Коли розійшлася звістка про унію, православна громада вибухнула від обурення. Найвидатніший її представник князь Острозький був розлючений не самою унією, а тим, в який спосіб її укладено. У широко розповсюдженому відкритому листі він оголосив чотирьох єпископів «вовками в овечій шкурі», які зрадили свою паству, й закликав віруючих до протесту. Надіславши офіційну скаргу королю, яку було проігноровано, Острозький вступив у антикатолицьку спілку з протестантами, погрожуючи підняти збройне повстання. Водночас по всіх українських та білоруських землях православна знать збирала свої місцеві ради (сеймики), на яких гнівно засуджувала унію. Перелякані такими подіями, ініціатори всієї справи єпископи Балабан і Копистенський зреклися своїх колег та оголосили про свою формальну опозицію унії.
Щоб розв'язати конфлікт, у 1596 р. в м. Бересті (Бресті) був скликаний церковний собор. Ніколи не бачили Україна і Білорусія таких величезних зборів духовенства. Противників унії представляли два вищезгаданих єпископи, православні ієрархи з-за кордону, десятки виборних представників знаті, понад 200 священиків та численні миряни. Водночас у таборі її прибічників була жменька католицьких сановників, королівських урядовців і четверо православних єпископів. Із самого початку стало очевидним, що сторони не можуть знайти спільної мови. Зрозумівши, що переговори не мали ніякого сенсу, прибічники унії публічно підтвердили свої наміри укласти її.
Незважаючи на протести та погрози, православній стороні не вдалося змусити їх відступити або домогтися того, щоб король позбавив їх посад. Так українське суспільство розкололося навпіл: з одного боку — православні магнати, більшість духовенства та народні маси, в той час як з іншого — колишні ієрархи, підтримувані королем та купкою прибічників. Унаслідок цього виникла ситуація, коли існувала церковна ієрархія без віруючих і віруючі без своїх ієрархів. Те, що почалося як спроба об'єднати християнські церкви, закінчилося їхнім подальшим роздрібненням, бо тепер замість двох існувало три церкви: католицька, православна та уніатська або греко-католицька. як її згодом стали називати.
Релігійна полеміка. Суперечки навколо Берестейської унії породили небачену зливу полемічних писань. Перший і цілком сподіваний постріл у затятій словесній війні зробив невтомний єзуїт Скарга своїм твором «На захист Брестської унії»(1597 р.). Осередки православної науки дали на нього негайну відповідь. Того ж року опублікував польською (а у 1598 р. українською) мовою свій «Апокрисис» острозький шляхтич Марцін Бронєвський, що писав під псевдонімом Христофор Філалет. У цьому полемічному творі викривалося відступництво греко-католицьких єпископів, підтверджувалася законність проведеного у Бересті собору православної церкви. З типовою для шляхти підозріливістю до вищої влади, перемежованою з протестантськими ідеями, Бронєвський відкинув посягання цих єпископів на виключне право приймати рішення щодо життя церкви. Дошкульній сатирі піддав греко-католиків у своїх памфлетах інший представник острозького гуртка — Клірик Острозький. Трохи згодом, у 1605 р., у вогневому натиску православної полеміки взяв участь і Львів. Не підписаний автором трактат під назвою «Пересторога»зосередився на викритті тих егоїстичних мотивів, які керували греко-католицькими єпископами. З боку греко-католиків виступав лише один вартий уваги автор —Іпатій Потій. У 1599 р., користуючись добре розвинутими прийомами єзуїтів, він опублікував українською мовою свій «Антиапокрисис» — пристрасну відповідь на полемічний виступ Бронєвського.