Особливість Острозької Біблії в тому, що церковнослов’янською мовою вона перекладалася не зі староєврейської мови, як більшість біблійних видань, а з грецької. Тобто її оригінал інший, ніж більшості перекладів Біблії. Взагалі до нинішнього перекладу Святого Письма українською мовою, уже зробленого отцем Рафаїлом, відомі три давніших переклади. Це видання Пантелеймона Куліша, яке вийшло після його смерті 1903 року у Відні (деякі книги переклали також Іван Нечуй-Левицький та Іван Полюй), робота професора Івана Огієнка (митрополита Ілларіона), здійснена в 20–30-ті роки ХХ ст., і український переклад Івана Хоменка, що вийшов 1963 року. В основі видань Пантелеймона Куліша та Івана Огієнка лежить канон (список усіх книг, що входять до Старого і Нового Завітів), без другоканонічних книг, переклад же отця Хоменка включає другоканонічні книги, які визнаються в Римо-католицькій церкві. Всі ці переклади зроблено з єврейської мови.

Що ж до Острозької Біблії, то її основу становить Александрійський (А) кодекс. Це грецький переклад Старого Завіту, здійснений в Александрії 72 євреями-перекладачами (чому він і названий каноном сімдесятих) із староєврейського тексту ще за 250 років до явлення Ісуса Христа. Переклад був зроблений євреями для євреїв, які вже забули єврейську мову, оскільки тоді весь світ перебував практично в межах однієї Римської імперії і мовою спілкування була грецька мова. Тому одночасно з рухом християнства поширювався і грецький переклад Біблії, що його євреї визнавали й використовували у своїх богослужіннях. З появою християнства в Україні сюди прийшов і грецький текст Старого Завіту. Пізніше він (разом із Новим Завітом) був перекладений церковнослов’янською мовою, і перше видання «української» Біблії з’явилося 1851 року саме в Острозі, містило в собі 76 книг Старого й Нового Завітів з урахуванням деяких другоканонічних книг. Тому, розпочавши роботу над перекладом Святого Письма сучасною українською мовою, отець Рафаїл, як і рекомендував йому Патріарх Сліпий, узявся за слов’янський (найповніший) канон Біблії, звіряючи його з грецьким критичним текстом Біблії, опрацьованим у Німеччині, у Гетингенському університеті, де від 1917 року триває робота над критичним виданням усіх книг грецького тексту Святого Письма.

Найбільш цінним виданням серед вищевказаних стала Острозька Біблія, що побачила світ у 1581 р. Хоча це досить велике за обсягом видання, однак завдяки майстерності набору та застосуванню дрібного шрифту книга не видається масивною. Вона надрукована форматом у аркуш, двома шпальтами, в два кольори й містить 1256 сторінок. На повній сторінці міститься 50 рядків. При друкуванні Біблії використовувалося 6 різних за розміром та графікою шрифтів (4 кириличні та 2 грецькі), спеціально виготовлених для цієї книги.

Ілюстративне оформлення видання вирізняється стриманістю, продуманістю композиції, художнім смаком. У книзі використано 81 заставку з 16 дощок, 70 кінцівок з 17 дощок, 1384 гравійованих ініціалів, а також численні композиції з виливних прикрас. Щоправда, Біблія майже не ілюстрована, якщо не брати до уваги гравійовану рамку на титулі, герб Василя-Костянтина Острозького на звороті титулу й друкарську марку Івана Федоровича (Федорова) в кінці книги. Раніше, коли мова йшла про Острозьку Біблію, дослідники (особливо радянські) концентрували увагу на особі Івана Федорова. Дійсно, його заслуга в появі цього видання дуже велика. Не треба забувати, що він виконував переважно технічну роботу. А щоб це видання побачило світ, треба було здійснити велетенську науково-дослідницьку й перекладацьку роботу. В Острозі за сприяння князя Василя-Костянтина був створений науковий осередок, який, власне, й займався цими питаннями. Ймовірно, його очолював Герасим Смотрицький — перший ректор Острозької академії; він же й автор передмов.

В Острозі вдалося зібрати різноманітні списки біблійних книг. Серед них особливі надії покладалися на отриманий з великими труднощами в царя Івана Грозного рукопис, т. зв. Геннадіївської Біблії. Цей рукопис зробили під керівництвом новгородського архієпископа Геннадія в 1499 р., й він був відносно повним зібранням біблійних книг. У літературі можна зустріти думку, що в основі Острозької Біблії лежить саме Геннадіївська Біблія. Насправді це далеко не так. У Геннадіївській Біблії було чимало неточностей та помилок, які не залишилися непоміченими острозькими книжниками. Останні використовували різноманітні церковнослов’янські біблійні тексти, частина з яких була отримана у південних слов’ян (болгар та сербів). Користувалися вони чеськими й польськими рукописами біблійних книг, а також протестантськими й католицькими виданнями.

Але в основу старозавітного тексту Острозької Біблії була покладена «Септуагінта» — грецький переклад із староєврейської, здійснений ще в елліністичному Єгипті (III ст. до Р.Х.). Всі зібрані староєврейські біблійні тексти порівнювалися й коректувалися відповідно до «Септуагінти». Цей момент викликав критику з боку окремих дослідників, наприклад Івана Огієнка. Адже між грецькою «Септуагінтою» і єврейським старозавітним текстом є певні розходження. Та все ж треба враховувати, що в той час авторитет «Септуагінти» в православному світі був надзвичайно високим, а сама вона трактувалася як богонатхненне джерело. Тому зрозуміло, чому ж острозькі книжники звернулися до неї.

Аналіз мови Острозької Біблії дає підстави зробити висновок про те, що окремі її книги перекладалися з текстів різних часів, виконаних у багатьох країнах. Широко використовувалися південнослов’янські списки, що відобразилося на правописі та мові перекладу. Деякі книги Острозької Біблії були перекладені безпосередньо з «Септуагінти». А книгу Єздри, якої не було в грецькому тексті, переклали безпосередньо з «Вульгати» — латиномовного перекладу Біблії.