Події 1620 р. значно загострили ворожнечу між православними та греко-католиками. На додаток до розбіжностей із питань догми та церковних обрядів між ними розгорівся затяжний конфлікт за церковні володіння. Суперечка довкола права розпоряджалися церквами, монастирями із закріпленими за ними землями досягало такої гостроти, що у сутичках, які нерідко були заздалегідь спланованими битвами, з обох сторін гинули сотні священиків. Найбільшого розголосу набуло вбивство у 1623 р. греко-католицького архієпископа Йосафата Кунцевича натовпом православних віруючих, розлючених його спробами конфліктувати дві православні церкви. Занепокоєні братовбивчою боротьбою, кілька православних священиків, зокрема архієпископ полоцький Мелетій Смотрицький та ректор Київської братської школи Касіян Сакович, намагалися досягти компромісу, "що об'єднав би обидві Русі". Але хоч у Києві та Львові кілька разів скликалися собори, спроби примирення не мали успіху.

Розчаровані войовничою непримиренністю своїх православних співвітчизників , Смотрицький із Саковичем урешті-решт стали на бік греко-католиків. Тим часом інші представники православного духовенства звернулися за підтримкою до московського царя. Це не був безпрецедентний крок. Ще в 1570-х роках Львівське братство контактувало з православною Московії, а на початку XVII ст. багато українських православних ченців утікали до Московії від переслідувань католиків. У 1625 р., переконаний в тому, що православ'я від владою Польці не має майбутнього, митрополит Борецький звернувся до царя з проханням прийняти Україну під своє покровительство. Проте Москва реагувала з обмеженістю. Побоюючись викликати роздратування Польщі, вона надала українцям підтримку заохочуючим словом і грішми, не беручи зобов'язань стати на захист їхніх прав.

Боротьба між православними та греко-католиками спричинялася до такого хаосу, що врешті-решт у 1632 р. в неї втрутився польський уряд, нав'язавши компроміс. Православна ієрархія отримала офіційне визнання, що викликала суперечки, ділилася між двома церквам. Одним із головних "архітекторів" цього компромісу став митрополит Петро Могила - провідний український релігійний діяч XVII ст. Нащадок знатного молдавського роду, Могила, як і багато його співвітчизників, дістав початкову освіту у Львівській братській школі. Закінчивши навчання в Парижі, він повернувся на Україну, щоб зробити кар'єру священика. В 1627 р., у 31-річному віці, він стає архімандритом Києво-Печерської лаври, а через п'ять років - митрополитом київським.

Скориставшись із відносного спокою, що настав після 1632 р., Могила проводить конче необхідні реформи у православній церкві, її культурних та учбових закладах. Разом із групою освічених богословів і письменників, яку часом назвали Могилянським Атенеумом, він систематизував православні догми та обряди й підготував до друку перший православний Катехізис. Об'єднавши засновану ним у Києво-Печерській лаврі школу із школою Київського братства, Могила заклав підвалини так званої Могилянської колегії, яка згодом стала одним із найважливіших учбових закладів слов'янського світу. Взявши за взірець єзуїтські школи, особливу увагу в колегії звертали на вивчення класичних дисциплін, особливо латини та польської мови. Грецькій мові, такій популярній колись у братських школах, вже не вдавалося великого значення. Програма школи, заснованої Петром Могилою, свідчила про його прагнення поєднати традиції слов'янського православ'я з латинськими традиціями католицького Заходу. Але, захоплений культурою Заходу, митрополит Могила та коло його послідовників не розуміли, що латинські філософські трактати, історичні й поетичні твори приваблювали тільки невелику купку вчених-схоластів, а в українському суспільстві в цілому вони не знаходили широкого розуміння. Відтак між елітарними київськими схоластами та рештою українського суспільства поступово намітився культурний розрив.

У культурі українських верхів, тобто невеликої освіченої еліти, й далі панували релігійні теми. У більшості книжок, зокрема таких, як "Палінодія" Захарії Копистянського, "Зерцало богословія" Кирила Ставровецького, робилися способи продемонструвати істинність православ'я, довести, що воно - єдиний шлях до людського спасіння. Навіть у "бестселерах" того часу, призначених для масового вжитку, порушувалися теми житія святих чи давався каталог чудес, що відбувалися в Києво-Печерській лаврі. У переважній своїй більшості ці книги писалися складною для розуміння церковнослов'янською мовою, котра все ще використовувалася на Україні як літературна. Проте чим далі серед письменників поширювалася й "проста" мова. Так, Памва Беринда протягом 30 років складав свій "Лексикон", в якому подав до церковнослов'янських слів їхні українські відповідники. Новим фактом літературного життя того періоду стала зростаюча популярність поезії й особливо панегіриків. До найкращих зразків цього жанру належать "Вірші" Касіяна Саковича, написані на смерть Сагайдачного, та вірші, присвячені Петру Могилі. П'єси, що складалися й ставилися по школах, також були популярними й часто містили елементи народної творчості. В міру того як братські школи та Могилянська колегія випускали нові сотні студентів, а друкарні - нові книги, грамотність набувала на Україні дедалі відчутнішого поширення.

Якщо релігійне суперництво та західні зв'язки стимулювали культурний розвиток київської еліти, то в культурі народних мас і надалі знаходили відбиття землеробський стиль життя та умови пограниччя. Так, темами народних пісень, а багато з них мали давнє походження, були взаємини людини з природою, праця на