачова О.В., Трощіна Т.Л., Кальф-Каліф С.С. Місцеве лікування ран та опіків препаратами рослинного і природнього походження (огляд літератури)// Фармакологічний вісник.- 1999.- № 1.- С. 16-23.

2. Яковлева Л.В., Ткачева О.В., Трощина Т.Л. Изучение антимикробной активности растительных препаратов для лечения ран// Експериментальна і клінічна медицина.- 1999.- № 2.- С. 242-245.

3. Яковлєва Л.В., Шаламай А.С., Трощіна Т.Л., Левицька З.В., Чікіткіна В.В., Ткачова О.В. Вивчення гострої і специфічної токсичності субстанції флагінат із трави звіробою звичайного// Современные проблемы токсикологии.- 1999.- № 3.- С. 30-33.

4. Трощіна Т.Л. Дослідження фармакодинаміки капсул флагінат

з трави звіробою звичайного// Фармакологічний вісник.- 2000.- № 1.- С.28-32.

5. Бадрадинова И.В., Трощина Т.Л., Балаклицкая И.С. Флагинат в репаративной регенерации костной ткани (экспериментальное исследование)// Вісник харківського університету. Сер.: Актуальні проблеми сучасної науки в дослідженнях молодих вчених м. Харкова.- 2000.- № 456, Ч. 2.- С. 109-112.

6. Яковлєва Л.В., Трощіна Т.Л. Дослідження впливу субстанції із звіробою звичайного на ШКТ// Тезисы докладов "Достижения и нерешенные проблемы гастроэнтерологии", Харьков, 1998.- С.384.

7. Трощина Т.Л. Доклиническое изучение фармакологической активности субстанции гиперфлат из травы зверобоя продырявленного// Теорія і практика створення лікарських препаратів: Матеріали міжнар. конф. присвяч. 75-річчю проф. Д.П.Сало – Харків: Основа, 1998.- С.299-304.

8. Городнянський Д.Л., Шаламай А.С., Трощіна Т.Л. Особливості фармакокінетики субстанції флагінат із звіробою звичайного//

Матер. V зўїзду фармацевтів України.- Харків, 1999.- С 567-568.

9. Трощина Т.Л. Фармакологическое изучение репаративной активности нового растительного репаранта капсул флагинат// Медицина на межі столітть: відкриття і перспективи: Матер. наук.-практ. конф. молодих вчених Харк. мед. акад. післядипл. освіти.- Харків, 1999.- С. 145.

Трощіна Т.Л. ІФармакологічне вивчення нового репаративного засобу з трави звіробоюІ.- Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 14.03.05 - фармакологія.- Одеський державний медичний університет, Одеса, 2001.

Проведено фармакологічне вивчення субстанції і капсул флагінату, отриманих з трави звіробою, у порівнянні з репарантами метилурацилом і ацеміном. Встановлено, що флагінат у дозі 25 мг/кг виявляє виражену репаративну активність, стимулюючи репаративні процеси на клітинному рівні, у дозі 200 мг/кг - прискорює зростання кісток, регулюючи рівень електролітів. Флагінат у дозі 25 мг/кг має протизапальну, антиоксидантну і на відміну від препаратів порівняння анальгетичну, мембраностабілізуючу і антимікробну дію. Флагінат є "відносно нешкідливим", не має ембріотоксичної, мутагенної, алергізуючої, імунотропної і місцевоподразнюючої дії, не впливає на функціональний стан ШКТ (за винятком дози 200 мг/кг, яка збільшує кислотність шлункового соку).

Флагінат можна рекомендувати як репаративний засіб для лікування ран, трофічних виразок, запальних процесів та для стимуляції зрощення переломів поряд з метилурацилом і ацеміном. Перевагою флагінату є більш широкий спектр активності і менша токсичність.

Ключові слова: трава звіробою, фармакологічна активність, репаративна дія, гостра токсичність, специфічна токсичність.

Трощина Т.Л. ІФармакологическое изучение нового репаративного препарата из травы зверобояІ.- Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук по специальности 14.03.05 – фармакология.- Одесский государственный медицинский университет, Одесса, 2001.

Проведено фармакологическое изучение субстанции флагината из травы зверобоя и препарата на ее основе капсул флагината в сравнении с отечественными стимуляторами репаративных процессов ацемином и метилурацилом.

Данные литературы о применении отваров зверобоя в качестве ранозаживляющего средства и наличие широкого спектра БАВ в траве зверобоя позволили предположить репаративную активность флагината.

Исследование репаративных свойств показало, что флагинат в дозе 25 мг/кг стимулирует репаративные процессы на уровне метилурацила в дозе 120 мг/кг и ацемина в дозе 900 мг/кг при повреждении кожи на модели линейных резаных ран и слизистых оболочек на модели спирто-преднизолоновой язвы желудка. В дозе 200 мг/кг флагинат ускоряет срастание костей, проявляя активность на уровне ацемина в дозе 600 мг/кг и превышая таковую у метилурацила в дозе 180 мг/кг. По механизму репаративного действия флагинат имеет сходство как с метилурацилом, стимулируя синтетические процессы на внутриклеточном уровне, так и с ацемином, оказывая влияние на электролитный баланс при переломе костей.

С целью изучения механизма репаративного действия флагината изучали противовоспалительную, анальгетическую, антиоксидантную, мембраностабилизирующую и антимикробную активности.

Исследования выявили выраженные противовоспалительные свойства флагината в дозе 25 мг/кг. На модели каррагенинового отека было установлено, что флагинат проявляет антиэкссудативную активность, по которой превышает метилурацил. Изучение антиальтеративной активности на модели асептического воспаления кожи и подкожной клетчатки подтвердило способность флагината стимулировать репаративные процессы на внутриклеточном уровне, снижать интенсивность воспалительной реакции, а также нормализовывать общетрофические процессы, что способствует ускорению заживления длительно гранулирующих ран кожи на уровне метилурацила и ацемина.

У флагината в дозе 25 мг/кг в отличие от препаратов сравнения установлена анальгетическая активность на модели уксусно-кислых "корчей", обусловленная периферическим механизмом действия.

Флагинат в дозе 25 мг/кг на модели тетрахлорметанового гепатита оказывает гепатозащитное действие вследствие выраженной антиоксидантной активности, по которой превышает метилурацил и ацемин. Более выраженные антиоксидантные свойства флагината в дозе 25 мг/кг подтверждены наличием мембраностабилизирующего действия, что является одним из механизмов противовоспалительного действия и наряду со стимулирующим влиянием на синтетические процессы на внутриклеточном уровне обеспечивает флагинату репаративные свойства.

У 25 % водного раствора субстанции флагината установлена антимикробная активность по отношению к музейному и клиническому штаммам Helicobacter pilory и к основным представителям инфекционных и гнойно-воспалительных процессов: Streptococcus speciosus, Staphylococcus aureus, Streptococcus pyogenes, Klebsiella pneumoniae, Proteus vulgaris, Clostridia perfringens, Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli, Bacilus subtilis, Candida albicans.

Исследование токсических свойств флагината позволило выявить, что препарат является "относительно безвредным", не имеет видовой специфичности и в сравнении с ацемином и метилурацилом обладает более широким диапазоном условно-терапевтических доз.

Флагинат не оказывает мутагенного и местнораздражающего действия, в дозах 25 мг/кг и 200 мг/кг не проявляет аллергизирующей и иммунотропной активности, не влияет на функциональную активность ЖКТ за исключением дозы 200 мг/кг, которая повышает кислотность желудочного сока. Субстанция флагината в дозе 25 мг/кг положительно влияет на протекание беременности у крыс.

На основании проведенных исследований капсулы флагината можно рекомендовать как репаративный препарат для лечения ран, в том числе инфекционных, длительно не заживающих, воспалительных процессов кожи и слизистых оболочек и при переломах костей наряду с такими репарантами как метилурацил и ацемин. Преимуществом флагината перед последними является более широкий спектр активности: анальгетическое, мембраностабилизирующее, антимикробное действие. В отличие от ацемина флагинат можно применять при гнойных и инфицированных ранах, а также при беременности. В сравнении с метилурацилом флагинат не оказывает аллергизирующего и местнораздражающего действия.

Ключевые слова: трава зверобоя, фармакологическая активность, репаративное действие, острая токсичность, специфическая токсичность.

Troshchina T.L. ІPharmacological investigation new reparation drug from herb of Common St. John's Wort І.- Manuscript.

Thesis on the Candidate of Biological Sciences Degree on speciality 14.03.05 – pharmacology.- Odessky State Medical University, Odessa, 2001.

Search of the pharmacological investigation of the new substance and capsule Flaginat from herb of Common St. John's Wort comparison with Acemin and Methyluracil. Flaginat in dose 25 mg/kg stimulate reparation process at damage of soft tissues, in dose 200 mg/kg further to consolidation bones. The mechanism of action Flaginat is similar with Methyluracil, stimulating reparation processes on cells level and with Acemin, rendering influence on an exchange electrolytes at fracture. Flaginat in dose 25 mg/kg has anti-inflammatory, antioxidant and as against drugs of comparison has analgesic, membranostabilisation and antimicrobical activity. Flaginat is concerning harmless, hasn't mutagenic, allergic, immunotoxicity, local irritation action, can be applied during pregnancy, don't influence on functional activity alimentary canal (exception the dose 200 mg/kg which raise acidity gastric juice).

Flaginat is possible to recommend for healing of wounds, lingering healing, inflammatory processes and trophic ulcer and consolidation bone on a level with drug-reparant Methyluracil and Acemin. Advantage of the Flaginat is wider spectrum actions and smaller toxicity.

Clue words: herb of Common St. John's Wort, pharmacological activity, reparation action, acute toxicity, specific toxicity.