такий ген може бути введений в клітину, в якій він здатен розмножуватися. В

результаті проходить зміна спадкових властивостей клітини. При відомих

умовах чужорідний ген починає функціонувати, керувати синтезом певного

продукту. В деяких випадках клітина одержує здатність до посиленого

виробництва цього продукту, що може мати важливе практичне значення [10].

Генетична інженерія - це одна з багатьох галузей так званої техніки

рекомбінантних ДНК, що відкриває безмежний простір для фантазії вчених,

кидає справжній виклик існуючим уявленням про можливості людини.

Техніка рекомбінантних ДНК має велике значення не тільки для

практики, вона значно розширює можливості пізнання фундаментальних основ

організації й функціонування геномів.

З моменту зародження генетична інженерія привертала увагу не тільки

блискучими перспективами, а й потенційною небезпекою деяких досліджень.

Першим висловив переконання Пол Берг, який у США в 1972 році власними

руками сконструював першу рекомбінантну молекулу in vitro. Він разом з

групою відомих молекулярних біологів вказав на необхідність впровадження

певних правил та обмежень у роботах рекомбінантними молекулами,

побоюючись, по-перше, потрапляння робочих матеріалів за межі лабораторії,

а отже, загрози внесення в організм людини або тварини шкідливих речовин

та живих істот з летальною дією. По-друге, вчених турбувала невизначеність

процесу взаємодії рекомбінантних ДНК з генами «реципієнта». Тому в 1975

році представники 16 країн зібралися на конференцію, присвячену питанням

одержання рекомбінантних молекул ДНК. Окрім вчених, у ній брали участь

юристи, представники преси, промислових компаній. Зібрання дійшло

висновку, що генетична інженерія має право на існування, але на існування

під контролем.

Як правило генетична інженерія здійснюється через ряд послідовних

операцій:

1) одержання гену, який повинен включатися в організм, за необхідності

- його зміна;

2) вмонтовування гену у вектор;

3) клонування гену та ідентифікація його функцій;

4) введення гену в «місце призначення».

17

Одержання гену може відбуватись різними шляхами. Ще в 60-х роках Г.

Корана запропонував методологію хімічного синтезу ДНК. Ним була

синтезована спочатку кодуюча частина аланінової т-РНК, а в 1976 році - ген

тирозинової т-РНК Е coli, який діяв при введенні в бактеріофаг.

Нині синтез гену можна здійснити автоматично за короткий час, але

необхідною умовою для цього є знання послідовності нуклеотидів. Але вчені

впроваджують й інші методи. Один з них передбачає використання фраґменту

зворотньої транскриптази, який спростував пануюче правило:

ДНК>РНК>білок. Цей фраґмент деяких вірусів здатний синтезувати ДНК на

матриці РНК. Тому для синтезу гена необхідно виділити потрібну м-РНК, дати

в пробірку чотири дезоксирибонуклеотидтрансферази, зворотну

транскриптазу, іони магнію та затравку. Фраґмент синтезує на матриці РНК

комплементарний ланцюг ДНК, після чого система обробляється лугом. Це

призводить до руйнування уже непотрібного ланцюга РНК. Надалі фраґмент

ДНК-полімераза відтворює комплементарний ланцюг, таким чином дослідник

отримує ген необхідного білка.

Даний метод одержання генів має як переваги, так і недоліки. Серед

незаперечних переваг - неперервність кодуючої послідовності. Еукаротичні

гени складаються з кодуючих ділянок (екзонів), розміщених упереміш з

некодуючими (інтронами). Синтез м-РНК на таких генах супроводжується

вирізанням інтронів та подальшим сплайсингом кодуючих ділянок. Для цього

необхідні певні ферменти.

Однак кількість м-РНК різних видів, наявних у клітині, важко собі

уявити. Виділення з цього різноманіття певної молекули - завдання важке.

Допомагають ученим «зонди» - мічені радіоактивними атомами молекули ДНК

довжиною 20-40 нуклеотидів. У багатьох випадках білок, який цікавить

дослідника, можна ідентифікувати і виділити в очищеному вигляді. Зовсім

незначної його кількості достатньо для визначення перших десятків

амінокислот послідовності білка, а отже, і синтезу ділянки кодуючої ДНК.

Введення такого зонду в суміш м-РНК легко знаходить потрібні молекули.

Труднощі відшукування необхідної м-РНК доповнюються недоліками

синтезованих генів, оскільки вони не вимагають регуляторних ділянок [14].

Другий шлях одержання генів - їх виділення безпосередньо з геномів за

допомогою рестриктаз. Це ферменти мікроорганізмів, які розрізають подвійну

спіраль ДНК у певних ділянках з 4-8 нуклеотидів. Дані ферменти

18

характеризуються специфічністю до послідовності, яку вони розпізнають. На

сьогодні відомо понад 500 рестриктаз, тому підбирати необхідний фермент

досить просто. Значну кількість рестриктаз, як кінцевих продуктів

біотехнології випускають компанії Sigma (США), Pharmacia (Швеція), Serva

(Німеччина).

Вектор-молекула ДНК здатна переносити в клітину чужорідну ДНК і

забезпечувати там її розмноження або включення в геном.

Вектор - найбільш важливий компонент процесу клонування. Вектори

повинні розмножуватись в клітині-господарі, і при введені чужорідної ДНК їх

функції не повинні істотно порушуватись. Для клонування ДНК

використовують різноманітні вектори-плазміди, віруси, фоли, які в звичайних

умовах є інструментом для перенесення чужорідної генетичної інформації.

Плазміди - малі молекули, які несуть по кілька генів. Ці позахромосомні

детермінанти спадковості є автономними структурами, що несуть свою

інформацію у вигляді невеликої циклічної ДНК. До них належать статевий

фактор (F - фактор), фактори лікарської резистентності (фактор R), які

вивчаються з 1955 року.

Вмонтовування чужорідного фраґменту ДНК в геном вектору проходить

в два етапи: спочатку ДНК вектора розрізається за допомогою рестриктаз, а

потім в них вмонтовується чужорідний фраґмент.

Розрізняють два типи фраґментів ДНК. Деякі з них мають на кінцях

структури, які здатні об’єднуватись - короткі гомологічні послідовності

нуклеотидів (липкі кінці), інші не мають таких структур (з тупими кінцями)

Такі хвости легко взаємодіють один з одним за принципом

комплементарності. Об’єднання фраґментів з тупими кінцями відбувається під

дією лігаз - ферментів. При комбінації різних рестриктаз і лігаз можна в будь-

якому місці розрізати ДНК і зшити її.

Для зшивання фраґментів ДНК використовуються лінкери і адаптори.

Лінкер - це синтетичний короткий дволанцюговий олігонуклеотид, що містить

сайти розпізнання для ряду рестриктаз; він може бути приєднаний до кінців

фраґмента ДНК, одержаної за допомогою якоїсь рестриктази, в процесі

реконструювання р-ДНК. Адаптор - це лінкер, що містить більш ніж один сайт

розпізнавання рестриктаз, він призначений для об’єднання фраґментів з

несумісними кінцями.

19

При конструюванні векторів в них вводять гени-лінкери, що легко

кодують ознаки, які розпізнаються, для виявлення і відбору наступних

трансформантів, і декількох сайтів розпізнавання різними рестриктазами з

метою одержання для клонування серії різних молекул ДНК [11].

Отже, будь-яку доступну ДНК, в тому числі і людини, можна розщепити

за допомогою ферментів рестрикції